用于integrinαvβ3阳性肿瘤的RGD多肽放射性药物及其制备方法

摘要

本发明涉及一种用于integrin αvβ3阳性肿瘤的RGD多肽放射性药物，包括RGD多肽、双功能螯合剂(Chelator)和放射性核素(Nuclide)，所述RGD多肽为RGD环肽二聚体，所述RGD环肽二聚体是将连接剂L与RGD多肽单体c(RGDfK)连接，再将两个连接有连接剂L的RGD多肽单体L－c(RGDfK)二聚化而合成的RGD环肽二聚体E[L－c(RGDxK)]2；所述放射性核素通过一个双功能螯合剂标记所述RGD环肽二聚体，所述RGD环肽二聚体与所述双功能螯合剂之间还连接有药代动力学修饰分子PKM，所述RGD多肽放射性药物为Nuclide－Chelator－PKM－E[L－c(RGDxK)]2；所述RGD多肽放射性药物为无色透明液体针剂。

说明书

技术领域

本发明涉及肿瘤诊断及治疗的放射性药物，特别涉及用于integrin α_vβ₃阳性肿瘤的RGD多肽放射性药物及其制备方法。

背景技术

肿瘤生长过程中关键的一环是肿瘤血管生成。没有新的血管生成肿瘤在长到几个厘米大小之后便不能再继续生长。肿瘤血管生成被各种蛋白分子调控，其中包括integrin α_vβ₃。integrin α_vβ₃是一种细胞外基质受体，它是由α和β两个亚基组成的异源二聚体跨膜糖蛋白。integrinα_vβ₃是整合素家族重要的组成成员，作为与新生血管相关的分子标志物之一，它高表达在新生血管内皮细胞表面和某些肿瘤细胞表面(成神经细胞瘤、骨肉瘤、成胶质细胞瘤、乳腺癌和前列腺癌等)，而在已存在的血管和正常组织中不表达或表达很低。integrin α_vβ₃在肿瘤生长和转移过程中的高度限制表达，使其成为一个非常有吸引力的靶点，用于肿瘤的诊断和治疗。

研究证实含有RGD(Arg-Gly-Asp，精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸)序列的配体与integrin α_vβ₃具有高亲和力和特异性。不同放射性核素标记的RGD序列配体，如现有的RGD环肽二聚体和四聚体等已被用于肿瘤的显像和治疗研究。RGD二聚体或四聚体比其单体具有更高的integrin α_vβ₃亲和力，主要源于两个因素，一是两个RGD模序(motif)能同时与细胞表面的integrin α_vβ₃相结合，或者是一个RGD模序与integrin α_vβ₃结合之后增加了细胞表面结合位点局部RGD浓度。如果两个RGD模序之间的距离足够长，那么它们可以同时与integrin α_vβ₃结合；如果两个RGD模序之间的距离不是足够长，那么它们只能增加局部RGD浓度。目前报道的RGD环肽二聚体E[c(RGDxK)]₂(E代表谷氨酸，c代表环化，R代表精氨酸，G代表甘氨酸，D代表天冬氨酸，x为f或y，分别代表苯丙氨酸或酪氨酸)，其两个RGD模序之间的距离为6个键，由于距离不够长，因此E[c(RGDxK)]₂的两个RGD模序很难同时与细胞表面相邻的两个的integrin α_vβ₃受体结合(参见图1)。从这个意义上讲，两个RGD模序(motif)能同时与细胞表面的integrin α_vβ₃相结合具有更重要的作用。为此，有必要提出新型的RGD多肽二聚体，使二聚体分子中的两个RGD模序之间距离足够长以能同时与细胞表面表达的相邻的integrin α_vβ₃受体相结合，增强RGD多肽与integrin α_vβ₃的亲和力，提高肿瘤对药物的摄取，并在此基础上发明用于integrin α_vβ₃阳性肿瘤的RGD多肽放射性药物，以达到更好的诊治效果。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于integrin α_vβ₃阳性肿瘤的RGD多肽放射性药物及其制备方法。该药物首先将三个甘氨酸分子(G₃，G＝glycine)或四个聚乙二醇分子(PEG₄，PEG＝Polyethylene glycol)与RGD单体连接，然后再将此二聚化合成新型RGD环肽二聚体E[L-c(RGDxK)]₂，使二聚体分子中的两个RGD模序之间距离足够长以使其能同时与细胞表面表达的相邻的integrin α_vβ₃受体相结合(参见图2)，即以双价形式与integrin α_vβ₃结合，这样会进一步增强结合亲和力以及肿瘤对药物的摄取，达到更好的诊断治疗效果。该药物通过DOTA、DTPA、NOTA及其衍生物作为双功能螯合剂将放射性核素¹¹¹In、⁹⁰Y、¹⁷⁷Lu、⁶⁸Ga及⁶⁴Cu等标记到新型RGD环肽二聚体分子上，在体内标记药物通过RGD多肽的靶向作用浓聚到肿瘤部位，利用核医学的单光子断层显像技术和正电子断层显像技术对integrin α_vβ₃阳性肿瘤进行显像诊断，还可以通过放射性核素放射的β^-粒子杀伤肿瘤细胞，对integrin α_vβ₃阳性肿瘤进行放射靶向治疗。当通过双功能螯合剂DOTA或DTPA或其衍生物标记放射性核素¹¹¹In时，本发明RGD多肽放射性药物用于integrin α_vβ₃阳性肿瘤的单光子断层显像诊断。当通过双功能螯合剂DOTA或NOTA或其衍生物标记放射性核素⁶⁸Ga时，本发明RGD多肽放射性药物用于integrin α_vβ₃阳性肿瘤的正电子断层显像诊断。当通过双功能螯合剂DOTA或TETA或其衍生物标记放射性核素⁶⁴Cu时，本发明RGD多肽放射性药物用于integrin α_vβ₃阳性肿瘤的正电子断层显像诊断。当通过双功能螯合剂DOTA或DTPA或其衍生物标记放射性核素⁹⁰Y或¹⁷⁷Lu时，本发明RGD多肽放射性药物用于integrin α_vβ₃阳性肿瘤的放射靶向治疗。

本发明的目的是通过如下技术方案实现：

一种用于integrin α_vβ₃阳性肿瘤的RGD多肽放射性药物，包括RGD多肽、双功能螯合剂(Chelator)和放射性核素(Nuclide)，所述RGD多肽为RGD环肽二聚体，所述RGD环肽二聚体是将连接剂L与RGD多肽单体c(RGDfK)连接，再将两个连接有连接剂L的RGD多肽单体L-c(RGDfK)二聚化而合成的RGD环肽二聚体E[L-c(RGDxK)]₂；所述放射性核素通过一个双功能螯合剂标记所述RGD环肽二聚体，所述RGD环肽二聚体与所述双功能螯合剂之间还连接有药代动力学修饰分子PKM，所述RGD多肽放射性药物为Nuclide-Chelator-PKM-E[L-c(RGDxK)]₂；所述RGD多肽放射性药物为无色透明液体针剂。

所述连接剂L为PEG₄或G₃。

所述药代动力学修饰分子PKM为G₂或G₃或G₄或PEG₄(G₂代表两个甘氨酸分子，G₄为四个甘氨酸分子)。

所述放射性核素为¹¹¹In，所述放射性核素¹¹¹In是通过双功能螯合剂DOTA和DTPA及其衍生物中的一种标记所述RGD环肽二聚体。

所述放射性核素为⁶⁴Cu，所述放射性核素⁶⁴Cu是通过双功能螯合剂DOTA和TETA及其衍生物中的一种标记所述RGD环肽二聚体。

所述放射性核素为⁶⁸Ga，所述放射性核素⁶⁸Ga是通过双功能螯合剂DOTA和NOTA及其衍生物中的一种标记所述RGD环肽二聚体。

所述放射性核素为⁹⁰Y或¹⁷⁷Lu，所述放射性核素⁹⁰Y或¹⁷⁷Lu是通过双功能螯合剂DOTA和DTPA及其衍生物中的一种标记所述RGD环肽二聚体。

所述的用于integrin α_vβ₃阳性肿瘤的RGD多肽放射性药物的制备方法，包括以下步骤：

a、L-c(RGDxK)的制备(L为PEG₄或G₃)

将Boc(t-Butyl carbamate，叔丁氧羰基)保护的连接剂L溶于1mL DMF(二甲基甲酰胺)中，加入NHS(N-羟基琥珀酰亚胺，也为HOSu)和DCC(二环己基碳二亚胺)，室温下搅拌反应2小时；将RGD多肽单体c(RGDxK)加入到上述反应液中，用DIEA(N，N-二异丙基乙胺)将pH调节到8.0-8.5，室温搅拌过夜；向反应液中加入3mL0.5M NH₄OAc缓冲溶液(pH＝7.0)并过滤，滤液经Zorbax C18半制备柱HPLC分离纯化，收集目标物的馏分，合并收集液并冻干；获得产物经ESI-MS质谱分析确认为预期产物Boc-L-c(RGDxK)；将Boc-L-c(RGDxK)加入到3.0mL TFA(三氟乙酸)中，室温反应30分钟；旋蒸去除TFA，残留物溶于2mL0.5M NH₄OAc缓冲溶液(pH＝7.0)，经Zorbax C18半制备柱HPLC方法分离纯化，收集目标物的馏分，合并收集液并冻干；获得产品经ESI-MS质谱分析确认为预期产物L-c(RGDxK)；

b、E[L-c(RGDxK)]₂的制备

将Boc保护的谷氨酸(E)溶于5mL DMF，加入NHS和DCC，室温搅拌10小时；滤掉副产物DCU(二环己基脲)，滤液真空蒸干得到粗产物；用3mL CH₂Cl₂溶解粗产物，滤掉不溶物，滤液浓缩至1mL左右；缓慢逐滴加入到30mL乙醚中，析出白色沉淀，过滤并真空干燥得到产品；获得产物经¹H NMR核磁谱分析确认为预期产物Boc-E(OSu)₂；将Boc-E(OSu)₂溶于无水1mL DMF中，加入L-c(RGDxK)；使用DIEA调节pH值至8.0-9.0，室温搅拌过夜，经Zorbax C18半制备柱HPLC分离纯化，合并收集液并冻干，获得产物经ESI-MS质谱分析确认为预期产物Boc-E[L-c(RGDxK)]₂。用无水TFA浸泡Boc-E[L-c(RGDxK)]₂5分钟，去除Boc-保护基团；粗产品经Zorbax C18半制备柱HPLC分离纯化，合并收集液并冻干，得到产品经ESI-MS质谱分析确认为预期产物E[L-c(RGDxK)]₂；c、PKM-E[L-c(RGDxK)]₂的制备(PKM为G₂或G₃或G₄或PEG₄)

将Boc-PKM-OSu和E[L-c(RGDxK)]₂溶于2mL DMF和H₂O的混合液(1:1＝v:v)，使用0.1N NaOH调节pH值至8.0-9.0，室温搅拌过夜。将反应液真空蒸干，得到粗产品并将之溶于2mL TFA，将溶液在室温下搅拌15分钟；产品经Zorbax C18半制备柱HPLC分离纯化，收集目标物的馏分，合并收集液并冻干，获得产物经ESI-MS质谱分析确认为预期产品PKM-E[L-c(RGDxK)]₂；d、Chelator-PKM-E[L-c(RGDxK)]₂的制备(Chelator为DOTA或DTPA或NOTA或TETA或其衍生物)

将Chelator和PKM-E[L-c(RGDxK)]₂溶于1mL DMF(二甲基甲酰胺)中，用DIEA(N，N-二异丙基乙胺)将pH调节到8.5-9.0，室温搅拌过夜；产品经ZorbaxC18半制备柱HPLC分离纯化，收集目标物的馏分，合并收集液并冻干；

e、Nuclide-Chelator-PKM-E[L-c(RGDxK)]₂的制备(Nuclide为¹¹¹In或⁹⁰Y或¹⁷⁷Lu或⁶⁸Ga或⁶⁴Cu)

将0.2mL溶有Chelator-PKM-E[L-c(RGDxK)]₂偶联物(浓度0.2-0.5mg/mL)的NaOAc(pH＝5.0)缓冲溶液加入到西林瓶中，加入10-50μL放射性核素(20-50mCi)，100℃水浴加热西林瓶，反应10-15分钟，反应结束后室温冷却10分钟，制成RGD多肽放射性药物Nuclide-Chelator-PKM-E[L-c(RGDxK)]₂。

所述HPLC方法为使用LabAllianceHPLC系统配备Zorbax C18半制备柱，梯度淋洗36分钟，流速2.5mL/min，其中流动相A为25mM NH₄OAc，B为乙睛。淋洗梯度设定为起始时90％ A和10％ B，5分钟时85％ A和15％ B，30分钟时65％ A和35％ B，32-36分钟时50％ A和50％ B。

本发明的有益效果：

1、在本发明RGD多肽放射性药物，首先将三个甘氨酸分子(G₃)或四个聚乙二醇分子(PEG₄)与RGD多肽单体c(RGDfK)]₂连接，然后再将此二聚化，即合成E[G₃-c(RGDxK)]₂或E[PEG₄-c(RGDxK)]₂，这样两个RGD模序之间的距离就从6个键增加到26个键或38个键，使二聚体分子中的两个RGD模序之间距离足够长以使其能同时与细胞表面表达的相邻的integrin α_vβ₃受体相结合，即以双价形式与integrin α_vβ₃结合，这样会进一步增强结合亲和力以及肿瘤对药物的摄取，达到更好的诊断或治疗效果。

2、本发明不仅在两个RGD模序之间引入G₃和PEG₄，同时在RGD多肽分子新型RGD环肽二聚体E[L-c(RGDxK)]₂与双功能螯合剂之间引入PKM，即Chelator-PKM-E[L-c(RGDxK)]₂，以进一步改善药代动力学性质，特别是从非肿瘤组织的清除动力学。

3、利用本发明制备方法，当通过双功能螯合剂DOTA或DTPA或其衍生物标记放射性核素¹¹¹In时，本发明RGD多肽放射性药物用于integrin α_vβ₃阳性肿瘤的单光子断层显像诊断。当通过双功能螯合剂DOTA或NOTA或其衍生物标记放射性核素⁶⁸Ga时，本发明RGD多肽放射性药物用于integrin α_vβ₃阳性肿瘤的正电子断层显像诊断。当通过双功能螯合剂DOTA或TETA或其衍生物标记放射性核素⁶⁴Cu时，本发明RGD多肽放射性药物用于integrin α_vβ₃阳性肿瘤的正电子断层显像诊断。当通过双功能螯合剂DOTA或DTPA或其衍生物标记放射性核素⁹⁰Y或¹⁷⁷Lu时，本发明RGD多肽放射性药物用于integrin α_vβ₃阳性肿瘤的放射靶向治疗。

以下结合附图及实施例对本发明作进一步说明。

附图说明

图1为结构改造前RGD环肽二聚体与integrin α_vβ₃受体结合示意图；

图2为结构改造后RGD环肽二聚体与integrin α_vβ₃受体结合示意图；

图3为RGD环肽二聚体及其¹¹¹In标记物结构示意图；

图4为不同RGD多肽体外受体竞争结合分析；

图5为¹¹¹In标记的不同RGD多肽于注射后不同时间在神经胶质瘤摄取的对比；

图6为注射¹¹¹In-DOTA-3PEG₄-dimer后24h神经胶质瘤动物模型的γ显像图。

具体实施方式

本发明实施例中所采用的材料：Dicyclcohexylcarbodiimide(DCC，N，N′-二环己基碳二亚胺)，N-hydroxysuccinimide(NHS，N-羟基琥珀酰亚胺)，N，N-Diisopropylethylamine(DIEA，N，N-二异丙基乙胺)，N，N-Dimethylforn amide(DMF，N，N-二甲基甲酰胺)，Trifluoroacetic acid(TFA，三氟乙酸)，购自美国Sigma-Aldrich公司。DOTA(1，4，7，10-tetraazacyclododecane-N，N’，N”，N”’-tetraacetic acid，1，4，7，10-四氮杂环十二烷四乙酸)、DTPA(diethylenetriaminepentaacetic acid，二乙烯三胺五乙酸)及NOTA(1，4，7-triazacyclononane-N，N’，N”-triacetic acid，1，4，7-三氮杂环壬烷三乙酸)购自美国Macrocyclics公司。环化RGD多肽单体c(RGDfK)]₂购自美国Peptide International，Inc.公司。¹¹¹In核素购自美国PerkinElmer公司。

实施例1：

本实施例以¹¹¹In-DOTA-PEG₄-E[PEG₄-c(RGDfK)]₂(简称¹¹¹In-DOTA-3PEG₄-dimer)RGD多肽放射性药物及其制备方法为例。

¹¹¹In-DOTA-PEG₄-E[PEG₄-c(RGDfK)]₂(简称¹¹¹In-DOTA-3PEG₄-dimer)多肽放射性药物包括RGD环肽二聚体、双功能螯合剂DOTA和放射性核素¹¹¹In。RGD环肽二聚体是将连接剂PEG₄与RGD多肽单体c(RGDfK)连接，再将两个连接有PEG₄的RGD多肽单体PEG₄-c(RGDfK)二聚化而合成的RGD环肽二聚体，即E[PEG₄-c(RGDfK)]₂，放射性核素¹¹¹In通过一个双功能螯合剂DOTA标记所述RGD环肽二聚体，所述RGD环肽二聚体与所述双功能螯合剂之间还连接有药代动力学修饰分子PEG₄，所述RGD多肽放射性药物为¹¹¹In-DOTA-PEG₄-E[PEG₄-c(RGDfK)]₂；所述RGD多肽放射性药物为无色透明液体针剂。

该药物首先将四个聚乙二醇分子(PEG₄，PEG＝Polyethylene glycol)与RGD单体连接，然后再将此二聚化合成新型RGD环肽二聚体E[L-c(RGDxK)]₂，使二聚体分子中的两个RGD模序之间距离足够长以使其能同时与细胞表面表达的相邻的integrin α_vβ₃受体相结合(参见图2)，即以双价形式与integrin α_vβ₃结合，与现有技术RGD环肽二聚体E[c(RGDxK)]₂的两个RGD模序很难同时与细胞表面相邻的两个的integrin α_vβ₃受体结合(参见图1)相比，新型RGD环肽二聚体E[L-c(RGDxK)]₂两个RGD模序(motif)能同时与细胞表面的integrin α_vβ₃相结合具有更重要的作用，进一步增强了结合亲和力以及肿瘤对药物的摄取，达到更好的诊治效果。

该药物通过DOTA作为双功能螯合剂将放射性核素¹¹¹In标记到新型RGD环肽二聚体分子上，在体内标记药物通过RGD多肽的靶向作用浓聚到肿瘤部位，利用核医学的单光子断层显像技术对integrin α_vβ₃阳性肿瘤进行显像诊断，

¹¹¹In-DOTA-PEG₄-E[PEG₄-c(RGDfK)]₂(¹¹¹In-DOTA-3PEG₄-dimer)制备方法如下：

预先配备Zorbax C18半制备柱，HPLC方法一：使用LabAlliance HPLC系统，配备Zorbax C18半制备柱(9.4mm x 250mm，100pore size)，梯度淋洗36分钟，流速2.5mL/min，其中流动相A为25mM NH₄OAc(pH 5.0)，B为乙腈。淋洗梯度设定为起始时90％ A和10％ B，5分钟时85％ A和15％ B，30分钟时65％ A和35％ B，32-36分钟时50％ A和50％ B。

PEG₄-c(RGDfK)的制备：

将Boc(t-Butyl carbamate，叔丁氧羰基)保护的PEG₄-OH溶于1mL DMF(二甲基甲酰胺)中，加入NHS(N-羟基琥珀酰亚胺，也为HOSu)(3.5mg，0.03mmol)和DCC(二环己基碳二亚胺)(6.2mg，0.03mmol)，室温下搅拌反应2小时。将c(RGDfK)(26.3mg，0.02mmol)加入到以上反应液中，用DIEA(N，N-二异丙基乙胺)将pH调节到8.0-8.5，室温搅拌过夜。向反应液中加入3mL 0.5M NH₄OAc缓冲溶液(pH＝7.0)并过滤，滤液经Zorbax C18半制备柱(HPLC方法一)分离纯化，收集保留时间约为14分钟的馏分，合并收集液并冻干。获得产品Boc-PEG₄-c(RGDfK)约7.5mg。ESI-MS质谱分析结果为m/z＝1665([M+H]⁺)，[C₇₅H₁₁₇N₂₀O₂₃]⁺理论值为1665.85。

将上述所得Boc-PEG₄-c(RGDfK)(10mg，6mol)加入到3.0mL TFA(三氟乙酸)中，室温反应30分钟。旋蒸去除TFA，残留物溶于2mL 0.5MNH₄OAc缓冲溶液(pH＝7.0)，经Zorbax C18半制备柱(HPLC方法一)分离纯化，收集保留时间约为14分钟的馏分，合并收集液并冻干。获得产品PEG₄-c(RGDfK)约7.0mg。ESI-MS质谱分析结果为m/z＝1565.2([M+H]⁺)，[C₇₀H₁₀₉N₂₀O₂₁]⁺理论值为1565.80。

E[PEG₄-c(RGDfK)]₂的制备：

将Boc-保护的谷氨酸(E)(0.247g，1.0mmol)溶于5mL DMF，加入NHS(0.253g，2.2mmol)和DCC(0.453g，2.2mmol)，室温搅拌10小时。滤掉副产物DCU(二环己基脲)，滤液真空蒸干得到粗产物。用3mL CH₂Cl₂溶解粗产物，滤掉不溶物，滤液浓缩至1mL左右。缓慢逐滴加入到30mL乙醚中，析出白色沉淀，真空干燥得到产品0.27g。获得产物经¹H NMR核磁谱分析确认为预期产物Boc-E(OSu)₂。

将上述所得Boc-E(OSu)₂(4.4mg，0.01mmol)溶于无水1mL DMF中，加入PEG₄-c(RGDfK)(5.28mg，0.03mmol)。使用DIEA调节pH值至8.0-9.0，室温搅拌过夜，经Zorbax C18半制备柱(HPLC方法一)分离纯化，合并收集液并冻干，得到15mg白色粉末。经ESI-MS质谱分析确认为预期产物Boc-E[PEG₄-c(RGDfK)]₂。ESI-MS质谱分析结果为m/z＝1913.13([M+H]⁺)，[C₈₆H₁₃₈N₂₁O₂₈]⁺理论值为1912.99。

用无水TFA浸泡上述产物Boc-E[PEG₄-c(RGDfK)]₂5分钟，去除Boc-保护基团。粗产品经Zorbax C18半制备柱(HPLC方法一)分离纯化，合并收集液并冻干，得到产品经ESI-MS质谱分析确认为预期产物E[PEG₄-c(RGDfK)]₂。ESI-MS质谱分析结果为m/z＝1813.0([M+H]⁺)，[C₈₁H₁₃₀N₂₁O₂₆]⁺理论值为1812.99。

PEG₄-E[PEG₄-c(RGDfK)]₂的制备：

将Boc-PEG₄-OSu(5.1mg，11μmol)和E[PEG₄-c(RGDfK)]₂(5mg，2.76μLmol)溶于2mL DMF和H₂O的混合液(1:1＝v:v)，使用0.1N NaOH调节pH值至8.0-9.0，室温搅拌过夜。然后反应液真空蒸干，得到粗产品，溶于2mL TFA，将溶液在室温下搅拌15分钟。产品经Zorbax C18半制备柱(HPLC方法一)分离纯化，收集保留时间为16.4分钟时的馏分，合并收集液并冻干。获得预期产品PEG₄-E[PEG₄-c(RGDfK)]₂约2.4mg，纯度大于95％。ESI-MS质谱分析结果为m/z＝2061.46([M+H]⁺)，[C₉₂H₁₅₁N₂₂O₃₁]⁺理论值为2061.1。

DOTA-PEG₄-E[PEG₄-c(RGDfK)]₂(简称DOTA-3PEG₄-dimer)的制备：

将DOTA-OSu(5.0mg，～10.0μM)和PEG₄-E[PEG₄-c(RGDfk)]₂(10.30mg，～5.0μM)溶于1mL无水DMF，使用DIEA调节pH值至8.5-9.0，室温搅拌过夜；向反应液中加入3mL0.5M NH₄OAc缓冲溶液(pH＝7.0)并过滤，滤液经Zorbax C18半制备柱HPLC(方法一)分离纯化，收集保留时间为22.5分钟时的馏分，合并收集液并冻干，得到产物4.0mg(产率为33％)。ESI-MS质谱分析结果：m/z＝2447.35([M+H]⁺)，[C₁₀₈H₁₇₇N₂₆O₃₈]⁺理论值为2447.27。

¹¹¹In-DOTA-PEG₄-E[PEG₄-c(RGDfK)]₂的制备：

将0.2mL溶有DOTA-3PEG₄-dimer(浓度0.25mg/mL)的NaOAc(pH＝5.0)缓冲溶液加入到西林瓶中，加入20μL放射性核素标记液(20-50mCi)，100℃水浴加热西林瓶，反应10-15分钟，反应结束后室温冷却10分钟，制成本发明的RGD多肽放射性药物¹¹¹In-DOTA-PEG₄-E[PEG₄-c(RGDfK)]₂(¹¹¹In-DOTA-3PEG₄-dimer)。

本发明的RGD多肽放射性药物中，当连接剂L为G₃、药代动力学修饰分子PKM为G₃时，本发明药物为¹¹¹In-DOTA-G₃-E[G₃-c(RGDfK)]₂(¹¹¹In-DOTA-3G₃-dimer)。药代动力学修饰分子PKM也可以是G₂或G₄。

本发明的RGD多肽放射性药物中，当双功能螯合剂为DTPA时，本发明药物可以是¹¹¹In-DTPA-PEG₄-E[PEG₄-c(RGDfK)]₂(¹¹¹In-DTPA-3PEG₄-dimer)或¹¹¹In-DTPA-G₃-E[G₃-c(RGDfK)]₂(¹¹¹In-DTPA-3G₃-dimer)。药代动力学修饰分子PKM也可以是G₂或G₄。

本实施例中，本发明RGD多肽放射性药物使用双功能螯合剂DOTA或DTPA或其衍生物标记放射性核素¹¹¹In。本实施例中的RGD多肽放射性药物用于单光子断层显像技术对integrin α_vβ₃阳性肿瘤进行显像诊断。

参见图3，图3为RGD环肽二聚体及其¹¹¹In标记物结构示意图。

对依据本发明方法制备的RGD多肽放射性药物¹¹¹In-DOTA-3PEG₄-dimer取样进行放射性HPLC分析(HPLC方法二：使用LabAlliance HPLC系统，配备放射性在线检测器和Zorbax C18分析柱(4.6mm x 250mm，300pore size)，梯度淋洗25分钟，流速1.0mL/min，其中流动相A为25mM NH₄OAc(pH 5.0)，B为乙腈。淋洗梯度设定为起始至2分钟时90％ A和10％ B，5分钟时85％ A和15％ B，20分钟时80％ A和20％ B，25分钟时90％ A和10％ B)，¹¹¹In-DOTA-3PEG₄-dimer的标记率>95％，经Sep-Pak C18柱纯化后放射化学纯度>98％。

DOTA-3PEG₄-dimer与integrin α_vβ₃结合亲和力测定：高表达integrin α_vβ₃的U87MG人神经胶质瘤细胞作为实验样本，使用¹²⁵I-c(RGDyK)作为integrin α_vβ₃受体特异性结合的放射性配基，采用竞争结合实验测定DOTA-3PEG₄-dimer的IC₅₀值(半抑制浓度)，并设c(RGDyK)、DOTA-PEG₄-c(RGDfK)(DOTA-PEG₄-monomer)、DTPA-Bz-PEG₄-E[PEG₄-c(RGDfK)]₂(DTPA-3PEG₄-dimer)、DOTA-G₃-E[G₃-c(RGDfK)]₂(DOTA-3G₃-dimer)、DOTA-E[c(RGDfK)]₂(DOTA-dimer)和DOTA-E{E[c(RGDfK)]₂}₂(DOTA-tetramer)为对照。实验结果显示，c(RGDyK)、DOTA-PEG₄-monomer、DOTA-dimer、DOTA-3PEG₄-dimer、DTPA-3PEG₄-dimer、DOTA-3G₃-dimer和DOTA-tetramer竞争¹²⁵I-c(RGDyK)与U87MG细胞结合的IC₅₀值分别为49.9±5.5nM，42.1±3.5nM，8.0±2.8nM，1.3±0.2nM，1.3±0.3nM，1.1±0.1nM和1.4±0.1nM(参见图4)，表明DOTA-3PEG₄-dimer、DTPA-3PEG₄-dimer以及DOTA-3G₃-dimer与integrin α_vβ₃的亲和力明显好于其RGD多肽单体和现有二聚体，说明改造后的RGD环肽二聚体能以双价形式与integrin α_vβ₃结合。

¹¹¹In-DOTA-3PEG₄-dimer在荷瘤裸鼠生物分布：将荷U87MG人神经胶质瘤BALB/c裸鼠随机分成若干组，每组4只。各组实验裸鼠分别经尾静脉注射100μL(～74kBq)不同的¹¹¹In标记的RGD多肽，于注射后0.5小时，1.0小时，4.0小时和24.0小时按组分别处死实验裸鼠，取血及主要脏器，称重并测量放射性计数，经衰变校正后计算每克组织百分注射剂量率(％ID/g)。

在U87MG人神经胶质瘤动物模型中，¹¹¹In-DOTA-3PEG₄-dimer、¹¹¹In-DOTA-3G₃-dimer及¹¹¹In-DTPA-3PEG₄-dimer的肿瘤摄取明显高于¹¹¹In-DTPA-dimer(参见图5)。这充分说明¹¹¹In-DOTA-3PEG₄-dimer、¹¹¹In-DOTA-3G₃-dimer及¹¹¹In-DTPA-3PEG₄-dimer是以双价形式与integrin α_vβ₃结合，而¹¹¹In-DTPA-dimer是以单价形式与integrin α_vβ₃结合。参见图6，图6为荷U87MG人神经胶质瘤裸鼠注射¹¹¹In-DOTA-3PEG₄-dimer后24h的γ显像图(图中箭头代表肿瘤部位)。

实施例2：

本实施例中，本发明RGD多肽放射性药物使用双功能螯合剂DOTA或TETA或其衍生物标记放射性核素⁶⁴Cu，当连接剂L为PEG₄、药代动力学修饰分子PKM为PEG₄时，本发明药物为⁶⁴Cu-DOTA-PEG₄-E[PEG₄-c(RGDfK)]₂(⁶⁴Cu-DOTA-3PEG₄-dimer)或⁶⁴Cu-TETA-PEG₄-E[PEG₄-c(RGDfK)]₂(⁶⁴Cu-TETA-3PEG₄-dimer)，其制备方法同实施例1。药代动力学修饰分子PKM也可以是G₂或G₄。

当连接剂L为G₃、药代动力学修饰分子PKM为G₃时，本发明药物为⁶⁴Cu-DOTA-G₃-E[G₃-c(RGDfK)]₂(⁶⁴Cu-DOTA-3G₃-dimer)或⁶⁴Cu-TETA-G₃-E[G₃-c(RGDfK)]₂(⁶⁴Cu-TETA-3G₃-dimer)，其制备方法同上。药代动力学修饰分子PKM也可以是G₂或G₄。

本实施例中，本发明RGD多肽放射性药物使用双功能螯合剂DOTA或TETA或其衍生物标记放射性核素⁶⁴Cu，本实施例中的RGD多肽放射性药物用于integrin α_vβ₃阳性肿瘤的正电子断层显像诊断。

实施例3：

本实施例中，本发明RGD多肽放射性药物使用双功能螯合剂DOTA或NOTA或其衍生物标记放射性核素⁶⁸Ga。当连接剂L为PEG₄、药代动力学修饰分子PKM为PEG₄时，本发明药物为⁶⁸Ga-DOTA-PEG₄-E[PEG₄-c(RGDfK)]₂(⁶⁸Ga-DOTA-3PEG₄-dimer)或⁶⁸Ga-NOTA-PEG₄-E[PEG₄-c(RGDfK)]₂(⁶⁸Ga-NOTA-3PEG₄-dimer)，其制备方法同实施例1。药代动力学修饰分子PKM也可以是G₂或G₄。

当连接剂L为G₃、药代动力学修饰分子PKM为G₃时，本发明药物为⁶⁸Ga-DOTA-G₃-E[G₃-c(RGDfK)]₂(⁶⁸Ga-DOTA-3G₃-dimer)或⁶⁸Ga-NOTA-G₃-E[G₃-c(RGDfK)]₂(⁶⁸Ga-NOTA-3G₃-dimer)。药代动力学修饰分子PKM也可以是G₂或G₄。

本实施例中，本发明RGD多肽放射性药物使用双功能螯合剂DOTA或NOTA或其衍生物标记放射性核素⁶⁸Ga，本实施例中的RGD多肽放射性药物用于integrin α_vβ₃阳性肿瘤的正电子断层显像诊断。

实施例4：

本实施例中，本发明RGD多肽放射性药物使用双功能螯合剂DOTA或DTPA或其衍生物标记放射性核素⁹⁰Y。当连接剂L为PEG₄、药代动力学修饰分子PKM为PEG₄时，本发明药物为⁹⁰Y-DTPA-PEG₄-E[PEG₄-c(RGDfK)]₂(⁹⁰Y-DTPA-3PEG₄-dimer)或⁹⁰Y-DOTA-PEG₄-E[PEG₄-c(RGDfK)]₂(⁹⁰Y-DOTA-3PEG₄-dimer)，其制备方法同实施例1。药代动力学修饰分子PKM也可以是G₂或G₄。

当连接剂L为G₃、药代动力学修饰分子PKM为G₃时，本发明药物为⁹⁰Y-DTPA-G₃-E[G₃-c(RGDfK)]₂(⁹⁰Y-DTPA-3G₃-dimer)或⁹⁰Y-DOTA-G₃-E[G₃-c(RGDfK)]₂(⁹⁰Y-DOTA-3G₃-dimer)，其制备方法同上。药代动力学修饰分子PKM也可以是G₂或G₄。

本实施例中，本发明RGD多肽放射性药物使用双功能螯合剂DOTA或DTPA或其衍生物标记放射性核素⁹⁰Y。本实施例中的RGD多肽放射性药物用于integrin α_vβ₃阳性肿瘤的放射靶向治疗。

实施例5：

本实施例中，本发明RGD多肽放射性药物使用双功能螯合剂DOTA或DTPA或其衍生物标记放射性核素¹⁷⁷Lu。当连接剂L为PEG₄、药代动力学修饰分子PKM为PEG₄时，本发明药物为¹⁷⁷Lu-DTPA-PEG₄-E[PEG₄-c(RGDfK)]₂(¹⁷⁷Lu-DTPA-3PEG₄-dimer)或¹⁷⁷Lu-DOTA-PEG₄-E[PEG₄-c(RGDfK)]₂(¹⁷⁷Lu-DOTA-3PEG₄-dimer)，其制备方法同实施例1。药代动力学修饰分子PKM也可以是G₂或G₄。

当连接剂L为G₃、药代动力学修饰分子PKM为G₃时，本发明药物为¹⁷⁷Lu-DTPA-G₃-E[G₃-c(RGDfK)]₂(¹⁷⁷Lu-DTPA-3G₃-dimer)或¹⁷⁷Lu-DOTA-G₃-E[G₃-c(RGDfK)]₂(¹⁷⁷Lu-DOTA-3G₃-dimer)，其制备方法同上。药代动力学修饰分子PKM也可以是G₂或G₄。

本实施例中，本发明RGD多肽放射性药物使用双功能螯合剂DOTA或DTPA或其衍生物标记放射性核素¹⁷⁷Lu。本实施例中的RGD多肽放射性药物用于integrin α_vβ₃阳性肿瘤的放射靶向治疗。