一种快速过滤筛选骨髓基质干细胞方法

摘要

本发明涉及一种过滤方法，具体地说关于一种快速过滤筛选骨髓基质干细胞方法。本发明的技术方案如下：一种快速过滤筛选骨髓基质干细胞方法，包括以下步骤：(1)将待用骨髓血进行抗凝处理；(2)抗凝处理后的骨髓血通过过滤复合器过滤；(3)收集干细胞－支架复合材料。本发明优点表现在：在骨髓基质干细胞进行过滤筛选的同时，进行了细胞与载体(即滤网材料)的快速复合，使细胞筛选与细胞－载体复合的两道工序合二为一。滤过方法耗时短，无需体外培养，可以术中同期进行，而且筛选的基质干细胞体积比之于密度梯度离心技术最后获得的细胞悬液体积要小得多，更利于临床使用。

说明书

技术领域

本发明涉及一种过滤方法，具体地说关于一种快速过滤筛选骨髓基质干细胞方法。

背景技术

骨缺损的修复往往需要植骨或骨替代材料填充，而目前在该领域组织工程的研究热点是复合有干细胞的支架载体。通过贴壁培养或密度梯度离心分离骨髓基质干细胞，再进行体外扩增的手段，虽然可以在体外分离骨髓基质干细胞、制备复合有细胞的支架载体，但仍处在实验室研究阶段，要植入人体，仍存在技术上和伦理学上的诸多问题，而且培养周期长，易污染，成本高，影响临床的应用推广。

目前细胞筛选技术主要有：1)流式细胞仪分离法，2)免疫磁珠分离法3)贴壁筛选法，4)密度梯度离心法。1)流式细胞仪分离法是应用特异的荧光抗体与细胞表面的抗原标志结合，然后应用流式细胞仪对其进行分选。2)免疫磁珠分离法是利用微磁珠既可结合蛋白质，又可被磁铁吸引的特点，经过一定处理，将抗体包被在磁珠上。通过与细胞表面特异性抗原结合，形成抗原-抗体磁珠免疫复合物。当该复合物通过分离柱时，在磁力作用下，即与母液分离，从而使筛选细胞与其他物质分离，达到筛选的目的。3)贴壁筛选法是目前实验室最常用的骨髓基质干细胞筛选方法。通过将骨髓血在培养皿中培养，24-48h后骨髓基质干细胞贴壁，借此可将骨髓基质干细胞与其它不贴壁的骨髓细胞分离。4)密度梯度离心法是常用的浓缩分离细胞的方法，利用不同细胞成分密度梯度的差异，通过离心可以使细胞在不同层次浓集，结合使用不同比重的分离液，将不同比重的细胞进行分层分离。以上现有技术有以下缺点：

1)流式细胞仪分离法分离细胞虽然分离迅速，纯度高，但是费用昂贵，对含量太低的痕量细胞难以分离，不能处理大量的细胞样品，要获得无菌的细胞悬液也很困难。2)免疫磁珠分离法对细胞的活性影响较大，回收率仅有60％-75％，可能会导致细胞完全失活，同样操作较复杂，价格昂贵。最关键的是目前对骨髓基质干细胞表面特异性的筛选抗体仍缺乏共识，所以使用该方法筛选骨髓基质干细胞尚处在研究阶段。3)贴壁筛选法是虽是目前实验室最常用的骨髓基质干细胞筛选方法。但需要时间较长，涉及细胞的体外培养，临床使用有一定难度。4)密度梯度离心法是常用浓缩分离细胞的方法，但往往需要使用分离介质(如Ficoll或Hypaque液等)，对于大容量骨髓血的基质干细胞的分离使用的分离介质也较大，而且最后需要洗去分离介质，要保持整个操作的无菌需要特殊的设备，费用昂贵。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种快速过滤筛选骨髓基质干细胞方法。

本发明的目的是通过以下技术方法来实现的：在“应用干细胞技术进行骨修复和再生的研究”中，发现由于人骨髓基质干细胞的粘附特性，当对250ml抗凝后的骨髓血进行过滤时(滤网孔径150-200μm，厚约300μm)，约有1/6～1/3的骨髓基质干细胞被选择性富集在滤网上。我们将滤网上的细胞洗脱后培养，可在体外形成碱磷酶(ALP)染色阳性的细胞集落(见图1)，提示这些细胞是可分化为成骨前体细胞的骨髓基质干细胞。将过滤用后的滤网直接剪下培养，可以发现这些细胞会在滤网上增殖，形成细胞集落(见图2、3)。滤网为常规的输血用滤器，孔径较大，约为150～200μm，滤网厚约300μm，是骨髓造血细胞和基质干细胞直径的数十倍。骨髓中大量的红细胞等造血系细胞，易于形变，不易粘附，加入抗凝剂后，血小板也不易聚集或黏附，滤过不受影响。而骨髓基质干细胞由于存在较强的粘附特性，在短短的数分钟过滤后，一些骨髓基质干细胞即可粘附在滤网上。同样在多孔磷酸三钙(可植入材料)上，我们也观察到相似的结果，骨髓基质干细胞可快速粘附在材料的内壁(见图4，5)。由此通过实验，发明了以可回植的材料作为滤网材料来进行骨髓基质干细胞的快速筛选，发明了并联循环式细胞选择性过滤复合器，并发明应用该过滤复合器多层次过滤或循环过滤的手段来最大程度的提高骨髓基质干细胞的筛选效率，从而形成了对原始骨髓血进行快速过滤筛选骨髓基质干细胞的方法。

本发明的技术方案如下：

一种快速过滤筛选骨髓基质干细胞方法，包括以下步骤：(1)将待用骨髓血进行抗凝处理；(2)抗凝处理后的骨髓血通过过滤复合器过滤；(3)收集干细胞-支架复合材料；其中所述的过滤复合器设有滤网，该滤网由多孔生物支架材料制成的。所述的过滤复合器包括注入泵，第一管道，第二管道，第一右连接管，第一左连接管，第二右连接管，第二左连接管，第一单向活瓣阀门，第二单向活瓣阀门，开关阀门，排气孔，蠕动泵，其中还包括过滤盒，过滤盒设有滤网，活动盖，滤网材料选自β-磷酸三钙、天然型无机骨NNB、脱钙骨基质DBM、煅烧骨、聚乳酸-聚羟乙酸(PLGA)、胶原、冻干松质骨，滤网网孔直径为300-700微米，滤网网孔直径优选为500微米，第一管道设有第二右连接管，第二右连接管设有内螺纹，第二管道设有第二左连接管，第二左连接管设有外螺纹，过滤盒一端设有内螺纹，过滤盒另一端设有外螺纹，过滤盒内螺纹与第二左连接管外螺纹连接，过滤盒外螺纹与第二右连接管内螺纹连接。第一管道设有第二右连接管与第二管道设有第二左连接管的管数相同。第二右连接管和第二左连接管的管数为两个、三个、四个、五个，过滤盒为两盒、三盒、四盒、五盒。第二右连接管和第二左连接管的管数优选为两个，过滤盒优选为两盒。第一管道设有第一右连接管，第一右连接管设有内螺纹，第二管道设有第一左连接管，第一左连接管设有外螺纹，蠕动泵一端设有内螺纹，蠕动泵另一端设有外螺纹，蠕动泵内螺纹与第一左连接管外螺纹连接，蠕动泵外螺纹与第一右连接管内螺纹连接。

本发明所公开一种快速过滤筛选骨髓基质干细胞方法，其优点表现在：1)快速过滤筛选骨髓基质干细胞方法，是利用基质干细胞本身的粘附特性，通过滤过时材料对干细胞的选择性储留作用进行细胞的筛选，不加入其它物质，对细胞的干扰小。2)在骨髓基质干细胞进行过滤筛选的同时，进行了细胞与载体(即滤网材料)的快速复合，使细胞筛选与细胞-载体复合的两道工序合二为一。3)滤过方法耗时短，无需体外培养，可以术中同期进行，而且筛选的基质干细胞体积比之于密度梯度离心技术最后获得的细胞悬液体积要小得多，更利于临床使用。

附图说明

图1上3孔为过滤骨髓血后的滤网细胞洗脱液，100μl/皿；下3孔为原始骨髓血100μl/皿，经体外诱导培养10天，显示碱磷酶(ALP)染色阳性细胞集落。

图2将过滤用后的滤网直接剪下，培养8天，有大量碱磷酶(ALP)阳性细胞集落生长(40x)。

图3滤网上碱磷酶(ALP)阳性骨髓基质干细胞粘附、拉丝生长(图2的放大，200x)。

图4骨髓血经多孔磷酸三钙滤过后，部分骨髓基质干细胞粘附在材料的表面和内壁(扫描电镜500x)。

图5骨髓血经多孔磷酸三钙滤过后，骨髓基质干细胞粘附在材料壁上(扫描电镜5000x)。

图6是本发明过滤复合器结构示意图。

图7是本发明过滤复合器另一结构示意图。

图8将抗凝后的骨髓血流经多孔生物支架材料制成的滤网，进行过滤。

图9利用骨髓基质干细胞特有的粘附特性，使骨髓基质干细胞在滤网上选择性储留富集，而其余的骨髓细胞则被滤过。

图10多层过滤有利于骨髓基质干细胞的高度筛选，并且细胞筛选的同时也进行了细胞-支架的复合，两道工序合二为一，制备干细胞-支架复合材料。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步描述。

实施例1

请参阅图6。

图6中有第一单向活瓣阀门1，开关阀门2，第二单向活瓣阀门3，排气孔4，蠕动泵5，过滤盒6，注入泵8，第一右连接管11，第一左连接管12，第二右连接管13，第二左连接管14，第一管道31，第二管道32，滤网61，活动盖62。

本发明工作方法如下：打开开关阀门2，将抗凝处理后的250ml骨髓血通过注入泵8进入第一管道31，关闭开关阀门2，打开蠕动泵5开关，骨髓血分别流入第二右连接管13，进入过滤盒6过滤，然后流到第二管道32，在蠕动泵5蠕动和滤网61作用下，250ml骨髓血中的骨髓基质干细胞在滤网上选择性储留富集，滤过其余的骨髓细胞，关闭蠕动泵5开关，打开活动盖62，取出富集骨髓基质干细胞滤网61，收集得到干细胞-支架复合材料备用。

本发明过滤复合器，包括注入泵8，第一管道31，第二管道32，第一右连接管11，第一左连接管12，第二右连接管13，第二左连接管14，第一单向活瓣阀门1，第二单向活瓣阀门3，开关阀门2，排气孔4，蠕动泵5，还包括过滤盒6，过滤盒6设有滤网61，活动盖62，所述的注入泵8连接第一管道31，第一管道31设有第一右连接管11和第二右连接管13，第一右连接管11和第二右连接管13分别设有内螺纹，第二管道32设有第一左连接管12，第二左连接管14，第一左连接管12和第二左连接管14分别设有外螺纹，蠕动泵5一端设有内螺纹，蠕动泵5另一端设有外螺纹，蠕动泵5内螺纹与第一左连接管12外螺纹连接，蠕动泵5外螺纹与第一右连接管11内螺纹连接，过滤盒6一端设有内螺纹，过滤盒6另一端设有外螺纹，过滤盒6内螺纹与第二左连接管14外螺纹连接，过滤盒6外螺纹与第二右连接管13内螺纹连接，第二管道32设有开关阀门2、排气孔4，第一右连接管11设有第一单向活瓣阀门1，第一管道31设有第二单向活瓣阀门3。

需说明的是，本实施例中第二右连接管13，第二左连接管14的管数为两个，过滤盒6为两盒，滤网61材料选自β-磷酸三钙，滤网61网孔直径为500微米。

实施例2

请参阅图7。

图7中有第一单向活瓣阀门1，开关阀门2，第二单向活瓣阀门3，排气孔4，蠕动泵5，过滤盒6，注入泵8，第一右连接管11，第一左连接管12，第二右连接管13，第二左连接管14，第一管道31，第二管道32，滤网61，活动盖62。

本发明工作方法如下：打开开关阀门2，将抗凝处理后的300ml骨髓血通过注入泵8进入第一管道31，关闭开关阀门2，打开蠕动泵5开关，骨髓血分别流入第二右连接管13，进入过滤盒6过滤，然后流到第二管道32，在蠕动泵5蠕动和滤网61作用下，300ml骨髓血中的骨髓基质干细胞在滤网上选择性储留富集，滤过其余的骨髓细胞，关闭蠕动泵5开关，打开活动盖62，取出富集骨髓基质干细胞滤网61，收集得到干细胞-支架复合材料备用。

本发明过滤复合器，包括注入泵8，第一管道31，第二管道32，第一右连接管11，第一左连接管12，第二右连接管13，第二左连接管14，第一单向活瓣阀门1，第二单向活瓣阀门3，开关阀门2，排气孔4，蠕动泵5，还包括过滤盒6，过滤盒6设有滤网61，活动盖62，所述的注入泵8连接第一管道31，第一管道31设有第一右连接管11和第二右连接管13，第一右连接管11和第二右连接管13分别设有内螺纹，第二管道32设有第一左连接管12，第二左连接管14，第一左连接管12和第二左连接管14分别设有外螺纹，蠕动泵5一端设有内螺纹，蠕动泵5另一端设有外螺纹，蠕动泵5内螺纹与第一左连接管12外螺纹连接，蠕动泵5外螺纹与第一右连接管11内螺纹连接，过滤盒6一端设有内螺纹，过滤盒6另一端设有外螺纹，过滤盒6内螺纹与第二左连接管14外螺纹连接，过滤盒6外螺纹与第二右连接管13内螺纹连接，第二管道32设有开关阀门2、排气孔4，第一右连接管11设有第一单向活瓣阀门1，第一管道31设有第二单向活瓣阀门3。

需说明的是，本实施例中第二右连接管13，第二左连接管14的管数为五个，过滤盒6为五盒，滤网61材料选自胶原，滤网61网孔直径为400微米。

实施例3

请参阅图8，9，10。

图8中有过滤复合器60，滤网61，骨髓基质干细胞71，其它骨髓细胞72，

图9中有过滤复合器60，滤网61，骨髓基质干细胞71，其它骨髓细胞72，

图10中有过滤复合器60，滤网61，骨髓基质干细胞71，其它骨髓细胞72，干细胞-支架复合材料7。

手术中抽取250ml骨髓血，进行抗凝处理。选用磷酸三钙作为滤网61材料，滤孔孔径可使骨髓细胞顺利通过。将抗凝后的骨髓血注入过滤复合器60进行过滤(图8)。利用骨髓基质干细胞特有的粘附特点，使骨髓基质干细胞71在滤网上选择性储留富集，滤过其余的骨髓细胞72(图9)。多平面过滤有利于骨髓基质干细胞的高度筛选。同时将细胞筛选与细胞-支架的复合这两道工序合二为一，制备干细胞-支架复合材料7(图10)。