公开/公告号CN101450056A
专利类型发明专利
公开/公告日2009-06-10
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申请/专利权人 深圳市宏锦天生物科技有限公司;
申请/专利号CN200710195690.0
发明设计人 邱芳龙;
申请日2007-12-06
分类号A61K31/529(20060101);A61K31/519(20060101);A61P31/00(20060101);
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代理人
地址 518067 广东省深圳市南山区蛇口工业七路广物花园2栋8单元
入库时间 2023-12-17 22:01:59
法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2013-04-24
授权
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2011-01-26
实质审查的生效 IPC(主分类):A61K31/529 申请日:20071206
实质审查的生效
2010-07-07
专利申请权的转移 IPC(主分类):A61K31/529 变更前: 变更后: 登记生效日:20100601 申请日:20071206
专利申请权、专利权的转移
2009-06-10
公开
公开
技术领域
本发明涉及钠离子通道阻断剂类化合物及其药用盐和酯在治疗抗生素对人体或生物耐药性的应用领域
背景技术
本发明所述的钠离子通道阻断剂类化合物及其药用盐或酯是指1、以河豚毒素(tetrodotoxin)为代表的天然水生生物提取或者人工合成的氨基全氢化喹唑啉类小分子化学成分。其分子结构式：
河豚毒素平面结构(I) 河豚毒素立体结构(II)
式中：R1＝R2＝R4＝R5＝OH，R3＝CH2OH；河豚毒素(tetrodotoxin)
R1＝R3＝R4＝R5＝OH，R2＝CH2OH；
河豚毒素分子式：C11H17N3O8，分子量319.27。
2、以石房蛤毒素(saxitoxin)为代表的从天然水生生物提取或者人工合成的双胍基氢化嘌呤环类化合物。其分子结构式：
R1＝R2＝R3＝R4＝H 石房蛤毒素(STX)
R1＝OH，R2＝R3＝R4＝H 新石房蛤毒素(N-STX)
R1＝OH，R2＝R4＝H，R3＝OSO3 赤藻毒素(POP)
河豚毒素(Tetrodotoxin，简称TTX)类化合物和石房蛤(saxitoxin，简称STX)类化合物最早是从水生物中提取分离和人工合成，有关提取和人工合成早有文献报道，河豚毒素和石房蛤毒素的化学结构研究见CN2007101439995和文献[1]。本发明中所指的钠离子通道阻断剂的生物活性极强，现有的技术中，还未见有关于本发明中所指的，氨基全氢化喹唑啉类化合物和双胍基氢化嘌呤环类化合物及其衍生物的盐和酯用于治疗抗生素对人体或生物耐药性的应用研究。
抗生素是人类克服疾病，确保人体健康，延年益寿必不可缺少的药品。从1928年英国微生物学家费莱明发现青霉素(盘尼西林Penicillin)到1942年青霉素大批量生产用于临床，至今有60多年，在这期间，全世界至少有50亿人受益于各种类型的抗生素药品。几十年来，用抗生素救活的人不计其数。抗生素不仅对病源性微生物，包括细菌、真菌、螺旋体、放线菌、支原体、衣原体具有抑制和杀灭作用，而且对癌细胞和恶性肿瘤也有良好的抑制和杀灭作用。
目前临床上使用的抗生素药品约有500多个品种，这些抗生素就成了临床各科医师最常用的一类药物。可以说人类能有今天的健康长寿和高质量的生活，抗生物类药品是功不可没。然而人类在大量使用抗生素治疗病源性微生物给人类导入的各种各样疾病的同时也造成了对抗生素的过度依赖和滥用，这一结果必将导致病源性微生物对其拮抗的抗生素产生“耐药性”。据科学统计人类开发一个新抗生素，几乎要花10-20年的时间和数十亿美金，但是因为人类单纯追求抗生素快速治疗效果及人们对抗生素产生的过分依赖性和无意识的滥用，一个新开发的抗生素往往在1-2年内就使人体内的病源微生物对其产生了拮抗性。使抗生素失去了治疗人类重大疾病的价值。有些病人因为过多滥用抗生素几乎要达到了无药可治病的地步。除此之外，人类在农牧种植养殖业、水产养殖业中，滥用抗生素的现象也非常普遍，几乎人类自身使用的全部抗生素都在农牧业、水产养殖业中广泛使用。科学研究证实，耐药细菌可以从一个地区传到另一个地区，从一个国家传到另一个国家，甚至从动物、植物传到人。使人体在不知情或无意识中被动、植物体内积蓄的“耐药病菌”或“病源微生物的残留病菌株”通过食物链的方式传染。随着人们交流的频繁和便捷，耐药细菌传播到人体内并产生拮抗抗生素的速度越来越快，范围越来越广。所以，抗生素耐药性已成为一个全球性的严重问题。科学发现，自然界病源微生物无处不在，它本身也是一个生命，当有外面的物质侵入时会自卫、防御、反击，最后的结果就是耐药性。是病源性微生物保护自己的必然措施。病源性微生物的生存之道，是千方百计适应环境，一但进入人体细胞内就开始大量繁殖，继而爆发、并感染其他细胞，要阻止它不断制造与繁衍，目前人们仅仅知道的就是使用各种抗生素、可以有效的杀死这些病源性微生物。然而由于病源性微生物的生命周期很短，代与代的间隔很小。几乎4小时等于一个世代，每一个世代能繁殖一千多倍，随时间的变化而不断倍增，一但人体被病源微性生物感染患病，即使病人使用能杀死这种病源性微生物的抗生素，当中只要有一个被抗生素还未被杀死或者是杀伤的病源性微生物发生基因突变，产生病变蛋白，该病变蛋白会引发抗药性菌株生成。人类要解决这种病源性微生物对抗生素产生耐药性的重点就必须控制和防止这种病源性微生物的基因演化。
本发明的目的就是研究发现钠离子通道阻断剂是可以有效抑制“耐药病菌”或“病源微生物的残留病菌株”的化学成分，使用本发明钠离子通道阻断剂类的药品或者化学成分，能快速将人体内或动物体内残留的“耐药病菌”或“病源微生物的残留病菌株”拮抗或将其排泄出人体或生物体外，减少病源性微生物对抗生素的耐药性。
发明内容
本发明的目的之一，是使用钠离子通道阻断剂类化合物及其可药用盐或酯，制备治疗抗生素类药品对人体或生物体产生耐药性的应用。
本发明的目的之二，是使用钠离子通道阻断剂类化合物显著提高抗生素药效时，而且使用的钠离子通道阻断剂自身不会残留在人体或生物体内。
本发明的另一目的，是使用钠离子通道阻断剂类化合物治疗人体或生物体内残留耐药性病源微生物的使用剂量。
本发明使用的钠离子通道阻断剂是指，一、氨基全氢化喹唑啉类化合物是以河豚毒素(tetrodotoxin，简称TTX)为代表的化合物及其衍生物或者合成(修饰)化学成分及其药用盐和酯；二、双胍基氢化嘌呤环类化合物是以石房蛤毒素(saxitoxin，简称STX)为代表的化合物及其衍生物或者合成(修饰)化学成分及其药用盐和酯。本发明中所述的氨基全氢化喹唑啉类化合物及其衍生物或者合成(修饰)化学成分及其药用盐和酯化学结构式如下：
河豚毒素平面结构(I) 河豚毒素立体结构(II)
式中：R1＝R2＝R4＝R5＝OH，R3＝CH2OH；河豚毒素(tetrodotoxin)
R1＝R3＝R4＝R5＝OH，R2＝CH2OH；异河豚毒素
河豚毒素分子式为：C11H17N3O8，分子量319.27，其化学结构式的研究见专利CN2007101439995。
本发明制备氨基全氢化喹唑啉类衍生物及其药学上可接受的盐或酯组合物的技术特征，是以河豚毒素为母体结构的天然提取或者人工合成的化合物，其中：
R1选自：氢；卤素；C1-C5烷氧基；C1-C5卤代烷氧基；C3-C6环烷氧基；C3-C6环烷基；C2-C6链烯基；C2-C6链炔基；C5-C10芳基部分和C1-C6烷基部分的芳烷基或C5-C10芳基；氨基；C1-C6烷氨基；酰基；C1-C6烷酰基；R3＝R4＝R5＝OH，R2＝CH2OH。
当R1＝H，或OH时，R2选自：CH2OH；C1-C5烷羟基；卤素；C1-C5烷氧基；C1-C5卤代烷氧基；C3-C6环烷氧基；C3-C6环烷基；C2-C6链烯基；C2-C6链炔基；C5-C10芳基部分和C1-C6烷基部分的芳烷基或C5-C10芳基；氨基；C1-C6烷氨基；酰基；C1-C6烷酰基；C1-C6烷醛基；R3＝R4＝R5＝OH。
当R1＝H，或OH；；R2＝CH2OH时，R3选自：氢；羟基；C1-C5烷羟基；卤素；C1-C5烷氧基；C1-C5卤代烷氧基；C3-C6环烷氧基；C3-C6环烷基；C2-C6链烯基；C2-C6链炔基；C5-C10芳基部分和C1-C6烷基部分的芳烷基或C5-C10芳基；氨基；C1-C6烷氨基；酰基；C1-C6烷酰基；R4＝R5＝OH。
当R1＝H，或OH时，R2＝CH2OH；R3＝OH时；R4选自氢；羟基；C1-C5烷羟基；卤素；C1-C5烷氧基；C1-C5卤代烷氧基；C3-C6环烷氧基；C3-C6环烷基；C2-C6链烯基；C2-C6链炔基；C5-C10芳基部分和C1-C6烷基部分的芳烷基或C5-C10芳基；氨基；C1-C6烷氨基；酰基；C1-C6烷酰基；R5＝OH。
当R1＝H，或OH时，R2＝CH2OH；R3＝R4＝OH；R5选自：氢；羟基；C1-C5烷羟基；卤素；C1-C5烷氧基；C1-C5卤代烷氧基；C3-C6环烷氧基；C3-C6环烷基；C2-C6链烯基；C2-C6链炔基；C5-C10芳基部分和C1-C6烷基部分的芳烷基或C5-C10芳基；氨基；C1-C6烷氨基；酰基；C1-C6烷酰基；
可用于实施本发明所述组合物的新用途优选河豚毒素的主要衍生物及其药学上可接受的盐有：
R1＝H，R3＝R4＝R5＝OH， R2＝CH2OH； (去氧河豚毒素)
R1＝OCH3，R3＝R4＝R5＝OH； R2＝CH2OH； (甲氧河豚毒素)
R1＝OCH2CH3，R3＝R4＝R5OH； R2＝CH2OH； (乙氧河豚毒素)
R1＝NH2，R3＝R4＝R5OH； R2＝CH2OH； (氨基河豚毒素)
本发明制备组合物技术特征的河豚毒素(I)在弱酸水溶液或盐溶液中，是以酯和半缩醛基的互变异构体或对映体形式存在(II)，
式中：
R1＝R3＝R4＝R5＝OH，R2＝CH2OH；碳7-酯基或者半缩醛基异构体
R1＝R2＝R4＝R5＝OH，R3＝CH2OH；异碳7-酯基或者半缩醛基异构体
式中：R1＝R2＝R4＝R5＝OH，R3＝CH2OH；异碳5-酯基或者半缩醛基异构体
R1＝R3＝R4＝R5＝OH，R2＝CH2OH；碳5-酯基或者半缩醛基异构体
本发明组合物新用途，技术特征的河豚毒素(I)在弱酸性和盐溶液条件下，易转化为C-4互变异构体或对映体(III)，
式中：
R1＝R3＝R4＝R5＝OH，R2＝CH2OH；4-表河豚毒素
R1＝R2＝R4＝R5＝OH，R3＝CH2OH；异4-表河豚毒素
以C-4表河豚毒素为代表的一类天然提取或者人工合成化合物及其药学上可接受的盐，其中：
R1选自氢；卤素；C1-C5烷氧基；C1-C5卤代烷氧基；C3-C6环烷氧基；C3-C6环烷基；C2-C6链烯基；C2-C6链炔基；C5-C10芳基部分和C1-C6烷基部分的芳烷基或C5-C10芳基；氨基；C1-C6烷氨基；酰基；C1-C6烷酰基；R3＝R4＝R5＝OH，R2＝CH2OH。
当R1＝H，或OH时，R2选自：CH2OH；C1-C5烷羟基；卤素；C1-C5烷氧基；C1-C5卤代烷氧基；C3-C6环烷氧基；C3-C6环烷基；C2-C6链烯基；C2-C6链炔基；C5-C10芳基部分和C1-C6烷基部分的芳烷基或C5-C10芳基；氨基；C1-C6烷氨基；酰基；C1-C6烷酰基；C1-C6烷醛基，R3＝R4＝R5＝OH。
当R1＝H，或OH；；R2＝CH2OH时，R3选自：氢；羟基；C1-C5烷羟基；卤素；C1-C5烷氧基；C1-C5卤代烷氧基；C3-C6环烷氧基；C3-C6环烷基；C2-C6链烯基；C2-C6链炔基；C5-C10芳基部分和C1-C6烷基部分的芳烷基或C5-C10芳基；氨基；C1-C6烷氨基；酰基；C1-C6烷酰基；R4＝R5＝OH。
当R1＝H，或OH时，R2＝CH2OH；R3＝OH时；R4选自氢；羟基；C1-C5烷羟基；卤素；C1-C5烷氧基；C1-C5卤代烷氧基；C3-C6环烷氧基；C3-C6环烷基；C2-C6链烯基；C2-C6链炔基；C5-C10芳基部分和C1-C6烷基部分的芳烷基或C5-C10芳基；氨基；C1-C6烷氨基；酰基；C1-C6烷酰基；R5＝OH。
当R1＝H，或OH时，R2＝CH2OH；R3＝OH时；R4＝OH；R5选自：氢；羟基；C1-C5烷羟基；卤素；C1-C5烷氧基；C1-C5卤代烷氧基；C3-C6环烷氧基；C3-C6环烷基；C2-C6链烯基；C2-C6链炔基；C5-C10芳基部分和C1-C6烷基部分的芳烷基或C5-C10芳基；氨基；C1-C6烷氨基；酰基；C1-C6烷酰基；
本发明组合物新用途技术特征的河豚毒素(I)在室温，酸性和盐溶液条件下，易变成脱水(脱羟基)河豚毒素(IV)及它们的对映异构体，
式中：R2＝R4＝R5＝OH，R3＝CH2OH；R1＝H 碳4-脱水异河豚毒素
R3＝R4＝R5＝OH，R2＝CH2OH；R1＝H 碳4-脱水河豚毒素
R1＝R4＝R5＝OH，R3＝CH2OH；R2＝H 碳6-异脱水河豚毒素
R1＝R4＝R5＝OH，R2＝CH2OH；R3＝H 碳6-脱水河豚毒素
R1＝R2＝R5＝OH，R3＝CH2OH；R4＝H 碳8-异脱水河豚毒素
R1＝R3＝R5＝OH，R2＝CH2OH；R4＝H 碳8-脱水河豚毒素
R1＝R2＝R4＝OH，R3＝CH2OH；R5＝H 碳9-异脱水河豚毒素
R1＝R3＝R4＝OH，R2＝CH2OH；R5＝H 碳9-脱水河豚毒素
本发明组合物新用途的河豚毒素(I)在室温，强酸性和盐溶液条件下，(I)易变成双脱水(脱羟基)河豚毒素醚(V或VI或VII)或它们的对映异构体，
式中：R2＝R4＝R5＝OH，R3＝O＝R1碳4，碳11-脱水成异河豚毒素醚
R3＝R4＝R5＝OH，R2＝CH2O＝R1碳4，碳11-脱水成河豚毒素醚
式中：R3＝ R5＝OH，R2＝CH2OHR4＝O＝R1 碳4，碳8-脱水成河豚毒素醚
式中：R3＝R4＝OH，R2＝CH2OH，R5＝O＝R1碳4，碳9-脱水成河豚毒素醚
式中优选4，9-脱水河豚毒素，4，9脱水6-表河豚毒素
在室温，强碱性条件下，(I)容易转变成河豚毒素酸(VIII)类衍生物及其酯，
式中：
R1＝R3＝R4＝R5＝OH，R2＝CH2OH；R＝H 河豚酸
R1＝R2＝R4＝R5＝OH，R3＝CH2OH；R＝H 异河豚酸
以河豚毒素酸类为代表的天然提取或者人工合成化合物，其中：
R1选自氢；卤素；C1-C5烷氧基；C1-C5卤代烷氧基；C3-C6环烷氧基；C3-C6环烷基；C2-C6链烯基；C2-C6链炔基；C5-C10芳基部分和C1-C6烷基部分的芳烷基或C5-C10芳基；氨基；C1-C6烷氨基；酰基；C1-C6烷酰基；R2＝R4＝R5＝OH，R3＝CH2OH；R＝C1-C8烷基或芳环。
当R1＝H，或OH时，R2选自：CH2OH；C1-C5烷羟基；卤素；C1-C5烷氧基；C1-C5卤代烷氧基；C3-C6环烷氧基；C3-C6环烷基；C2-C6链烯基；C2-C6链炔基；C5-C10芳基部分和C1-C6烷基部分的芳烷基或C5-C10芳基；氨基；C1-C6烷氨基；酰基；C1-C6烷酰基；C1-C6烷醛基；R3＝R4＝R5＝OH，R＝C1-C8烷基，烷氨基，C1-C5烷羟基；卤素或芳环。
当R1＝H，或OH；；R2＝CH2OH时，R3选自：氢；羟基；C1-C5烷羟基；卤素；C1-C5烷氧基；C1-C5卤代烷氧基；C3-C6环烷氧基；C3-C6环烷基；C2-C6链烯基；C2-C6链炔基；C5-C10芳基部分和C1-C6烷基部分的芳烷基或C5-C10芳基；氨基；C1-C6烷氨基；酰基；C1-C6烷酰基；R4＝R5＝OH；R＝C1-C8烷基，烷氨基，C1-C5烷羟基；卤素或芳环。
当R1＝H，或OH时，R2＝CH2OH；R3＝OH时；R4选自氢；羟基；C1-C5烷羟基；卤素；C1-C5烷氧基；C1-C5卤代烷氧基；C3-C6环烷氧基；C3-C6环烷基；C2-C6链烯基；C2-C6链炔基；C5-C10芳基部分和C1-C6烷基部分的芳烷基或C5-C10芳基；氨基；C1-C6烷氨基；酰基；C1-C6烷酰基；R5＝OH；R＝C1-C8烷基，烷氨基，C1-C5烷羟基；卤素或芳环。
当R1＝H，或OH时，R2＝CH2OH；R3＝OH时；R4＝OH；R5选自：氢；羟基；C1-C5烷羟基；卤素；C1-C5烷氧基；C1-C5卤代烷氧基；C3-C6环烷氧基；C3-C6环烷基；C2-C6链烯基；C2-C6链炔基；C5-C10芳基部分和C1-C6烷基部分的芳烷基或C5-C10芳基；氨基；C1-C6烷氨基；酰基；C1-C6烷酰基；R＝C1-C8烷基，烷氨基，C1-C5烷羟基；卤素或芳环。
当R1＝R3＝R4＝R5＝H，或OH时，R2＝CH2OH，R选自；C1-C5烷羟基；卤素；C1-C5烷氧基；C1-C5卤代烷氧基；C3-C6环烷氧基；C3-C6环烷基；C2-C6链烯基；C2-C6链炔基；C5-C10芳基部分和C1-C6烷基部分的芳烷基或C5-C10芳基；氨基；C1-C6烷氨基；酰基；C1-C6烷酰基；R5＝OH；R＝C1-C8烷基，烷氨基，C1-C5烷羟基；卤素或芳环。
其中优选的河豚酸及其酯有：
R1＝R3＝R4＝R5＝OH，R2＝CH2OH；R＝C1-C8烷基或芳环，河豚酸酯
R1＝H，R2＝R4＝R5＝OH，R3＝CH2OH；R＝C1-C8烷基或芳环，去氧河豚酸酯
R1＝OCH3，R2＝R4＝R5OH；R3＝CH2OH；R＝C1-C8烷基或芳环，甲氧河豚酸酯
R1＝OCH2CH3，R2＝R4＝R5OH；R3＝CH2OH，R＝C1-C8烷基或芳环，乙氧河豚酸酯
R1＝NH2，R2＝R4＝R5OH；R3＝CH2OH；R＝C1-C8烷基或芳环氨基河豚酸酯
本发明中所述双胍基氢化嘌呤环类化合物及其药用盐和酯，是以石房蛤毒素为主的化合物及其衍生物或者是合成(修饰)化学成分。其化学结构式为[4]：
R1＝R2＝R3＝R4＝H 石房蛤毒素(STX)
R1＝OH，R2＝R3＝R4＝H 新石房蛤毒素(N-STX)
R1＝OH，R2＝R4＝H R3＝OSO3 赤藻毒素(POP)
钠离子通道阻断剂可专一的阻止钠离子进入细胞内，阻止神经细胞、肌肉细胞产生兴奋活动。科学研究认为，细胞膜对不同物质具有不同的通透性。膜内外的离子浓度不同，膜内主要为钾离子，膜外主要为钠离子。细胞膜内外侧通常保持50-100mv的负静息电位。神经一兴奋电位差就起变化，即产生去极化。这种电位变化增加了钠离子对细胞膜的通透性，钠离子一流入神经细胞膜内，膜电位就起变化，钾离子接着就流出。这样一系列的变化，使与膜表面相邻的部分之间造成了局部回路，造成的局部回路导致相邻部位去极化，由于去极化，再次造成细胞膜兴奋，增加钠离子内流，此种形式，向邻近部位一一传递。传递的速度为0.1-100米/秒。兴奋一旦消失，流入的钠离子又回到细胞膜外侧，钾离子流入膜的内侧，产生去极化。这也是细胞膜的信息通道，河豚毒素和石房蛤毒素及其衍生物或其盐、酯是控制细胞膜的电位极差变化，阻止钠离子的流通，使其与钠相关的信息受阻。在机体中钠离子通道被阻断后，机体的神经系统、心血管系统、代谢功能都会产生重要变化。但是本发明的钠离子通道阻断剂及其可接受的盐或酯类在生物体内如何将抗生素耐药菌株排除体外的机理目前我们还未能清晰阐述，仍然在继续研究，但是这并不限制本发明的实际用途及其使用效果。
本发明制备的氨基全氢化喹唑啉类化合物和双胍基氢化嘌呤环类化合物及及其衍生物和它药学上可接受的盐，包括无机酸如盐酸、氢溴酸、氢碘酸、次氯酸、硫酸、亚硫酸、硫代硫酸、磷酸、氢磷酸、二氢磷酸、碳酸、次碳酸、硝酸、亚硝酸和有机酸盐，包括醋酸、草酸、枸橼酸、苹果酸、酒石酸、马来酸、琥珀酸、半琥珀酸、水杨酸、甲磺酸、烷基苯磺酸，马尿酸等形成的盐类或酯类，可根据现有制药技术使用药物学上的载体、赋形剂或其他添加剂，制成各种剂型，如将其制成皮下、肌肉、穴位或静脉注射剂，口服制剂(包括舌下含片)、油制剂、皮肤贴敷、渗透、泵渗透、肛门栓剂、气雾剂。优选注射剂、口服制剂和皮肤贴剂。制剂含河豚毒素和石房蛤毒素纯度为80--110％，最优选为90-105％。其制剂含河豚毒素和双胍基氢化嘌呤环类化合物及为标示量的80-120％。最优选为90-110％。使用氨基全氢化喹唑啉类化合物和双胍基氢化嘌呤环类化合物及的用药剂量为：每单位人体或生物体用药为：每人或每生物0.001--50μg/次，1-2次/天。最优选为，0.01--30μg/次。
本发明中所述的氨基全氢化喹唑啉类化合物和双胍基氢化嘌呤环类化合物及在治疗抗生素对人或生物体耐药性的新用途，所指的抗生素产生耐药性病毒菌株，是由目前常见和临床上常用的各种抗生素所导致或者引发的。如：(1)胺类抗生素，主要包括两大类：①青霉素类，也是最早的β-内酰胺类，其常用的药品有，青霉素钠盐或钾盐，氨苄西林钠，氧哌嗪青霉素，阿莫西林，普鲁卡因青霉素，苯唑西林钠，氯唑西林钠，哌拉西林，阿洛西林，美洛西林，替卡西林钠，美西林，青霉素V等，②头孢菌素类，常用的药品有头孢氨苄，头孢羟氨苄，先锋V号，头孢拉定，头孢曲松，头孢曲松钠，头孢噻吩钠，头孢硫脒，头孢唑啉，头孢曲秦，头孢克洛，头孢孟多，头孢呋辛，头孢呋辛酯，头孢替氨，头孢噻肟，头孢唑肟，头孢甲肟，头孢哌酮，头孢他啶，头孢地啶，头孢唑南，头孢泊肟酯，头孢克肟，头孢地尼，头孢特仑，头孢匹罗，头孢布希，头孢拉姆酯，头孢替坦，头孢米诺，头孢美唑，拉氧头孢，头孢比肟，头孢丙烯等，(2)氨基苷(甙)类，常用的药品有链霉素，新霉素，阿米卡星，妥布霉素，西索米星，奈替米星，依替米星，核替米星，地贝米星，异帕米星，小诺米星，大观霉素，庆大霉素，卡那霉素，小诺霉素，阿司米星等，(3)四环素类，常用的药品有四环素，土霉素、多西环素，金霉素，米诺环素等，(4)氯霉素类，常用的药品有氯霉素，氯霉素棕榈酸酯，甲砜霉素等，(5)大环内酯类，常用的药品有红霉素，罗红霉素，罗他霉素，地红霉素，琥乙红霉素，麦迪霉素，乙酰麦迪霉素，乙酰螺旋霉素，吉他霉素，克拉霉素，阿奇霉素，麦白霉素等，(6)林可霉素类，常用的药品有洁霉素、克林霉素，林可霉素等，(7)、抗细菌抗生素类，常用的药品有去甲万古霉素、磷霉素、多粘菌素、巻曲霉素、利福平，杆菌肽，夫西地酸，替考拉宁等，(8)、抗真菌抗生素类，常用的药品有两性霉素B、灰黄霉素、克念菌素、制霉菌素、曲古霉素，卡泊芬净，氟胞嘧啶，咪康唑，氟康唑，伊曲康唑，特比萘芬，克霉唑，益康唑，伏拉康唑，噻康唑等，(9)、抗肿瘤抗生素类，常用的药品有丝裂霉素、阿霉素、表阿霉素、放线菌素D，博来霉素，平阳霉素，培洛霉素，柔红霉素等，(10)具有免疫抑制作用的抗生素类，常用的药品有环孢素，阿西洛韦，阿糠腺苷，碘苷，利巴韦林，更昔洛韦，拉米夫定等，(11)、喹诺酮类，常用的药品有氧氟沙星，环丙沙星，诺氟沙星，依诺沙星，培氟沙星，托氟沙星，氟罗沙星，洛美沙星，芦氟沙星，加替沙星，莫昔沙星，司氟沙星，左氧氟沙星等，(12)、抗结核类，常用的品种有异烟肼，异烟腙，吡嗪酰胺等，(13)、抗生素与酶抑制剂联合药物类，常用的品种有阿莫西林/克拉维酸，氨苄西林/舒巴坦，哌拉西林/他唑巴坦，替卡西林/克拉维酸钾，头孢哌酮/舒巴坦，亚胺培南/倍他米隆，及美罗培南等对人或生物体产生的耐药性病菌株残留物。
目前的科学研究认为，病源微生物对抗生素产生耐药性机理，有如下原因：
1、病源微生物产生药物失活酶，如β内酰胺酶可使β内酰胺类抗生素失效；如氨基糖苷修饰酶可使氨基糖苷类失效；目前最重要的β内酰胺酶是超广谱β内酰胺酶(Extended spectrumbeta-lactamases，ESBLs)、染色体异型酶(AmpC)和碳青霉烯水解酶(OXA)三种。ESBLs主由质粒介导，又可分为TEM、SHV、OXA等类型；AmpC既可由染色体介导，也可由质粒介导，因对头孢菌素水解率高于青霉素类，故又称为头孢菌素酶，迄今巳达30余种，OXA是ESBLs酶的一种，又称金属β内酰胺酶或碳青霉烯水解酶，能灭活青霉素、头孢菌素和碳青霉烯类(培南类)抗生素，甚至能灭活酶抑制剂，包括克拉维酸、舒巴坦和他唑巴坦。近年还出现了质粒介导的碳青霉烯水解酶，使有害细菌或者病毒对很多广谱抗生素发生耐药。值得强调的是一种细菌的同一质粒可携带多类抗菌药的耐药基因，即同时可产生多种酶，如大肠埃希菌和肺炎克雷白杆菌可同时产生ESBLs和AmpC，被称为超强广谱酶(SSBLs)。
2、病源微生物靶部位发生改变，如细菌PBPs改变使β-内酰胺类耐药S12蛋白改变使链霉素耐药；
3、病源微生物等建立靶旁路系统，如细菌新建青霉素结合蛋白2(PB2)，使甲氧西林对金葡球菌耐药；
4、病源微生物代谢途径改变，抗生素类药物可与细菌生长所必须的某些物质结合，影响其生长繁殖，如抗磺胺类细菌能利用自已合成的叶酸，而不需要外源性PABA；
5、病源微生物使膜(壁)通透性降低，如细菌膜蛋白变性、膜孔蛋白(通道蛋白或外膜蛋白)缺如或形成生物膜，使亚胺培南对铜绿假单孢菌耐药；
6、病源微生物膜泵外排，目前已知有5个家族、20多种外排泵，是四环素、氯霉素、喹喏酮类等最常见的耐药原因，也是细菌产生MDR的主要原因。
也有些科学家认为病源微生物所以产生耐药性，均是由病源微生物染色体编码介导质粒，即DNA或RNA突变所致，这种介导质粒在未使用抗生素以前就存在了，这实际上是病菌将突变作为一种自我防御的措施(简称病源微生物的SOS应答)。当病菌处于极端逆境下时，它们会尝试各种方式，将受到的损伤作为突变的初始步骤。然后，它们开启一些基因——这些基因表达的蛋白会加速突变的发生，这类突变的产生速度，比细胞复制期间产生突变的速度要快1万倍。实质上，这些细胞经受了一种迅速的身份转变。在未与抗生素相遇时，它们很少携带耐药基因。但自从与抗生素药物相互拮抗以后，介导质粒已成为捕获或传播耐药基因的最佳载体。例如，大肠埃希杆菌(即大肠杆菌，Escherichia coli)通过发出SOS，对环丙沙星和其他抗生素造成的持久性DNA损伤作出应答。发生突变，开始阻止环丙沙星结合其靶标——促旋酶。而促旋酶是DNA复制时所必需的介导质粒。如果病源微生物SOS应答突变，成功阻止抗生素与其靶标—促旋酶的结合，病源细菌就会突变成耐药菌株，从而使抗生素失去杀病源菌株的活性。如果细菌不能阻止抗生素与促旋酶结合，那么细菌的DNA就不能正常复制，就会断裂，接着病源细菌就会死亡。这也是抗生素杀菌，治病的有效过程。这其中，如果抗生素与病源微生物的靶标—促旋酶结合，不被病源微生物SOS应答突变所阻断。那么病源微生物就不会在与抗生素的拮抗过程中，在人体体内残留下耐药病毒菌株。由此可见如果能找到某种能关闭病源微生物SOS应答系统的成分，就能阻止这些细菌的过度进化，就能防止这些细菌的过度突变，也就能解决病源微生物对抗生素产生的耐药性。
2002年美国加利福尼亚大学伯克利分校Floyd Romsberg科学家和Ryan T.Cirz、JodieK.Chin以及他们在威斯康星大学麦迪逊分校的合作者发现，一种LexA蛋白可以抑制细菌的SOS应答，而环丙沙星会引起LexA蛋白的剪切，从而诱发大肠杆菌中的SOS超突变。一旦LexA蛋白被剪切，三种DNA聚合酶就开始制造突变，让细菌迅速产生耐药性。罗姆斯伯格找到了一种能和抗生素一起服用的小分子药物，该药物可以阻止LexA受到剪切。在对小鼠服用的环丙沙星试验中，结果发现小鼠对环丙沙星没有产生抗药性。
2005年中国四川大学生命科学院的研究人员发现，葡萄提取物有消除O157大肠杆菌耐药性的作用。这些研究成果阐明，抗生素的耐药性是可以解决的。
本发明发现，钠离子通道阻断剂类化合物一、氨基全氢化喹唑啉类化合物以河豚毒素(tetrodotoxin，简称TTX)为代表的化合物及其衍生物或者合成(修饰)化学成分的盐和酯；二、双胍基氢化嘌呤环类化合物以石房蛤毒素(saxitoxin，简称STX)为代表的化合物及其衍生物或者合成(修饰)化学成分的盐和酯，可以显著的抑制病源微生物，提高抗生素的效价，也许是和膜泵外排或者使膜(壁)通透性降低让病源微生物不产生SOS应答突变有关。
目前的研究证明，河豚毒素及其衍生物类成分有选择性地阻滞或阻断细胞膜兴奋时钠离子流入细胞膜内侧，从而抑制神经肌肉细胞膜的电位变化，也就抑制了神经一兴奋冲动的传递，但钾离子在细胞膜内外的流动却不受河豚毒素的影响。在这个过程中病源微生物的细胞膜的电位差被极化后失去与体内与正常细胞的结合机会，从而使病源微生物中耐药菌株被排除体外。钠离子通道阻断剂是一种极强的膜外钠离子通道阻断剂，在阻断神经肌肉细胞膜的电位变化时，可以促进人体或动物体内LexA蛋白的生成，而且当钠离子阻断剂单独或与抗生素一同使用时，通过专一性的阻断生物体内钠离子通道就可以防止抗生素对人体体内的LexA蛋白受到剪切，并能专一性的抑制和拮抗病源微生物发生突变。这种变化不受目前已知的各种耐药病毒菌株的机理影响。虽然抗生素产生耐药性的机理有很多，目前科学家还未完全搞清楚，还有待我们进一步的深入研究，但我们现有的实验，并不影响本发明的实施，通过使用本发明的钠离子通道阻断剂可以显著提高抗生素的效价和抑制耐药性菌株对人体的抗药性，这也许是本发明对人类战胜疾病的一个贡献。
钠离子通道阻断剂中的河豚毒素和石房蛤毒素的药代动力学研究证实，河豚毒素和石房蛤毒素自身不会在人体体内残留，造成钠离子通道阻断剂对人体或生物体的污染。在拮抗抗生素耐药病菌时所使用的河豚毒素或石房蛤毒素在48—72小时以后，它自身通过生物体汗腺、糞便、尿液等代谢排出体外。
本发明的钠离子通道阻断剂即可以单独使用，也可以和现有的各种抗生素合用。在与抗生素合用时有显著提高抗生素药效的作用。合用的抗生素有：(1)胺类，主要包括：①青霉素类，②头孢菌素类，(2)氨基苷(甙)类，(3)四环素类，(4)氯霉素类，(5)大环内酯类，(6)林可霉素类，(7)抗细菌抗生素类，(8)抗真菌抗生素类，(9)抗肿瘤抗生素类，
(10)具有免疫抑制作用的抗生素类，(11)喹诺酮类，(12)抗结核类，(13)抗生素与酶抑制剂联合药物等。
本发明的显著技术进步特征是：
1、将钠离子通道阻断剂氨基全氢化喹唑啉和双胍基氢化嘌呤环类化合物及其衍生物的盐和酯的组合物，用于治疗抗生素对人或生物体耐药性是本发明人经过大量实验发现的最具有实用价值的新用途，通过本技术的应用它可以非常显著提高人类的健康、生活质量和延长人类的预期寿命。
2、用本发明的钠离子通道阻断剂类化合物及其衍生物的盐和酯提高抗生素的效价或抗生素的敏感率无论是单独使用还是和其它抗生素制剂合用都有显著的使用效果。
3、用本发明的钠离子通道阻断剂类化合物及其衍生物盐和酯和抗生素合用时，在对其合用的抗生素类药物增效的同时还可以明显降低抗生素的副作用。
4、用本发明的钠离子通道阻断剂类化合物降低抗生素耐药性的同时还减少了抗生素的使用剂量。
实施方案
一、注射用河豚毒素的配制方法：
1、河豚毒素及其盐
A、河豚毒素 5.0μg B、河豚毒素 10.0μg
枸橼酸及钠盐缓冲液 2.1：2.9μg 水杨酸及盐 0.15μg
乳糖 250.0μg 乳糖 50.0μg
注射用水 1.0-2.0ml 注射用水 1.0-2.0ml
C、河豚毒素 10.0μg D、河豚毒素 15.0μg
酒石酸及盐 0.15μg 磷酸及盐 0.15μg
乳糖 50.0μg 蔗糖 50.0μg
注射用水 1.0-2.0ml 注射用水 1.0-2.0ml
2、4-表河豚毒素及其盐
E、4-表河豚毒素 5.0μg F、4-表河豚毒素 10.0μg
枸橼酸及盐 2.1：2.9μg 醋酸及盐 0.15μg
麦芽糖 25.0μg 蔗糖 50.0μg
注射用水 1.0-2.0ml 注射用水 1.0-2.0ml
G、4-表河豚毒素 5.0μg H、4-表河豚毒素 10.0μg
盐酸及盐 0.14μg 硝酸及盐 0.15μg
麦芽糖 25.0μg 蔗糖 50.0μg
注射用水 1.0-2.0ml 注射用水 1.0-2.0ml
3、脱水河豚毒素及其盐
a、脱水河豚毒素 5.0μg b、脱水河豚毒素 10.0μg
枸橼酸及盐 0.14μg 苹果酸 0.15μg
乳糖 25.0μg 乳糖 50.0μg
甘露醇 7.5mg 甘露醇 7.5mg
注射用水 1.0-2.0ml 注射用水 0-2.0ml
c、脱水河豚毒素 5.0μg d、脱水河豚毒素 10.0μg
醋酸 0.14μg 酒石酸 0.15μg
乳糖 25.0μg 乳糖 50.0μg
甘露醇 7.5mg 甘露醇 7.5mg
注射用水 1.0-2.0ml 注射用水 0-2.0ml
4、河豚酸及其酯
e、河豚毒素酸 10.0μg f、河豚毒素酸酯 15.0μg
磷酸钠 1.5μg 枸橼酸钠 0.15μg
枸橼酸钠 0.01μg 蔗糖 50.0μg
乳糖 50.0μg 甘露醇 15.0mg
注射用水 1.0-2.0ml 注射用水 1.0-2.0ml
5、氨基河豚毒素及其酯
g、氨基河豚毒素 5.0μg h、乙氨基河豚毒素 10.0μg
盐酸酸 0.14μg 硫酸 0.15μg
麦芽糖 25.0μg 蔗糖 50.0μg
甘露醇 25.0mg 甘露醇 20.0mg
注射用水 1.0-2.0ml 注射用水 1.0-2.0ml
二、河豚毒素盐的制备
例1、取河豚毒素(TTX)，含量(95-99％)10mg，用柠檬酸150μg，用柠檬酸钠调制成PH＝5.0-7.0的溶液，按每2ml含10ug计算，制成1000支注射液，用HPLC检测，含量合格后，灌装，灭菌，符合医用卫生标准或者兽用标准，即可使用，简称：河豚毒素盐A。
例2、取脱氧河豚毒素，含量(85-98％)1mg，用草酸150μg，用草酸钠调制成PH＝5.0-7.0的溶液，按每2ml含10ug计算，制成1000支注射液，用PLC检测，含量合格后，灌装，灭菌，符合医用卫生标准或者兽用标准，即可使用，简称：河豚毒素B。
例3、取河豚毒素酸，含量(85-95％)1mg，用苹果酸150μg，配制成PH＝5.0-7.0的溶液，按每2ml含10ug计算，制成1000支注射液，用PLC检测，含量合格后，灌装，灭菌，符合医用卫生标准或者兽用标准，即可使用，简称：河豚毒素C。
例4、取4-表河豚毒素，含量(95-98％)1mg，用甲磺酸150μg，配制成PH＝5.0-7.0的溶液，按每2ml含10ug计算，制成1000支注射液，用PLC检测，含量合格后，灌装，灭菌，符合医用卫生标准或者兽用标准，即可使用，简称：河豚毒素D。
例5、取氨基河豚毒素酸，含量(85-95％)1mg，用酒石酸150μg，配制成PH＝5.0-7.0的溶液，按每2ml含10ug计算，制成1000支注射液，用PLC检测，含量合格后，灌装，灭菌，符合医用卫生标准或者兽用标准，即可使用，简称：河豚毒素E。
三、注射用石房蛤毒素的配制方法：
1、石房蛤毒素及其盐
A、石房蛤毒素 3.0μg B、石房蛤毒素 10.0μg
枸橼酸及钠 2.1：2.9μg 水杨酸酸 0.15μg
乳糖 25.0μg 乳糖 50.0μg
注射用水 1.0-2.0ml 注射用水 1.0-2.0ml
C、石房蛤毒素 10.0μg D、石房蛤毒素 5.0μg
酒石酸 0.15μg 磷酸 0.15μg
乳糖 50.0μg 蔗糖 50.0μg
注射用水 1.0-2.0ml 注射用水 1.0-2.0ml
2、新石房蛤毒素及其盐
A、新石房蛤毒素 3.0μg B、新石房蛤毒素 10.0μg
枸橼酸 1.4μg 水杨酸酸 0.15μg
乳糖 25.0μg 乳糖 50.0μg
注射用水 1.0-2.0ml 注射用水 1.0-2.0ml
C、新石房蛤毒素 10.0μg D、新石房蛤毒素 5.0μg
酒石酸 0.15μg 磷酸 0.15μg
乳糖 50.0μg 蔗糖 50.0μg
注射用水 1.0-2.0ml 注射用水 1.0-2.0ml
3、赤藻毒素及其盐
A、赤藻毒素 3.0μg B、赤藻毒素 10.0μg
枸橼酸 1.4μg 水杨酸酸 0.15μg
乳糖 25.0μg 乳糖 50.0μg
注射用水 1.0-2.0ml 注射用水 1.0-2.0ml
C、赤藻毒素 10.0μg D、赤藻毒素 5.0μg
酒石酸 0.15μg 磷酸 0.15μg
乳糖 50.0μg 蔗糖 50.0μg
注射用水 1.0-2.0ml 注射用水 1.0-2.0ml
四、石房蛤毒素盐的制备
例1、取石房蛤毒素，含量(95-99％)10mg，用柠檬酸150μg，配制成PH＝5.0-7.0的溶液，按每2ml含10ug计算，制成1000支注射液，用HPLC检测，含量合格后，灌装，灭菌，符合医用卫生标准或者兽用标准，即可使用，简称：石房蛤毒素盐A。
例2、取新石房蛤毒素，含量(85-98％)1mg，用草酸150μg，配制成PH＝5.0-7.0的溶液，按每2ml含10ug计算，制成1000支注射液，用PLC检测，含量合格后，灌装，灭菌，符合医用卫生标准或者兽用标准，即可使用，简称：新石房蛤毒素B。
例3、取赤藻毒素，含量(85-95％)1mg，用苹果酸150μg，配制成PH＝5.0-7.0的溶液，按每2ml含10ug计算，制成1000支注射液，用PLC检测，含量合格后，灌装，灭菌，符合医用卫生标准或者兽用标准，即可使用，简称：赤藻毒素C。
五、检测河豚毒素和石房蛤毒素仪器和试剂
1、仪器和试剂
1.1、Agilent型HPLC仪，带UV检测及色谱工作站，Agela C8柱或C18柱，离心机，超声波震荡提取器。
1.2、试剂：庚烷基磺酸钠、磷酸盐缓冲液、HCN流动相，0.01mM庚烷基磺酸钠(PH＝5.0磷酸)+1％HCN溶液，检测波长，UV-198nm；流速，1.0ml/min；灵敏度，0.05ng/ml。
2、标准曲线及最低检出浓度
精密称定河豚毒素及其石房蛤毒素适量，加流动相溶解并稀释成含河豚毒素0.3、1.56、3.125、6.25、12.5、25、50和100μg/ml的溶液，摇匀。分别取上述溶液20μl注入液相色谱仪，重复三次，取平均值，结果见表1。
表1 HPLC法测定河豚毒素含量与吸收峰面积
以浓度与峰面积作线性回归，其直线方程为Y＝42.012X+32.303，R2＝0.9997，X为浓度，Y为峰面积，表明河豚毒素在0.3~100μg/ml浓度范围内，浓度与其峰面积呈良好的线性关系。
在本发明实验条件下，最低检测浓度为0.07ng/ml。
3、方法的准确度
加样回收试验：精密称取河豚毒素及石房蛤毒素，配为高、中、低三个浓度的样品，按HPLC含量测定方法测定，根据标准曲线测定含量，计算回收率，结果见表2。结果表明，方法的总平均回收率为99.98％，SD为0.011，HPLC方法的准确度很好。
表2 加样回收试验结果
4、方法的精密度
精确配制62μg/ml的河豚毒素溶液，按含量测定项下设定的方法连续进样6次，按标准曲线计算含量，结果见表3。
表3 方法的精密度试验结果
结果表明，HPLC法含量测定的精密度较好。
六、检测抗生素仪器和试剂
1、方法一：
A、Waters-515型HPLC仪，带Uv和电化学检测及色谱工作站，C8柱或C18柱，离心机，超声波震荡提取器。
B、试剂：甲醇(色谱纯)，环己烷，吡啶，乙醇，氢氧化钠溶液(0.55mol/l)，盐酸溶液(0.05mol/l).磷酸及其缓冲液，醋酸及其缓冲液。所用试剂均为分析纯，所用水符合GB。
C、(1)分析柱，ZORBAX C-18250nmX250cm；流动相，甲醇，水(65∶35)检测波长，UV-220-263nm；流速，0.65ml/min；灵敏度，0.01ng/ml。(2)分析柱，C-8150nmX2nm；流动相，磷酸缓冲液(65∶35)检测波长，UV-220-283nm；流速，0.5ml/min；灵敏度，0.01ng/ml。
D、标准曲线及最低检出浓度
称取环丙沙星(喹诺酮类抗生素)10mg于100ml量瓶中，用0.1mol/l盐酸溶解并定容至刻度，摇匀，为贮备液。取贮备液1.0ml至100ml量瓶中，用盐酸定容，摇匀，为工作液。从工作液中取1.0ml、2.0ml、4.0ml、6.0ml、8.0ml、10.0ml于10ml量瓶中，用盐酸稀释至刻度，摇匀，浓度分别为0.1μg/ml、0.3μg/ml、0.5μg/ml、0.8μg/ml、1.0μg/ml、1.2μg/ml，1.5μg/ml，2.0μg/ml，分别进样20μl测定相应的峰面积。以浓度与峰面积作线性回归，其直线方程为Y＝4484531X+0.005579，R2＝0.9995，X为浓度，Y为峰面积，表明环丙沙星在0.1~2.0μg/ml浓度范围内，浓度与其峰面积呈良好的线性关系。在本文实验条件下，最低检测浓度为0.01ng/ml。
表4 HPLC法测定环丙沙星含量与吸收峰面积
E、方法的准确度
加样回收试验：采用标准加入法。取未检测出含环丙沙星的血液样品，定量添加环丙沙星后再进行检测，将检测值除以实际添加值，计算回收率。具体操作如下：取阴性血液样品0.20g，精密称定，置100ml量瓶中，准确加入一定量的对照品工作液，混匀，加入盐酸溶液约70ml，浸泡过夜，置超声波摇荡器上20min，用盐酸溶液定容至刻度，摇匀，静置。取上清液离心10min(4000r/min)，准确吸取上清液10.0ml，置分液漏斗，滴加氢氧化钠溶液碱化，振摇5min，用环己烷提取二次，每次20ml，合并正己烷层，定容至50ml。从中吸取5.0ml，置水浴蒸干，向残渣中准确加入甲醇适量，使环丙沙星充分溶解，并使其浓度约为0.2μg/ml～0.8μg/ml，经0.45μ微孔滤膜过滤，注入高压液相色谱仪测定。测得回收率为97.1％～98.8％，结果参见表5。
表5 样品平均回收率和精密度±SD(n＝5)
F、方法的精密度
分别取对照组未注射环丙沙星等抗生素的毕格犬和大鼠的血各2.0g，精密称定，置100ml量瓶中，加盐酸溶液70ml浸泡过夜，以下按回收率项目方法操作，各测定5次。测定结果是未注射环丙沙星等抗生素的血液全为阴性，注射了环丙沙星等抗生素的血液测定平均结果3.63ug/kg。CV为1.8％。
七、筛选抗生素品种
1、品种：(1)环丙沙星，标准品，标示量(98.5％)药检所购买。(2)妥布霉素，标准品，标示量(98.6％)药检所购买。(3)多西环素，标准品，标示量(95.2％)药检所购买。(4)乙酰螺旋霉素，标准品，标示量(98.5％)药检所购买。(5)利福平，标准品，标示量(98.5％)药检所购买。(6)益康唑，标准品，标示量(98.5％)药检所购买。(7)阿霉素，标准品，标示量(98.5％)药检所购买。(8)阿西洛韦，标准品，标示量(97.5％)药检所购买。(9)依诺沙星，标准品，标示量(98.5％)药检所购买，(10)吡嗪酰胺，标准品，标示量(98.5％)药检所购买。
2、实验结果：
用注射环丙沙星等抗生素饲养5天后的狗和大鼠用河豚毒素A、B、a、e、g石房蛤毒素A、N-stx-A、POP-A分别给狗和大鼠肌注或静脉注射，动物注射TTX用量为0.1ug/Kg，然后间隔8小时取狗和大鼠血液，测其环丙沙星等抗生素的含量。并用未注射环丙沙星等抗生素的狗和大鼠血液作对照。结果见表6
表6 使用TTX-A、B、a、e、g、和STX-A、N-stx-A、POP-A平均用量0.1ug/kg检测量ppm P>0.01
续表6
2、方法二、检测抗生素仪器和试剂
A、Waters-515型HPLC仪，带Uv和电化学检测及色谱工作站，C8柱或C18柱，离心机，超声波震荡提取器。
B、试剂：甲醇(色谱纯)，环已烷，吡啶，乙醇，氢氧化钠溶液(0.55mol/l)，盐酸溶液(0.05mol/l).磷酸及其缓冲液，醋酸及其缓冲液。所用试剂均为分析纯，所用水符合GB。
C、(1)分析柱，ZORBAX C-180.45um×150nmX250cm；流动相，甲醇，水(65∶35)检测波长，UV-210-350nm；流速，1.0ml/min；灵敏度，0.01ng/ml。
(2)分析柱，Agel C-80.45um×150nmX250cm；流动相，磷酸缓冲液(65∶35)检
测波长，UV-210-420nm；流速，1.0ml/min；灵敏度，0.01ng/ml。
D、标准曲线及最低检出浓度
称取青霉素等抗生素对照品10mg于100ml量瓶中，用0.1mol/l盐酸溶解并定容至刻度，摇匀，为对照品贮备液。取对照品贮备液1.0ml至100ml量瓶中，用盐酸定容，摇匀，为对照品工作液。从工作液中取1.0ml、2.0ml、4.0ml、6.0ml、8.0ml、10.0ml于10ml量瓶中，用盐酸稀释至刻度，摇匀，浓度分别为0.1μg/ml、0.2μg/ml、0.4μg/ml、0.6μg/ml、0.8μg/ml、1.0μg/ml，分别进样20μl测定相应的峰面积。当青霉素浓度在0.1μg/ml～1.0μg/ml范围时，浓度与相应的峰面积线性关系良好，回归方程为Y＝4484531X+0.005579，相关系数为0.9995。在本文实验条件下，最低检测浓度为0.05μg/ml。
E、回收率试验
采用标准加入法。取未检测出含青霉素的血液样品，定量添加青霉素后再进行检测，将检测值除以实际添加值，计算回收率。具体操作如下：取阴性血液样品0.20g，精密称定，置100ml量瓶中，准确加入一定量的对照品工作液，混匀，加入盐酸溶液约70ml，浸泡过夜，置超声波摇荡器上20min，用盐酸溶液定容至刻度，摇匀，静置。取上清液离心10min(4000r/min)，准确吸取上清液10.0ml，置分液漏斗，滴加氢氧化钠溶液碱化，振摇5min，用环己烷提取二次，每次20ml，合并正己烷层，定容至50ml。从中吸取5.0ml，置水浴蒸干，向残渣中准确加入甲醇适量，使青霉素充分溶解，并使其浓度约为0.2μg/ml～0.8μg/ml，经0.45μ微孔滤膜过滤，注入高压液相色谱仪测定。测得回收率为89.5％～96.1％，结果参见表7。
表7 回收率测定结果(n＝5)
分别取对照组未注射青霉素等抗生素的比格犬和大鼠的血各2.0g，精密称定，置100ml量瓶中，加盐酸溶液70ml浸泡过夜，以下按回收率项目方法操作，各测定5次。测定结果是未注射青霉素等抗生素的血液全为阴性，注射了青霉素等抗生素的血液测定平均结果3.63ug/kg。CV为4.6％。以上证明实验仪器可靠。
八、钠离子通道阻断剂拮抗抗生素的品种
1、品种：(1)青霉素V，标准品，标示量(95.5％)药检所购买。(2)妥布霉素，标准品，标示量(98.6％)
药检所购买。(3)多西环素，标准品，标示量(94.2％)药检所购买。(4)乙酰螺旋霉素，标准品，标示量(98.5％)药检所购买。(5)利福平，标准品，标示量(91.5％)药检所购买。(6)益康唑，标准品，标示量(91.5％)药检所购买。(7)阿霉素，标准品，标示量(91.5％)药检所购买。(8)阿西洛韦，标准品，标示量(91.5％)药检所购买。(9)依诺沙星，标准品，标示量(91.5％)药检所购买。(10)吡嗪酰胺，标准品，标示量(91.5％)药检所购买。
2、实验结果：
用青霉素等抗生素饲养5天后的狗和大鼠用河豚毒素TTX-A、石房蛤毒素STX-A分别给狗和大鼠肌注或静脉注射，平均TTX用量0.05ug/Kg，然后间隔8小时取狗和大鼠血液，测其青霉素等抗生素的含量。并用未注射青霉素等抗生素的狗和大鼠血液作对照。结果见表8
表8 使用TTX-A、STX-A平均用量0.05ug/kg检测量ppm P>0.01
九、病源性细菌耐药性检测
1、鲍曼不动杆菌药敏性试验。采用KB纸片扩散法。操作结果判断读数严格按照美国临床实验标准化委员会(NCCLS)2004版判断标准。
A、仪器，VITEK-32全自动微生物分析仪。
B、药敏纸，购自北京天坛生物技术开发公司。
C、革兰阴性鉴定板(GNI+)鉴定到菌种。
D、对照菌株，购自卫生部临检中心。研究结果见表9
表9，656株鲍曼不动杆菌对临床常用抗生素耐药率和使用TTX、STX后的耐药率
2、阴沟肠杆菌的药敏性试验。采用KB纸片扩散法。操作结果判断读数严格按照美国临床实验标准化委员会(NCCLS)2004版判断标准。
A、抗菌药物纸片：氨苄西林(AM)、哌拉西林(PIP)、头孢他啶(CAZ)、头孢噻肟(CTX)、
头孢曲松(CR0)、头孢吡肟(FEP)、环丙沙星(CIP)、左氧氟沙星(LEV)、阿米卡星(AK)、泰能(IMP)、氨曲南(ATM)、布霉素(TB)、复方新诺明(SXT)购北京微生物试剂有限公司。
B、M+H培养基购于北京微生物有限公司。
C、对照菌种，大肠埃希菌ATCC25923，铜绿假单胞菌ATCC2783，金黄色葡萄球菌ATCC259233购自临床检验中心。
D、耐药检测：(1)、超广谱抗生素EsBLs检测，将细菌菌落稀释成0.5mm麦氏浊度的菌液，均匀涂末于M-H平板上，贴上头孢他啶等抗生素的药敏纸中，孵育24hr(37C)，若抗生素的平均抑菌环≤2-27mm，可判断为有EsBLs酶的产生。(2)、AMPC酶的检测：将细菌菌落用生理盐水稀释成0.5mm麦氏浊度，均匀涂抹于M-H平板上，贴1片头孢西丁等各种抗生素的药敏纸片，当抑菌环直径为≤8-21mm，既可疑为产Ampc酶。实验结果见表10，
表10，常用抗生素对225株阴沟肠杆菌耐药率和使用TTX、STX后的耐药率
3、对肺炎克雷伯菌(KPN)的耐药性检测。操作结果判断读数按照美国临床实验标准化委员会(NCCLS)2004版判断标准。
A、药敏试验方法。
采用VitekGPS-101药敏卡(法国生物梅里埃公司产品)。用Vitek统计软件进行资料统
计分析。对351株KPN和AEEF细菌的耐药率见表11.
表11 不同来源的KPN标本对常用抗生素的耐药率和使用TTX、STX后的耐药率
4、对洋葱伯克霍尔德耐药性检测.操作结果判断读数按照美国临床实验标准化委员会(NCCLS)2004版判断标准。
A、药敏试验方法。药敏纸为英国Oxoid公司，数据分析用WHONET-5软件。对常用抗生素的耐药性检测结果见表12.
表12，洋葱伯克霍尔德菌对常用抗生素和TTX的耐药率
5、对幽门螺杆菌的耐药性检测。用Etst法检测。
A、菌株分离，将活体组织用研磨器研磨，滴加0.5ml转送液，分别接种于8％哥伦比亚(英国OXOID)血琼脂平皿并添加SR147E，37C，湿度90％，培养3-5天，选取半透明小菌落进行鉴定。
B、药敏试验，取72hr传统培养物HP品于BH1肉汤(法国外bio-Merieux)管中，调配菌液浓度至1.0Mc，以加样器取100μl菌液于直径90mm，厚度4+0.5mm的血琼脂平皿上，用玻璃棒涂布均匀，放置10min用Etest试条(瑞典AB BIODISK)贴放在琼脂表面，于椭圆形抑菌环与试条的交界点读取MIC值。结果见表13.
表13，幽门螺杆菌、抗生素和TTX的耐药率
6、对屎肠球菌(AREF)耐药性检测，操作结果判断读数按照美国临床实验标准化委员会(NCCLS)2004版判断标准。
A、药敏试验方法。
采用VitekGPS-101药敏卡(法国生物梅里埃公司产品)。用Vitek统计软件进行资料统计分析。对351株KPN和AEEF细菌的耐药率见表14.
表14 屎肠球菌(AREF)、TTX对抗生素的耐药率
7、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的研究
对甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)耐药性检测，操作结果判断读数按照美国临床实验标准化委员会(NCCLS)2004版判断标准。
A、药敏试验方法。
采用VitekGPS-101药敏卡(法国生物梅里埃公司产品)。用Vitek统计软件进行资料统计分析。对851株(MRSA)细菌的耐药率见表14.
表15 甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)与TTX对抗生素的耐药率
8、与抗生素合用提高抗生素效价的研究
A、选用抗生素品种：氨苄青霉素、环丙沙星、氨曲南、头孢呋肟。
B、选用菌种：甲氧西林金黄色葡萄球菌、屎肠球菌(AREF)、铜绿假单胞菌ATCC2783、大肠埃希菌ATCC25923、金黄色葡萄球菌ATCC259233。购自临床检验中心。
C、灭菌率检测：将细菌菌落种数计算的菌液，均匀涂末于M-H平板上，作对照组，将加入河豚毒素和石房蛤毒素抗生素的药(1mg/ml)中，孵育24hr(37C)，计算抗生素的平均抑菌率(菌种数)，用未加入TTX和STX样品作对照组，实验结果见表15
表15 抗生素与TTX、STX合用的抑菌率
续表15
以上实验结果证实，将本发明的钠离子通道阻断剂制备成药品或保健品，可以显著的提高抗生素的药效和治疗抗生素的耐药性问题。
参考文献
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机译： 靶向激光和抗生素治疗多药耐药性生物膜的方法
机译： 使用可用于注射的β-内酰胺酶抑制剂对抗β-内酰胺酶治疗的抗生素耐药性的组合物
机译： 使用可用于注射的β-内酰胺酶抑制剂来对抗β-内酰胺酶治疗的抗生素耐药性的组合物
