一种防治苹果真菌病害并促增产的菌剂及其专用菌株与应用

摘要

本发明公开了一种防治苹果真菌病害的菌剂。该菌剂的活性成分包括枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)。本发明的防治苹果真菌病害的菌剂，主要可以防治苹果轮纹病，其防治效果在80％以上，兼治其他真菌病害，对苹果白粉病的防治效果在30～60％之间，对红腐病的防治效果可达45％，对褐腐病的防治防治效果可达40％，对苹果斑点落叶病的防治效果可达42.33％，苹果平均亩产增加9.3％，并且苹果品质得到明显改善，苹果的抗逆性明显提高。

说明书

技术领域

本发明涉及一种防治苹果真菌病害并促增产的菌剂及其专用菌株与应用。

背景技术

苹果轮纹烂果病是苹果生产上的重大病害，已成为当前果农和农业技术员亟待解决的难题。大部分苹果产区采果前烂果率在10％～15％，大发生年可达30％左右，最高时甚至达到50％。我国每年因轮纹烂果病造成的经济损失达30亿～50亿元，且生产上喷药次数也逐年增多，这样既给农民造成了巨大的经济损失，也对苹果的出口和发展造成极大的影响，同时还给环境保护带来了潜在的危险。因此，对于该病害采取合理的防治措施、提高防效，显得尤为重要。生物防治是近年来被证实很有成效的新的防治途径，它主要是利用微生物之间的拮抗作用，选择对农产品不造成危害的微生物来防治植物病害，既可以减少化学农药的用量和在农产品上的残毒，又可以降低成本节约开支，有利于保护人体健康和生态环境以及实现经济的可持续发展，顺应社会发展的需求。

发明内容

本发明的目的是提供一种防治苹果真菌病害的菌剂及其专用菌株与应用。

本发明所提供的菌剂，它的活性成分包括枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)。

上述菌剂中，所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和所述短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)的集落形成单位数目比为1:(0.2-5)，具体为1:1。

所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)具体可为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)KTB004，所述短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)具体可为短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)KTB005。

本发明所提供的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)KTB004是从发生苹果轮纹病的果树的健康苹果枝干皮层中筛选获得的内生菌，短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)KTB005是从发生苹果轮纹病的果树的健康苹果果实中筛选得到的内生菌，分别鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)。枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)KTB004和短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)KTB005均已于2008年12月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所)，保藏登记号分别为CGMCC № 2816和CGMCC № 2817。

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)KTB004 CGMCC № 2816菌体杆状，长2～3μm，宽0.7～0.8μm，革兰氏反应阳性，芽孢椭圆形或柱状，中生或近中生，壁薄。孢囊不膨大，原生质中不含有β-羟基丁酸盐颗粒；在含有7％质量百分含量的NaCl中生长，石芯牛奶不产酸，pH5.7条件下生长，v.p阳性，水解淀粉，可产酸，与葡萄糖反应产气，能将NO^3-还原为NO^2-，厌氧条件下不能生长，接触酶阳性。与同种其它枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)相比菌体较宽。菌株KTB004的16S rDNA序列与枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的相似性为96％。

短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)KTB005 CGMCC № 2817菌体短杆状，大小为(2.0～3.0)μm×(0.6～0.7)μm，革兰氏反应阳性，芽孢呈椭圆形，不明显膨大，芽孢从中生到次端生，壁薄，易形成；在含有质量百分含量为2％、5％或7％的NaCl中均生长，在pH5.7或pH6.8的营养肉汤中均生长，v.p阳性，不水解淀粉，可产酸，不与葡萄糖反应产气，能以铵盐为氮源，可利用柠檬酸盐而不能利用丙酸盐，不还原硝酸盐，不能厌氧生长，接触酶阳性。菌株KTB005的16S rDNA序列与短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)的相似性为97％。

本发明所提供的菌剂的活性成份也可仅由所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)KTB004 CGMCC № 2816和所述短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)KTB005 CGMCC №2817组成。

上述菌剂可以为液体菌剂，也可以为固体菌剂，在液体菌剂中加入吸附基质(如轻质碳酸钙)，即可获得固体菌剂。上述菌剂中，所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)KTB004 CGMCC № 2816和所述短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)KTB005 CGMCC №2817可以分别独立包装，也可以混合在一起。

所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)KTB004 CGMCC № 2816和所述短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)KTB005 CGMCC № 2817也属于本发明的保护范围。

本发明的另一个目的是提供一种防治苹果真菌病害的方法。

本发明所提供的防治苹果真菌病害的方法，是在苹果生长期施用上述任一种菌剂，使苹果真菌病害得到有效防治并且果实产量得到提高。

上述方法中，所述真菌病害包括轮纹病、红腐病、褐腐病、白粉病和斑点落叶病等。

所述植物具体可为苹果。

本发明的防治苹果真菌病害并促增产的菌剂，对苹果轮纹病的防治效果在80％以上，兼治苹果的其他真菌病害，对苹果白粉病的防治效果在30～60％之间，对红腐病的防治防治效果可达45％，对褐腐病的防治防治效果可达40％，对苹果斑点落叶病的防治效果可达42.33％，苹果平均亩产增加9.3％，并且苹果品质得到明显改善，苹果的抗逆性明显提高。

具体实施方式

下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和生物材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

实施例1、菌剂中活性成分的筛选

NA培养基的组成：牛肉膏3g/L、蛋白胨5g/L、NaCl 5g/L、琼脂20g/L。pH7.0～7.2。0.11MPa压力下灭菌30min。

在苹果轮纹病重病区，从发生苹果轮纹病的果树上选取健康的苹果果实和树皮，分别用无菌水冲洗干净，各称取5g，用75％体积百分含量的乙醇浸泡3min，然后将果实用1％体积百分含量的次氯酸钠溶液浸泡3min，将树皮用0.1％质量百分含量的升汞浸泡3min，无菌水冲洗3～5次，最后一次无菌水冲洗液分别涂布于PDA和NA培养基平板上，28℃恒温培养3～4d，每个处理重复3次。若培养基平板上无菌落长出，表明该材料表面灭菌彻底。取经检验表面灭菌彻底的树皮和叶片分别剪碎，加入10mL无菌水和少许石英砂将树皮和叶片研磨成匀浆，静置20min后，各取0.1mL涂NA培养基平板，涂布均匀，每个处理重复3次，28℃恒温箱中培养3～5d，获得单菌落。

接种苹果轮纹病病原菌(Botryosphaeria berengriana f.sp piricola)(苹果轮纹病病原菌属子囊菌门、囊孢壳属的真菌，无性阶段为无性菌类大茎点菌属)(徐梅等，苹果轮纹病菌与干腐病菌的研究，河南林业科技，1999，19卷第2期)于PDA培养基平板中央，然后将上述获得的多个单菌落分别接种于苹果轮纹病病原菌的周围，每个平皿中，在苹果轮纹病病原菌周围4个方位各接种1株上述获得的单菌落，进行初筛，实验设3次重复，结果获得对苹果轮纹病病原菌有明显拮抗性的菌株。取上述获得的对苹果轮纹病病原菌有明显拮抗性的菌株，进行单株与病原菌对峙培养。采取一边接有明显拮抗性的菌株，一边接病原菌的对峙培养法进行复筛。结果得到2株对苹果轮纹病病原菌具有抑制作用的菌株，分别命名为KTB004和KTB005。

提取菌株KTB004的基因组DNA并以其为模板，分别以530F(5′-GTGCCAGCMGCCGCGG-3′)、1494R(5′-GGYTACCTTGTTACGACTT-3′)和63F(5′-CAGGCCTAACACATGCAAGTC-3′)、1387R(5′-GGGCGGTGTGTACAAGGC-3′)为引物进行PCR扩增，结果以530F和1494R为引物扩增出约1kb的片段，以63F和1387R为引物扩增出约1.3kb的片段。将上述扩增得到的1kb和1.3kb的DNA片段纯化回收后，分别连接到pMD-18T载体上，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞进行蓝白斑筛选，得到转化子，将得到的转化子分别用EcoR I和Hind III双酶切验证后测序。将酶切后的序列进行拼接，对拼接得到的序列进行BLAST比对，结果发现，菌株KTB004与枯草芽孢杆菌的16S rDNA序列的同源性达96％。分析菌株KTB004的16S rDNA的系统发生树状图也确定了此菌株的初步分类学的地位，与BLAST比对结果一致。在此基础上进行属内的各种生理生化指标的检测。结果表明，KTF004菌体杆状，长2～3μm，宽0.7～0.8μm，革兰氏反应阳性，芽孢椭圆形或柱状，中生或近中生，壁薄。孢囊不膨大，原生质中不含有β-羟基丁酸盐颗粒；在含有7％质量百分含量的NaCl中生长，石芯牛奶不产酸，pH5.7条件下生长，v.p阳性，水解淀粉，可产酸，与葡萄糖反应产气，能将NO^3-还原为NO^2-，厌氧条件下不能生长，接触酶阳性。与同种其它枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)相比菌体较宽。

提取菌株KTB005的基因组DNA并以其为模板，用通用引物63F和1387R进行PCR扩增，结果扩增出约1.3kb的片段。将扩增得到1.3kb的DNA片段纯化回收后，连接到pEASY-T3载体上，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞进行蓝白斑筛选，得到转化子，将得到的转化子用EcoR I和Not I双酶切验证后测序。结果表明，菌株KTB005与短小芽孢杆菌的16S rDNA序列的同源性达97％。分析菌株KTB005的16S rDNA的系统发生树状图也确定了此菌株的初步分类学的地位，与BLAST比对结果一致。在此基础上，进行属内的各种生理生化指标的检测。结果表明，KTB005菌体短杆状，大小为(2.0～3.0)μm×(0.6～0.7)μm，革兰氏反应阳性，芽孢呈椭圆形，不明显膨大，芽孢从中生到次端生，壁薄，易形成；在含有质量百分含量为2％、5％或7％的NaCl中均生长，在pH5.7或pH6.8的营养肉汤中均生长，v.p阳性，不水解淀粉，可产酸，不与葡萄糖反应产气，能以铵盐为氮源，可利用柠檬酸盐而不能利用丙酸盐，不还原硝酸盐，不能厌氧生长，接触酶阳性。

根据以上结果将菌株KTB004鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，将菌株KTB005鉴定为短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)。枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)KTB004和短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)KTB005均已于2008年12月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所)，保藏登记号分别为CGMCC № 2816和CGMCC № 2817。

实施例2、防治苹果真菌病害的菌剂的制备及其防治效果

一、防治苹果真菌病害的菌剂的制备

1、菌种活化与扩大培养

NA培养基的组成：牛肉膏3g/L、蛋白胨5g/L、NaCl 5g/L、琼脂20g/L。pH7.0～7.2。121～125℃、0.11～0.14MPa压力下灭菌30min。

将上述实施例1筛选得到的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)KTB004 CGMCC №2816和短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)KTB005 CGMCC № 2817用NA培养基分别进行划线培养，30～32℃温箱内培养24h，将经检查无杂菌、菌体生长整齐的菌落再置于30～32℃温箱内培养24～28h，肉眼观察，将菌苔丰满的单菌落涂片、染色检查无杂菌，孢子整齐时，作为发酵生产的菌种。

2、种子罐培养

种子培养基的组成：玉米粉：1.8％，鱼粉0.4％，淀粉2.8％，酵母粉0.17％，蛋白栋0.07％，豆粕粉1.67％，花生饼粉2.5％，中温豆饼粉1.25％，碳酸钙0.3％，硫酸镁0.06％，磷酸二氢钾0.03％。pH值7.0～7.2。121～125℃、0.11～0.14MPa压力下灭菌30min。

将经过上述步骤1活化后的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)KTB004 CGMCC №2816和短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)KTB005 CGMCC № 2817按照1％的体积百分含量分别接种于上述种子培养基中，装罐量为罐容积的70％。28～30℃、转速为220rpm条件下搅拌培养15～20h。

3、发酵罐发酵

发酵培养基的组成：玉米粉1.8％，鱼粉0.4％，淀粉2.8％，酵母粉0.17％，蛋白栋0.07％，豆粕粉1.67％，花生饼粉2.5％，中温豆饼粉1.25％，碳酸钙0.3％，硫酸镁0.06％，磷酸二氢钾0.03％。pH值7.0～7.5。121～125℃、0.11～0.14MPa压力下灭菌30min。

将上述步骤2的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)KTB004 CGMCC № 2816和短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)KTB005 CGMCC № 2817的种子液按照1％的体积百分含量分别接种于上述发酵培养基中，装罐量为罐容积的70％。30～32℃、转速为220rmp条件下搅拌培养40～45h，罐压为0.05MPa；通气量为1:1.5(即每分钟进出气体体积之比)，溶氧40％。

当芽孢形成量≥70％，个别芽孢开始脱落，并且杂菌率≤0.3％，发酵液中含菌量≥5×10⁹CFU菌体/ml时即可放罐。

5、防治苹果真菌病害的菌剂的制备

在上述步骤4获得的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)KTB004 CGMCC № 2816和短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)KTB005 CGMCC № 2817的发酵液中分别加入粒径为0.09mm的轻质碳酸钙进行吸附，加入吸附载体的量按照如下公式计算：

加入吸附载体后机械搅拌3～6h，使芽孢和孢子全部被吸附，然后再用板框压滤；将板框压滤后的滤饼捣碎后进行烘干，烘干时的温度不能超过40℃(为了防止菌体死亡)，并不断翻动，使受热均匀。当含水率≤5％时，将滤饼粉碎，使粉碎后颗粒的粒径≤0.09mm；将吸附有枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)KTB004 CGMCC №2816的颗粒和吸附有短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)KTB005 CGMCC № 2817的颗粒按照1：1的质量比混合，得到防治苹果真菌病害的菌剂。每克菌剂中含有5.0×10⁹CFU枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)KTB004 CGMCC № 2816和5.0×10⁹CFU短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)KTB005 CGMCC № 2817。

二、菌剂对苹果轮纹病的防治试验

在北京市昌平区流村镇北流村北流果园和河南省灵宝县大王镇王和村果园选择土壤性状一致、肥力均匀中等、往年苹果轮纹病发病相对均匀的果园(均为套袋果园)，进行菌剂的防治效果实验，每个处理区面积为2亩。

将上述步骤一制备的菌剂用水稀释，使稀释后菌剂的浓度为0.5g/L。将该菌剂分别在开花前(3月25日)、落花后至幼果期(4月25日)、套袋前(5月20日)、果实膨大期(6月30日)、7月30日和8月30日共6次均匀的喷施到果树树体上，滴水为度。同时以不喷施上述步骤一制备的菌剂的果树作为对照。

苹果摘袋后，在每个处理区内采用五点取样法，按照东、西、南、北、中五个方位选择树势及挂果量比较一致的果树，每点选1株果树摘无病果混在一起装箱(果实于10月17日采摘)，箱子上标明所摘树的编号。将果实放入室内常温(22℃)诱发，观察果实的发病情况，分别记载不同种类病害的发病率，计算防治效果，统计差异显著性。每次调查时凡是病果一律剔除，只计发病率不计病情指数，无病果继续诱发，统计和计算发病率和防治效果。

发病率(％)＝发病果数/调查总果数×100％，

防治效果(％)＝(对照区发病率—处理区发病率)/对照区发病率×100％。

分别于11月1日、11月17日和12月25日共3次对采自北京市昌平区流村镇北流村北流果园的苹果调查苹果的发病情况，结果见表1所示。

表1 菌剂对果实轮纹病及其它采后病害的防治效果

结果表明，在果实采摘2个月内上述步骤一制备的菌剂对苹果轮纹病、采后果实红腐病和褐腐病均有较为明显的防治效果，对苹果轮纹病的防效达到80.0％以上，对采后果实红腐病的防效达到10.7～45.6％，对褐腐病的防效达到10.0～40.0％，经SAS统计分析均达到显著水平。

分别于11月14日、12月24日、2008年1月14日共3次对采自河南省灵宝县大王镇王和村果园的苹果调查苹果的发病情况，结果如表2所示。

表2 菌剂对果实轮纹病的防治效果

结果表明，在果实采摘3个月内上述步骤一制备的菌剂对苹果轮纹病有较为明显的防治效果，其防效达到80％以上，经SAS统计分析达到极显著水平。

三、菌剂对苹果轮纹病、白粉病和苹果斑点落叶病的防治试验

在河南省三门峡市陕县原种场果园和河南省三门峡市陕县菜园乡桃王村果园选择土壤性状一致、肥力均匀中等、往年苹果轮纹病发病相对均匀的平地和山区果园(果实不套袋)，进行菌剂的防治效果实验，每个处理区面积为2亩。

将上述步骤一制备的菌剂用水稀释，使稀释后菌剂的浓度为0.5g/L和1.0g/L。将上述浓度的菌剂分别在开花前、落花后至幼果期、套袋前和果实膨大期均匀的喷施到果树树体上，滴水为度。同时以不喷施上述步骤一制备的菌剂的果树作为对照。

在每个处理区内采用五点取样法，按照东、西、南、北、中五个方位每点选择1株果树，从每株果树的东、南、西、北4个方位齐胸高处各选5个新稍，检查春梢叶片苹果斑点落叶病的发病情况。分级标准为：0级，无病斑；1级，每片叶1～5个病斑；2级，每片叶6～10个病斑；3级，每片叶11个病斑以上。秋梢部分不计。分级记载病叶数，计算病情指数和防病效果，统计分析差异显著性。苹果轮纹病的调查方法同步骤二。苹果轮纹病的发病率和防治效果的计算方法同步骤二。

于2008年9月25日对采自河南省三门峡市陕县原种场苹果园未套袋的果实调查苹果轮纹病的发病情况，结果如表3所示。

表3 菌剂对苹果轮纹病的防治效果

结果表明，浓度为0.5g/L和1.0g/L的上述步骤一制备的菌剂对苹果轮纹病的防治效果分别为84.1％和80.7％，经统计上述步骤一制备的菌剂对苹果轮纹病的防治效果均达到极显著水平。

于2008年7月3日对采自河南省三门峡市陕县原种场苹果园的果树叶片进行白粉病发病情况调查，结果见表4。

表4 菌剂对苹果叶部白粉病的防治效果

结果表明，浓度为0.5g/L和1.0g/L的上述步骤一制备的菌剂对白粉病的防治效果分别为60.9％和46.8％，经统计达到极显著水平。另外，用菌剂处理的叶片深绿，叶片较厚，未发生其它病害。

于2008年7月2日对采自河南省三门峡市陕县菜园乡桃王村果园的果树叶片进行白粉病发病情况调查，结果见表5。

表5 菌剂对苹果叶部白粉病的防治效果

结果表明，浓度为0.5g/L的上述步骤一制备的菌剂对白粉病的防治效果达到32.9％，经SAS统计达到显著水平。另外，用菌剂处理的叶片深绿，叶片较厚，未发生其它病害。

于2008年9月24日对采自河南省三门峡市陕县菜园乡桃王村果园的果树叶片进行苹果斑点落叶病的调查，结果见表6。

表6 菌剂对苹果斑点落叶病的防治效果

结果表明，浓度为0.5g/L的上述步骤一制备的菌剂对苹果斑点落叶病有明显的防治效果，防效达42.33％，经SAS统计分析达到极显著水平。另外，用菌剂处理的叶片深绿，叶片较厚，衰老落叶较少。

四、菌剂的促增产效果实验

在河南省三门峡市陕县原种场果园选择土壤性状一致、肥力均匀中等、往年苹果轮纹病发病相对均匀的平地和山区果园(果实不套袋)，进行菌剂的促增产效果实验，每个处理区面积为2亩。

将上述步骤一制备的菌剂用水稀释，使稀释后菌剂的浓度为0.5g/L和1.0g/L。将上述浓度的菌剂分别在开花前、落花后至幼果期、套袋前和果实膨大期均匀的喷施到果树树体上，滴水为度。同时以不喷施上述步骤一制备的菌剂的果树作为对照。

在每个处理区内采用五点取样法，按照东、西、南、北、中五个方位每点选择1株果树，从每株果树的东、南、西、北4个方位齐胸高处各选5个新稍，每个新梢从第4片叶起连续摘取5片叶，每树共计100片叶混在一起称重。计算百叶重和增重效果，统计分析差异显著性。产量调查分别从处理区和对照区的东、南、西、北、中5个方各选1株树，共5棵，将所有果实采摘称重，计算产量。平均单株百叶重和增重效果的计算方法如下：

平均单株百叶重(g)＝5株树百叶重的和/5，

增重效果(％)＝(处理区平均单株百叶重-对照区平均单株百叶重)/对照区平均单株百叶重×100％。

于2008年9月25日对采自河南省三门峡市陕县原种场苹果园的果树进行苹果叶片增重和苹果增产的统计，结果见表7。

表7 菌剂对苹果叶片增重效果

结果表明，上述步骤一制备的菌剂具有促进生长作用，苹果叶重增加2.09～5.04％，增加效果显著。且用菌剂处理的叶片深绿，叶片较厚。

分别从处理区和对照区的东、南、西、北、中5个方各选1株树，共5棵，将所有果实采摘称重，计算产量，统计增产率，结果如表8所示。

表8 菌剂增产效果测定

结果表明，上述步骤一制备的菌剂具有明显的增产效果，可使每亩苹果增产达9.3％以上，增加效果显著。