用细胞工程培养的泛生墙藓原丝体制备的动物拒食剂

摘要

本发明涉及一种用细胞工程培养的泛生墙藓原丝体制备的动物拒食剂，属生物技术领域。本发明的动物拒食剂经以下工序得到：由细胞工程方法繁殖得到的泛生墙藓原丝体用0.5倍体积的90％乙醇研磨，再加入10－100倍体积的75％乙醇，在50℃温度下密闭提取4－8小时，再在35－50℃温度下用旋转蒸发仪去除乙醇及水，至最后20min回收溶剂体积不会变化时，即获得动物拒食的浓缩胶状粗提物；收集的原丝体也能在80℃烘干后保存，待需要使用时，将烘干的原丝体在50℃温度下，先用1－2倍体积的75％乙醇浸泡1－2小时后研磨，随后加入10－100倍体积的75％乙醇，其余步骤同鲜活原丝体。本发明具有制备方法简便、环保、动物拒食效果佳的优点。

说明书

技术领域：

本发明涉及一种用细胞工程培养的泛生墙藓原丝体制备的动物拒食剂，属生物技术领域。

背景技术：

在植物界，苔藓植物是由一类水生生活转为陆生生活过渡型的植物类群，是地球上陆生植物中最古老的种群之一。目前地球上包括南极在内除5000米以上高山及海洋外，在不同的生态系统中均有苔藓植物的足迹。苔藓植物隶属于高等植物中的孢子植物，全世界约有23000种，种数仅次于被子植物，是植物界中的一个重要门类。

由于苔藓植物分布广，生境多样化以及对恶劣环境的特殊适应机制，多数的苔藓植物能产生特别丰富的次生代谢物质，如单萜和倍半萜类化合物等。苔藓植物被认为是生物活性物质的源泉。在民间，苔藓植物被广泛用于治疗创伤、烧伤、感染、肺结核、神经衰弱、惊厥、烫伤和肺炎等症。

另外，几乎所有的苔藓植物都不被各种动物所采食，也不被细菌、真菌或病毒所感染，所有这些都表明苔藓中存在着一些活性物质作为自身保护剂，来抵御外界的有害刺激，例如，德国农场主曾用田边采集到的苔藓用水匀浆后喷洒在卷心菜上防止虫害；娄红祥等发现苔藓的某些成分可以有效抵抗HIV病毒等。由于苔藓植物含有多种类型化合物，而且许多化合物表现出良好的生物活性，因此苔藓植物有可能成为前景广阔的农用、药用植物资源，造福人类。然而，苔藓植物形体小，混杂丛生，种间不易区别和分离，单独一种苔藓的人工培养繁殖还没有成熟体系，某些种类采集足够量的样品又比较困难，导致了苔藓植物相关产品的研究开发面临原料困境。植物的组织培养技术恰恰可以解决这一难题，利用快速繁殖技术，能在相对较短的时间内，获得大量单一种类的纯净的材料，即能用于研究，又能为利用苔藓制备各种活性制剂提供大量原材料。

参考文献：

[1]Stefan A.Rensing，Daniel Lang，Andreas D.Zimmer，et al.The Physcomitrella Genome RevealsEvolutionary Insights into the Conquest of Land by Plants[J].Science，2008，319(5859)：64-69.

[2]D.Cove，M.Bezanilla，P.Harries，et al.Mosses as model systems for the study of metabolism anddevelopment[J].Annu Rev Plant Biol，2006，57：497-520.

[3]吴鹏程，苔藓植物生物学[M].北京：科学出版社，1998.

[4]吴鹏程，贾渝。中国苔藓植物的地理分区及分布类型[J].植物资源与环境学报，2006(01)：1-8.

[5]胡人亮，苔藓植物学[M].北京：高等教育出版社，1987.

[6]Becker H.Zinsmeister H.D.，Eicher T.BryoPhytes，a souree of biologically active，naturally occurringmaterial？[J].AngewChemintEdit，1991，30:130-147.

[7]Y.Asakawa，Recent advances in phytochemistry of bryophytes-acetogenins，terpenoids and bis(bibenzyl)from selected Japanese，Taiwanese，New Zealand，Argentinean and European liverworts[M].New York：Phytochemistry，2001.

[8]Asakawa Y.Chemosystematics of the Hepaticae[J].Phytochemistry，2004，65(6)：623-669.

[9]王小宁，娄红祥。苔藓植物生物活性成分研究进展[J].中草药，2005(02)：303-307.

[10]吴玉环，程国栋，高谦。苔藓植物的生态功能及在植被恢复与重建中的作用[J].20，2003，3:215-220.

[11]王世冬，白学良，雍世鹏。沙坡头地区苔藓植物区系初步研究[J].中国沙漠植物，2001，21(3):244-249.

[12]Erikson M，Miksche G.E.On the occurrence of lignin or polyphenols in some mosses andliverworts.[J].Phytochemistry，1974，13：2295-2299.

[13]白学良，王瑶，徐杰，et al.沙坡头地区固定沙丘结皮层藓类植物的繁殖和生长特性研究[J].中国沙漠，2003，23(2):171-176.

发明内容：

本发明的目的在于将通过细胞工程的方法获得大量发育程度一致的泛生墙藓原丝体，并将其用作原料，用乙醇提取粗提物制备动物拒食制剂。

本发明是这样实现的：

一、泛生墙藓原丝体的获得和大量繁殖

1、泛生墙藓成熟孢子的无菌萌发获得初生原丝体

泛生墙藓成熟孢子的无菌初生原丝体的获得经由成熟孢子的灭菌、固体培养基上的萌发得到，具体步骤如下：

(1)成熟孢子的灭菌：

挑选泛生墙藓成熟饱满的孢蒴，从孢蒴以下1—2cm，蒴柄中间部分剪断，用清水洗净孢蒴表面，然后用体积浓度75％的酒精浸泡孢蒴，预消毒组织表面0.5-1分钟；而后用含1.0g/L的氯化汞和1.0％餐洗剂的溶液对孢蒴表面进行消毒，处理时间为3-5分钟；再用灭菌水反复浸泡清洗孢蒴4次，洗净材料孢蒴表面的氯化汞和洗涤剂残留；然后用无菌镊子固定蒴柄，以无菌眼科剪刀横向切断孢蒴顶部，暴露出内部的孢子，用镊子挤出孢子到盛有无菌水的离心管中，使孢子分散悬浮起来；将盛有孢子的离心管密封好，在40℃的水浴中刺激40-50秒；

(2)固体培养基上的萌发：

在无菌条件下，取密度为10⁴-10⁶/ml的孢子，接种到改良的MS培养基(添加了2，4-二氯苯氧基乙酸(2，4-Dichlorophenoxyacetic acid，简称2，4-D)2-5mg/L，硅酸钠2.0g/L，蔗糖2.0％、pH5.8的MS培养基)中。培养温度为25℃±3℃，光照度为4000lx。10-20天之后就可以获得由孢子萌发的初生原丝体。

2、原丝体的大量繁殖及收集

原丝体的大量繁殖及收集由摇瓶培养或发酵罐通气培养后经离心或过滤工序得到，具体如下：

(1)原丝体的大量繁殖

用镊子轻轻夹取体积为10-1000mm³的萌发原丝体，接种到添加了2，4-D2-5mg/L，硅酸钠2.0g/L，蔗糖2.0％、pH5.8的MS液体培养基的体积为50-1000ml三角瓶中，每个三角瓶中加入的培养液为三角瓶容积的1/3-1/2，120rpm摇床培养7-10天，环境温度控制在25±3℃，光源为漫射光；随后用相同的培养基和控制条件进行转瓶培养7-15后获得大量原丝体。如需要更大的量，则在无菌条件下，将培养得到的原丝体连同培养液倒入玻璃发酵罐中，加入3—10倍体积的新鲜培养液，底部通入无菌空气(200L/小时)，使得培养液中的原丝体不断翻腾，以发酵罐底部无永久沉积的原丝体为标准，培养7—15天后，停止进气，待原丝体沉入罐底后，用蠕动泵在无菌条件下缓慢将处于罐体上部的培养液抽出2/3，再加入新鲜无菌培养液至原初体积的5倍，继续重复扩大培养，如此可反复至罐体最大容积为止，即能获得更大量的原丝体。

(2)原丝体的收集

将培养瓶中的全部混悬液倒入离心管中，在800rpm/min(转/分)离心2分钟，

弃去上清液，回收得到原丝体；发酵罐中的大量原丝体可以用4—8层纱布过滤收

集获得。

二、动物拒食制剂的制备

动物拒食制剂经乙醇提取工序得到。具体如下：

1.收集的原丝体用0.5倍体积的90％乙醇研磨，再加入10-100倍体积的75％乙醇，在50℃温度下密闭提取4-8小时，再在35-50℃温度下用旋转蒸发仪去除乙醇及水，至最后20min回收溶剂体积不会变化时，获得动物拒食的浓缩胶状粗提物；

2.收集的原丝体也能用80℃烘干后保存，待需要使用时，将烘干的原丝体在50℃温度下，先用1-2倍体积的75％乙醇浸泡1-2小时，然后研磨，其余步骤同鲜活原丝体。

本发明具有制备方法简便、环保、动物拒食效果佳的优点。

具体实施方式：

以下是本发明的实施例，但本发明的内容并不局限于此。实施例中的高抗紫外线细胞克隆按照发明内容部分所述的方法获得。

实施例1：

1、泛生墙藓成熟孢子的无菌萌发获得初生原丝体

泛生墙藓成熟孢子的无菌初生原丝体的获得经由成熟孢子的灭菌、固体培养基上的萌发得到，具体步骤如下：

(1)成熟孢子的灭菌：挑选泛生墙藓成熟饱满的孢蒴，从孢蒴以下1cm，蒴柄中间部分剪断，用清水洗净孢蒴表面，然后用体积浓度75％的酒精浸泡孢蒴，预消毒组织表面0.5分钟；而后用浓度为1.0g/L的氯化汞和1.0％餐洗剂的溶液对材料孢蒴表面进行消毒，处理时间为3分钟；再用灭菌水反复浸泡清洗孢蒴4次，洗净材料孢蒴表面的氯化汞和洗涤剂残留；然后用无菌镊子固定蒴柄，以无菌眼科剪刀横向切断孢蒴顶部，暴露出内部的孢子，用镊子挤出孢子到盛有无菌水的离心管中，使孢子分散悬浮起来；将盛有孢子的离心管密封好，在40℃的水浴中刺激40秒；

(2)固体培养基上的萌发：在无菌条件下，取密度10⁴/ml的孢子，接种到添加了2，4-二氯苯氧基乙酸2mg/L，硅酸钠2.0g/L，蔗糖2.0％、pH5.8的MS培养基中，培养温度为25±3℃，光照度为4000lx，10天后获得由孢子萌发的初生原生体。

2.原丝体的大量繁殖及收集

用镊子轻轻夹取体积为10mm³萌发的原丝体，接种到添加了2，4-D2mg/L，硅酸钠2.0g/L，蔗糖2.0％、pH5.8的MS液体培养基的体积为50ml三角瓶中，每个三角瓶中加入的培养液为三角瓶容积的1/3，120rpm摇床培养7天，环境温度控制在25±3℃，光源为漫射光；随后用相同的培养基和控制条件将得到的原丝体转入大瓶中培养，7后获得大量原丝体，随后将培养瓶中的全部混悬液倒入离心管中，800rpm/min(转/分)离心2分钟，弃去上清液，即能回收得到原丝体。

3、动物拒食制剂的制备

收集的原丝体用0.5倍体积的90％乙醇研磨，再加入20倍体积的75％乙醇，在50℃温度下密闭提取5小时，再在45℃温度下用旋转蒸发仪去除乙醇及水，至最后20min回收溶剂体积不会变化时，即获得胶状粗提物。

在防止烟青虫和蚜虫危害烟叶试验中，将上述胶状物用蒸馏水稀释2000倍后，加入0.1％的表面活性剂，如十二烷基璜酸钠后均匀喷洒在烟叶表面，即能达到驱赶烟青虫和蚜虫的作用。

实施例2：

基本同实施例1，不同之处在于：

1.泛生墙藓成熟孢子的无菌萌发获得初生原丝体时，75％的酒精预消毒时间为1分钟，氯化汞消毒5分钟，水浴刺激时间为50秒，固体培养基上的萌发时，孢子密度为10⁶/ml，2，4-D浓度为5mg/L。

2.原丝体的大量繁殖及收集中：

用镊子轻轻夹取体积为200mm³原丝体，接种到添加了2，4-D 5mg/L，硅酸钠2.0g/L，蔗糖2.0％、pH5.8的MS液体培养基的体积为500ml三角瓶中，每个三角瓶中加入的培养液为三角瓶容积的1/3，120rpm摇床培养7天，环境温度控制在24℃，光源为漫射光；随后用相同的培养基和控制条件进行转瓶培养，12天后获得大量原丝体。

这些培养瓶中的原丝体全部用于转瓶扩大繁殖，在无菌条件下，将500ml三角培养瓶中的原丝体及其培养液全部倒入玻璃发酵罐，加入1000ml新鲜培养液，底部通入无菌空气200L/小时，使得培养液中的原丝体不断翻腾，培养15天后，停止进气，待原丝体沉入罐底后，用蠕动泵在无菌条件下缓慢将处于罐体上部的培养液抽出2/3，再加入新鲜无菌培养液2500ml，继续重复扩大培养，15天后重复上述步骤，加入新鲜无菌培养液至罐体最大有效容积10L为止，培养8天后将全部罐内物体全部倒出，用纯6层纱布过滤清洗后得到大量的原丝体，

3、动物拒食制剂的制备

收集的原丝体用0.5倍体积的90％乙醇研磨，再加入20倍体积的75％乙醇，在50℃温度下密闭提取5小时，再在45℃温度下用旋转蒸发仪去除乙醇及水，至最后20min回收溶剂体积不会变化时，即获得胶状粗提物。

在防止蜗牛啃食卷心菜的试验中，将上述胶状物用蒸馏水稀释1200倍后，加入0.1％的表面活性剂，如十二烷基璜酸钠后均匀喷洒在卷心菜表面，即达到防止蜗牛啃食的作用。

实施例3：

基本同实施例1，不同之处在于：

1.成熟孢子的灭菌时，75％的酒精浸泡孢蒴，预消毒组织表面1.5分钟，氯化汞消毒3分钟，水浴刺激时间为45秒。

2.固体培养基上的萌发时，孢子密度为10⁵/ml，2，4-D浓度为3mg/L。

3.原丝体的大量繁殖及收集中：

用镊子轻轻夹取体积为1000mm³原丝体，接种到添加了2，4-D3mg/L，硅酸钠2.0g/L，蔗糖2.0％、pH5.8的MS液体培养基的体积为1000ml三角瓶中，每个三角瓶中加入的培养液为三角瓶容积的1/3，120rpm摇床培养7天，环境温度控制在24℃，光源为漫射光；随后用相同的培养基和控制条件进行转瓶培养，12天后获得大量原丝体。

4、动物拒食制剂的制备中：5个1000ml培养瓶中回收干燥后的原丝体先用2倍体积的75％乙醇浸泡1小时，然后研磨，再加入20倍体积的75％乙醇，在45℃温度下密闭提取5小时，再在50℃温度下用旋转蒸发仪去除乙醇及水，至最后20min回收溶剂体积不会变化时，即获得胶状粗提物。

在防止蜗牛啃食烟叶的试验中，将上述胶状物用蒸馏水稀释1000倍后，加入0.1％的表面活性剂，如十二烷基璜酸钠后均匀喷洒在菜叶表面，即达到防止蜗牛啃食的作用。