用于微生物分析的肽核酸探针

摘要

本发明提供一种用于侦测、识别和/或是计量微生物的肽核酸(PNA)探针，该微生物例如大肠杆菌(Escherichia coli)、克雷伯氏肺炎菌(Klebsiella pneumoniae)、克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)、无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)、真菌(fungi)、以及不动菌属(Acinetobacter)的菌种。本发明更提供一种使用本发明所述PNA探针的方法，以及一种含有本发明所述PNA探针的试剂盒。

说明书

相关申请案

本申请主张于2005年6月2日申请，案号为60/687,178的美国 临时申请案，以及2005年8月1日申请，案号为60/704,552的美国 临时申请案的优先权，且特别将这两篇的全部内容整合于本文，以作 为参考。

发明所属之技术领域

本发明是关于分析任选地出现于样本中的微生物的肽核酸(PNA) 探针、PNA探针组与方法。本发明的探针的目标微生物包含大肠杆菌 (Escherichia coli)、克雷伯氏肺炎菌(Klebsiella pneumoniae)、克 雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)、不动菌属(Acinetobacter)菌种、无 乳链球菌(Streptococcus agalactiae)，以及真菌(fungi)。本发明更 关于包括所述PNA探针的诊断试剂盒。

先前技术

传染性疾病的诊断仍往往基于传统微生物学方法，例如表现型标 识物(marker)的培养与生化测试，其通常需要1-2天至数周、甚至是 数月的时间才能取得最终诊断。于此段时间中，通常是凭经验并基于 初步测试结果以及临床症状来治疗患者，这样通常导致不必要的抗生 素的使用及其所造成的后遗症。

众所周知传统微生物分析的生化方法是缓慢且错误识别的。因此， 对于确保最佳抗生素治疗与患者管理，快速且正确的微生物侦测、识 别和/或是计量的方法是重要的。尽管其名字为肽核酸，肽核酸(PNA) 既不是肽也不是核酸，其甚至不是酸。PNA为非自然产生聚酰胺，根据 华生克里克(Watson-Crick)碱基配对规则，其可杂交具有序列特异性 的核酸(DNA与RNA)(参见美国专利号第5,539,082以及Egholm et al.， Nature 365：566-568(1993))。然而，与核酸为一种生物性材料，并于 活的物种的生命中扮演基因遗传与表达的媒介的重要角色不同，PNA 为最近发展出的完全人工分子，其是由化学家所构想出，且其是利用 合成有机化学制造。PNA在结构上也与核酸不同。虽然它们都利用常见 的核酸碱基(A、C、G、T与U)，这些分子的骨架于结构上却是不同。 RNA与DNA的骨架是由重复的磷酸二酯核糖与2-去氧核糖单元所构成。 相反地，最常见的PNA的骨架是由(氨乙基)-甘氨酸 ((aminoethyl)-glycin)次单元所构成。另外，于PNA中的核酸碱基是 以额外的次甲基羰基(methylene carbonyl)部分(moiety)连接到骨架。 所以，PNA不是酸，且其不会含有例如出现于DNA与RNA中的那些带电 酸性基。该不带电骨架允许PNA探针可于导致DNA与RNA不稳定的条 件下进行杂交，其对于使PNA探针接近已知不为DNA探针(参见 Stephano & Hyldig-Nielsen，IBC Library Series Publication #948. International Business Communication，Southborough，MA，pp. 19-37(1997))所接近的目标物，例如高度结构化的rRNA以及双股DNA 有贡献。于发展以探针为基础的杂交试验时，PNA为有用的调查候选物， 这是因为它们杂交序列特异性的核酸。然而，PNA探针与核酸探针于结 构与功能上都是不相等的。

核糖体RNA(rRNA)的序列以及对应于该rRNA的基因组DNA(rDNA) 的序列的比较性分析已经变成一种广泛认知为建立细菌菌种之间的物 种关系的方法(Woese，Microbiol.Rev.51：221-271(1987))，且已 基于rRNA或是rDNA序列比对，修订伯吉氏系统细菌学手册(Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology)。于非常相关物种间的rRNA或 是rDNA序列的差异使得设计用于微生物识别的特定探针变得可行，因 此使得诊断微生物学可基于单一基因识别物而非基于做为传统微生物 学特征的一系列的表现型识别物(Delong et al.，Science 342：1360-1363(1989))。

已经有数篇文章揭露用于侦测特定微生物的PNA萤光原位杂交 (PNA FISH)技术(例如参见Stender et al.，J Clin Microbiol.1999 Sep；37(9)：2760-5；Rigby et al.J Clin Microbiol.2002 Jun；40(6)：2182-6；以及Oliveira et al.J Clin Microbiol.2002 Jan；40(1)：247-51)，且已有数种可购买的试剂盒(AdvanDx，Inc， Wobum MA)。PNA FISH如同其名字所指，是使用经萤光标记的PNA探针， 而基于PNA探针对存在于样本中的核酸目标物的特异性杂交来使样本 发光。通常PNA探针是设计来侦测具有高套数的目标物，例如rRNA。 该PNA FISH方法以其具有提供快速且正确识别微生物达种的层级的潜 力，而被公认是一种比传统微生物侦测更重要的技术。PNA FISH技术 的一个限制因素在于已验证探针序列的取得性。由于制造与测试新颖 的探针需要一些花费，且只有一些设计探针的技艺，不常见到具有已 验证价值的新的探针序列。

发明内容

本发明是针对PNA探针及其用途，以及关于用于分析任选地出现 于样本中的关注微生物的试剂盒。根据本发明，该PNA探针是针对rRNA 或是对应于该rRNA的基因组序列(rDNA)，或其互补物。于优选的实施 例中，本发明的探针用于对任选地出现于样本中的微生物的原位杂交 分析，优选的，该原位杂交分析为萤光原位杂交分析。

于一个实施例中，本发明是针对侦测、识别和/或是计量微生物的 PNA探针，该微生物例如、大肠杆菌、克雷伯氏肺炎菌、克雷伯氏菌、 无乳链球菌、真菌以及不动菌属的菌种。

与核酸探针相比，这些PNA探针具有PNA探针天生的物理/化学特 性，使得可以只使用单一个PNA探针来实施快速且正确的分析。再者， 于具有相对较硬的细胞壁的许多微生物中，应用具有较核酸探针的穿 透性为优的PNA探针于萤光原位杂交试验时也具有好处。而对于核酸 探针需要以交联剂和/或是酶进行固定与穿透(例如参见Kempf et al.， J.CHn.Microbiol 38：830-838(2000))的那些例子，这些PNA探针则 是可如同例1所示范般地于制备抹片后直接施用。

于一优选的实施例中，这些PNA探针具有相对较短的核酸碱基序 列，例如8-17碱基，优选的，例1中描述它们为15个核酸碱基。由 于Tm值较低，自然产生的核酸探针典型具有至少18个核酸碱基(例如 参见Kempf et al.，J.Clin.Microbiol 38：830-838(2000))。这个 差异使得这些PNA探针对于如同分析来自微生物的rRNA或是rDNA所 需要的只具有一个或是很少的核酸碱基差异的非常相关非目标物序列 具有优选的区别性。

根据本发明的PNA探针的核酸碱基序列选自下列所组成的群组： ACA-CAC-ACT-GAT-TCA(SEQ ID NO：1)、CAC-CTA-CAC-ACC-AGC(SEQ ID NO：2)、CAC-TTA-CCA-TCA-GCG(SEQ ID NO：3)、 ACA-CCA-AAC-CTC-AGC(SEQ ID NO：4).、ACA-CCA-AAC-ATC-AGC(SEQ ID NO：5)、CCC-TAG-TCG-GCA-TAG(SEQ ID NO：6)、 CCA-AGA-GAT-CCG-TTG(SEQ ID NO：7)、CCT-CTC-ATC-GCA-TTA-C(SEQ ID NO：8)、以及GCT-CAC-CAG-TAT-CG(SEQ ID NO：9)。这些探针中的一种 或是多种，或是它们的互补物是包含于本发明的多个最佳探针组中。

优选的以至少一种可侦测部分来标记本发明的探针，其中该可侦 测部分选自下列所组成的群组：偶合物(conjugate)、支链侦测系统、 发色团、萤光团、自旋标记、放射性同位素、酶、半抗原、吖啶酯 (acridinium ester)以及发光(luminescent)化合物。本发明的萤光标 记探针可为自我报告(self-reporting)的。优选的，本发明的自我报 告萤光探针是PNA线性信标(Linear Beacon)。本发明的探针可含有二 种或是更多种的萤光标记，其为独立可侦测或是可通过符合 (coincidental)的萤光侦测。

本发明的其他概念中，包含含有增加该探针功能的部分的PNA探 针。该部分包含但不受限于间隔子与连接子(linker)。同样的，本发 明的PNA探针包含附着至固体载体上的探针，例如但不受限于膜、载 片、阵列、珠子或是粒子。

本发明的探针组包含二种或是更多种的PNA探针，其用于分析任 选地出现于样本中的微生物。优选的，以可侦测部分来标记探针组。 可能以相同的可侦测部分来标记多个探针组，或是可为了独立的探针 信号的分析而相异地标记多个探针组。通过符合的萤光，一个探针组 的二种或是更多种经不同标记的萤光探针可用以产生一个第三信号， 这也是包含于本发明的概念中。

根据本发明的方法包含将样本与一种或是更多种上述PNA探针接 触。根据该方法，接着侦测、识别和/或是计量于该样本中微生物的出 现、没出现、和/或是其数目，和/或是通过关联该探针的探索核酸碱 基序列对该目标物序列于适当杂交条件下的杂交而决定对抗生素的敏 感性。因此，该分析是基于具有可靠结果的单一试验。相反地，目前 微生物分析的例行方法是基于涉及多重测试的多重表现型特性。

于优选的实施例中，本发明的方法用于对任选地出现于样本中的 微生物的原位杂交分析，最优选，该原位杂交分析是萤光原位杂交分 析。于本发明的优选的方法中，该样本是生物样本，其包含但不受限 为血液、尿液、分泌液、汗水、唾液、粪便、黏液或是它们的培养物。

本发明的优选方法任选地包含非标记阻隔探针，以降低或是排除 PNA探针对非目标物序列的杂交。本发明的方法不包含于杂交前使用 交联剂或是酶。

本发明方法也可用来侦测于反应中所产生、合成或是扩增的核酸 目标物。产生、合成或是扩增该目标物的优选方法包含PCR、LCR、SDA、 TMA、RCA以及Q-beta复制脢。

本发明的方法包含于其中该目标物是固定至表面或是另可为阵列 的组份者，其中该表面例如膜、载片、珠子粒子。任选地，该方法可 包含固定至表面或是另可为阵列的组份的PNA探针，其中该表面例如 膜、载片、珠子或是粒子。

于本发明的极优选实施例中，患者的医学治疗包含i.)取得来自患 者的样本，ii.)决定该样本中微生物出现与否、量和/或是其身分，以 及iii.)任选地投药至少一种治疗该感染的抗生素化合物。

于另一实施例中，本发明是针对适于实施侦测、识别和/或是计量 任选地出现于样本中的微生物的试验，和/或是决定抗生素敏感性的试 剂盒。本发明的所述试剂盒包括一种或是更多种的PNA探针，以及被 选择来执行试验或是简化试验的表现的其他试剂或是组合物。优选的 试剂盒形式包含设计用以执行原位杂交试验的试剂盒，以及设计用以 执行实时PCR试验的试剂盒。优选的试剂盒是用来检验例如为临床标 本，或是其培养物的样本。

本领域的技术人员将能领会适当的PNA探针并不需要具有确切这 些有效的探索核酸碱基序列(probing nucleobase sequence)，而是通 常根据特定试验条件而修改。例如，如果需要经由修改该杂交的稳定 度来降低Tm和/或是调整严格度的话，可通过截断该核酸碱基序列而 制备较短的PNA探针。相似地，只要是该差别性核酸碱基仍保留于该 PNA探针的序列中，可在该核酸碱基序列一端将其截断并在另一端延 长。落于本文所描述的参数中的这些探索核酸碱基序列的这些变形皆 视为本发明的实施例。

已证实本发明的PNA探针、方法以及试剂盒对于其所针对的微生 物是敏感且特异的。再者，本文所描述的该些试验是快速(少于3小时) 且能够于单一试验中分析微生物。本领域的技术人员将也能领会互补 探索序列同样适用于试验，例如但不受限于使用rDNA作为目标物的实 时PCR。

发明详细说明

I.定义：

a.如本文所使用的，名词“核酸碱基”意指那些自然产生以及那 些非自然产生杂环部分，其已为那些利用核酸技术或是那些利用肽核 酸技术者所知，并可经由它产生可序列特异结合到核酸的聚合物。

适当核酸碱基的非限制性例子包含但不受限于腺嘌呤、胞嘧啶、 鸟嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶、5-丙炔基-尿嘧啶、2-硫代-5-丙炔基-尿 嘧啶、5-甲基胞嘧啶、假等轴胞嘧啶、2-硫代尿嘧啶以及2-硫代胸腺 嘧啶、2-氨基嘌呤、N9-(2-氨基-6-氯嘌呤)、N9-(2，6-二氨基嘌呤)、 次黄嘌呤、N9-(7-去氮-鸟嘌呤)、N9-(7-去氮-8-氮-鸟嘌呤)以及 N8-(7-去氮-8-氮-腺嘌呤)。适当核酸碱基的其他非限制性例子包含例 示于Buchardt et al.的图2(A)与2(B)中的那些核酸碱基(美国专利号 第6,357,163或是WO92/20702或是WO92/20703，于此并入参考)。

b.如本文所使用的，名词“核酸碱基序列”意指任何包括含有核 酸碱基次单元的聚合物的片段。适当的聚合物或是聚合物片段的非限 制性例子包含寡去氧核苷酸、寡核醣核苷酸、肽核酸、核酸类似物、 核酸模拟物、和/或是嵌合体。

c.如本文所使用的，名词“目标物序列”意指试验中待侦测的核 酸碱基序列。

d.如本文所使用的，名词“探针”意指聚合物(亦即，DNA、RNA、 PNA、嵌合体或是经连接聚合物)，其具有设计来序列特异地杂交关注 生物的目标分子的目标序列的探索核酸碱基序列。

e.如本文所使用的，名词“分析”意指为了侦测、识别和/或是计 量和/或是为了决定对抗生素的抗性(抗微生物敏感性)而标识个别细 菌。

f.如本文所使用的，名词“肽核酸”或是“PNA”意指包括二种或 是更多种PNA次单元(残余物)的任何寡聚物或是聚合物片段，包含但 不受限于在任何一种或是更多种下列美国专利号中称为或是请求为肽 核酸的任何寡聚物或是聚合物片段：5,539,082、5,527,675、 5,623,049、5,714,331、5,718,262、5,736,336、5,773,571、5,766,855、 5,786,461、5,837,459、5,891,625、5,972,610、5,986,053、6,107,470、 6,201,103、6,350,853、6,357,163、6,395,474、6,414,112、6,441,130、 6,451,968、6969766、以及7022851所有这些专利并入本文参考。该 名词″肽核酸″或是″PNA″也应适用于包括二种或是更多种描述于下列 公开案中的那些核酸模拟物的次单元的任何寡聚物或是聚合物片段： Lagriffoul et al.，Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters，4： 1081-1082(1994)；Petersen et al.，Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters，6：793-796(1996)；Diderichsen et al.，Tett. Lett.37：475-478(1996)；Fujii et al.，Bioorg.Med.Chem.Lett. 7：637-627(1997)；Jordan et al.Bioorg.Med.Chem.Lett.7： 687-690(1997)；Krotz et al.，Tett.Lett.36：6941-6944(1995)； Lagriffoul et al.，Bioorg.Med.Chem.Lett.4：1081-1082(1994)； Diederichsen，U.，Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters，7： 1743-1746(1997)；Lowe et al.，J.Chem.Soc.Perkin Trans. 1，(1997)1：539-546；Lowe et al.，J.Chem.Soc.Perkin Trans. 11：547-554(1997)；Lowe et al.，J.Chem.Soc.Perkin Trans.1 1：5 55-560(1997)；Howarth et al.，J.Org.Chem.62： 5441-5450(1997)；Altmann，K-H et al.，Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters，7：1119-1122(1997)；Diederichsen，U.， Bioorganic & Med.Chem.Lett.，8：165-168(1998)；Diederichsen et al.，Angew.Chem.Int.Ed.，37：302-305(1998)；Cantin et al.， Tett.Lett，38：4211-4214(1997)；Ciapetti et al.，Tetrahedron， 53：1167-1176(1997)；Lagriffoule et al.，Chem.Eur.J.，3： 912-919(1997)；Kumar et al.，Organic Letters 3(9)： 1269-1272(2001)；以及如同Shah et al.于WO96/04000所揭露的以 肽为基础的核酸模拟物(PENAMs)。于最优选实施例中，PNA次单元是由 自然产生或是非自然产生的核酸碱基所组成，其中该核酸碱基透过次 甲基羰基连结而附着至该N-[2-(氨乙基)]甘氨酸的骨架的氮基的氮原 子上。

g.如本文所使用的，名词“标记(label)”与“可侦测部分”是可 互相替换，且应指可附着至探针并因此使得该探针通过仪器或是方法 成为可侦测的部分。

h.如本文所使用的，名词“符合的萤光(conincidential fluoresence)”是用以描述所察觉到的一种颜色，其通过同步侦测二 种或是更多种于空间位置够近而使其不可分的标记所发射的光束所产 生。该符合的萤光的侦测可通过眼睛或是光敏装置。

2.说明

1.一般：

PNA合成：

PNA的化学合成方法为已知(参见美国专利号第5,539,082、 5,527,675、5,623,049、5,714,331、5,718,262、5,736,336、5,773,571、 5,766,855、5,786,461、5,837,459、5,891,625、5,972,610、5,986,053、 6,107,470、6,201,103、6,350,853、6,357,163、6,395,474、6,414,112、 6,441,130、6,451,968、6,969,766以及7,022,851，所有这些专利并 入本文参考(同时也请参见透视生物系统和/或是应用生物系统产品文 献)。PNA合成方法学的一般性参考也请参见Nielsen et al.， Polypeptide Nucleic Acids；Protocols and Applications，Horizon Scientific Press，Norfolk England(1999)。

肽核酸的载体键结自动化学组装的化学物与仪器目前为商业上可 取得，标记与未标记PNA寡聚物同样地也可由客制PNA寡聚物的贩售 商取得。PNA的化学合成类近于固相肽合成，其中于组装的各周期中， 寡聚物具有反应性烷基氨基端，其与下一个将被加到正在增长的聚合 物的合成子缩合。

可以任何规模合成PNA，从次微莫耳到千莫耳或是更多。可在加速 合成仪(Expedite Synthesizer，Applied Biosystems)上使用 Fmoc(Bhoc)保护基单体，使用XAL、PAL或是许多其他适当的商业上可 取得肽合成载体而方便地以2μmole的规模合成PNA。取代地，可使 用具有适当固体载体(例如MBHA载体)的433A形号的合成仪(Applied Biosystems)。再者，可利用许多其他自动化合成仪与合成载体。可使 用连续流式方法和/或是批次方法来执行合成。也可手动合成PNA。

PNA标记：

用来标记PNA的优选非限制性方法是如同美国专利号第 6,110,676、6,361,942、6,355,421、6,969,766以及7,022,851所描 述者、本说明书实施例部分或是其他本领域已知的PNA合成与肽合成 者。

标记：

实现本发明且适于标记PNA探针的可侦测部分(标记)的非限制例 子将包含葡聚糖偶合物、支链侦测系统、发色团、萤光团、自旋标记、 放射性同位素、酶、半抗原、吖啶酯以及发光化合物。

熟习PNA、多肽或是核酸合成领域技术人员能够认出其他适当的标 记试剂与优选的附加方法。

优选的半抗原包含5(6)-羧基萤光素、2，4-二硝基苯基、长叶毛地 黄配质以及生物素。

优选的萤光物质(萤光团)包含5(6)-羧基萤光素(Flu)、6-((7-氨 基-4-甲基熏草素-S-乙醯)氨基)已酸(Cou)、5(以及6)-羧-X-若丹明 (Rox)、花青素2(Cy2)染料、花青素3(Cy3)染料、花青素3.5(Cy3.5) 染料、花青素5(Cy5)染料、花青素5.5(Cy5.5)染料、花青素7(Cy7) 染料、花青素9(Cy9)染料(花青素染料2、3、3.5、5及5.5可以NHS 酯形式由Amersham，Arlington Heights，IL公司取得)、JOE、Tamara 或是Alexa染料系列(Molecular Probes，Eugene，OR)。

优选的酶包含聚合酶(例如Taq聚合酶、补平PNA聚合酶、T7DNA 聚合酶、测序酶(Sequenase)、DNA聚合酶1、以及phi29聚合酶)、碱 性磷酸酶(AP)、辣根过氧化物酶(HRP)以及最优选的大豆过氧化物酶 (SBP)。

未标记探针：

用于实现本发明的探针于本发明的方法作用并不一定需要以可侦 测部分将其标记，举例来说，当附着至固体载体时。

自我表示(self-indicating)探针：

信标探针为自我表示探针的例子，其包含供给者部分以及接受者 部分。该供给者与接受者部分的运作方式为使得该接受者部分接收从 该供给者部分来的能量或是其他从该供给者部分来的淬熄信号。虽然 前述所列的萤光团(具有适当的光谱性质)也可作为能量转移接受者， 优选的该接受者部分为淬灭体部分。优选的，该淬灭体部分为非萤光 芳香或是异芳香部分。优选的该淬灭体部分为4-((-4-(二甲基氨基) 苯基)氮)苯甲酸(dabcyl)。于一优选的实施例中该自我表示信标探针 为如同于US 6,485,901中具有更多描述的PNA线性信标。

于另一实施例中，本发明的该自我表示探针具有如WIPO专利申请 案第WO97/45539号所描述的那种。与信标探针相比时，这些自我表示 探针主要不同在于该接受者必须与该核酸反应以产生信号。

间隔子/连接子部分：

通常，间隔子是用来最小化巨大标记试剂可能对于探针杂交性质 的副作用。本发明的该核酸碱基聚合物的优选间隔子/连接子部分是由 一种或是一种以上的下列物所构成：氨基烷基羧酸(例如氨基己酸)、 氨基酸的侧链(例如离氨酸或鸟氨酸的侧链)、自然氨基酸(例如甘氨 酸)、氨烷基酸(例如8-氨基-3，6-二氧辛烷基酸、烷类双酸(例如琥珀 酸)、烷氧类双酸(例如缩二羟乙酸)或是烷二氨(alkyldiamines)(例如 1，8-二氨基-3，6-二氧辛烷)。

杂交条件/严格度：

那些熟习核酸杂交领域技艺者将承认常用于加诸或是控制杂交严 格度的因数包含甲醯胺的浓度(或是其他化学变性试剂)、盐的浓度(亦 即离子强度)、杂交温度、清洁剂的浓度、pH值以及离液剂的出现与否。 通常可由已知技术固定数个前述严格度因数然后决定改变单一严格度 因数的效果来找出探针/目标物序列结合的最理想严格度。PNA的杂交 除了完全独立于离子强度之外，可调节相同严格度因数以藉此控制PNA 对核酸的杂交严格度。一种试验的最理想严格度可经由实验决定，其 通过检验各严格度因数直到达到所欲识别程度。

适当杂交条件：

通常，当造成背景值的核酸序列越相关于目标物序列时需要越小 心控制严格度。也可使用阻断探针以作为改善超出最理想化严格度因 数可行限度的差别度的方法。因此，适当杂交条件将包括于该条件下 达到所欲的差别程度使得试验产生正确(落于该试验的所欲容忍度中) 且可重复的结果。PNA探针的使用表现出本发明相对于使用DNA探针的 传统方法的显著好处。PNA的部分好处在于其在对于DNA探针来说为非 优选的或不稳定的条件下杂交。这样条件的例子包含低离子强度(低盐) 条件、以及高浓度的较低分子量醇，亦即50％乙醇的条件。

通過只有例行实验以及本文所提供的说明的帮助，本领域熟习技 艺者将可决定利用该方法以及如本文所描述的组合物实施试验的适当 杂交条件。适当原位杂交或PCR条件包括适于实施原位杂交或是PCR 程序的条件。因此，对于本领域熟习技艺者而言利用本文所提供的描 述在有或是没有额外例行实验下，适当原位杂交或是PCR的条件将明 显易懂。

阻断探针：

阻断探针为核酸或非核酸探针，其可用来抑制探索聚合物的探索 核酸碱基序列对非目标序列的结合。优选的阻断探针是PNA探针(参见 US 6,110,676)。一般相信阻断探针的运作是藉由与非目标物序列杂 交，以藉此形成相较于探索核酸碱基序列与非目标物序列的杂交于热 动力上较为稳定的偶合物。该较稳定且优选的偶合物的形成能阻断较 不稳定且非优选的该探索核酸碱基序列与非目标物序列的偶合物的形 成。所以阻断探针可与方法本发明的试剂盒与组合物一起使用，以抑 制探针对非目标物序列的结合，该结合可能出现并干扰试验的表现。 阻断探针特别有利于系统发生上非常相关物种间的辨识。

探索核酸碱基序列：

本发明的探针的探索核酸碱基序列为建构的特定序列辨识部分。 所以探索核酸碱基序列为设计来杂交特定目标物序列的核酸碱基序 列，其中目标物序列出现、没出现以及量可用来直接或间接侦测样品 中兴趣生物的出现、没出现以及数目。因此，考量对于所选定试验的 形式的探针的需求，一般将选择探针的探索核酸碱基序列的长度与序 列组成为使得于适当杂交条件下与目标物序列形成适当偶合物者。

本发明适于侦测、识别和/或是计数大肠杆菌的探针的优选探索核 酸碱基序列包括ACA-CAC-ACT-GAT-TCA(SEQ ID NO：1)的核酸碱基序 列，及其互补物。

本发明适于侦测、识别和/或是计数无乳链球菌的探针的优选的探 索核酸碱基序列包括ACA-CCA-AAC-CTC-AGC(SEQ ID NO：4)、 ACA-CCA-AAC-ATC-AGC(SEQ ID NO：SEQ ID NO：5)的核酸碱基序列，及 其互补物。基于序列号码为SEQ ID NO：4与SEQ ID NO：5仅相差一 个碱基对所设计的探针是用以侦测无乳链球菌的自然发生的变异株 (Kempf et al 2003)。

本发明适于侦测、识别和/或是计数克雷伯氏肺炎菌的探针的优选 探索核酸碱基序列包括：CAC-CTA-CAC-ACC-AGC(SEQ ID NO：2)的核酸 碱基序列，及其互补物。本发明适于侦测、识别和/或是计数克雷伯氏 菌的探针的优选探索核酸碱基序列包括：CAC-TTA-CCA-TCA-GCG(SEQ ID NO：3)的核酸碱基序列，及其互补物。

本发明适于侦测、识别和/或是计数真菌的探针的优选探索核酸碱 基序列包括：CCC-TAG-TCG-GCA-TAG(SEQ ID NO：6)、 CCA-AGA-GAT-CCG-TTG(SEQ ID NO：7)的核酸碱基序列，及其互补物。 序列号码6与7相当于泛真菌探针，其分别相当于18S与5.8S rRNA 序列。通过序列比对，预计这些泛真菌探针侦测广泛真菌家族。预计 该泛真菌探针于真菌种子囊菌门与担子菌门具有特别广泛覆盖范围。

本发明适于侦测、识别和/或是计数不动菌种的探针的优选探索核 酸碱基序列包括：CCT-CTC-ATC-GCA-TTA-C(SEQ ID NO：8)与 GCT-CAC-CAG-TAT-CG(SEQ ID NO：9)的核酸碱基序列，及它们的互补物。

本发明预期这些经识别的探索核酸碱基序列的变形物应该也提供 适用于该微生物分析的探针。落于本文所描述的参数内的探索核酸碱 基序列的变形物将视为本发明的实施例。

共同变形物包含缺失、插入与移码。另外，可通过截断上述已识 别的序列来产生较短的探索核酸碱基序列。

本发明的探针通常将具有完全与目标物序列互补的探索核酸碱基 序列。取代地，也可使用大致上互补的探索核酸碱基序列，这是因为 已证实当使用探针时，探针与目标物序列间存在一个或是一个以上点 突变(碱基不匹配)可得到较大序列差别度(参见Guo et al.，Nature Biotechnology 15：331-335(1997))。因此，探索核酸碱基序列可能 只有90％一致于上述已识别探索核酸碱基序列。落于上述参数中的大致 上互补的探索核酸碱基序列将视为本发明的实施例。

探索核酸碱基序列的互补物将视为本发明的实施例。这是因为当 待侦测的目标物序列已扩增或是拷贝并由此产生已识别目标序列的互 补物时，探索核酸碱基序列的互补物能够因此变成适当探针。 侦测、识别和/或是计数：

侦测意指对任选地出现在样本中的生物的存在与否的分析。识别 意指以基因名或是种名建立该生物的身分。计量意指对样本中的该生 物计数。某些试验形式提供同时侦测、识别与计数，例如参见Stender， H.et al.，J.Microbiol.Methods.45：31-39(2001)，其他则是提 供侦测与识别，例如参见Stender，H.et al.，Int.J.Tuberc.Lung Dis.3：830-837(1999)，还有其他试验形式只提供识别，例如参见 Oliveira，K et al.J.CHn.Microbiol.40：247-251(2002))。

抗生素抗性

对抗生素抗性的决定意指基于与针对抗微生物剂的抗性或敏感性 相关的特定基因或是突变对一个生物对抗生素的敏感性的分析。

II.本发明的优选实施例：

a.PNA探针：

于一个实施例中，本发明的PNA探针适于侦测、识别和/或是剂量 微生物。适合用于分析的PNA探针的一般性特征(例如长度、标记、核 酸碱基序列、连接子等等)已事先于此说明。本发明PNA探针的优选探 索核酸碱基序列将列于表1。

表1

  序列号码   核酸碱基序列   SEQ ID NO：1   ACA-CAC-ACT-GAT-TCA   SEQ ID NO：2   CAC-CTA-CAC-ACC-AGC   SEQ ID NO：3   CAC-TTA-CCA-TCA-GCG   SEQ ID NO：4   ACA-CCA-AAC-CTC-AGC   SEQ ID NO：5   ACA-CCA-AAC-ATC-AGC   SEQ ID NO：6   CCC-TAG-TCG-GCA-TAG   SEQ ID NO：7   CCA-AGA-GAT-CCG-TTG   SEQ ID NO：8   CCT-CTC-ATC-GCA-TTA-C   SEQ ID NO：9   GCT-CAC-CAG-TAT-CG

本发明的PNA探针可只包括探索核酸碱基序列(如先前所述者)或 是可包括额外部分。额外部分的非限制性例子包含可侦测部分(标记)、 连接子、间隔子、自然或非自然氨基酸或其他PNA、DNA或RNA的次单 元。额外部分可能在试验中是功能性的或是非功能性的。然而，于使 用PNA探针的试验设计中通常选择功能性的额外部分。本发明的优选 PNA探针为已标记一种或是一种以上可侦测部分，该可侦测部分选自萤 光团、酶与半抗原。

于优选的实施例中，本发明的探针用于原位杂交(ISH)与萤光原位 杂交(FISH)试验。典型必须移除原位杂交(ISH)与萤光原位杂交(FISH) 试验中所用的过量探针以使得与探针特异结合的可侦测部分可高于由 仍然存在但没有杂交的探针所导致的背景信号而被侦测。一般来说， 于样本与探针一起反应一段时间后，需洗掉过量的探针。然而本发明 的优选实施例为应用自我指示探针，这是因为它只产生少量或是无法 侦测的背景信号，而不需要将过量的我指示探针完全由样本中移除(洗 掉)。除了ISH或FISH试验之外，包括这里所描述的探索核酸碱基序 列的自我指示探针可特别应用于各式均相试验中，例如用于实时PCR 或是与自我指示装置(例如横向流动试验)或是自我指示数组一起应 用。

b.PNA探针组

本发明的探针组包括二种或是更多种PNA探针。于一个实施例中， 该组中的某些PNA探针可以是阻断探针。探针组可包含任何一群本发 明的探针的二种或是二种以上的探针，不论是标记或是未标记，且也 可包含没有特别于本文描述的探针，但其中包含至少一种本发明的探 针。对于侦测克雷伯氏菌种，优选的探针组包含 CAC-CTA-CAC-ACC-AGC(SEQ ID NO：2)与CAC-TTA-CCA-TCA-GCG(SEQ ID NO：3)；对于侦测无乳链球菌变异株，优选的探针组包含 ACA-CCA-AAC-CTC-AGC(SEQ ID NO：4)与ACA-CCA-AAC-ATC-AGC(SEQ ID NO：5)；对于侦测真菌，优选的探针组包含CCC-TAG-TCG-GCA-TAG(SEQ ID NO：6)与CCA-AGA-GAT-CCG-TTG(SEQ ID NO：7)；而对于侦测不动菌 属的种，优选的探针组包含CCT-CTC-ATC-GCA-TTA-C(SEQ ID NO：8)与 GCT-CAC-CAG-TAT-CG(SEQ ID NO：9)。

c.方法：

于本发明另一实施例中针对适于分析任选地出现于样本中的微生 物的方法。适于微生物分析的PNA探针的一般与特异特征已于先前描 述于本文中。优选的探索核酸碱基序列已列于表1中。

分析样本中微生物的方法包括将样本与一种或是一种以上适于与 特定目标物序列杂交的PNA探针接触。

根据该方法，于是侦测、识别和/或是计量样本中的微生物，或是 决定其对抗生素的抗性。这是通过关连化一个PNA探针的探索核酸碱 基序列于适当杂交条件下对样本中预计侦测其存在与否或是数目的微 生物的目标物序列的杂交而达成。典型地，该关联是通过直接或是间 接侦测该探针/目标物序列的杂交物达成。

萤光原位杂交与实时PCR：

本发明的PNA探针、方法、试剂盒与组合物对于快速以基于探针 为基础的微生物分析是特别有用的。于优选的实施例中，用于微生物 分析的试验形式为原位杂交或PCR。最佳地，试验形式为萤光原位杂交 (PNA FISH)或是实时PCR(Reviewed by Stender et al.J.Microbiol. Methods 48：1-17(2002))。优选的，用於PNA FISH分析的抹片于杂交 前不经过交联剂或是酶处理。

示范性试验形式：

实施PNA FISH的示范性方法可在以下找到：Oliveira et.，J.Clin. Microbiol 40：247-251(2002)、Rigby et al.，J.Clin.Microbiol. 40：2182-2186(2002)、Stender et al.，J.Clin.Microbiol. 37：2760-2765(1999)、Perry-O’Keefe et al.，J.Microbiol.Methods 47：281-292(2001)。根据一种方法，于显微镜的载玻片上制备一个样 本，例如但不限于阳性血液培养，的涂抹物，然后以溶于杂交缓冲液 中的萤光标记PNA探针液滴将其覆盖。将盖玻片放在抹片上以确保平 均覆盖，接着将载玻片放到载玻片加温器或是反应器中于55℃反应90 分钟。于杂交后，通过将载玻片埋浸到一个预先加温过的强力清洗溶 液中将盖玻片移除，并清洗载玻片30分钟。最后以一滴封片液覆盖一 个盖玻片封片该抹片，然后以萤光显微镜检验。

可通過多种仪器來决定能以本发明试剂盒所含PNA探针分析的任 选地出现在样本中的微生物，例如但不限于下列例子：显微镜(例如参 见Oliveira et al.，J.Clin.Microbiol 40：247-251(2002))、菲林 (例如参见Perry-O’Keefe et al.，J.Appl.Microbiol.90：180- 189)(2001)、像机与即影菲林(例如参见Stender et al.，J. Microbiol.Methods 42：245-253(2000))、光度计(例如参见Stender et al.，J.Microbiol.Methods.46：69-75(2001)、激光扫描装置(例 如参见Stender et al.，J.Microbiol.Methods.45：31-39(2001) 或是流式细胞仪(例如参见Wordon et al.，Appl.Environ.Microbiol. 66：284-289(2000))。全自动玻片扫瞄仪与流式细胞仪对于快速计量出 现于兴趣样本中的微生物特别有用。

使用自我报告PNA探针来实施实时PCR的示范性方法可于以下找 到：Fiandaca et al.，Abstract，nucleic Acid-Based technologies、 DNA/RNA/PNA Diagnostics，Washington，DC，May 14-16，2001，以 及Perry-O’Keefe et al.，Abstract，International Conference on Emerging Infectious Diseases，Atlanta，2002。

d.试剂盒：

于本发明又一实施例中针对适于实施一种试验的试剂盒，其分析 任选地出现于样本中的微生物。适于微生物分析的PNA探针的优选与 一般特征先前已描述于本文中。优选的探索核酸碱基序列为列于表1 中。再者，适合应用该PNA探针以分析样本中微生物的方法先前已描 述于本文中。

本发明的试剂盒包括一种或是一种以上的PNA探针与其他试剂或 是组合物，该其他试剂或是组合物是选用来实施一种试验或是用来简 化用以分析样本中微生物的试验的表现。

举例来说，该试剂盒可应用在原位试验中或是与核酸扩增技术一 起应用。核酸扩增技术的非限制性例子包含但不限于聚合酶链反应 (PCR)、连接酶链反应(LCR)、链替代扩增法(SDA)、转录介导的扩增法 (TMA)、Q beta复制酶扩增法(Q-beta)以及滚环式扩增(RCA)。因此， 于某些实施例中，该其他试剂可包括实施以原位或核酸扩增试验为基 础的缓冲液、酶和/或是主要混合物。

e.使用本发明的示范性应用：

本发明的PNA探针、方法与试剂盒对于临床样本的微生物分析特 别有用，例如尿液、血液、创伤、唾液、喉拭物(laryngeal swabs)、 胃灌洗液、支气管冲洗物、切片、吸出物(aspirates)、痰以及在食物、 饮料、水、医药产品、个人护理产品、日用品以及环境样本中者及它 们的培养物。

另外的侦测策略

虽然已描述以萤光素与tamra标记的探针，产生一种可察觉的第 三萤光的萤光标记的任何组合是落于本发明的概念中。同样地，应用 二种或是二种以上标记已产生多个可察觉颜色也是可想象的到的。潜 在萤光标记也都包含于本说明书中。已证实二种或是二种以上萤光部 分的符合萤光对于产生颜色光谱有用(Kool et al JACS 2003)。组合 颜色是通过二种或是二种以上萤光团「混合物」以及调整它们的比例 取得。举例来说，二部分的红色与一部分的绿色的组合产生不同于一 部分的红色与二部分的绿色所组合的颜色。虽然以肉眼正确分辨这些 变化浓淡有一定的限度，建构出一个装置来正确察觉这类维细变化并 不困难。

可侦测与独立可侦测部分/多重(multiplex)分析：可根据本发明 实施多重杂交试验。于多重试验中，可同时试验大量感兴趣的条件。 多重分析依赖其能够在试验中或是完成试验后将样本组份或是与它们 相关的资料分类。于本发明优选的实施例中，可使用一种或是一种以 上可区分的独立可侦测部分來标记二种或是二种以上应用于试验中的 不同的探针。能够于各独立可侦测部分间区分和/或是将其计量的能力 使得该方法能够多重分析杂交试验。各该可区分(独立)標記探針對特 定核酸序列的杂交的关联性对于样本中各待侦测生物出现与否与量具 有指示性。

因此，本发明的多重试验可在相同试验中用来同时侦测二种或是 二种以上于样本中的不同生物(例如克雷伯氏菌的不同种)的出现与否 与量。例如，多重试验可利用二种或是二种以上各自以一种或是一组 独立可侦测萤光团标记的PNA探针。

因此，本发明提供治疗患者的方法其于实例中包含至少一个或是 优选包含所有下列步骤：

a)从患者取得生物性样本

b决定微生物出现、量和/或是其身分；以及

c)投药至少一种具有朝排除感染的活性的抗生素。

本发明更提供PNA探针组，其包含至少一种本文所提供的PNA探 针，优选的为二种或是二种以上探针，其中该探针通过符合萤光产生 第三颜色。

根据本发明所描述的优选实施例，对熟习本领域技述者显然可以 应用其他结合本文所描述概念的实施例。有感于此，实施例不应该只 限制于所描述的那些实施例而是应该只限制于下列权利要求书的精神 与范围。

实施例

本发明现在以下列实施例说明，但并不意味以任何形式受限制。

实施例1

PNA探针序列

Kpn23S01-Flu  FIU-OO-CACCTACACACCAGC-NH2(SEQ ID NO：2)

Kox23S01-Tam  Tam-OO-CACTTACCATCAGCG-NH2(SEQ ID NO：3)

(注意：于此使用一般命名法说明PNA探针的端点；O＝8-氨基-3，6- 二氧杂辛酸；flu＝5(6)-羧基-荧光素；tam＝5(6)-羧基四甲基若丹 明)

细菌菌株

制备代表各式革兰氏阴性杆菌参考菌珠的隔夜培养(American Type Cultuere Collection，Manassas，VA)，该革兰氏阴性杆菌包含 克雷伯氏肺炎菌以及克雷伯氏菌菌种。

制备抹片

通过混合一滴培养物与一滴含有1％(v/v)Triton X-100磷酸盐缓 冲盐水，为各菌株制备涂附在直径为8mm培养井的涂有铁氟龙的载玻 片(AdvanDx，Woburn，MA)上的抹片。接着将该载玻片放在55℃的载玻 片加温器中20分钟，于该时间点，抹片呈干燥。接着，通过浸没于 96％(v/v)乙醇中5-10分钟，消毒该抹片，然后风干。

萤光原位杂交(FISH)

于抹片上覆盖一滴含有10％(w/v)硫酸葡聚醣、10mM NaCl、30％(v/v) 甲酰胺、0.1％(w/v)焦磷酸钠、0.2％(w/v)聚乙烯吡咯烷酮、0.2％(w/v) 菲可、5mM Na₂EDTA、1％(v/v)Triton X-100、pH 7.5的50mM Tris/HCl， 以及500nM Kpn23S01-Flu以及500nM Kox23S01-Tam探针的杂交溶液 (Flu为萤光染料，其产生特有的绿色萤光，Tam为萤光染料其产生特有 的红色萤光)。将盖玻面覆盖在抹片上以确保平均覆盖杂交溶液，然后 将载玻片放到载玻片加温器(Slidemoat，Boekel，Germany)于55℃反 应90分钟。于杂交后，通过将载玻片埋浸到每个载玻片约20ml预先加 温过的25mM Tris，pH 10、137mMNaCl与3mMKCl(于55℃水浴中) 中将盖玻片移除，并于清洗载玻片30分钟。最后各以一滴封片媒介 (AdvanDx，Woburn，MA)覆盖盖玻片封片该抹片，然后以配置 FITC/Texas Red双频滤光组的萤光显微镜检验。克雷伯氏肺炎菌经识 别为绿色萤光杆菌，而克雷伯氏菌经识别为红色萤光杆菌，结果纪录 于表2。

表2

 生物   结果  大肠杆菌   阴性  克雷伯氏肺炎菌   阳性/绿色  克雷伯氏菌   阳性/红色  绿脓杆菌(Pseudomonasa eruginosa)   阴性  毁花假单胞(Pseudomonas florescens)   阴性  门多萨假单胞菌(Pseudomonas mendocina)   阴性  类鼻疽假单胞菌(Pseudomonas mucidolens)   阴性  类产碱假单胞菌(Pseudomonas pseudoalcigenes)   阴性  恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)   阴性  紫丁香假单胞菌(Pseudomonas syringe)   阴性

参考表2，所测试10个革兰氏阴性杆菌菌种中只有2个有阳性结 果，克雷伯氏肺炎菌样本中含有绿色萤光杆菌，而克雷伯氏菌样本中 含有红色萤光杆菌。阳性结果证明所测试的该探针混合物分别对克雷 伯氏肺炎菌与克雷伯氏菌产生绿色与红色的菌种特异信号。

实施例2

PNA探针序列

Saga16S03-Flu Flu-OO-ACACCAAACCTCAGC(Seq.Id.No.4)

Saga16S04-Flu Flu-OO-ACACCAAACATCAGC(Seq.Id.No.5)

(注意：于此使用一般命名法说明PNA探针的端点；O＝8-氨基-3，6- 二氧杂辛酸；flu＝5(6)-羧基-荧光素)

细菌菌株

制备代表各式革兰氏阳性球菌参考菌珠的隔夜培养(American Type Cultuere Collection，Manassas，VA)，革兰氏阳性球菌包含无 乳链球菌。

制备抹片

如同实施例1所述制备抹片。

萤光原位杂交(FISH)

如同实施例1所述实施杂交，除了本例所使用的探针为500nM的 Saga16S03-Flu、500nM的Saga16S04-Flu或是Saga16S03-Flu与 Saga16S04-Flu的组合，两者都是500nM(双探针)。以配置FITC/Texas Red双频滤光组的萤光显微镜检验。无乳链球菌经识别为绿色萤光球 菌，结果纪录于表3。

表3

  生物   Saga16S03   Saga16S04   双探针   无乳链球菌   阳性/绿色   阴性   阳性/绿色   类马链球菌(Strep tococcus equisimilis)   阴性   阴性   阴性   化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)   阴性   阴性   阴性   耐久肠球菌(Enterococcus durans)   阴性   阴性   阴性   粪肠球菌(Enterococcus faecalis)   阴性   阴性   阴性   屎肠球菌(Enterococcus facium)   阴性   阴性   阴性   海氏肠球菌(Enterococcus hirae)   阴性   阴性   阴性

参考表3，不论是以Saga16S03探针或是双探针组侦测无乳链球菌 都产生阳性结果，其他结果都是阴性，这显示该探针/探针组具特异性。

实施例3

PNA探针序列

PF-Adx1  Flu-OO-CCCTAGTCGGCATAG(Seq.Id.No.6)

PF-Adx2  Flu-OO-CCAAGAGATCCGTTG(Seq.Id.No.7)

(注意：于此使用一般命名法说明PNA探针的端点；O＝8-氨基-3，6- 二氧杂辛酸；flu＝5(6)-羧基-荧光素)

细菌菌株

制备代表各式革兰氏阳性球菌参考菌珠的隔夜培养(American Type Cultuere Collection，Manassas，VA)，革兰氏阳性球菌包含无 乳链球菌。

制备抹片

如同实施例1所述制备抹片。

萤光原位杂交(FISH)

如同实施例1所述实施杂交，除了本例所使用的探针为500nM的 PF-Adx1或是500nM的PF-Adx2。以配置FITC/Texas Red双频滤光组 的萤光显微镜检验。真菌经识别为绿色萤光芽或是菌丝，结果纪录于 表4。

表4

  生物   PF-Adx1   PF-Adx2   白假丝酵母(Candida albicans)   阳性/绿色   阳性/绿色   链状假丝酵母(Candida catenulata)   阳性/绿色   阳性/绿色   光滑假丝酵母(Candida glabrata)   阳性/绿色   阴性   金黄色葡萄球菌(S.aureus)   阴性   阴性   大肠杆菌   阴性   阴性   酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)   阳性/绿色   阳性/绿色

参考表4，所有以PF-Adx1探针侦测的真菌生物，包括白假丝酵母、 链状假丝酵母、光滑假丝酵母及酿酒酵母都呈阳性。而所测试的二个 细菌菌种(金黄色葡萄球菌与大肠杆菌)都呈阴性。除了光滑假丝酵母 的测试呈阴性之外PF-Adx2探针产生与PF-Adx1的结果类似的模式，。 与已公开光滑假丝酵母的5.8S rRNA基因序列比对证实基因中存在一 个不匹的配碱基，这可能是导致阴性结果的原因。

实施例4

PNA探针序列

Eco23S277-Flu    Flu-OO-ACA-CAC-ACT-GAT-TCA(Seq.Id.No.1)

Abau23S-03b-Flu  Flu-OO-CCT-CTC-ATC-GCA-TTA-C(Seq.Id.No.8)

Abau16S-04c-Flu  Flu-OO-GCT-CAC-CAG-TAT-CG(Seq.Id.No.9)

(注意：于此使用一般命名法说明PNA探针的端点；O＝8-氨基-3，6- 二氧杂辛酸；flu＝5(6)-羧基-荧光素)

细菌菌株

制备代表各式细菌菌种的参考菌珠的隔夜培养(American Type Cultuere Collection，Manassas，VA)，所有的细菌菌种为革兰氏阴 性杆菌(杆菌(bacilli))。

制备抹片

如同实施例1所述制备抹片。

萤光原位杂交(FISH)

如同实施例1所述实施杂交，除了本例所使用的探针为500nM的 Eco23S277-Flu、200nM的Abau23S-03b-Flu或是200nM的 Abau16S-04c-Flu。以配置FITC/Texas Red双频滤光组的萤光显微镜 检验。绿色萤光杆菌(杆菌(bacilli))识别为阳性，结果纪录于表4。

表4

生物   Eco23S277   Abau16S-04c   Abau23S-03b 大肠杆菌(35218)   阳性/绿色   阴性   阴性 大肠杆菌(0157：H7)(43888)   阳性/绿色   未试验   未试验 乙酸钙不动杆菌(Acinetobacter calcoaceticus)(14987)   阴性   阳性/绿色   阳性/绿色 鲍氏不动杆菌(Acinetobacter baumannii)(19606)   未试验   阳性/绿色   阳性/绿色 绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)(10145)   阴性   阴性   阴性 克雷伯氏肺炎菌(10031)   阴性   阴性   阴性 克雷伯氏菌(43086)   阴性   阴性   阴性

参考表4，以Eco23S277-Flu探针侦测大肠杆菌的菌株号都呈阳 性、以Abau23S-03b-Flu与Abau23S-03b-Flu探针侦测不动杆菌菌种， 这二者都呈阳性。，其他结果都是阴性，这显示该探针/探针组具特异 性。

均等物

当本发明已经以参考最优选实施例的方式特地显示或是描述后， 应理解对熟习本领域技术人员来说，其可于其中作出形式或是细部的 各式变化，而不会偏离本发明如同随附的权利要求书所定义的精神与 范围。那些熟习本领域技术人员将能够不超过常规实验而确认本发明 于此描述的特定实施例的许多均等物。预期这样的均等物应包含在权 利要求书的范围内。

所有于本文所提及的参考文件都并入本文参考。

序列表

<110>ADVANDX.INC.

<120>用于微生物分析的肽核酸探针

<130>63540WO(48497)

<140>PCT/US06/021614

<141>2006-06-21

<150>60/687,178

<151>2005-06-02

<150>60/704,552

<151>2005-08-01

<160>9

<170>专利第3.3版

<210>1

<211>15

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>对于人工序列的描述：合成探针

<400>1

acacacactg attca

<210>2

<211>15

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>对于人工序列的描述：合成探针

<400>2

cacctacaca ccagc

<210>3

<211>15

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>对于人工序列的描述：合成探针

<400>3

cacttaccat cagcg

<210>4

<211>15

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>对于人工序列的描述：合成探针

<400>4

acaccaaacc tcagc

<210>5

<211>15

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>对于人工序列的描述：合成探针

<400>5

acaccaaaca tcagc

<210>6

<211>15

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>对于人工序列的描述：合成探针

<400>6

ccctagtcgg catag

<210>7

<211>15

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>对于人工序列的描述：合成探针

<400>7

ccaagagatc cgttg

<210>8

<211>16

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>对于人工序列的描述：合成探针

<400>8

cctctcatcg cattac

<210>9

<211>14

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>对于人工序列的描述：合成探针

<400>9

gctcaccagt atcg