一种在杆状病毒—昆虫表达系统生产德国小蠊过敏原BgGSTD1蛋白的方法

摘要

本发明公开了一种在杆状病毒-昆虫表达系统生产德国小蠊过敏原BgGSTD1蛋白的方法：从德国小蠊组织提取总RNA，反转录为cDNA，通过PCR方法获得德国小蠊过敏原BgGSTD1编码基因；将该编码基因克隆到杆状病毒载体中，转化昆虫细胞以表达；采用亲和层析方法进行纯化，从而到德国小蠊过敏原BgGSTD1蛋白。本发明方法通过杆状病毒-昆虫表达系统生产德国小蠊过敏原BgGSTD1蛋白，从而避免在不同的表达系统中(例如细菌和酵母菌)对BgGSTD1过敏原结构造成影响的问题，并提供一种亲和层析的方法，解决天然BgGSTD1过敏原纯化工艺复杂的问题。

说明书

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种在杆状病毒-昆虫表达系统生产德国小蠊过敏原BgGSTD1蛋白的方法。

背景技术

过敏性疾病是人类重大疾病之一。其发病率目前估计约占世界人口的30～40％，而且正以每年大于1％的速度增加，以儿童患者的发病率上升最为明显。在过去几十年，过敏性疾病的发生率在全球有显著和迅速的增加，西方国家比发展中国家多，城市比农村地区多。以过敏性哮喘(哮喘)为例，英国现有520万哮喘病人：110万儿童(占儿童总人口的1/10)和410万成人(占成人总人口的1/12)，平均每年有1400人死于哮喘。根据美国健康调查统计报告，2002美国约有3800万病人：2190万成人，890万0～17岁的儿童。2004年世界哮喘日会议报告指出在过去的20年内，哮喘的发病率在亚太地区一些国家上升了近5倍，值得关注。我国近年来对全国的大规模调查显示，儿童哮喘发病率比10年前明显增加，仅小儿哮喘患者达1000万之多，其中过敏为主要诱因(全国哮喘儿童防治协作组2003)。此外，与癌症和心脑血管疾病不同，哮喘对人类社会和经济的影响是不能简单地以其死亡率来衡量的，而要从这种疾病的发作频度来衡量其给人类造成的经济负担。由于哮喘多发生在年轻人群，其对人类社会和经济的影响就更严重。世界卫生组织认为：哮喘造成的社会负担超过艾滋病与肺结核的总和，以英国为例就超过了年88.9亿英镑。目前治疗过敏性疾病的方法主要体现在减轻症状。患者经常服用一些抗组胺类以及类固醇药物以缓解症状，然后这些药物并不能抑制IgE抗体的产生并经常带来副作用。近年来特异性免疫治疗(脱敏治疗)在过敏性疾病中的作用得到了肯定，被认为是当前过敏性疾病唯一的对因治疗方法。该疗法是在确定患者的过敏原后，对患者给予由低到高剂量的过敏原治疗。通过反复给药诱导其对此过敏原的耐受性，当再次接触此类过敏原时就不产生或减轻过敏反应。然而，用于治疗的过敏反应提取物是从天然来源分离得到的蛋白质和非蛋白质成分的粗混合物，这些资源或者含有大量与过敏原无关的成分，或者几乎不含有造成患者高敏感性的过敏原。在最近几年，随着杂交瘤技术的进展，可以利用基于单克隆抗体的免疫试验对主要过敏原含量进行鉴定，由此导致了在过敏反应提取物的标准化方面取得了重要进展，所有对一种特定的过敏反应提取物敏感的患者都继续接受含全部提取物成分的相同的复杂混合物的治疗，但是这有可能导致副作用的产生，这个副作用主要是由于对提取物中所有蛋白质成分具有抗性的另外的Ig E抗体所引起。就过敏诊断而言，这种使用整个过敏反应提取物来进行皮肤测试的方法妨碍了导致患者敏感的特殊过敏原的检测。针对这些缺点，许多研究人员采用生物化学分离和纯化技术的方法得到单独的过敏原。然而，尽管这个方法对于过敏原的鉴定可能有效，但却不足以制备工业规模上的过敏原。因为这个过程极其耗费人力，并且从昂贵的自然资源中纯化出过敏原产量通常情况下都很低。基于这些原因，用于合成过敏原蛋白质的重组DNA技术引起了人们的注意。利用可生长在大发酵罐的微生物表达系统可以大规模获得重组过敏原。因此，这些技术使得重组过敏原以一致纯度大量生产。除此以外，使用重组DNA技术可以表达抗原表位片断或修饰的过敏原以方便应用于过敏性疾病的诊断或处理。早在上世纪60年代，就有蟑螂引起哮喘的报道。但直到近年来，蟑螂在哮喘发病中的作用才逐渐受到人们的关注。资料显示，美国哮喘患者中蟑螂过敏的发生率达到27.5～42％，欧洲为3.9～24.5％，非洲为30～44.6％，在我国，北京、上海等大城市中儿童哮喘患者的蟑螂过敏率也高达27.8～43.8％。哮喘发病率的不断升高，在很大程度上与蟑螂污染加剧有关，蟑螂已经成为仅次于尘螨的第二大过敏源。目前常见的美洲大蠊和德国小蠊过敏原已经被鉴定出来，包括3种美洲大蠊过敏原和7种德国小蠊过敏原被鉴定出来。这使得运用DNA重组技术生产蟑螂过敏原用于蟑螂过敏诊断和治疗成为可能。德国小蠊的delta型谷胱甘肽转移酶，简称BgGSTD1为德国小蠊主要过敏原。它是一种肌球蛋白，也是一种泛过敏原。约有30％的蟑螂过敏病人对BgGSTD1阳性。目前该过敏原只是在大肠杆菌中被表达，但是没有在杆状病毒-昆虫系统中表达的报道。杆状病毒-昆虫细胞表达系统其表达产物的生物学特性与天然产物相似，具有可糖基化、磷酸化、酰胺化、信号肽和蛋白切割等后加工修饰功能，而且具有很高的克隆容量，表达产量高，细胞培养简单，适合大规模生产等优点，现已被广泛的用于各种外源基因的表达。杆状病毒具有高度的种属特异性，不感染脊椎动物，相对于其他病毒载体，如腺病毒、痘病毒等载体而言，其安全性好。BgGSTD1是来源于昆虫(蟑螂)的蛋白，在昆虫细胞中表达能保证表达产物具有活性，蛋白质表达后修饰加工，信号肽的切除及磷酸化、糖基化等反应，抗原性、免疫原性均与天然蛋白相似。因此是非常好的生产昆虫过敏原的方法。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种在杆状病毒-昆虫表达系统生产德国小蠊过敏原BgGSTD1蛋白的方法。

未解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：

一种在杆状病毒-昆虫表达系统生产德国小蠊过敏原BgGSTD1蛋白的方法，包括如下步骤：

(1)从德国小蠊组织提取总RNA，反转录为cDNA，通过PCR方法获得德国小蠊过敏原BgGSTD1编码基因；

(2)将该编码基因克隆到杆状病毒载体中，转化昆虫细胞以表达BgGSTD1蛋白；

(3)采用亲和层析方法对BgGSTD1蛋白进行纯化，从而到德国小蠊过敏原BgGSTD1蛋白。

步骤(1)中，所述的BgGSTD1编码基因如SEQ ID No：1所示。

步骤(1)中，所述的BgGSTD1编码基因，其所编码的氨基酸序列如SEQ ID No：2所示。与国外来源的德国小蠊过敏原BgGSTD1有一个位点氨基酸差异，第6位为150位点是Glu而不是国外的Arg。

步骤(2)中，所述的杆状病毒载体为pFastBacHTA。

步骤(2)中，所述的昆虫细胞为sf-9细胞。

步骤(3)中，所述的亲和层析方法为Nickel亲和层析法。所述的Nickel亲和层析具体包括如下步骤：P0病毒以感染复数为1感染500mL sf9细胞，其细胞密度为2×10⁶/ml，到细胞出现肿胀的时候收集细胞，超声裂解细胞，离心得到上清，上Nickel亲和柱，用20mM Tris-HCl洗去非特异性结合蛋白，该Tris-HCl含有300mM NaCl和5％(v/v)甘油，之后改用20mM Tris-HCl洗脱，该Tris-HCl含有300mM NaCl、250mM咪唑和5％(v/v)甘油，洗脱下的蛋白即为BgGSTD1蛋白。

有益效果：本发明方法通过杆状病毒-昆虫表达系统生产德国小蠊过敏原BgGSTD1蛋白，从而避免在不同的表达系统中(例如细菌和酵母菌)对BgGSTD1过敏原结构造成影响的问题，并提供一种亲和层析的方法，解决天然BgGSTD1过敏原纯化工艺复杂的问题。

附图说明

图1为重组Bacmid的PCR鉴定。其中1、2为鉴定阳性的重组Bacmid。

图2为重组Bacmid诱导表达及其纯化的SDS-PAGE图谱。其中1.重组质粒感染的sf-9全细胞裂解物；2.上清上Nickel柱后穿透峰；3.用20mM Tris-HCl(含有300mMNaCl，5％甘油，pH8.0)洗下的蛋白；4.用20mM Tris-HCl(含有300mM NaCl 5％甘油，20mM咪唑，pH8.0)洗脱后的蛋白；5-8.用20mM Tris-HCl(含有300mM NaCl 5％甘油，250mM咪唑，pH8.0)洗脱下的蛋白。

图3为纯化后的蛋白(BgGSTD1)免疫印迹(Western blot)鉴定图。

图4为纯化后的蛋白(BgGSTD1)电泳图。其中，1.用20mM Tris-HCl(含有300mM NaCl，5％甘油，250mM咪唑，pH8.0)洗脱下的蛋白；2在20mM Tris-HCl(含有300mM NaCl，5％甘油)中透析后的蛋白。

具体实施方式：

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。

实施例1：德国小蠊总RNA的提取。

取人工饲养的冻存德国小蠊(来自江苏省疾病控制中心)，液氮研磨，按照100mg/mLTrizol试剂加入Trizol试剂。提取德国小蠊总RNA。

实施例2：PCR扩增出德国小蠊过敏原BgGSTD1的基因并克隆。

将提取出来的总RNA反转录为cDNA。根据已发表的德国小蠊过敏原BgGSTD1基因序列设计引物5’-ATGACCATTGATTTCTATTAC-3’和5’-TCATTTTTGCGTGAGATTATC-3’，用PCR方法(94℃预变性10分钟后，94℃30秒，50℃45秒，72℃1分钟共35个循环)扩增出BgGSTD1基因，并克隆到pMD18-T载体中，转化到大肠杆菌JM109感受态细胞中。涂板过夜培养。筛选阳性菌，抽提质粒PCR和测序鉴定。得到德国小蠊过敏原BgGSTD1基因，其核苷酸序列如SEQ ID No：1所示。

实施例3：德国小蠊过敏原BgGSTD1杆状病毒载体pFastBacHTA的构建。

将得到的BgGSTD1基因通过EcoR I and Sal I酶切位点克隆到质粒pFastBacHTA中，转化感受态JM109。筛选出阳性克隆。

实施例4：重组杆状病毒质粒(Bacmid)的构建及其PCR鉴定。

以含有BgGSTD1基因的pFastBacHTA质粒转化感受态DH10Bac，在DH10Bac菌内质粒助手的帮助下，BgGSTD1基因可转座到含杆状病毒基因组的Bacmid大质粒上。得到重组Bacmid。抽提重组Bacmid，PCR鉴定。结果见图1。

实施例5：重组Bacmid的转化到昆虫细胞Sf9。

将PCR鉴定阳性的重组Bacmid，用Cellfectin试剂盒转染昆虫细胞Sf9。在HyQ液体培养基中27℃培养7天后。收集上清得到P0病毒。对上清及细胞进行表达鉴定。用His单抗做western blot，发现在35～50kDa之间有反应条带，表明BgGSTD1蛋白被诱导表达(图2)。

实施例6：P1病毒扩增。

P0病毒以感染复数0.1感染100mL sf9细胞(2×10⁶/ml)，4天收集上清得到P1病毒(4dpi)。

实施例7：大规模感染和纯化

P0病毒以感染复数为1感染500mL sf9细胞(2×10⁶/ml)，到细胞出现肿胀的时候收集细胞。超声裂解细胞离心得到上清。上Nickel亲和柱，用20mM Tris-HCl(含有300mM NaCl，5％甘油)洗去非特异性结合蛋白后，改用20mM Tris-HCl(含有300mMNaCl，250mM咪唑，5％甘油)洗脱，洗脱下的蛋白即为BgGSTD1蛋白。

SEQUENCE LISTING

<110>江苏省人民医院

<120>一种在杆状病毒-昆虫表达系统生产德国小蠊过敏原BgGSTD1蛋白的方法

<130>JPH090301

<160>4

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>648

<212>DNA

<213>德国小蠊(German cockroach)

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(648)

<400>1

acc att gat ttc tat tac ttg ccc ggc agt gct cca tgc cgc tca gtc    48

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1                   5               10                  15

ctg ctg gca gct aaa gct ttt ggg gtt gat cta aac ctc aaa gtg act    96

Leu Leu Ala Ala Lys Ala Phe Gly Val Asp Leu Asn Leu Lys Val Thr

                20              25                  30

aac ctg atg gct gga gaa cat ctc aca cca gaa ttt ttg aaa atg aat    144

Asn Leu Met Ala Gly Glu His Leu Thr Pro Glu Phe Leu Lys Met Asn

            35              40                  45

cct caa cat aca att cct aca ctg aat gat aat ggc ttt tgc ctc tgg    192

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        50              55                  60

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Glu Ser Arg Ala Ile Leu Ser Tyr Leu Ala Asp Gln Tyr Gly Lys Asp

    65              70                  75                  80

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Asp Ser Leu Tyr Pro Lys Asp Pro Lys Lys Arg Ala Leu Val Asp Gln

                85                  90                  95

aga ttg tat ttt gac ttg gga act ctg tac cag aga ttt ggt gat tat    336

Arg Leu Tyr Phe Asp Leu Gly Thr Leu Tyr Gln Arg Phe Gly Asp Tyr

            100                 105                 110

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        115                 120                 125

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Lys Lys Leu Glu Glu Ala Tyr Gln Phe Leu Asp Glu Phe Leu Glu Gly

    130                 135                 140

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Gln Lys Phe Val Ala Gly Asn Ser Leu Thr Ile Ala Asp Ile Ala Thr

145                 150                 155                 160

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Tyr Pro Asn Val Asn Lys Trp Phe Glu Asn Ala Lys Lys Val Ile Pro

            180                 185                 190

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Gly Tyr Asp Glu Leu Asn His Ser Gly Cys Leu Glu Phe Lys Lys Met

        195                 200                 205

tgg gat aat ctc acg caa aaa tga                                    648

Trp Asp Asn Leu Thr Gln Lys

    210                 215

<210>2

<211>215

<212>PRT

<213>德国小蠊(German cockroach)

<400>2

Thr Ile Asp Phe Tyr Tyr Leu Pro Gly Ser Ala Pro Cys Arg Ser Val

1               5                   10                  15

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            20                  25                  30

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    50                  55                  60

Glu Ser Arg Ala Ile Leu Ser Tyr Leu Ala Asp Gln Tyr Gly Lys Asp

65                  70                  75                  80

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            100                 105                 110

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        115                 120                 125

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145                 150                 155                 160

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                165                 170                 175

Tyr Pro Asn Val Asn Lys Trp Phe Glu Asn Ala Lys Lys Val Ile Pro

            180                 185                 190

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         195                 200                 205

Trp Asp Asn Leu Thr Gln Lys

    210                 215

<210>3

<211>21

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>根据已发表的德国小蠊过敏原BgGSTD1基因序列设计引物

<400>3

atgaccattg atttctatta c    21

<210>4

<211>21

<212>DNA

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<220>

<223>根据已发表的德国小蠊过敏原BgGSTD1基因序列设计引物

<400>4

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