用于血液替代品和其他治疗用途的优化的氟碳乳剂

摘要

本发明是涉及具有连续水相和不连续氟碳相的稳定的氟碳乳剂，该氟碳相包含两种氟碳化合物并出人意料地证实全氟溴癸烷在稳定某种浓度的全氟溴辛烷乳剂时比更加高度浓缩的全氟溴辛烷/全氟溴癸烷乳剂有效，且没有在更高浓缩的乳剂中经历的问题，例如更长的器官滞留时间、形成PFDB结晶、更大的乳剂颗粒、生产问题和不能重复给药，这些都是更高浓度的全氟溴癸烷内在的问题所致。

说明书

应用领域

本发明涉及氟碳和全氟碳乳剂，它们被最优化配制为血液携氧体 用于人类患者并且预防暴露于同源或异源输血以及其他治疗用途。更 具体地说，本发明涉及具有连续水相和非连续氟碳相的氟碳乳剂配方， 该配方显示出最佳的稳定性及最小的器官滞留，因此避免了不希望的 副作用。

发明背景

血液是一种在非细胞的、连续的血浆相中的胶体颗粒(例如红细胞 和白细胞、蛋白质等)的复杂分散相。血液分散相的组分提供了大部分 的生物学功能，包括将氧运送至组织、止血、宿主防御、营养素和激 素的运输以及代谢废物的排除。虽然血液所有的功能都非常重要，但 是血液的精髓作用还是氧的传送。缺氧或缺血会快速导致细胞、组织 和器官不可逆的退化。

当前，人血是急性和慢性贫血症患者的选择试剂。但是，捐赠的 血液不是没有风险的。捐赠的血液可能被很多病原体污染，例如人免 疫缺陷病毒(HIV)、肝炎或蛋白感染素，它们导致不同程度的克-雅二 氏病。同种异源输血也可能导致免疫抑制，它与日益增长的癌症复发 和外科手术患者事故或术后感染有关。Blumberg等，Blood(《血液》)， 66 Supp.1，274a(1966)；Maetani等，Ann.Surg，203，275(1986)。

虽然公众对风险的感知集中于感染的风险，但是笔误导致的错误 输血是有关输血的严重发病率和死亡率最常见的原因。报告的将红细 胞给予与计划受血者之外的人士的发生率是19,000分之1；然而，在 一项输血错误的前瞻性研究中发现的实际发生率是400单位中1例。 美国血库协会，输血的非感染性严重危害，协会公报，01-4(2001)。 在血液储存过程中，血液内发生的生化和形态学的改变，这导致红细 胞不可逆的损害和降低的输血后存活率。这一所谓的“贮存损害”引起 2，3-二磷酸甘油酸(2，3-DPG)的耗竭，导致血红蛋白更低效率的传送氧 直到自然地充满，这个过程需要几个小时。Valeri等，“输注枸橼酸葡 萄糖储存的人血红细胞之后体内红细胞三磷酸腺苷、2，3-二磷酸甘油、 钾离子和钠离子浓度的恢复。”J.Lab Clin Med.，73：722-33(1969)。 储存的血液也包含生物活性物质，例如细胞活素类，其被视为引起非 溶血性发热输血反应的一个主要原因。

在疾病传染和笔误保持为输血的严重问题的同时，捐赠血液的可 获得性已成为近期国际上重要的忧虑。血液短缺的忧虑可能部分受到 最近的指导原则的驱动：阻止在欧洲住过很长时间的捐血者的捐血， 这是由于食用被感染牛肉而感染不同的克-雅二氏病(vCJD)的潜在 风险。此外，捐血者库的减少(由于人口老年化和更多捐血限制)和很 多老年患者大手术中对血液要求的增加，导致频繁的地区性短缺，引 起选择性外科手术取消或延误。捐赠的血液，当使用时，通常时间较 长并且必须为每一位患者进行血型和交叉配型，这一过程会导致危险 的输血延误。血液还必须冷藏并具有约42天的贮存期限，使其在很多 危急情况下无法获得，例如在一些偏远地区的创伤情况下。贮存血的 短缺是一个重要的全球性问题，很多情况下血液储存只能保证数天， 使得应对灾难非常困难。

寻找替代血液的氧运输作用的治疗剂一直是全世界的高度优先的 事项。目标是找到捐赠血的一种替代品，它无病原体、稳定、可长时 间储存、可支付得起、并且是一种万能供血产品，它在需要的任何时 间和地点都可以立即使用。目前，血液代用品中采用了两种不同的方 法，纯化的血红蛋白衍生物和含氟化合物乳剂。

1.纯化的基于血红蛋白的氧传送

生产以血红蛋白为基础的氧载体已经进行了一段时间的努力。血 红蛋白是一个约64,000道尔顿的四聚体蛋白质，它将氧传送至全身。 血红蛋白由4个亚单位的多肽链组成，每个约140个氨基酸。每个链 具有16,100道尔顿的分子量并携带一个四吡咯含铁的辅基，血红素， 它可以结合一个氧分子。人类有几种不同类型的血红蛋白，所有类型 都包含4个亚单位。人类红蛋白亚型中的不同限于珠蛋白的一级结构 (氨基酸序列)。

血液运送在红细胞内与血红蛋白结合的氧，红细胞将氧分散到全 身的组织。所以，血红蛋白结合和释放氧的能力使其成为血液替代品 的一个吸引人的主题。但是，血红蛋白是一种内在不稳定的分子。在 其红细胞环境之外，血红蛋白分子迅速地分解成由一个α和一个β亚 单元组成的二聚体，它们通过循环由肾迅速去除。因此，合适的无基 质血红蛋白分子的开发依赖于一种稳定的、输注时不会分解成二聚物 的血红蛋白功能性四聚物的开发。血红蛋白在红细胞外环境的另一个 问题是由于它具有较高的氧亲和力(由于其正常变构效应体的缺乏， 2，3-二磷酸甘油通常存在于红细胞内)和高浓度下引起肾小管阻塞因此 造成肾衰竭的潜在可能性。因此，为了成为无细胞状态或溶液中有效 的氧载体，血红蛋白必须进行化学改性以避免分解和氧亲和力的问题。 第二个目标是以成本有效的方式生产高产量的产品。

为了解决这些问题已经尝试了几种新方法，包括化学结合血红蛋 白的蛋白质亚单位来一起防止分解(例如，将磷酸吡哆醛与血红蛋白分 子相结合或其他各种交联策略)和重组体血红蛋白的生产。化学上改变 血红蛋白产生的问题包括确保血红蛋白原材料的充足供应，该材料例 如处于供应短缺的人全血。使用从其他哺乳动物中获得的血红蛋白， 例如来自牛的血红蛋白，由于牛海绵状脑炎病毒和其他病原体而令人 担忧。重组体血红蛋白是另一个选择。重组体血红蛋白的问题是它的 低产率和因此造成的高生产成本。还有纯度方面的忧虑，因为内毒素 污染通常是大肠杆菌产品存在的问题。

人造血红蛋白的另外一个问题是它与其他游离气体的结合。游离 血红蛋白易于结合一氧化氮。这种结合在体内是否具有临床意义还是 未知的，尽管与一氧化氮的结合被视为血红蛋白输注后常见的高血压 的原因。仍然有待确定无基质血红蛋白对血流量无局部自身调节有何 种作用，以及与血红蛋白相关的高血压是否具有病理性后果。当前， 在大型动物或临床研究中使用这些化合物来阐释此种现象的重要性几 乎没有可供使用的数据。

2.氟碳乳剂

含氟化合物是包含氟原子的分子。术语含氟化合物或氟碳化合物 是与术语全氟碳化合物(“PFC”)相对比，全氟碳化合物是化学上惰性 的合成分子，主要由碳原子和氟原子组成(即没有氢原子)。液态的PFC 和氟碳化合物通常是澄清、无色以及实际上无味的，并且具有物理性 溶解大量的多种气体的固有能力，该气体包括氧气、二氧化碳和氮气。 由于PFC是疏水性的，它们不易与水混合所以必须用表面活性剂(例 如磷脂)乳化来产生一个基于水的PFC乳剂用于静脉使用。通过在高 切力(例如均化)条件下混合PFC、表面活性剂和水性缓冲液，在水性 介质中形成微小的亚微米尺寸的液滴。PFC液滴被表面活性剂的单分 子层包围，其中表面活性剂分子的疏水的脂质端将自身定向于含PFC 的核心，同时亲水的含磷酸盐的极性头部基团形成液滴的外表面，它 们暴露于水性环境中。

PFC和氟碳化合物并不以与血红蛋白相同的方式将氧运送到组 织。氧高度可溶于氟碳化合物中，静脉输注之后这些氟碳化合物出现 在血液的血浆相中。因此含氟化合物对运送氧的主要贡献是由于它们 能够增加血浆室携带的氧气。虽然，即使在高吸入氧浓度分数(FiO₂) 下氟碳化合物携带的氧气的绝对值相对较小，但是非常高百分数的被 传输的氧气释放到组织，导致从氟碳相提取氧气，通常超过90％。

PFC乳剂通过增加血浆室中携带的溶解氧而增加血液中的总氧含 量，其量与氧分压(PO₂)呈线性比例。在高水平的PO₂(患者吸入高浓 度氧气)时，PFC乳剂中的氧要比红细胞(RBC)中与血红蛋白结合的氧 更易于供组织使用。这是因为来自PFC乳剂中的氧线性地负载和卸 载，而在红细胞中的氧按照S型氧合血红蛋白分解曲线化学地结合和 释放。在组织的正常环境下从血红蛋白中提取氧气是在20-25％范围 内，并且总体低于当氟碳化合物在循环中向组织传送氟碳溶解的氧气 时。

血红蛋白在大气氧水平时几乎是饱和的，其氧含量不能通过增加 吸入氧浓度而被显著提高。PFC乳剂的提取率约为60％，相比之下血 红蛋白在环境条件下的提取率约为20-50％。当吸入高浓度的氧时， 从PFC乳剂中提取氧达到90％或更多。所以，当氟碳化合物或PFC 乳剂存在于血液中时，该氟碳化合物或PFC乳剂总是首先释放其氧负 载，从而保留与血红蛋白结合的氧。很多体内和体外研究支持PFC乳 剂具有增加氧传送以及维持或改进外科手术过程中系统和组织的氧合 作用的效力。

自二十世纪六十年代初期以来，就进行了很多不同的研究努力试 图研发一种稳定的氟碳乳剂用于血管内的氧治疗。第一个商业化开发 的可注射的氟碳乳剂产品是大约30年前由绿十字株式会社(日本，大 阪)生产的FLUOSOL，它是一种20％重量/容积(w/v)的PFC乳剂，包 括14％ w/v全氟萘烷和6％w/v全氟三丙胺，主要由一种合成的泊洛 沙姆，普流尼克(Pluronic)F-68和少量蛋黄磷脂乳化。该第一代产品 的局限性包括茎乳剂(stem emulsion)需要冷冻保存，使用前需要将乳 剂融化然后与两种附加溶液混合。混合后较短的产品稳定性(8小时) 和明显的副反应(例如严重的替代途径补体激活)都是FLUOSOL严重 的问题，这主要由合成的普流尼克表面活性剂引起。

FLUOSOL在严重贫血症和活动性出血Jehovah’s Witness人患者 中进行了广泛的试验，清楚地证明了其运送氧的能力。Tremper等， “用一种全氟化合物氧运输液体Fluosol-DA对严重贫血症患者进行手 术前的治疗。”；N Engl J Med 307：277-83(1982)；Gould等， “Fluosol-DA在急性贫血中作为一种红细胞代用品。”N Engl J Med314：1653-6(1986)。

但是，FLUOSOL没有为这种大容量“血液代用品”适应症得到 FDA的批准，因为在这些出血和严重贫血且由于宗教信仰拒绝输血的 患者中，暂时的氧合利益不能显著地改善死亡率结果。后来对开发 FLUOSOL所做的努力主要集中于将其作为冠状动脉气囊血管成形术 (PTCA)过程中的附加物，即在延长球囊扩张的过程中作为一种能够通 过PTCA导管灌注的携氧低粘度液体来为末端心肌供氧。FLUOSOL 在PTCA中的疗效通过减轻心肌缺血、在球囊扩张过程中维持心室功 能(改善心输出量)以及减少室壁运动伪差(即减少的ST段抬高以及改 善的左心室射血分数)得到证实。Bell等人，“在冠状动脉气囊血管成 形术中冠状动脉内输注Fluosol-DA20％能够防止左心室舒张期功能障 碍吗？”J Amer CollCardiol 16：959-66(1990)；Cowley等，“在不稳 定和高风险患者冠状动脉血管成形术中输注全氟化合物。”循环(Circulation)81(Supp IV)：IV-27-34(1990)。这些数据是FLUOSOL 在美国市场上允许销售的基础，FDA于1989年12月给予批准。迄今 为止，FLUOSOL是唯一一个被FDA批准的合成的氧治疗剂。

二十世纪八十年代后期和二十世纪九十年代初期的其他临床试验 是将FLUOSOL用于癌症患者的初级放射的添加物。这些研究包括患 有早期头颈恶性肿瘤、多形性成胶质细胞瘤、肺癌和多形性恶性胶质 瘤的患者。二十世纪九十年代初期，FLUOSOL在430位患有急性心 肌梗塞患者中进行了大规模多中心临床研究试验(TAMI-9)，来评价在 用血栓溶解剂(组织型纤溶酶原激活物)治疗后FLUOSOL作为一种附 加再灌注治疗药物的安全性和有效性。在FLUOSOL治疗组中观察到 较低的平均梗塞面积和较少的复发性缺血的趋势。不幸的是在总体射 血分数、局部室壁活动或左心室射血分数上并没有发现显著改善。由 于FLUOSOL的大容量给药(15mL/kg)，观察到短暂的充血性心力衰 竭和肺水肿的趋势，这可能减弱FLUOSOL治疗的氧合治疗效益。

尽管做了各种努力开发第二种适应症，绿十字还是于1994年初停 止生产FLUOSOL，主要由于在PTCA市场的销售不好(自从自体灌注 导管进入市场，现在在球囊扩张过程中允许血液通过导管内腔进行灌 注)。此外，有资料显示延长的球囊扩张时间与PTCA之后冠状动脉再 狭窄率降低没有关系。尽管如此，FLUOSOL得到FDA的批准代表了 氧疗法发展中的一个非常重要的里程碑。这个批准证明了基于PFC的 乳剂作为临时的血管内氧载体对于改善患者局部缺血组织的缺氧状况 是安全和有效的。

最近十至十五年中，商业研究努力带来了第二代氟碳乳剂的开发， 与第一代稀释的配方相比具有改善的产品特性。这些成果最成功之处 集中在更多样的直链氟碳化合物(而不是环状氟碳分子)，它们具有略 高的氧溶解性。第二代氟碳乳剂的另外一点改进是使用卵磷脂(即蛋黄 磷脂(EYP))作为表面活性剂。EYP多年来被用来生产肠外产品例如英 脱利匹特(INTRALIPID)(即对于不能摄食的患者静脉输注的基于甘油 三酯的脂肪乳剂)，它比以前使用的合成的基于普流尼克(Pluronic)的 表面活性剂具有更好的生物相容性。

致力于生产基于氟碳的氧载体的另一个开发已经在俄罗斯进行了 很多年，但是在英文文献关于此产品可获得的信息很少。 PERFTORAN，最初由理论和实验生物物理学研究所(Institute of Theoretical and Experimental Biophysics)(俄罗斯，Puschino)开发，它 是一种20％ w/v乳剂，包含14％ w/v的全氟萘烷和6％ w/v的全氟代 -n-甲基环己基哌啶，它是用一种类似于普流尼克(Pluronic)F-68的合 成的泊洛沙姆(Proxanol)进行乳化。PERFTORAN乳剂的平均粒度小 于0.2μm。可是乳剂必须被冷冻储存(可达3年)，融化后只可以冷藏 储存两周。Perftoran已经在超过500位患者中进行了评估，用于各种 不同的临床和医学适应症中，包括战场中遭受外伤失血的士兵。 Vorobyev等，“全氟碳乳剂Perftoran—具有气体运输作用的血浆代用 品。”Artif Cells Blood Subst Immob Biotech 24：453(1996)。

在俄罗斯，PERFTORAN于1999年得到批准用于人体。 PERFTORAN声明的适应症为，它被用作“一种血液代用品制剂，它 在休克、失血、多发性外伤、大面积皮肤烧伤、外观死亡情形以器官 移植等情况下具有气体运输功能。”在临床上它也被用于心肺分流术、 治疗四肢局部缺血的区域性灌注和严重的酒精中毒。但是值得注意的 是，在俄罗斯以外没有进行过关于PERFTORAN的任何研究，据报 道是由于他们不能按照cGMP指南生产产品。

人造血液国际公司(Synthetic Blood International，Inc.，SBI)根据 Leland Clark Jr的早期先驱工作，已经对PFC进行了多年研究。该 公司最初的焦点是研发用于糖尿病患者的一种可植入的葡萄糖生物传 感器，并且利用PFC进行液体通气(Fluorovent)。仅在过去的几年中， SBI明显地基于一种定制合成的C₁₀F₂₀专有PFC分子配制了一种浓缩 的60％ w/v PFC乳剂。此化合物宣称具有有利于制造体内使用的生物 相容的PFC乳剂的物理性质。但是，他们专有的化合物可能很难以极 高纯度水平合成，并且因为需要定制合成所以有可能使生产很昂贵。 还有，组织滞留时间可能会比其他更常使用的PFC(例如全氟萘烷或全 氟溴烷)要长。2003年2月，SBI宣布他们提交了OXYCYTE的新药 审查申请，并于2003年4月接到了FDA的批准开始剂量递增I期研 究。

在二十世纪九十年代初期，Hemagen/PFC(圣路易斯，MO)在试 图开发OXYFLUOR作为一种浓缩的乳剂时，尝试使用了一种定制合 成的含氟化合物，全氟二氯辛烷(C₈F₁₆Cl₂；PFDCO)。Kaufman RJ.，“基 于全氟碳的乳剂作为红细胞代用品的临床开发。”血液代用品：疗效的生理学基础。波士顿：Birkhauser，52-75(1996)。Hemagen/PFC尝 试了一种新的方法，该方法是为了减小OXYFLUOR乳剂的粒度并因 此增加产品的稳定性而通过向乳剂中添加油。得到的OXYFLUOR乳 剂是一个3-相配方，它基于将PFDCO与甘油三酯(红花油)和EYP组 合来作为唯一的表面活性剂(78％ w/v(40％ v/v)氟碳乳剂)。 OXYFLUOR乳剂的平均粒度为0.22-0.25μm，实际上包含两类不同的 颗粒：即较小的油滴(甘油三酯)和较大的包含PFC的微滴。结果，在 人体使用中的副反应更加明显，由于这些较大的乳剂颗粒触发的急性 期反应引起了严重的发热反应和流行性感冒样症状。Kaufman R.， “40％ v/v的HM351乳剂(Oxyfluor^TM)在健康人志愿者中的1期临床试 验结果。”Artif Cells Blood Subst Immob Biotech；22：A112(1994)。

Hemagen正在研究一种适应症以改善分流术后常出现的认识功 能障碍，据推测是由于在心肺分流术中产生的气体微栓部分引起的局 部脑缺血。启动了心肺分流术中早期的2a期安全性研究，但是所有的 患者必须预先接受地塞米松治疗来抑制急性副反应。这最终导致了这 些临床研究的终止，并且研发最终停止。

尽管上面说明了不同的氟碳乳剂的问题，取决于具体PFC和表面 活性剂的选择，有可能生产适合人类体内使用的具有特别小的颗粒(中 间粒径小于0.2μm)的水包氟碳化合物乳剂，它们可以长时间保持稳定 并且是生物相容的。但是，选择具有适当的物理和化学性质的具体氟 碳化合物、合适的浓度和数量以及合适的表面活性剂，是决定一个氟 碳乳剂在体内的安全度(即生物相容性)和氟碳化合物分子如何迅速从 体内排除的关键。氟碳化合物(包含其他氟碳化合物或部分氟化的污染 物)的纯度不够会不利地影响氟碳乳剂的安全性并且通常会带来毒性。 氟碳化合物的性状例如分子量、脂溶性以及蒸汽压，都是直接影响氟 碳化合物在体内的行为的主要因素。此外，这些氟碳化合物的性质以 及选择与氟碳化合物一起使用且具有正确的化学和物理性质的表面活 性剂，最终决定了最后的氟碳乳剂配方的内在稳定性和贮存期限。 静脉内给药的氟碳乳剂的药代动力学

静脉内给药的氟碳乳剂的药代动力学可以由图1中的四个区来说 明。乳剂微滴通过网状内皮系统(RES)的循环单核细胞或组织驻留型 巨噬细胞的吞噬作用从循环中清除。循环单核细胞通过肺循环并在循 环中吞噬乳剂微滴，之后移至肺泡腔，在那里含氟化合物通过血/气界 面被转移，并在呼气时被排除。显示这一过程的速率常数k₁₀的值非 常小，表明很少氟碳化合物通过此途径被移除。主要的血液移除机制 包括微滴被RES细胞摄取和吞噬。发现约80％或更多的给药量在从 血液移出后存在于RES器官中，主要是肝和脾。

全氟碳在化学上和生物学上是惰性的，因此观测不到全氟化合物 的代谢作用。被吞噬后，细胞内的含氟化合物通过与循环脂质载体(即 乳糜微粒类和脂蛋白类)结合从RES细胞(k24)中被移除。此时含氟化 合物能够在呼气时被排除(k40)、分配至脂肪组织(k43)或回到 RES(k42)。最终的移除取决于增加和减少第4区的速度常数的大小。 定速步骤k24由含氟化合物传质到脂质载体所控制，这一过程关键地 取决于含氟化合物的脂溶性。R.E.Moore和L.C.Clark在R.Frey等， “运输氧的胶体血液代用品：德国慕尼黑第五届国际全氟化合物血液代用品研讨会(5^th Int.Symp.On Perfluorochemical Blood Substitutes， Munich)，”第50页(1982)。在3区(脂肪组织)的含氟化合物的浓度同 样取决于该含氟化合物的亲脂性质。由于脂肪灌注不良，与循环丰富 的RES相比移除要缓慢。再分布进脂肪导致全身移除速率(k40)的下 降。对于一种典型的含氟化合物(例如，全氟溴辛烷(perfluorooctyl bromide))这些速率常数具有下面的量值，以hr^-1为单位：k10≈0.000， k12≈0.04，k24≈0.006，k42≈0.002，k34≈0.002，k40≈0.07。

含氟化合物的性质对于观测到的药代动力学有极深的影响。如所 讨论的，k24主要取决于含氟化合物的亲油性。确实已经观察到氟碳 乳剂FLUSOSOL的两种含氟组分的k24的明显差异，FLUSOSOL是 一种被美国食品和药品监督管理局(FDA)批准的用于气囊血管成形术 中向组织运送氧的氟碳乳剂(日本大阪，绿十字株式会社)。对于全氟 萘烷和全氟三丙胺的RES消除速度常数(k24)分别等于0.10和0.011 天^-1，全身清除远远比全氟溴辛烷缓慢。

含氟化合物的血管内持久性同样是其生物相容性的一个重要因 素，因为它与设计用作“血液代用品”的乳剂产品的疗效直接成比例。 k12的值(被RES摄取的颗粒)关键地取决于含氟化合物的总剂量、乳 剂微粒大小以及可能与促进RES识别微滴或选择性给与乳剂微滴“隐 形”特性的特异调理素或异常调理素结合。在包含两相分散相组分的含 氟乳剂中，由于通过连续相时更多水溶性组分的分子扩散，在不同大 小的微滴之间观察到含氟化合物组分的明显分隔。这导致了以下的现 象：更多水溶性的含氟化合物浓集在较大微滴中，而较小的微滴聚集 于较慢扩散的不溶组分中。由于不同大小的微滴具有不同的含氟化合 物量值，有可能想象这样一个情景：从血液中移除的个别速度常数多 少有些不同，尤其是当较大微滴被RES选择性地移除时。

在移除过程中含氟化合物亲油性的重要性的更多直接证据来自 Obraztsov等的工作，他提出了全氟化合物的两步移除机制。根据这 个模型，第一步是全氟化合物通过RES细胞的细胞质到达血流的分子 扩散。这个过程发生在几分钟到几小时的时间间隔内。第二步(定速步 骤)包括含氟化合物通过脂质载体从RES器官到肺的传质过程，这个 过程关键地取决于PFC的亲油性。在一个巧妙的试验中，Obraztsov 发现了全氟碳化合物的器官滞留时间可以通过在PFC乳剂静脉注射 给药后静脉注射一种脂质乳剂而显著降低。因此该脂质乳剂能够在血 液中提供脂质槽来从器官中移除PFC并且运送至肺。Obratzsov，V.V 等，J.Fluorine Chem.54，376(1991)。

氟碳乳剂的稳定性

设计用于氧运输的亚微粒含氟乳剂是热力学不稳定的。不可逆微滴 粗化的最初机理是奥斯特瓦尔德(Ostwald)熟化。J.G.Reiss，胶体表面(Colloids Surfaces)，84，33(1994)。奥斯特瓦尔德熟化是由于开 尔文(Kelvin)效应而发生，其中不同大小的微滴之间表面张力的微小差 异就导致随着时间较大微滴的增长以及较小微滴的变小。微滴间传质 发生在通过连续相时分散相的分子扩散。奥斯特瓦尔德熟化不但出现 在乳剂被制造之后的储存过程中，还出现在制造过程中。为了消除通 过奥斯特瓦尔德熟化造成的乳剂粗化，Haguchi和Misra提出了添加 高分子量的第二种分散相组分，该组分在连续相中更加不溶。Higuchi 等，J.Pharm.Sci，51，459(1962)。在这种情况下，出现了不同微滴 之间两种分散相组分的明显分配，具有较低水溶性的组分浓集于较小 的微滴中。

在两种组分相系统的奥斯特瓦尔德熟化过程中，当不同大小微滴 之间由于毛细管效应造成的化学势的不同被两种组分的分配造成的化 学势的不同平衡时，就建立了平衡状态(类似于汽/液平衡的拉乌尔定 律)。

含氟乳剂最初的微滴大小和分布、微滴稳定性以及最终观察到的 很多副反应，主要取决于奥斯特瓦尔德熟化的减少。因此氟碳乳剂的 物理稳定性主要取决于分散的氟碳相的性质。

通过分子扩散的微滴增长动力学最通常地以 Lifshitz-Slezov-Wagner(“LSW”)理论的术语说明。LSW理论涉及： 对于单一组分分散相，平均半径的立方随着时间以速率线性增长。

其中a是半径，γ是界面张力，V是分子体积，C_a是水溶解度，D是 扩散系数，R是摩尔气体常数，以及T是绝对温度。对氟碳乳剂稳定 性尤为重要的是水溶解度项，它是主要取决于氟碳化合物分子量的一 个参数。一般而言，具有较高分子量的氟碳化合物显示出降低的水溶 解度，以及因此更高的乳剂稳定性。但是，目的为可注射用氧载体的 氟碳乳剂(即血液代用品)还必须是生物相容的。尤为重要的是氟碳化 合物在RES器官内的半衰期。虽然较高分子量的氟碳化合物显示出较 高的乳剂稳定性，但是它们同样在RES中保留极其长的时间。

奥斯特瓦尔德熟化可以通过加入较大分子量和较小水溶性的次级 含氟化合物或在氟碳化合物/水界面显著降低界面张力的一种氟化的表 面活性剂而降低。遗憾的是，向一个配方中添加具有更小水溶性的次级 氟碳化合物会导致器官保留的增加，这是一种非常严重的副作用，因为 含氟化合物在循环脂质载体中的溶解性同样被降低。氟化的表面活性剂 已经被证实具有严重的毒性问题，这使它们作为乳剂稳定剂有很大风 险。为了克服乳剂稳定性/器官保留的两难局面，次级氟碳化合物必须选 择那些能够提供所需的乳剂稳定性/器官滞留特性，是生物相容的且具有 较短的器官滞留时间，并且加入尽可能少的量就能获得所需的稳定性功 效。为了实现这些，所选的含氟化合物应是亲脂的(例如全氟溴癸烷 (perfluorodecyl bromide))。非亲脂化合物(例如全氟三丙胺和氟代正 甲基环己基哌啶)排泄过于缓慢，并且不能有效地稳定含氟乳剂。

一些代表性的主要和次要氟碳化合物包括在下面的清单中。

1.主要氟碳化合物

主要氟碳化合物针对其较短的器官滞留时间和生物相容性来选 择。总的来说，在器官中的半衰期优选小于约4周，更加优选小于约 2或3周，并且最优选7天或更少。分子量约为460至550道尔顿。

这种可能的主要氟碳化合物包括二(F-烷基)乙烯，如 C₄F₉CH＝CHC₄F₉(“F-44E”)、i-CF₃CF₉CH＝CHC₆F₁₃(“F-i36E”)和环状 氟碳化合物，如C₁₀F₁₈(F-萘烷，全氟萘烷或FDC)；F-金刚胺(FA)； 全氟茚满；F-甲基金刚胺(FMA)；F-1，3-二甲基金刚胺(FDMA)；全氟 代-2，2，4，4-四甲基戊烷；F-二或F-三甲基二环[3，3，1]壬烷(壬烷)；C_7-12全氟化的胺类，如F-三丙胺、F-4-甲基八氢喹嗪(FMOQ)、F-n-甲基- 十氢异喹啉(FMIQ)、F-n-甲基十氢喹啉(FHQ)、F-n-环己基吡咯烷 (FCHP)以及F-2-丁基四氢呋喃(FC-75或RM101)。

其他主要氟碳化合物的实例包括溴化全氟碳化合物，如全氟溴辛 烷(C₈F₁₇Br，USAN全氟溴烷)、1-溴十五氟庚烷(C₇F₁₅Br)、1-溴十三 氟己烷(C₆F₁₃Br，也被称为全氟溴己烷或PFHB)。其他溴化氟碳化合 物如在Long的美国专利号为3,975,512和4,987,154以及美国专利号 为5,628,930和5,635,538中公开，其全部内容通过引用并入本文。

同时考虑的是具有其他非氟取代基的氟碳化合物，如1-氯十七氟 辛烷(C₈F₁₇Cl，也被称为全氟氯辛烷或PFOCl)；全氟辛基氢化物，以 及具有不同碳原子数的类似化合物。

根据本发明考虑的其他首要氟碳化合物包括全氟烷基化的醚类、 卤代醚类(尤其是溴化醚类)或聚醚类，如 (CF₃)₂CFO(CF₂CF₂)₂OCF(CF₃)₂；(C₄F₉)₂O。此外，可以使用氟碳-碳 氢化合物，例如，具有以下通式的化合物：C_nF_2n+1-C_n’H_2n’+1；、 C_nF_2n+1OC_n’H_2n’+1或C_nF_2n+1CH＝CHC_n’H_2n’+1，其中n与n’相同或不 同，并且为大约1至大约10(只要化合物在室温下为液体)。例如这种 化合物包含C₈F₁₇C₂H₅和C₆F₁₃CH＝CHC₆H₁₃。

其他可能用作主要氟碳化合物的氟碳化合物包括全氟胺类，具有 下列通式的末端取代的直链脂肪族全氟碳化合物：

C_nF_2n+1R，其中n为6-8的整数，R包括选自Br、Cl、I、CH₃的 亲脂部分，或者2或3个碳原子的饱和或不饱和烃，

具有下列通式的二(F-烷基)乙烯类：

C_nF_2n+1-CH＝CH-C_n’F_2n’+1，其中n与n’的和等于6-10，以及

具有下列通式的全氟醚类：

C_nF_2n+1-O-C_n’F2_n’+1，其中n与n’的和等于6-9。

此外，选自下列一般组的氟碳化合物可以适合用作主要氟碳化合 物：全氟环烷类或全氟烷基-环烷类，全氟烷基饱和的杂环化合物，或 全氟叔胺类。一般请见Schweighart，美国专利号4,866,096，其全部 内容通过引用并入本文。

值得注意的是酯类、硫醚类以及其他不同改性的混合氟碳-碳氢化 合物，包括异构体，也被包括在适合用于本发明的主要氟碳化合物的 广泛定义中。其他合适的氟碳化合物混和物也被考虑在内。

在此没有列出的但是具有本公开所说明的特性因此具有治疗应用 的其他氟碳化合物也被考虑在内。这种氟碳化合物可以商购到或者可 以特别制备。本领域的技术人员知道，有很多本领域熟知的制备氟碳 化合物的方法。例如，见Schweighart，美国专利号4,895,876，其全 部内容通过引用并入本文。

2.次要氟碳化合物

次要氟碳化合物可以是一种脂肪族氟碳化合物，它被一个或多个 亲脂部分取代并且比主要氟碳化合物具有更大的分子量。该亲脂可能 在氟碳化合物分子末端被取代。优选地，该次要氟碳化合物的分子量 大于约540道尔顿。该次要氟碳化合物分子量的上限通常与器官滞留 时间以及被主要氟碳化合物溶解的能力相关。最优选的次要氟碳化合 物具有高于约150℃的沸点和小于约1 x 10^-9mol/L的水溶解度。

当然，本领域的技术人员知道，被不同亲油基团取代的许多氟碳 化合物可以适合用作本发明的次要氟碳化合物。这种氟碳化合物包括 酯类、硫醚类以及不同的氟碳-碳氢化合物，包括异构体。满足前述标 准的两种或多种氟碳化合物的混合物也被考虑在适合用作本发明的次 要氟碳化合物的氟碳化合物材料的广泛定义中。没有在此列出但是具 有本公开所说明的性质因此可以用于治疗应用的氟碳化合物也被考虑 在内。

亲脂部分可任选地选自Br、Cl、I、CH₃，或者2或3个碳原子的 饱和或不饱和烃。因此，优选的次要氟碳化合物可以选自用下列通式 表示的末端取代的氟碳卤化合物：

C_nF_2n+1X或C_nF_2nX₂，其中n为8或更高，优选10-12，X为选自 Br、Cl或I的卤化物；

用下列通式表示的1-烷基-全氟碳或二烷基全氟碳化合物：

C_nF_2n+1-(CH₂)_n’CH₃，其中n为8或更高，优选10-12，n’为0-2；

用下列通式表示的1-烯基-全氟碳化合物：

C_nF_2n+1-C_n’H_(2n’-1)，其中n为10或更大，优选10-12，n’为2或3； 或者

具有下列通式的溴化的直链或支链全氟醚类或聚醚类：

Br-(C_nF_2n+1-O-C_n’F_2n’+1)，其中n和n’各自至少是2，并且n与n’ 之和大于或等于8。

最优选地，本发明的次要氟碳化合物选自下组，其构成为：直链 或支链的溴化的全氟化的烷基醚类、全氟溴癸烷(C₁₀F₂₁Br)、全氟溴十 二烷(C₁₂F₂₅Br)、1-全氟癸基乙烯(C₁₀F₂₁CH＝CH₂)和1-全氟癸基乙烷 (C₁₀F₂₁CH₂CH₃)，特别优选全氟溴癸烷。

对具体的次要氟碳化合物必须提出的问题是，次要氟碳化合物提 供的增加的稳定性是否胜过其延长器官滞留时间以及半衰期、毒性、 生物相容性和其他并发症等潜在问题。

全氟溴辛烷(“PFOB”)的化学式为C₈F₁₇Br。其结构为 CF₃(CF₂)₆CF₂Br，化学文摘服务社(CAS)号为423-55-2。PFOB其他的 物理参数包括：

沸点　　　760mmHg时143℃

蒸汽压    37℃时10.5mmHg

熔点      4℃

PFDB的化学式为C₁₀F₂₁Br。其结构为CF₃(CF₂)₈CF₂Br。CAS号 为307-43-7。其他的物理参数包括：

沸点     760mmHg时180℃

蒸汽压   37℃时1.5mmHg

熔点     55℃

已经发现向全氟溴辛烷(“PFOB”)或全氟萘烷(“FDC”)的乳剂中添 加全氟溴癸烷(“PFDB”)会带来非常好的室温稳定性。由于其亲脂特 性，PFDB在RES中的半衰期只有23天，被认为是静脉内注射应用 可接受的值。还发现添加PFDB带来狭窄的粒度分布和更少的大颗粒。 向PFOB乳剂中添加PFDB，出现不同大小的微滴之间的两种组分显 著分隔，这是分子扩散的结果，因此不溶组分变为浓缩在较小微滴中， 而高溶解度组分浓缩在较大微滴中。根据拉乌尔定律，不同大小的微 滴之间的两种组分的分隔导致了较小微滴的溶解性降低。这补偿了由 于毛细血管压不同而引起的化学势不同(即开尔文效应)。当浓度平衡 了毛细管效应时，微滴的增长终止。

对于一个两种组分的分散相的乳剂增长率由下列方程式给 出：

其中，Φ_a和Φ_b为氟碳化合物a和b各自的体积分数。和为上述方程式中氟碳化合物a和b各自的乳剂增长率。

当PFDB已被证实是一个理想的次要氟碳化合物候选物时，PFDB 应以一定的量与适当浓度的合适的主要氟碳化合物(如PFOB)进行配 制，以便不会引起器官保留和半衰期等并发症，但是仍然提供适当的 乳剂稳定性。此外，因为希望患者在尽可能短的时间间隔内重复使用 任何氟碳乳剂，因此需要使用最小量的PFDB来允许重复给药。它应 与适量的主要氟碳化合物组合。

PFDB以过高的浓度存在于乳剂中的另一个复杂因素是由于 PFDB的高熔点(55℃)导致在乳剂中形成结晶形态的高危险性。PFDB 在乳剂中的结晶可能引起严重的安全性和毒性问题。还有一个严重的 生产忧虑是高浓度的PFDB在生产过程中遇到冷区时很容易结晶。这 是配制乳剂中考虑的一个重要因素，尤其是在大规模生产中，因为 PFDB是乳剂稳定剂，如果它在生产过程中结晶，这不但出现生物相 容性/毒性问题，还有其结晶作用会使得有更少的PFDB可用来稳定乳 剂，并且使最终乳剂满足产品质量标准的可能性变得更小。PFDB以 太高浓度存在时的另外一个复杂因素是使微粒过小的危险，它会导致 氟碳颗粒从毛细血管床中渗漏到组织的细胞间隙中，引起严重的滞留 问题。

因此，生产一种可用于人体体内的氟碳乳剂需要平衡很多关键因 素。设计用于人体内氧传送的氟碳乳剂应至少具备以下属性：

1.可接受的器官半衰期—氟碳乳剂组分的器官半衰期应尽可能短， 优选少于4周；

2.可接受的储存稳定性—氟碳乳剂在5℃条件下应具有至少6个 月的储存期，优选18个月的储存期。在储存过程中，氟碳乳剂的物理 特性和生物相容性不应该改变。由于增加的便利性、更多的潜在应用 和降低的成本，优选室温储存；

3.可接受的体内稳定性—在静脉给药时，该乳剂不应出现相改变、 沉淀、凝聚、聚结或其他具有不利的物理化学或生物化学性质的聚集 现象；

4.优异的生物相容性—氟碳乳剂应引起最小的副反应并且无毒性作 用；

5.可接受的或最佳的粒度和分布—由于乳剂粒度和分布，乳剂的粒 度在毒性、储存期限、副反应和生物分布中都起着非常重要的作用， 所以应在可接受的范围内；

6.最终灭菌—该乳剂的物理性质应能够进行最终的灭菌；

7.可接受的血液半衰期—该乳剂应具有符合预期目的的可接受的血 液半衰期；

8.可接受的粘度—全血/氟碳乳剂混合物的粘度非常重要，因为组 织的氧合和灌注与粘度负相关；

9.低的游离氟化物值—该氟碳化合物应表现出优异的化学稳定性；

10.表面活性剂安全性—该表面活性剂应该是生物相容的并且无毒 的；

11.可接受的氟碳含量—氟碳化合物的生物相容性和毒性关键性地 取决于总氟碳含量，并且必须在患者可接受的容量下有效，并且应该 被配制用于重复给药；

12.制造—该氟碳乳剂应具有容易生产并且在在规模放大的基础上 生产一致性产品的物理性质。用于该配方的氟碳化合物应该容易生产 并具有优异的纯度；以及

13.重复的剂量—氟碳乳剂应能够在尽可能短的时间间隔内重复使 用以用于患者的重复给药。

发明概述

本发明是在配制稳定的并且理想地适合人体体内使用以避免用血 并且用于其他治疗用途的氟碳乳剂的过程中作为大量实验、分析和仔 细平衡多种因素的结果而配制成的一种氟碳乳剂。优选的实施方案构 成了优于先有技术的氟碳乳剂，其被配制为保持乳剂稳定性而同时实 现了最小的器官滞留时间。

如上所述，分子扩散或奥斯特瓦尔德熟化已被证明是氟碳乳剂初 始颗粒大小的关键性决定因素。虽然用全氟溴辛烷作为分散的氟碳相 可以实现短期内大约0.2μm的微滴大小，对于具有某种浓度的PFOB 和PFDB混和物在很长时间内可以获得坚持很长时间的小于0.15- 0.20μm的微滴大小。在连续水相中几乎不溶却溶于PFOB的PFDB 通过在多元分散系内减少小微滴的溶解度来起到抑制分子扩散的作 用。对于在某种浓度下的PFOB，已经发现PFDB是一种非常有效的 颗粒增长阻滞剂。PFDB是直链的、更高分子量的PFOB类似物，结 构的不同在于PFDB具有两个额外的碳原子和四个额外的氟原子。 PFOB和PFDB的熔点分别是4℃和55℃，以及37℃时的蒸汽压分 别是10.5和1.5mmHg。

此处的数据出人意料地证明PFDB对于稳定具体浓度下的PFOB 乳剂(与更高浓度的PFOB/PFDB乳剂相比)是很有效的，并且通过使 用少量的PFDB(总乳剂的1-3％w/v)添加到55-60％w/v PFOB乳剂 中，与更高浓度的PFDB的混合物(例如90％/10％w/v PFOB/PFDB 乳剂、60％/30％w/v PFOB/PFDB乳剂和60％/10％w/v PFOB/PFDB 乳剂)得到同样的乳剂稳定作用，而在这些更浓缩的乳剂中没有经历显 著的问题，例如更长的器官滞留时间、形成PFDB结晶、更大的乳剂 颗粒、患者副作用、生产问题和不能重复给药等。

通过向某种浓度的PFOB添加少量的PFDB来阻滞颗粒大小的生 长是引人注目且意想不到的，并且此处的数据证明如果数量与效果， 以及生物相容性与稳定性等方面达到最佳的平衡，在浓度大约为1％- 3％w/v PFDB，大约55％-60％w/v PFOB，高达大约59-62％w/v 的总氟碳相，用适量的蛋黄磷脂乳化，就会产生一种有效的氟碳乳剂， 它理想地适合用于人类体内的氧输送。

优选58％w/v PFOB和2％w/v PFDB的配方，但是其他配方，例 如1％、2％和3％w/v PFBD添加至55％，56％，57％，58％，59％，和 60％w/v PFOB，所有可能的组合，例如55％-60％w/v PFOB/3％ w/v PFDB，55-60％w/v PFOB/2％w/v PFDB和55-60％w/v PFOB/1％w/v PFDB都在本发明的范围内。添加更多的PFDB，高 达10％w/v PFDB及更高，只会对乳剂稳定性提供很小的额外利益， 但是产生非常大的问题，如生物相容性、器官滞留时间和生产问题。

向PFOB乳剂中添加很少量的PFDB不仅会延迟乳剂中的颗粒生 长速率，还会在乳剂生产之后最初形成很小的颗粒。在乳剂形成时产 生更小的颗粒会导致内部微滴接触数目的减少，这会通过集结减慢颗 粒生长并且加强EYP表面层，使得接触微滴的表面的融合更加困难。 更小的颗粒通过减缓氟碳颗粒的沉降现象来减少内部微滴接触，因此 微滴被最大程度地分开。但是，如果颗粒做得太小，就有氟碳颗粒从 毛细血管床渗漏到组织间的细胞间质的很大的风险。因此在制造颗粒 大小来减少内部微滴接触、但是又不能太小以致引起渗漏问题之间的 必须达成一种平衡。

沉降的速率按照斯托克斯定律(Stokes Law)给出(Ross和 Morrison，胶体系统和界面(Colloidal Systems and Interfaces)，Wiley-Interscience，纽约，第69-125页(1988)：

$V=\frac{2r2({\rho }_o-{\rho }_w)g}{9\eta }$

其中r＝微滴半径

ρ_o＝油的密度

ρ_w＝水的密度

η＝粘度

全氟溴烷的密度是1.9g/L，所以密度项(ρ_o-ρ_w)促进将集中在容 器的底部的颗粒快速沉降。沉降速率，V，通过减小微滴半径而减小， 这发生在PFDB添加到全氟溴烷时。通过增加PFOB与PFDB的比例 并且由于PFDB溶于PFOB的事实，更多的PFDB被此处说明的配方 中的PFOB带走，因此患者的组织内保留的PFDB更少。另外，添加 少量的PFDB(1-3％w/v)来稳定PFOB乳剂会导致显著的财力节约， 这是因为高成本的PFDB，更高的全氟碳化合物的产率，比更浓缩的 PFDB需要更少的EYP以及延长的贮存期限。由于较少量的EYP导 致乳剂中更少的水解产物如过量的游离脂肪酸和溶血卵磷脂化合物， 因此EYP量值的减少也会带来更高的相容性。

本申请所说明的氟碳乳剂可以用于预防手术中暴露于异源输血及 患者需要血液的其他情况。尽管不限于以下内容，本发明的氟碳乳剂 的一些其他疗法包括，用于术后器官功能(肠、肝、心脏、脑、肾)， 镰状细胞性贫血的治疗，器官保护，器官移植，化疗治疗的促进，放 疗治疗的促进，一氧化碳中毒的治疗，“减压病”的治疗，外伤性脑损 伤和中风的治疗。尽管配制用于人类，本发明的氟碳乳剂可以用于任 何哺乳动物、鸟、爬行动物或鱼。

本发明涉及但不限于：

1)一种用于人类患者体内氧输送的储存稳定的氟碳乳剂，包含连续水 相和不连续氟碳相，其中该不连续氟碳相包含氟碳化合物全氟溴辛烷 和全氟溴癸烷，其中该全氟溴辛烷在该氟碳乳剂中存在的量为总乳剂 的大约57-60％w/v并且该全氟溴癸烷在该乳剂中存在的量为总乳剂 的大约2-3％w/v，并且，

该乳剂进一步包含一种乳化剂，其存在的量大约为3.5％-4％w/v。

2)第1段所述的乳剂，进一步包含d，α-生育酚。

3)第1段所述的乳剂，其中该d，α-生育酚存在的量为大约1％w/v。

4)第1、2和3段所述的氟碳乳剂，进一步包含NaCl、NaH₂PO₄和 EDTA。

5)第1和3段所述的氟碳乳剂，其中所述PFOB的存在量为57-59％ w/v以及PFDB存在的量为2％w/v。

6)第1、2和3段所述的氟碳乳剂，其中所述PFOB存在的量为58％ w/v以及PFDB存在的量为2％w/v。

7)第1段所述的氟碳乳剂，其中该乳化剂是蛋黄磷脂，存在的量为大 约3.6％w/v并且进一步包含NaCl、NaH₂PO₄·H₂O、NaHPO₄·7H₂O。

8)第1-4段所述的氟碳乳剂，其中该氟碳乳剂进一步包含d，α-生育酚 和EDTA。

9)第1、2、3、6和7段所述的氟碳乳剂，其中d，α-生育酚存在的量 为0.0025w/v或更少并且EDTA存在的量为0.02w/v。

10)向人体和其他哺乳动物的组织输送氧的氟碳乳剂，包含：连续水 相和不连续氟碳相，其中该不连续氟碳相由全氟溴辛烷和全氟溴癸烷 组成，其中该全氟溴辛烷在该氟碳乳剂中存在的量大约为总乳剂的57 -60％w/v并且该全氟溴癸烷在该乳剂中存在的量大约为总乳剂的1- 3％w/v。

11)第10段所述的氟碳乳剂，进一步包含由蛋黄磷脂组成的乳化剂， 其存在的量为大约3.5％-4％w/v。

12)第10段所述的氟碳乳剂，其中该乳剂通过选自下组的一种表面活 性剂进行稳定：氟化的表面活性剂和基于卵磷脂的表面活性剂。

13)第10、11和12段所述的氟碳乳剂，其中该不连续相包含大约58 -59％w/v PFOB和大约2-3％w/v PFDB。

14)第10、11和12段所述的氟碳乳剂，其中该不连续相包含大约58％ w/v PFOB和2％w/v PFDB。

15)第10和14段所述的氟碳乳剂，其中在该乳剂的形成过程中，形 成了中间粒径为0.18μm或更小的氟碳颗粒。

16)用于向人体和其他哺乳动物的组织输送氧的氟碳乳剂，包含：连 续水相和不连续氟碳相，其中该不连续氟碳相由全氟溴辛烷和全氟溴 癸烷组成，其中该全氟溴辛烷在该氟碳乳剂中存在的量大约为总乳剂 的58％w/v并且该全氟溴癸烷在该乳剂中存在的量大约为总乳剂的 2％w/v。

17)第16段所述的氟碳乳剂，进一步包含卵磷脂，其量大约为3-4％ w/v。

18)第17段所述的氟碳乳剂，其中该卵磷脂是蛋黄磷脂并且存在的量 为3.6％w/v。

19)第16和18段所述的氟碳乳剂，进一步包含抗氧化剂。

20)第19段所述的氟碳乳剂，其中该抗氧化剂是d，α-生育酚。

21)在人类体内使用的氟碳化合物，包含连续水相和不连续氟碳相， 其中该不连续氟碳相包括氟碳化合物全氟溴辛烷和全氟溴癸烷，其中 该全氟溴辛烷在该氟碳乳剂中存在的量大约为总乳剂的58％w/v并且 该全氟溴癸烷在该乳剂中存在的量大约为总乳剂的2％w/v，并且， 该乳剂进一步包含一种乳化剂，其存在的量大约为3.6％w/v。

22)第21段所述的乳剂，其中该乳化剂是蛋黄磷脂。

23)第21和22段所述的乳剂，进一步包含d，α-生育酚，量为大约1％ w/v。

24)第21和23段所述的氟碳乳剂，其中该乳化剂存在的量大约为 3.6％w/v并且进一步包含NaCl、NaH₂PO₄·H₂O、NaHPO₄·7H₂O。

25)第21、22和24段所述的氟碳乳剂，其中该氟碳乳剂进一步包含 d，α-生育酚和EDTA。

26)第23段所述的氟碳乳剂，其中d，α-生育酚存在的量为0.0025w/v 或更少以及EDTA存在的量为0.02w/v。

27)全氟溴辛烷和全氟溴癸烷在生产向患者输送氧的医药中的用途， 其中该全氟溴辛烷和全氟溴癸烷在水性连续相内形成不连续相以形成 乳剂，其中该全氟溴辛烷存在的量为乳剂总量的57-60％w/v以及该 全氟溴癸烷的量为乳剂总量的1-3％w/v，进一步包含乳化剂。

28)第27段的用途，进一步包含蛋黄磷脂作为该乳化剂。

29)第27和28段的用途，进一步包含NaCl、NaH₂PO₄·H₂O、 NaHPO_4·7H₂O。

30)第27-29段的用途，其中该全氟溴辛烷存在的量为乳剂总量的 58-59％w/v并且该全氟溴癸烷存在的量为乳剂总量的1-3％w/v。

31)第27和28段所述的用途，其中该全氟溴辛烷存在的量为总乳剂 的58％w/v以及该全氟溴癸烷存在的量为乳剂总量的2％w/v。

32)全氟溴辛烷和全氟溴癸烷在生产向患者体内输送氧的医药中的用 途，其中该全氟溴辛烷和全氟溴癸烷在水性连续相内形成不连续相以 形成乳剂，其中该全氟溴辛烷存在的量为乳剂总量的58％w/v以及该 全氟溴癸烷的量为乳剂总量的2％w/v，进一步包含由蛋黄磷脂组成的 一种乳化剂，量为总乳剂的3.6％w/v。

33)权利要求32所述的用途，进一步包含NaCl、NaH₂PO₄·H₂O和 NaHPO_4·7H₂O。

34)一种生产用于体内氧输送的包含全氟溴辛烷和全氟溴癸烷且具有 长时间的大小稳定性特性的氟碳乳剂的方法，包括以下步骤：

a)在第一罐内向热水内制备钠盐的水溶液并且喷入氮气；

b)向第二罐内加入全氟溴辛烷和全氟溴癸烷并且喷入氮气；

c)向第三罐内加入乳化剂并且将第一罐内的内容物加入到第三罐内；

d)向第三罐内加入全氟溴辛烷和全氟溴癸烷并且混合这些内容物以 使全氟溴辛烷和全氟溴癸烷乳化；

e)将第三罐内的内容物引向一个或多个均质罐内。

35)第34段所述的生产方法，其中第一罐内的水溶液是在65至80℃ 的温度范围内制备的。

36)第34和35段所述的生产方法，其中该水溶液在喷入氮气过程中 温度被调节至55至65℃。

37)第34-36段所述的生产方法，其中添加到第一罐内的钠盐包括磷 酸二氢钠一水合物、氯化钠和乙二胺四乙酸钙二钠。

38)第34段所述的生产方法，其中全氟溴辛烷和全氟溴癸烷是在15- 25℃下保持在该第二罐内。

39)第37和38段所述的生产方法，其中该全氟溴辛烷和全氟溴癸烷 (氟碳化合物溶液)在喷入氮气的过程中是保持在真空状态下。

40)第34段所述的生产方法，其中该乳化剂是蛋黄磷脂。

41)第34段所述的方法，其中d-α-生育酚与该乳化剂一起加入到该第 三罐内。

42)第34段所述的方法，其中d-α-生育酚与蛋黄磷脂一起加入到该第 三罐内。

43)第34-40段所述的方法，其中该第一罐内的内容物是通过管线内 过滤器壳体加入该第三罐内并且通过分散混合器进行再循环。

44)第43段所述的方法，其中该管线内过滤器壳体具有大约0.45μm 的筛网。

45)第43-44段所述的方法，其中该第一罐内的内容物被加入该第三 罐之后，将这些内容物用搅拌器混合。

46)第34段和43-44段所述的方法，其中该氟碳溶液被加入到该分散 混合器的头部同时将该第一罐内的内容物再循环。

47)第46段所述的方法，其中该氟碳溶液直到流速达到至少150L min 时才被加入到该分散混合器内。

48)第40-42段所述方法，其中该第一罐的内容物在高速、高剪切混 合器下加入到该第三罐内以此将该氟碳溶液乳化。

49)第48段所述的方法，其中该氟碳溶液被乳化之后，该混合物通过 该分散混合器进行再循环。

50)第49段所述的方法，其中该混合物以大约1600-1750L的质量流 量以240-300L/min进行再循环。

51)第34段所述的方法，其中第三罐内的内容物通过管线内过滤器被 引导向所述均质器罐。

52)一种用于在人类和其他哺乳动物体内氧合作用的氟碳乳剂，包含 连续水相和不连续氟碳相，其中该不连续氟碳相是由58％w/v全氟溴 辛烷和2％w/v全氟溴癸烷组成，进一步包含由蛋黄磷脂组成的乳化 剂。

53)一种用于在人类体内氧合作用以及避免暴露于异源或同源血液的 氟碳乳剂，包含连续相和不连续氟碳相，该氟碳相包括大约95-96％ w/w的全氟溴辛烷和大约3-4％w/w的全氟溴癸烷，进一步包含由蛋 黄磷脂组成的一种乳化剂。

54)用于向人类和其他哺乳动物的组织输送氧以及避免暴露于异源或 同源血液的氟碳乳剂，包含：连续水相和不连续氟碳相，其中该不连 续氟碳相是由全氟溴辛烷和全氟溴癸烷组成，其中该全氟溴辛烷在该 氟碳乳剂中存在的量大约为总乳剂的57-60％w/v并且该全氟溴癸烷 在该乳剂中存在的量大约为总乳剂的1-3％w/v。

55)第54段所述的氟碳乳剂，进一步包含由蛋黄磷脂组成的一种乳化 剂，其存在的量大约为3.5％-4％ w/v。

56)第54和55段所述的氟碳乳剂，其中该乳剂用选自以下的一表面 活性剂进行稳定：氟化的表面活性剂和基于卵磷脂的表面活性剂。

57)第54段所述的氟碳乳剂，其中该不连续相包括大约58-59％ w/v PFOB和大约2-3％ w/v PFDB。

58)第54段所述的氟碳乳剂，其中该不连续相包括大约58％ w/v PFOB和2％ w/v PFDB。

59)第54段所述的氟碳乳剂，其中在该乳剂形成时，形成了中间粒度 为0.18μm或更小的氟碳颗粒。

附图简要说明：

图1是静脉给药的氟碳化合物排泄的四组分药代动力学模型；

图2是显示根据本申请的一个实施方案生产乳剂的方法步骤的流程 图；

图3展示了d³作为时间函数的Lifshitz-Slezov-Wagner图，它是针对 90％ w/v PFOB、90％ w/v PFOB/1％ w/v PFDB以及90％ w/v PFOB/10％ w/v PFDB的乳剂；

图4示出大鼠在静脉输注了60/30％ w/v PFOB/PFDB氟碳乳剂和6％ EYP(2.7g PFC/kg)之后PFOB和PFDB在血管内的保留时间；

图5示出从PFOB/PFDB乳剂获得的沉降场流动分离法分数图 (SdFFF fractogram)，显示了接近空隙的磷脂小囊泡的分数和大约0.15 μm的磷脂单分子层稳定的乳剂微滴的分数；

图6示出一个沉降场流动分离法研究，展示了作为微滴大小的函数出 现的分隔。右边的轴(在图表上用圈给出)代表了在单一大小的微滴部 分PFDB的摩尔分数，由气相色谱法确定。发现PFOB和PFDB分别 在大和小液滴内被浓缩；

图7示出实例V直接在静脉输注了剂量为2.7g PFC/kg之后24小时 后在体外大鼠血液中的乳剂粒度分布。插表显示了随着时间的粒度分 布变化。一旦进入血管腔隙，较大的微滴选择性地被网状内皮系统清 除；

图8是在单一大小的乳剂微滴中PFDB的摩尔分数图，是体外大鼠血 液对1/d，在静脉输注了2.7g PFC/kg的60/30％ w/v PFOB/PFDB和 6％ EYP乳剂之后获得的。标绘的数据包括注射前的乳剂，以及24hr 之后的样品。更不易溶解的含氟化合物组分PFDB的摩尔分数在给药 之后增加；以及

图9示出避免任何异源和PAD输血的受试者的百分比，(表A)意欲治 疗的人群(N＝492)，(表B)治疗方案定义的失血≥20mL/kg的目标人群 (N＝330)以及(表C)临床受益组(析因分析)，即手术失血≥10mL/kg的 患者(N＝424)。(各组间^＊p<0.05)。

优选实施方案的详细说明

本发明的氟碳乳剂包括两个相：连续水相和不连续氟碳相。渗透 剂、缓冲液和螯合剂可以包括在该连续相中来保持渗透性和pH值从 而促进其生理学可接受性。使用乳化剂通过在不连续相和连续相之间 的界面处形成一个层来帮助氟碳乳滴的形成和稳定。该乳化剂可以包 含一个单个化合物或者多个化合物例如在多种表面活性剂的情况下。

如此处所使用，表述“重量/体积“或者“w/v”指的是每100立方厘 米或者毫升乳剂体积的克数。表述“重量/重量”用于并理解为指的是加 至给定重量的不同组分的重量分数。

本发明针对由氟碳化合物的一种混合物组成的一种氟碳乳剂，该 氟碳化合物的混合物是高度稳定的且具有极好的生物相容性和有效 性。本发明提供了一种氟碳乳剂，其中不连续相是由PFOB和PFDB 的一种混合物组成。与先有技术的乳剂不同，本发明中的氟碳乳剂在 贮藏时显示出最小的颗粒增长并且使用最少量的PFDB来防止颗粒增 长并且避免了明显的器官滞留和半衰期延长等问题。

本发明的乳剂可以按照以下过程进行生产。在水罐(1号罐)中通过 将预先称重的量值的美国药典(USP)一水合磷酸二氢钠、美国药典氯化 钠和乙二胺四乙酸钙二钠在65至80℃下加入到所需量的注射用热水 (WFI)中来制备水溶液。在该水溶液中喷入氮气并将温度调节为55至 65℃(+/-5℃)。在PFC罐中加入需要量的PFC组分(PFOB和PFDB) 并保持在20+/-5°。然后在PFC液体中喷入氮气以取代溶解的氧气， 然后置于真空下给液体脱气。脱气以后，该PFC液体在真空下加热至 60℃(+/-5℃)。

将需要量的蛋黄磷脂和美国药典d-α-生育酚加入到一个预混合罐 (2号罐)中并用氮气吹扫。在氮气压力下，将1号罐中的水溶液通过一 个管线内的0.45-μm的过滤器壳体转移到该预混合罐(2号罐)中，然后 通过一个分散混合器进行再循环。该预混合罐中的内容物用一个搅拌 器混合。在流速达到不低于150L/min后，在水溶液再循环时将PFC 溶液加入到该分散混合器的头部。通过将PFC加入到表面活性剂(EYP) 和水性盐分散相且同时使用一种高速和高剪切力的混合器来乳化 PFC。这产生了最佳的PFC颗粒的表面活性剂包覆。在预混合期间持 续向罐中吹扫氮气。在加入PFC并且在水相中乳化之后，该混合物通 过分散混合器在80+/-20L/min下进行1670+/-70L质量流量的再循 环。

预混合完成以后，将以上制备的乳剂通过一个管线内10μm过滤 器从2号罐循环至两个均质罐H1和H2中，通过一个热交换器，并在 60+/-5℃下返回2号罐，总质量流量为1170+/-5-kg。然后首先在60+/- 3℃下进行均质化，然后在控制的压力下在11+/-3℃下达到最佳均质 化作用。在均质的最后一步中，乳剂通过该均质机转移到3号罐中而 不是返回2号罐。均质化作用的这一最后步骤被说明为“分别的通过”， 确保转移到灌装罐的所有产品都已经通过均质机。

在1号罐中(11+/-5℃)在注射用水中制备美国药典七水合磷酸氢 二钠、美国药典一水合磷酸二氢钠和美国药典氯化钠的通氮气的缓冲 溶液，并通过0.45μm的过滤器转移至含有均质乳剂的3号罐中。该 乳剂在通过灌装回路之前以10+/-1L/min的流速搅拌至少5分钟。灌 装温度控制在11+/-3℃。该乳剂或者直接在灌装之前通过一个10μm 过滤器壳体或者循环返回3号罐。该乳剂在层流罩(100级)中灌装到 100-mL瓶中(美国药典I类玻璃)并用28-mm预先洗净的预硅化处理 的灰色丁基橡胶塞塞住。在用塞子塞住之前，在每个瓶子的顶部空间 用氮气吹扫。在塞好的瓶子上加上28-mm的铝漆三件套外封盖并手工 压盖。

然后该产品在蒸汽超压高压釜中通过注入洁净空气/洁净蒸汽的 混合物来进行最终蒸汽灭菌、进行检查、并且灭菌后在2至8℃下贮 藏。对从灌装工艺开始和结束时抽取的样品进行分析是否符合终产品 标准。

实例I

含有4％ w/v蛋黄磷脂的90％ w/v的PFOB乳剂(90/4％ w/v)的制备

根据Long氏方法(美国专利号4,987,154，其全文通过引用并入本 文)通过高压均质法制备含有90g PFOB，4g蛋黄磷脂(EYP)和生理学 水平的盐及缓冲液的一种对照乳剂以获得一个90％ w/v的PFOB乳 剂。然后在90％ w/v的PFOB乳剂中加入次要氟碳化合物全氟溴癸烷 (PFDB)，其量值为含有1％、2％、5％和10％(w/w)的全氟溴癸烷来 产生一种PFOB乳剂和四种PFOB/PFDB乳剂。将采用实例I的步骤 制备的四种PFOB/PFDB乳剂在40℃下用粒度分析仪进行三个月的 加速稳定性试验。

表I是用粒度分析仪测定的一种PFOB和四种PFOB/PFDB氟碳 乳剂随时间变化的粒度的稳定性。这些乳剂中包括一个对照，其中 100％的氟碳相都是全氟溴辛烷，以及本发明的乳剂，其中氟碳相是 90％至99％ w/w的全氟溴辛烷，1％至10％ w/w的全氟溴癸烷作为 一种稳定剂。在表I中，“EYP”指的是蛋黄磷脂，“全氟溴烷”指的是 全氟溴辛烷，“PFDB”指的是全氟溴癸烷，以及“S”指的是颗粒生长速 率，单位是μm³/mo。图3展示了对于其中三种乳剂的d³为时间函数 的典型的Lifshitz-Slezov-Wagner图，90％ w/v PFOB乳剂、90％ w/v PFOB/1％ w/v PFDB乳剂以及90％ w/v PFOB/10％ w/v PFDB乳剂。 因为根据Lifshits-Slezov-Wagner理论预测d³对时间的曲线将产生一 条直线，所以为纵坐标选择了立方项。事实上，对于氟碳乳剂普遍地 观察到这种线性相关性。

表I

含有添加的全氟溴癸烷和4％EYP的90％w/vPFOB乳剂中全氟 溴癸烷的稳定效应，T＝40℃

(括号中的是粒度分布的标准偏差)

上述结果表明较高浓度的PFDB比较低浓度的PFDB对90％w/v 的PFOB乳剂的稳定作用更有效。证明90％ w/vPFOB/10％ w/w PFDB 的氟碳乳剂在三个月期间中对于最小的粒度是最稳定的。

实例II

一种60％ w/v的PFOB乳剂的稳定性

(全氟溴辛烷/全氟溴癸烷)

根据Long氏过程(美国专利号4,987,154)和实例I所教导的内容制 备了一种乳剂，但不是90％ w/v的PFOB乳剂，而是制备一种60％ w/v 的PFOB乳剂和用10％ w/v的PFDB稳定的一个第二60％ w/v的 PFOB乳剂。表II对不含有PFDB的60％ w/v的全氟溴烷乳剂和含有 10％ w/v的PFDB的60％ w/v的全氟溴烷乳剂在40℃下进行为期三 个月的加速稳定性试验中粒度的增加进行了比较。用粒度分析仪进行 稳定性试验。表II表明了加入10％ w/v的PFDB的60％ w/v的PFOB 乳剂在三个月期间颗粒增长的缩减。

表II

一种60％ w/v的氟碳乳剂的稳定性

(全氟溴辛烷/全氟溴癸烷)

 

样品 初始 粒度 (μm)一个月后 的粒度 (40℃)两个月后 的粒度 (40℃)三个月后 的粒度 (40℃)S×1000 (μm³/mo )0％ w/v PFDB 10％ w/v PFDB0.20 0.180.34 0.200.38 0.230.39 0.2316.9 2.3

结果表明，与60％ w/v的PFOB乳剂相比，加有10％ w/v的PFDB 的60％ w/v的PFOB乳剂在三个月期间颗粒增长显著缩减。

实例III

在两组分的分散相乳剂(60％PFOBw/v/30％PFDBw/v)中的氟碳化合 物在血管内持续性的差异

图4代表了将PFOB和PFDB均除去的典型数据。图4示出对 于用6％ w/v的EYP进行稳定的比例为60/30(％w/v)的PFOB/PFDB 中PFOB和PFDB在大鼠的血管内持续性所获得的沉降场流动分离法 分数图曲线。一般而言，PFDB去除的速度常数比PFOB的速度常数 低20-30％。

具有图4所示数据的乳剂组合物含有一个用6％ w/v的EYP稳定 的比例为60/30％(w/v)的PFOB/PFDB。在这种情况下，PFDB去除的 速度常数比PFOB的速度常数高20％。可以假定在给药后的最初几个 小时，从血液中的清除是由k12控制(见图1)。因此循环的乳剂微滴中 的含氟化合物组分应该保持完整。那么，为什么两个分散相组分会具 有不同的速度常数？为了回答这一问题，静脉给药乳滴的组成可以采 用沉降场流动分离法(SdFFF)联合气相色谱法来检测，从而确定微滴 的性质。

图5表明了用6％ w/v的EYP稳定的PFOB/PFDB比例为60/30 (％w/v)的沉降场流动分离法分布分数图曲线。数据表示为质量加权的 检测器响应对比乳滴直径。在尖锐的空体积峰旁边出现的肩部是由于 存在磷脂小囊泡，这些磷脂小囊泡中仅含有少量溶解的含氟化合物。 较大尺寸(后流出)峰可归因于含氟化合物乳剂微滴，它们被一个接触 面吸附的磷脂单层所稳定。这类微滴的浓度已经通过气相色谱法在单 分散分数中被确定。

实例IV

一种60/30％ w/v的PFOB/PFDB乳剂中组分的分散相的分离。

图6展示了分散相组分的分离，这发生在用6％的EYP稳定的 PFOB/PFDB的比例为60/30％ w/v的不同单一大小液滴部分(fraction) 之间。图6中标示出的是采用气相色谱法测定不同单一大小液滴的沉 降场流动分离法分布分数图(标绘在左侧坐标轴上)和PFDB的摩尔分 数(整体X_pfdb＝0.291)。整体组成是在聚结介导过程中跨越整个粒度分 布所预期的组成，因为通过这种机理不会发生组分分离。没有对这些 数据进行散射校正。因此，这种分布趋于过高估计了使光线强烈散射 的大液滴。这导致分布向更大的中间直径偏移。尽管中间直径为0.15 μm，大约在0.13μm处观察到液滴中最大含氟化合物含量。在左侧远 端(小粒径)的两个组分点看起来超出了粒度分布范围，但是仍然含有 大约10％和20％的峰值含氟化合物浓度(即很清楚它们位于分布的末 尾)。

很清楚，这些小液滴在缓慢扩散的PFDB组分中被显著地被浓缩 (达5％或者更高)，而大液滴在PFOB中浓缩到高达5％。观察到分离 程度比仅含有10％w/wPFDB的PFOB/PFDB乳剂要低。这一点是预 期的，因为预测到随着增加次要含氟化合物浓度，乳剂会对奥斯特瓦 尔德熟化更稳定。

实例V

含氟化合物乳剂在体外血液中粒度分布改变的沉降场流动分离法研究

图7是静脉注射剂量为2.7g PFC/kg的用6％w/vEYP稳定 PFOB/PFDB的比例为60/30％(w/v)的在大鼠体外血液中观察到的粒 度分布曲线。相比于对照，注射以后体外乳剂的液滴大小略有增加 (0.19μm对比0.15μm)。这可能反映血清蛋白的某种程度的调理作用、 增加液滴的絮凝作用、或者替代地血浆中某些颗粒的干扰，这些颗粒 具有0.15μm至1μm的粒度。24小时以后，很大部分的大液滴被优 先移除。图7中的插表示出在最初时间众数直径很少见到变化。但是， 在3和6小时之后，见到了小于0.2μm的液滴群的显著增加。与此同 时，见到了大于0.5μm的液滴群的减少。

所有这些结果结合在一起表明巨噬细胞选择性地移走分布中的大 颗粒。因为小颗粒富集更多PFDB，因此预期富含PFDB的颗粒的浓 度能够随着时间增加。图8相对于对照(即注射之前)示出24小时样品 的X_pfdb对1/d的曲线。这些点是如以前一样获得，通过采集液滴分布 中单一大小的部分并用气相色谱法分析其含氟化合物的含量。与对照 相比体外样品的X_pfdb增加，表明在PFDB组分中循环液滴确实被浓缩， 为多达12％。这比对照中观察到的5％的值有显著增加。

实例VI

根据本申请所教导的内容制备PFOB/PFDB氟碳乳剂，配制成 58％ w/v PFOB和2％ w/vPFDB的在连续水相中的氟碳不连续相。它 的组分有：

C8F17Br(PFOB)       58％ w/v

C10F21Br(PFDB)      2％ w/v

蛋黄磷脂            3.6％ w/v

d，α-生育酚        1.0018％ w/v

NaCl                0.36％ w/v

NaH2PO4·H2O        0.069％ w/v

Na2HPO4·7H2O       0.474％ w/v

EDTA                0.02％ w/v

这种58％/2％ w/v的PFOB/PFDB乳剂具有300至310mOsm/kg的 渗透压，pH值为7.0至7.2并且粘度大约为4厘泊(剪切力为1/秒)。

按照实例VI制备的乳剂表明与其他乳剂例如60/10％ w/v的 PFOB/PFDB乳剂同样稳定或者更加稳定，或者大约与90/10％ w/v 的PFOB/PFDB乳剂同样稳定但是不具有该乳剂的负面副作用。通过 使用比60/10％ w/v的PFOB/PFDB乳剂少500％的PFDB，实例VI 的乳剂避免了过量PFDB的更长的半衰期和器官滞留问题。与90/10％ w/v的PFOB/PFDB乳剂相比，实例VI的乳剂几乎少用了50％的 PFOB和500％的PFDB，仍然证明其与90/10％ w/v的乳剂具有同样 有效的氧输送(见下面的实例)。实例VI的乳剂的副作用，例如与大氟 碳颗粒有关的流感样副作用，与90/10％ w/v的PFOB/PFDB乳剂相比 更不显著。非临床研究结果表明流感样副作用是由于细胞因子类、前 列腺素类、促凝血素和/或内过氧化物产物的短效释放，这是对在更浓 缩的乳剂中由更大量氟碳化合物产生的较大氟碳颗粒对吞噬细胞的乳 剂-颗粒-诱导的刺激作用的反应。

表III

含有PFDB的氟碳乳剂的稳定性

(全氟溴辛烷/全氟溴癸烷)

 

样品 初始粒 度 (μm)一个月后的 粒度(40℃) 两个月后的 粒度(40℃) 三个月后 的粒度 (40℃)S×1000 (μm³/mo) 58％ w/v PFOB/2％ w/v PFDB^＊60％ w/v PFOB 60％ w/v PFOB/10％ w/v PFDB 90％ w/v PFOB 90％ w/v PFOB伴有10％ w/v PFDB 90％ w/v PFOB伴有1％ w/v PFDB0.18 0.20 0.18 0.23 0.20 0.230.19 0.34 0.20 0.39 0.25 0.29N.A. 0.38 0.23 0.49 0.27 N.A.0.21 0.39 0.23 0.52 0.27 N.A.0.80 16.9 2.3 44.4 3.9 N.A.

^＊数据来自GMP批，其中根据ICH指导原则在1，3，6个月测定粒度 (所有情况下，来自粒度分析仪Horiba CAPA-700)。58％/2％ w/v的 PFOB/PFDB乳剂的第六个月的粒度为0.22μm。

表III的结果表明实例VI的乳剂比其他列出的乳剂具有更大的随时 间的稳定性(颗粒增长速率S×1000为0.80μm，单位为μm³/mo)。60％ w/v的PFOB乳剂和90％ w/v的PFOB乳剂具有很高的S值，分别为 16.9和44.4μm。在两种乳剂中加入PFDB表明有助于使乳剂稳定， 对于60％ w/v PFOB/10％ w/v PFDB和90％ w/v PFOB/10％ w/v PFDB，S值分别为2.3和3.9。实例VI的58％ w/v PFOB/2％ w/v PFDB 的S值为0.80，表明与其他乳剂相比，有了很大改善并且是没有预料 到的。

实例VI的乳剂应以无菌方式静脉给药。它理想地用一种有可以掰 开的橡胶塞和铝盖的110-mL的单次使用瓶提供。该乳剂应该在2℃- 8℃下冷藏保存并且不能冷冻。使用前应该将乳剂达到室温并且轻轻 地反复倒转大约1分钟(至少30次)，以确保乳剂外观完全均匀。根据 个体和用途不同剂量有所不同，但是一般为1-3ml/kg或者1-4 ml/kg。

实例VII

按照实例VI所教导的内容制备的氟碳乳剂的长期和加速试验。

为了测定按照实例VI所教导的内容制备的乳剂的长期贮存期限， 在24个月期间确定的时间点用Horiba CAPA-700粒度分析仪产生24 个月窗口的确定时间点的稳定性数据，并用可商购的稳定性软件系统 (SCIENTEK^TM，Tustin，加利福尼亚)进行统计分析。制备乳剂，然后 在长期条件下(5℃)贮存高达24个月并在加速贮存条件下(25℃)放置 高达6个月。对于按照实例VI制备的乳剂进行了加速试验(6个月) 和长期试验(24个月)的测定。

表IV.对于实例VI的乳剂的长期和加速稳定性的乳剂微滴大小和结 果

 

初始粒 度(μm)1 3 6 9 12 18 24 58％ w/v PFOB/2％ w/v PFDB长期试验0.16 ＊ 0.20 0.21 0.22 0.23 0.20 0.21 58％ w/v/PFOB/2％ PFDB加速试验0.16 0.21 0.22 0.23 ＊ ＊ ＊ ＊

批次来自一个Horiba CAPA-700粒度分析仪

结果表明实例VI的乳剂直至24个月都具有非常好的长期稳定性。 用SCIENTEK稳定性软件系统对数据进行分析，对数据进行统计回 归分析并产生一个单侧95％置信预测的有效期(按照1998年FDA指 导原则草案)，考虑到稳定性问题例如游离脂肪酸、外观、pH和蛋黄 磷脂含量、渗透压和溶血磷脂酰胆碱，推荐其有效期为29个月。

实例VIII

根据本发明所教导的内容制备PFOB/PFDB氟碳乳剂，在连续水 相中配制成58％ w/v PFOB和2％ w/vPFDB的氟碳相。它的组分有：

C8F17Br(PFOB)       58％ w/v

C10F21Br(PFDB)      2％ w/v

蛋黄磷脂            3.6％ w/v

NaCl                0.36％ w/v

NaH2PO4·H2O        0.069％ w/v

Na2HPO4·7H2O       0.474％ w/v

对实例VI的氟碳乳剂做出了变化，不包含d，α-生育酚和EDTA。 这种58％/2％ w/vPFOB/PFDB乳剂具有的渗透压为300至310 mOsm/kg，pH值为7.0至7.2并且粘度大约为4厘泊(剪切力为1/ 秒)。

实例IX

单次静脉注射实例VI的乳剂后全氟溴烷和全氟溴癸烷在大鼠体内的 药代动力学和组织分布

本研究被设计为用于评价年龄为7-9周、体重为190-267克的 雌雄Sprague Daley大鼠在不同时间间隔内单次静脉注射剂量为1.8 和3.6g PFC/kg的实例VI的乳剂后，PFOB和PFDB的药代动力学 和组织分布。对于药代动力学，160只大鼠分成20组(N＝4只大鼠/性 别/剂量/时间间隔)，而对于组织分布，156只大鼠分成26组(n＝3只大 鼠/性别/剂量/时间间隔)。药代动力学血样采集时间间隔为0.083、0.5、 1、3、6、12、36、48、72和96小时。组织分布采样时间间隔为给药 前、24小时、1、2、4、8、13、17、21、26、39、52和72周。

药代动力学

给药以后，没有观察到大鼠出现不良临床表现。雌雄大鼠单剂量 静脉注射1.8g PFC/kg或者3.6g PFC/kg后测得的6个药代动力学参 数见下表。雌性和雄性大鼠给予1.8g PFC/kg后PFOB的平均末端半 衰期大约为73小时，与动物给予3.6g PFC/kg后的平均末端半衰期181 小时相比。与之比较，PFDB的末端半衰期要高几个数量级：大约为 25,130小时(雄性，1.8g PFC/kg)，大约为4800小时(雌性，1.8g PFC/kg)，大约为12,550小时(雄性3.6g PFC/kg)和大约为7,600小时 (雌性，3.6g PFC/kg)。

两种性别和两种剂量PFOB的分布体积(Vd)是从大约为1200至 2200g/kg。与此相比，两种性别和两种剂量PFDB的分布体积范围是 从大约为1,650,000至6,130,000g/kg。因此PFDB的Vd比PFOB的 Vd大约高3个数量级。

表V.单次静脉注射后雄性和雌性Sprague Dawley大鼠血液中PFOB 的药代动力学参数

^＊用最后的3或4个数据点计算半衰期T1/2

^＊＊根据末端相计算

表VI.单剂量静脉注射后雄性和雌性Sprague Dawley大鼠血液中 PFDB的药代动力学参数

^＊用最后的3或4个数据点计算半衰期T1/2

^＊＊根据末端相计算

组织分布

26组(N＝3只大鼠/性别/组)。在实施安乐死之前，记录体重。在指 定时间(见下面)，用麻醉大鼠并通过腹动脉放血。用含 有EDTA的注射器采集血液并转移到密封的塑料容器中在-20℃储存 直到进行分析测定。产生的数据包括在测定的药代动力学参数中。每 只大鼠采集下列组织并且置于密封容器中在-20℃冷冻保存。在冷冻 之前，处理血样和组织样品用于分析。用经过Oread验证的顶空气相 色谱法对血样和组织样品中的PFOB和PFDB进行定量测定。本方法 在肝脏样品中进行了验证，然后在全部其他组织、血液和血清中进行 了交叉验证。采集并进行分析的组织包括有心脏、肺、腹部脂肪、脾 脏、肝脏、肠系膜淋巴结、肾脏、肾上腺、睾丸、卵巢、子宫、全脑、 眼睛、骨骼肌、股骨骨髓和胃肠道。

测定了两种性别12个时间点的组织中PFOB和PFDB的浓度。对 于雄性动物，包括血液在内共360个个体结果。对于雌性动物额外增 加了24个结果。

在雄性中，对于接受1.8g PFC/kg的总剂量的动物在24小时后在 肝脏中发现大约59％的PFOB剂量。脾脏中总剂量的百分比<1％。雄 性动物接受3.6g PFC/kg的剂量后这一数值增加至大约69％。在雌性 中，对于接受1.8g PFC/kg的总剂量的动物，24小时后在脾脏中发现 大约4％的PFOB剂量并且24小时后在肝脏中发现大约63％的PFOB 剂量。在接受3.6g PFC/kg的雌性中，发现肝脏中总剂量的百分比大 约为53％而脾脏中<1％。

在雄性大鼠中，分别在脾脏和肝脏中发现大约占总剂量15％和85 ％的PFDB(1.8g PFC/kg)。在接受3.6g PFC/kg的雄性大鼠中，在脾脏 和肝脏中发现的PFDB的总剂量的百分比分别约为11％和69％。在 雌性中，在脾脏和肝脏中发现的PFDB百分比分别为PFDB的总剂量 的约14％和86％。当PFC的总剂量增加为3.6g/kg时，脾脏中大约 含有总剂量的8％而肝脏中大约含有总剂量的62％。

在给药1.8g PFC/kg的雄性大鼠中，24小时的PFOB的绝对浓度 除了眼睛和骨骼肌以外在所有组织中都高于100μg/g。对于给药3.6g PFC/kg的雄性大鼠，所有组织中PFOB的浓度都高于100μg/g。平均 起来PFOB的绝对浓度高于眼睛中平均定量的上限。在给药1.8g PFC/kg的雌性大鼠中，除了血液、眼睛和骨骼肌以外所有组织中 PFOB的浓度都高于100μg/g。在给药3.6g PFC/kg的雌性大鼠中，24 小时的所有组织中PFOB的浓度都高于100μg/g。此外，对于所有四 个组在肝脏和骨髓中的浓度都高于10mg/g。

两种性别和两种剂量的所有组织在24小时PFDB的绝对浓度都 高于1μg/g。给药1.8g PFC/kg的雄性大鼠在24小时的脾脏和肝脏中 PFDB的浓度高于1mg/g。给药3.6g PFC/kg的雄性大鼠在24小时的 脾脏、肝脏和骨髓中PFDB的浓度高于1mg/g。给药3.6g PFC/kg剂 量组的雌性大鼠在淋巴结、脾脏、肝脏和骨髓中PFDB的浓度高于1 mg/g。

药代动力学和组织分布的研究都清楚地证明了因为PFDB的半衰 期和在各种组织和器官中滞留的时间比PFOB长很多，所以希望限制 PFOB/PFDB乳剂中PFDB的量。因此任何PFOB/PFDB乳剂的配方 都应该避免PFDB的量超过绝对需要的量。

实例X

实例VI的PFOB/PFDB乳剂在健康人志愿者体内的药代动力学

在健康人体内用根据实例VI制备的氟碳乳剂进行两个随机、对 照、双盲、平行组的一期临床研究。健康人志愿者单剂量静脉注射 1.2或者1.8g PFC/kg的实例VI氟碳乳剂后，分析血液和呼气样品中 的PFOB和PFDB来测定其药代动力学。血样采集直至给药后336个 小时。

两组研究中对PFC血药浓度-时间曲线的试验表明初始峰浓度 (C_max)不依赖于各个每kg剂量组中受试者的绝对剂量(体重乘以各自 的每kg剂量)，提示PFC的分布空间是一个体重(最可能的是血容量) 的固定百分比。PFOB和PFDB的处置具有剂量依赖性。

在前2-4小时存在一个初始分布相，接下来是一个缓慢的初始消 除相。血液中PFC最初的Michaelis-Menten衰减可能是由于网状内 皮系统对血液中PFC的吸收达到饱和，而缓慢的末端消除相则表明 PFC在身体组织(最可能的是脂肪组织)中延长了存留时间。

在前12小时过程中的平均初始PFOB消除半衰期(t_1/2，12h)对于1.2g PFC/kg剂量比1.8g PFC/kg剂量要短。本实例中PFOB和PFDB的药 代动力学参数见表VII和表VIII。

表VII.对于PFOB和PFDB的消除半衰期值

^＊给药后前12个小时的初始消除半衰期。

因为5名受试者的值无法报告(r²<0.95)。

因为1名受试者的值无法报告(r²<0.95)。

表VIII.对于PFOB和PFDB的消除半衰期值

^*给药后前12个小时的初始消除半衰期。

因为其他3名受试者的值无法报告(r²<0.95)。

别的可报告的值(r²<0.95)。

实例XI

实例VI的氟碳配方在经受非心脏外科手术的人类受试者体内的药代 动力学

给经受全髋关节置换术或脊柱外科手术或包括耻骨后前列腺根治 切除术、根治性子宫切除术、膀胱切除术和复合手术在内的多种泌尿 外科和妇科手术的受试者给予实例VI的氟碳乳剂后测定PFOB和 PFDB的药代动力学。在一项研究中受试者接受0.9g PFC/kg或者 1.8g PFC/kg的实例VI的氟碳配方，而在第二项研究中受试者接受 1.8g PFC/kg的实例VI的氟碳配方。对PFOB和PFDB的药代动力 学参数的总结见表IX。

PFOB的全血药浓度大约比PFDB的全血药浓度高30倍，与它们 给药配方(58％ w/vPFOB：2％ w/v PFDB)中的相应比例一致。对于 PFOB和PFDB的C_max的平均值与剂量的增加成合理比例的增加。尽 管1.8g PFC/kg的AUC_∞的平均值比0.9g PFC/kg的AUC_∞的平均值超 出2倍，但是这种大的差异排除了任何有关PFOB或PFDB的药代动 力学呈非线性的结论。两种化合物的平均消除半衰期(t 1/2)范围都是大约 2.4小时至大约5.6小时。这些数值低于在健康志愿者中获得的数值， 因为事实上这些受试者发生外科出血，PFC从循环中流失。

表IX.经受非心脏外科手术的受试者给予实例VI的配方后PFC的药 代动力学参数

PFDB＝全氟溴癸烷；n＝能够提供足够分析数据的受试者数

C_max＝最大全血浓度；AUC_∞＝全血浓度-时间曲线下到无限远处的面积；

t 1/2＝消除半衰期；CL＝全血清除率。

实例XII

实例VI的配方在经受心脏外科手术的受试者中的药代动力学

给经受冠状动脉搭桥术或伴有低体温心肺分流术的冠状动脉旁路 移植手术的受试者给予实例VI的氟碳配方后测定PFOB和PFDB的 药代动力学。在第1和第2组中，在分流术后但在开始冷却之前，直 接从分流充氧器中对受试者给予实例VI的氟碳乳剂(2.7g PFC/kg)。 在第4组中，在主动脉插管之前或者在分流术后，但在开始冷却之前， 直接从分流充氧器中给受试者给予2.7g PFC/kg的氟碳乳剂。对PFOB 和PFDB的药代动力学参数的总结见表X。

表X.经受伴有低体温心肺分流术的冠状动脉旁路移植手术的受试者 给予实例VI的2.7g PFC/kg乳剂后PFC的药代动力学参数

n＝能够提供足够分析数据的受试者数

C_max＝最大全血浓度；AUC_∞＝全血浓度-时间曲线下到无限远处的面积；

t 1/2＝消除半衰期；CL＝全血清除率。

全氟溴烷的全血药浓度大约比PFDB的全血药浓度高大约30倍， 与它们给药配方(58％ w/vPFOB：2％ w/v PFDB)中的相应比例一致。 在主动脉插管之前或者在心肺分流术开始之后给予实例VI的氟碳乳 剂所产生的PFOB和PFDB的全血药浓度和药代动力学参数均具有可 比性。

实例XIII

与标准输血惯例(对照)相比，实例VI的2.7g PFC/kg的 58％PFOB/2％PFDB的氟碳乳剂结合急性等容血液稀释在选择性的 非心脏外科手术操作中伴有中度至大量失血中减少或者避免输储备血 的有效性的一个多中心、单盲、随机、对照、平行组研究

本研究的主要目的是评价与标准输血惯例相比(护理标准/SOC对 照)，用实例VI的58％PFOB/2％ PFDB w/v氟碳乳剂作为临时的氧 载体来增加急性等容血液稀释是否能够减少给患者输储备血，即给经 受伴有中度至大量失血(≥20mL/kg)的选择性非心脏外科手术受试者 输入同种异源红细胞和/或术前自体捐血(PAD)单位。

试验设计

这是一项在34个临床试验基地进行的第3期、单盲、随机、平行 组、对照、多中心研究。本研究中对总数为492名预计失血在20至 70mL/kg之间的经受大型非心脏外科手术的患者进行了登记。额外的 关键选择标准包括手术前血红蛋白浓度[Hb]在12至15g/dL之间； 年龄在18至80岁之间；体重在50至125kg之间；美国麻醉学家学 会(ASA)体格状态在I-III之间；并且估计血容量足够在手术前的急 性等容血液稀释(“ANH”)中抽取2个单位的自体血液。手术操作包括 主要的大型癌症手术(例如，盆腔廓清术、腹内肿瘤去除术、骨盆和骨 端的肌肉骨骼肿瘤切除术、主要的头和颈切除术、肝脏切除术和脊髓 肿瘤切除术)，两侧和修改臀部关节成形术，骨盆骨折切开复位内固定 术，和主要的血管外科手术。在本研究中不允许血液回收。手术前受 试者被随机分在两个研究组中的一个中，研究组1(急性等容血液稀释 (ANH)加实例VI的氟碳配方)或者研究组2，对照，标准输血惯例 (SOC)。

对于手术中的每一输血指征(即一个方案确定[Hb]的或几个方案 确定的手术中生理学指征之一种)，给患者输入术前自体捐血单位(如 果有的话)血液和同种异源血液。这些指征包括心动过速(心率≥100 次每分钟心跳或者≥135％的麻醉后诱导值)，低血压(平均主动脉压 ≥60毫米汞柱或者≥65％的麻醉后诱导值)，PvO₂≤38毫米汞柱(如果 使用了肺动脉导管)，或者ST-段压低(>0.1mV)或者ST-段抬高 (>0.2mV)。

A.对照组(SOC)：给对照组按照标准血液输注方案中确定的标准输 血惯例进行处理。当出现各手术中血红蛋白输血指征为8.0±0.5g/dL 和/或当出现至少一种生理学指征时，给患者输入术前自体捐血单位 (如果有的话)，然后输入同种异源红细胞。在手术期间使吸入氧气分 数(FIO₂)保持在40％(FiO₂＝0.4)(在普通外科手术中典型用到的水平)。 B.给予实例VI氟碳乳剂的治疗组：在进行外科切口之前，给患者 进行急性等容血液稀释使血红蛋白为8.0±0.5g/dL且FiO₂＝1.0，然后 立即静脉注射剂量为1.8g PFC/kg的实例VI的氟碳乳剂(3mL/kg)。 当手术中血红蛋白达到6.5±0.5g/dL时，再给予剂量为0.9g PFC/kg 的实例VI的氟碳乳剂(1.5mL/kg)。当血红蛋白低于5.5±0.5g/dL或 者当满足上述任何的生理学指征(如上所述)时，给患者输入急性等容 血液稀释单位和术前自体捐血血液(如果有的话)，然后输入同种异源 血液。在手术后输入全部的急性等容血液稀释血。

在两组中，目标为手术后血红蛋白≥8.5±0.5g/dL，维持至手术后 (POD)3天，并且根据方案要求直到出院。血红蛋白输血指征的范围 (±0.5g/dL)不适用于个别患者，但是能够使研究中心根据当地的标准 调整输血决定(对两组进行同样的调整)。

有效性评价

终点：主要的有效性终点是在急性研究期间(皮肤切开后24小 时)输入的同种异源和/或术前自体捐血单位的数量。次要终点包括：(1) 在急性研究期间避免输入同种异源红细胞的受试者的百分比；(2)在 急性研究期间避免输入同种异源红细胞和术前自体捐血单位的受试者 的百分比；和(3)从到达恢复室直至出院(DD)的时间或到手术后21天 的时间。主要有效性群体被定义为有治疗意图的群体，包括所有随机 的受试者。方案中定义的次要有效性群体包括预期失血≥20mL/kg的 所有随机受试者。

结果：在筛选和基点中，两组患者的人口统计学是相似的，所进 行的外科手术类型也是相似的。在进行治疗或手术前，由于他们自己 的要求或者因为临床条件不允许在此时进行手术，总计14名受治疗 患者和10名对照患者退出研究。在术前急性等容血液稀释中，抽出 1,618ml血液(标准偏差＝558mL，范围：450-3,374mL)，并被1,312 ml(标准偏差＝680mL，范围：100-3,500mL)的胶体以及2,418ml(标 准偏差＝1627mL，范围：100-10,000mL)的类晶体输液来代替。在急 性等容血液稀释后血红蛋白为8.1±0.5g/dL。在227名接受氟碳乳剂 治疗的患者中，50名患者仅接受初始剂量为1.8g PFC/kg的实例VI 的氟碳乳剂并且再也没有达到需要再次给药的血红蛋白指征，而177 名患者接受了全部2.7g PFC/kg的剂量。

在有治疗意图的群体(N＝492)中，实现了主要终点(在24小时内 减少了输入同种异源/术前自体捐血单位的数量)：接受氟碳乳剂组比 对照组需要更少输血(分别为1.5对2.1单位)，代表26％的缩减率(表 XI，尽管在手术中失血较高[2.7±2.7L对2.3±2.0L；p<0.05])。然 而，在方案中确定的目标群体中(失血≥20mL/kg；N＝330或67％的随 机受试者)，手术后第1天氟碳乳剂治疗组的平均缩减率更高 (>40％)(表XII)。在出院时，与对照组相比这种差异仍然很显著(在手 术后第21天/出院时，平均差为3.4对4.9单位；中位差为2对4单位； p<0.001)。总体上，在手术后第21天/出院时，给予氟碳乳剂治疗的 受试者需要696单位，而对照组需要846单位，代表净节约了150单 位的同种异源血液。

表XI.有治疗意图的群体输入的同种异源血红蛋白和/或术前自体捐 血单位数

^＊用经过自然对数转换的协方差分析对平均值进行调整

分级线性模型进行计算，与平均级进行比较

术后第21天或者出院日，无论那天发生得更早

表XII.目标群体(失血≥20mL/kg)输入的同种异源血红蛋白和/或术 前自体捐血单位数

^＊用经过自然对数转换的协方差分析对平均值进行调整

分级线性模型进行计算，与平均级进行比较

术后第21天或者出院日，无论那天发生得更早

就有治疗意图的群体避免输血而言(图9，A组)，在急性研究期间 (24小时)，氟碳乳剂治疗组比对照组多出大约21％的患者避免了同种 异源输血和术前自体捐血(p<0.05)。在方案确定的目标群体中，从手 术后第1天至手术后第21天/出院的所有时间点，显著地更大的受试 者百分比(p<0.05)(几乎是两倍)(图9，B组)避免了输血。为了确定从氟 碳乳剂治疗受益的所有受试者而进行的一项析因分析表明当外科手术 失血是≥10mL/kg(N＝424；全部受试者的86％)时，给予氟碳乳剂治疗 的受试者与对照相比输血明显减少(图9，C组)。

实例XIV

根据不良事件(“AE”)报告(包括体格检查)、感染发病率、生命征象(心 率、血压和体温)以及临床实验室值(血液学、凝固和血液化学)，对实 例VI的氟碳乳剂的安全性进行评价。手术后3个月对患者的安全性 进行电话随访。在本研究期间，使用了一个独立的安全监控委员会 (DSMB)对实验室和安全性数据进行定期审查。

可以预料到本研究中会有不良事件(“AE”)和严重不良事件 (“SAE”)的报告，因为这些患者都经受了伴有大量失血的大手术。表 XIII显示了不良事件和严重不良事件。总体上讲，氟碳乳剂治疗组的 所有不良事件的发病率(86％)均与对照组(81％)相似，尽管氟碳乳剂治 疗组在“整体”、“心血管系统”(高血压)和“消化系统”(肠梗阻)分类中的 不良事件的报告更多。高血压主要发生在手术之后，并且可能与再输 入等容血液稀释血有关。肠梗阻病例的临床后果较小，而且在析因分 析中也没有发现能够将这些事件与给予实例VI的氟碳乳剂联系起来 的一般模型或病理生理学机理。

表XIII.给予氟碳乳剂后3个月的不良事件和严重不良事件(按照身 体系统的COSTART列表)

^＊治疗组的随机受试者(经受手术，并且如果在治疗组也接受了第一剂 量的氟碳乳剂)。

治疗组或对照组受试者报告的不良事件均>5％。

治疗组或对照组受试者报告的严重不良事件均>1％。

两组间严重不良事件的总发生率差异显著(氟碳乳剂组为32％对 对照组21％；p＝0.03)。但是，仅是“消化系统”类别是统计性地不同于 对照组，如上所述，主要是因为手术后肠梗阻发病率较高。氟碳乳剂 治疗组报告了四例肠梗阻严重不良事件(而对照组没有)：一例发生在 直肠切断术后，两例发生在大型妇科肿瘤切除术后，还有一例发生在 根治性膀胱切除术后。在这类患者群体中报告出如此低的肠梗阻发病 率出人意料，因为绝大多数患者经受的都是腹腔骨盆手术，这表明在 某种程度上报告不全，特别是在对照组。两组手术后死亡的发生率、 性质和时间进程与对经受恶性肿瘤广泛非心脏手术操作患者的发表文 献报道一致，并且没有观察到氟碳乳剂对此产生的任何影响。两组发 生的全部感染性并发症的总和相似，均为32％，支持了早期临床发现， 即氟碳乳剂不会使免疫功能受损。

如上所述，氟碳乳剂治疗组进行中度的手术前等容血液稀释(抽出 平均大约30％的血容量并同时用胶体和/或类晶体溶液代替)。但是， 有证据表明在这种特殊实例的血量正常条件下不一定能进行等容血液 稀释。分析表明在大约70％的接受氟碳乳剂治疗的受试者中，输入的 液体容量不能满足在等容血液稀释中取出的血容量。某些患者，补液 不足会引起血流灌注不足，这在手术剩余期间不能被充分地纠正。因 此，可能会使某些接受氟碳乳剂治疗的受试者诱发严重的手术后病症， 例如与局部缺血有关的不良反应。其他受试者，在等容血液稀释中补 液过量会伴有某些更加典型的循环负荷过量的并发症。这些分析证实 了监督本研究的独立的数据安全监控委员会(“DSMB”)的结论，即在某 些集中的不良事件中某些组出现不平衡，表明某些患者可能出现血容 量减少。但是，DSMB推断这在临床上不具有连贯性或显著性，并推 荐对普通外科群体进行进一步的研究来确认实例VI的氟碳乳剂的有 效性并进一步评价其安全性。两组的死亡率相似(4％对2％)，研究 者认为所有死亡都与受试药物无关。相反，认为死亡与自身肿瘤发展、 败血症、多器官衰竭和心肺并发症有关。观察到手术后几天发生短暂 的血小板计数下降，这根据以前的临床数据可以预测。因为两组输入 的血小板数和出血事件的发病率相似，所以看起来这种手术后血小板 计数的适度下降基本不具有临床相关性。这与早期对志愿者的研究一 致，证明PFC乳剂对血小板功能和出血时间没有影响。

实例XIII和XIV的数据的结论

这项普通外科研究成功地证明了输入实例VI的氟碳乳剂以后，在 统计学上能够显著地减少或者避免经受多种主要的全身性手术操作的 受试者中同种异源血液和手术前自体血液的输血。总体上，认为两组 手术后死亡的概况和发生率是可以接受的而且并不突出的。尽管氟碳 乳剂治疗组的严重不良事件发生率较高，但是观察到的事件没有超出 研究者对这个年纪较大的外科群体的预料，而且与给予氟碳乳剂无关。 同时，这项特殊研究的单盲属性可能会在某种程度上造成对照组报告 的事件过少，而使氟碳乳剂治疗组有报告过多的倾向。

实例XV

对经受心肺分流术下主要冠状动脉旁路移植手术患者，一项评价实例 VI的2.7g PFC/kg氟碳乳剂对增进手术中自体捐血和避免同种异源红 细胞输血的有效性的第3期、单盲、随机、平行组、多中心、对照研 究

主要研究目的是评价实例VI的氟碳乳剂作为临时性氧载体，在经 受CABG手术患者的心肺分流术“CPB”之前，通过允许更广泛的采集 自体血液来避免同种异源血液输血的有效性。

试验设计

这是在38个临床实验基地进行的一项3期、单盲、随机、平行组、 多中心、对照研究。年龄在18至80岁之间，已经排定了初步的、非 紧急的低体温或正常体温心肺分流术下的冠状动脉旁路移植术(不包 括瓣膜手术)的心脏外科患者，在手术前随机分成两组：氟碳乳剂治疗 组(急性等容血液稀释加手术中自体捐血[IAD])或者对照组(仅急性等 容血液稀释)。附加的关键选择标准包括手术前筛选血红蛋白[Hb]≥11 和≤14g/dL；体重在50至125kg之间；而且美国麻醉学家学会(ASA) 体格状态分类为2或3，或者对于不稳定心绞痛的ASA体格状态分类 为4。

本研究预期要登记600名受试者(每个研究组300人)。在38个临 床研究基地，本研究一共登记了411名受试者(治疗组205人和对照组 206人)。在分流术开始前，麻醉师进行急性等容血液稀释，目标是使 分流术初期的[Hb]达到8g/dL；在氟碳乳剂组和对照组受试者进行相 同程度的急性等容血液稀释。在氟碳乳剂治疗组，灌注师在分流术开 始前实施IAD(一种在心肺分流术开始时从患者体内采集自体血液的 技术)，目标是使分流术中的[Hb](6g/dL)比对照组受试者更低，并且 保存多余的自体血液。在急性等容血液稀释和自体采血中收集的血液， 要同时输入适当量的基于淀粉的胶体、白蛋白和/或类晶体来代替，从 而保证血量正常。将两组的正常体温下(35至37℃)的初始分流流速 (BFR)设置为2.2至2.4L/min/m²，用充氧器(即100％ O₂)来使动脉血 的含氧量保持最高。在低体温分流术中(温度范围为28至34℃)，BFR 降为1.8至2.0L/min/m²。两组都允许手术中自体血液再利用(ABS)。

两组中，当达到方案确定的血红蛋白或生理学指征时，给受试者 输血。但是手术中，当血红蛋白≥10g/dL时，不是必须进行与生理学 指征相应的输血。根据临床需要来改变分流流速(BFR)，但不能为了 试图纠正方案确定的生理学输血指征而增加分流流速。这些包括在低 体温心肺分流术中PvO₂≤30mmHg(在血量正常的心肺分流术中≤35 mmHg)、SvO₂≤65％以及ST-段压低(≥0.1mV)或者ST-段抬高 (≥0.2mV)。

氟碳乳剂治疗组：在实施分流术之前立即给氟碳乳剂治疗组患 者首次静脉注射(“IV”)实例VI的氟碳乳剂(1.8g PFC/kg；3.0mL/kg)。 在实施心肺分流术初期采集自体血液时立即静脉注射第二剂量的实例 VI的氟碳乳剂(0.9g PFC/kg；1.5mL/kg)。在根据方案确定的血红蛋白 指征(即心肺分流术中为5.5g/dL和心肺分流术刚结束后为7.0g/dL) 和/或当出现任何生理学指征(如上所述)而进行同种异源血红蛋白输血 前，给患者输入急性等容血液稀释血和自体血液(和术前自体捐血单 位，如果有的话)。

对照组：在心肺分流术初期，当最后的等容血液稀释血被抽出以 后，给受试者静脉输入与第一剂量输注容量配对的平衡电解质溶液 (3mL/kg)，接着额外1.5mL/kg。在根据各手术中血红蛋白输血指征(即 心肺分流术中为7.0g/dL和心肺分流术刚结束后为8.0g/dL)和/或当出 现任何生理学指征(如上所述)时而进行同种异源血红蛋白输血前，给 患者输入急性等容血液稀释单位(和术前自体捐血单位，如果有的话)。

在分流术刚结束的期间，两组都给予自体血液来维持血液动力学 稳定性。当达到血红蛋白或生理学指征时输入自体血液，之后输入同 种异源红细胞。除非有禁忌，否则在离开手术室前将全部可以得到的 等容血液稀释单位和自体血液都输回给受试者。在手术后(直至手术后 第7天或出院日，无论那天发生得更早)，输入同种异源红细胞来维持 血红蛋白>8.0g/dL，或者如果观察到常规介入不能逆转的生理学指征 (仅术后24小时观察PvO₂和SvO₂)时，也可以更早输入同种异源红细 胞。

有效性评价

终点：主要的有效性终点是在直至手术后7天或出院日(DD)， 无论那天发生得更早，氟碳乳剂治疗组与对照组相比避免同种异源红 细胞输血的受试者的比例。次要有效性终点是在直至手术后7天或出 院日(无论那天发生得更早)输入的同种异源红细胞的单位数。

安全性评价

终点：在不良事件、生命体征、临床实验室值和体格检查的基础 上对安全性进行评价。在急性研究期间也对机械通气持续时间、在重 症监护病房(ICU)的时间、住院时间、因术后出血而再次手术以及 术后心肌梗死(MI)的发生率、中风和肾衰竭等也进行了评价。在手术 后3个月对安全性进行电话随访来评价任何不良事件。本研究中使用 了一个独立的安全监控委员会(DSMB)对安全性数据进行定期审查。

结果：因为暂停对患者进行登记，本研究中用所有可以得到的398 名受试者(氟碳乳剂治疗组的200名患者和对照组的198名患者)的数 据进行了一项临时的安全性分析，来对氟碳乳剂治疗组和对照组中脑 血管意外(CVA)和术后出血事件的发病率不平衡的病因学进行评价。 剩余13名受试者(氟碳乳剂组5名和对照组8名)在研究前退出并且没 有接受方案指定的治疗。

正如对这种患者群体的预测那样，在本研究中登记的所有受试者 都报告了不良事件(AE)。按照方案指定的分析表明两组间不良事件 或严重不良事件的总发生率在统计学上没有显著差异。严重不良事件 (总体上占34.4％；在氟碳乳剂治疗组中占38.5％；在对照组中占 30.3％)和死亡(总体上占1.5％；在氟碳乳剂治疗组中占2.5％；在对照组 中占0.5％)的发生率基本上都在对有心肺分流术的冠状动脉旁路移植 术术后3个月的报导的范围之内，尽管对照组的死亡率格外低，仅为 0.5％(参见表IX)。最近一篇关于大量经受有心肺分流术的冠状动脉旁 路移植手术的患者的文献报道的死亡率为4.5％。Klein M，Mahoney 等人，“在常规开放心脏外科手术中血液制品的用途：离心泵的影响”， 人造器官(Artificial Organs)25(4)：300-305(2001)。

包括到出院日为止的广泛的实验室研究在内的其他方案确定的安 全性结果的分析表明基本上没有医学上严重的不良反应。本质上，本 研究中报告的术后发病率的性质和时间进程与经受冠状动脉旁路移植 术群体的历史数据一致。

表XIV.给药后3个月的不良事件和严重不良事件(根据身体系统的 COSTART列表)

^＊治疗组的随机受试者(经受手术并且如果是氟碳乳剂组也接受第一 剂量药物)。

氧(Oxygent)组或对照组受试者报告的不良事件均>10％。

氧(Oxygent)组或对照组受试者报告的严重不良事件均>1％。

严重的神经学和出血并发症的总发病率在文献报道的正常范围之内； 但是，对照组的发病率格外低。典型地，大约2％至6％的冠状动脉旁 路移植术患者会产生局部或全面的不良神经学结果，而且大约2％的 冠状动脉旁路移植术患者因为胸腔出血需要再次手术。氟碳乳剂组的 神经学和出血事件发病率比预期要高的原因是广泛析因探索分析和假 设生成的主题。

程序变化因素似乎增加了引发神经学事件的风险。随机分到氟碳 乳剂治疗组的受试者进行了急性等容血液稀释(平均为9.5％血容量除 去)并且有时非常快速地通过IAD来额外采血(平均为18.4％血容量)。 总自体采血量(ANH加IAD)是引发严重神经学并发症的一个重要风险 因素：用这种组合采血程序从有严重神经学事件报道比没有严重神经 学事件报道的患者体内多抽出平均330ml的自体血液。氟碳乳剂治疗 组受试者更常使用血管升压类药物(来支持灌注压)表明在即将实施分 流术时他们可能会发生低血压(也就是快速抽取大量血液后续发的，可 能是由于缺乏充分补液而引起)，并且有助于支持在IAD期间发生的 血流灌注不足/含氧量低偶发事件将导致氧债的这种假说，这种作用将 持续几个小时并且可能加重手术后发病率。

表XV.抽出的急性等容血液稀释(ANH)和自体捐血(IAD)容量(单 位为mL或者血容量的百分比)

^＊对照组中有两名受试者进行了自体捐血。如果对照组受试者因为某种 原因不能继续进行急性等容血液稀释而且剩余的“急性等容血液稀释 血”需要被抽出，本方案允许对照组进行自体捐血。

在氟碳乳剂治疗组，采集自体血液和将自体血液输回的时间间隔 以及所用羟乙基淀粉的量是引起出血并发症的重要的独立风险因素。 假设稀释性凝血障碍是由于采集了大量的自体血液和使用了大量的羟 乙基淀粉以及在手术最后输入了具有高肝素浓度的自体血液而引起 的，这些加重了肝素化和心肺分流术(CPB)引起的止血机能障碍。

在对照组，程序变化因素也会对严重神经学和出血并发症的明显 的低发病率起作用。适度的急性等容血液稀释(目标为分流术初期血红 蛋白＝8.0g/dL)和在操作中给予100％的氧气可以改善患者的结果： 前者通过减少血容量和改善微血管流速来实现，而后者通过增加有效 氧气量和组织提取的改善程度来实现。此外，在分流术后期可以输入 新鲜的自体血液，它们没有受到分流循环的有害影响。

几个其他因素也可以困惑本研究的安全性，特别是缺乏研究基地 的患者管理的重要操作方面的标准化，也缺乏预先确定的实验室和临 床参数来使不良事件的报告标准化。更重要的是，本研究结果表明给 予实例VI的氟碳乳剂本身并不能增加神经学或出血事件的风险。此 外，体外实验室研究表明实例VI的氟碳乳剂和血液、胶体或其他心 肺分流术中使用的常规试剂和药物(例如肝素)没有明显的物理或化学 相互作用或不相容性；而且，对这些混合物的剪切粘度的测量也不受 影响。同样，对与止血作用和中枢神经系统(CNS)有关的药理学和 毒理学研究的详细的回顾性调查没有发现在不同模型下的氟碳乳剂的 影响。

实例XVI

进行普通外科手术的人类患者的临床研究。

在第一项研究中对进行矫形外科手术受试者(N＝147)进行登记，在 第二项研究中对进行泌尿生殖器外科手术受试者(N＝99)进行登记。因 为这些研究大概相同，所以下面提供了组合的总结。

目的/研究设计：这些随机、多中心、对照、单盲、平行组研究的 目的是评价矫形手术(髋关节置换术或脊柱手术)或泌尿生殖器外科手 术(根治性前列腺切除术，根治性子宫切除术，或膀胱切除术)的患者 在急性等容血液稀释后单剂量静脉注射实例的VI氟碳乳剂(0.9或者 1.8g PFC/kg)加上吸入氧气分数(FiO₂)为1.0相对于血液加上吸入 氧气分数(FiO₂)＝0.4或胶体加上吸入氧气分数(FiO₂)＝1.0的安 全性和有效性。在这些研究中随机采用了总数为246名的受试者(109 名进行氟碳乳剂治疗而137名进行胶体或血液治疗[对照组])。

有效性终点包括逆转生理学输血指征和逆转时间。根据手术后28 天的不良事件、临床实验室检验(血液学、血液化学和凝固)和生命体 征来进行安全性评价。

安全性结果：这些研究中1.8g PFC/kg(66％)组和血液对照组 (68％)以及胶体对照组(61％)的总不良事件的发生率具有可比性；接受 0.9g PFC/kg(50％)受试者的不良事件发生率比其他所有组都低。大体 上，在所研究的外科手术群体中不良事件的严重程度和术后发病率的 典型性为轻度至中度。没有患者因为不良事件而退出研究。

两项研究中没有受试者在研究期间或在研究30天之内死亡。氟碳 乳剂组和对照组的发病率或报告的严重不良事件的类型在临床上没有 明显差异，而且与所有其他治疗组相比，胶体对照组的发病率最高(18 ％，13名受试者)，(0.9g PFC/kg，1.8g PFC/kg氟碳乳剂组和血液对 照组分别为5％[n＝2]，11％[n＝8]，和9％[n＝6])。研究者判断所有的 严重不良事件都与受试药物无关。

异常实验室值与手术和血液稀释操作有关而与受试药物无关。在 两项研究中，在第2天至第3天氟碳组和对照组都出现短暂的血小板 计数减少。两项研究中血小板计数的最低点都出现在第2天，而且两 组间差异很小。在第28天，经过一个相当大的过度补偿后，即一种预 料中的对手术的急性期反应，所有治疗组的血小板计数都回复到近基 线水平。在生命体征或体格检查中没有记录到有临床意义的改变。

有效性结果：在两项研究中，发现剂量为1.8g PFC/kg的实例 VI的氟碳乳剂比血液对照能够使更高比例的受试者实现逆转输血指 征(在第一项和第二项研究中分别为97％对60％和69％对37％)。 此外，接受1.8g PFC/kg氟碳乳剂的受试者的逆转时间(也就是从开始 进行第一个输血指征治疗到开始进行第二个输血指征输血或手术结束 的时间)比血液和胶体对照组长很多(在第一项和第二项研究中分别为 60对30分钟和28对15分钟)。0.9g PFC/kg氟碳乳剂组的逆转时间 也比胶体对照组长很多。

还发现1.8g PFC/kg的氟碳乳剂在第一次输血中纠正P|O₂指征 的作用比血液对照更加有效(仅在第二项研究中分别为87％对14％的 受试者)。此外，在1.8g PFC/kg的氟碳乳剂组仅有2名受试者(6％) 以吸入氧气分数FiO₂作为第二次输血指征，而在血液对照组有13名 受试者(43％)以FiO₂作为第二次输血指征。这表明在进行第一次输血 指征治疗以后大多数情况下实例VI的氟碳乳剂具有维持FiO₂水平的 作用。实例VI的氟碳乳剂增加吸入氧气分数(FiO₂)、逆转生理学 输血指征和延迟给药后续发指征的能力表明实例VI的氟碳乳剂具有 氧传送的特性。

结论：在伴有血液稀释的中度失血的手术中单剂量输入1.8g PFC/kg的实例VI乳剂及吸入氧气分数(FiO₂)为1.0，在逆转时间 和实现输血指征逆转的患者比例方面在统计学上优于血液加上吸入氧 气分数FiO₂＝0.4(仅第二项研究)或胶体加上吸入氧气分数(FiO₂)＝ 0.4。0.9g PFC/kg的实例VI氟碳乳剂加上吸入氧气分数(FiO₂)＝ 1.0在这些有效性测量方面在统计学上与血液加上吸入氧气分数 (FiO₂)＝0.4的治疗相似。本研究中没有发现对给予同种异源血液所 需的次要终点有好处。在这种手术环境中使用的实例VI氟碳乳剂(0.9 和1.8g PFC/kg)表现出可以接受的安全性概况，仅1.8g PFC/kg氟碳 乳剂组出现一个血小板计数略有减少。