以花生种子休眠芽胚轴为外植体的农杆菌介导的遗传转化方法

摘要

本发明公开了一种以花生成熟种子休眠芽胚轴为外植体的农杆菌介导的花生遗传转化方法，该方法以花生成熟种子休眠芽胚轴为外植体，经过预培养脱分化后，采用农杆菌介导的方法进行遗传转化。并通过优化芽诱导培养和生根培养过程，有效提高了转化再生率和生根速度。本发明不依赖于基因枪等贵重仪器，不需要金粉等昂贵的实验载体材料，仅需一个超浮工作台以及相关农杆菌菌株就能在最简单地实验环境下实现花生成熟种子胚的休眠芽胚轴外植体的高效转化，而且周期短，在不同基因型品种间的转化效果稳定。

说明书

技术领域

本发明涉及一种花生遗传转化的方法，特别涉及一种利用农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的简便、高效地将外源基因转化进入花生成熟种子的休眠芽胚轴外植体内的转化方法。

背景技术

花生是重要的油料和经济作物，具有丰富的营养价值。虽然它是农杆菌的天然宿主之一，但具有和多数豆科作物相同的弱点，即外源基因导入难度大，遗传转化在花生育种上的工作受到一定限制，进展较慢。

国外从上世纪40年代开始花生组织培养研究，我国则从70年代开始，已经建立了多种花生营养和生殖器官再生体系。农杆菌介导的外源基因遗传转化是花生重要的遗传转化手段之一。自1994年Eapen和George首次报道获得花生转基因植株以来，农杆菌介导途径进行花生基因转化的研究已有较多成功的报道。

虽然近十几年来，花生的遗传转化随着其体细胞植株再生技术的进步取得了一定进展。已能够通过农杆菌介导的方法获得转基因花生再生株系。但转化及再生率过低，而且同样的遗传转化体系在不同基因型的花生中转化效果差异明显，不能满足现代基因工程进行遗传育种的需要。究其原因，除了多数豆科作物共同的难以被转化的弱点外及转化过程影响因素较多外，主要由于没有找到合适的转化外植体，来建立高效的植株再生体系。目前已成功获得转基因植株的外植体可概括为两大类，一类是来源于幼苗或萌动种子的幼叶、胚轴或子叶；另一类是带子叶的成熟胚。但利用这些外植体进行转化均存在再生周期长、转化及再生率低、在不同基因型花生品种间不稳定等问题，因此，正确选择转化外植体，建立稳定高效的植株再生体系的是的解决目前花生中基因转化有效性问题的关键环节。

发明内容

为了克服现有的花生遗传转化方法中再生周期长、转化及再生率低、转化效果不稳定等问题，本发明的目的在于提供一种以花生成熟种子休眠芽胚轴为转化外植体的农杆菌介导的稳定高效遗传转化方法。本发明采用花生成熟种子的休眠芽胚轴作为转化外植体，并就遗传转化中涉及的侵染菌液浓度、侵染时间、共培养时间、植物激素浓度和生根条件等处理因素对转化和再生效率的影响进行了研究。该方法采用具有活跃分生能力并易于脱分化的休眠芽胚轴细胞作为遗传转化外植体，只需常规的菌株和培养基，无须基因枪等贵重仪器，不需要金粉等昂贵的实验载体材料，而且操作简便易行，实验周期短，转化频率高，在不同基因型花生品种间的转化效果十分稳定。

本发明的目的通过下述技术方案来实现：一种以花生成熟种子休眠芽胚轴为外植体的农杆菌介导的遗传转化方法，包括如下步骤：

(1)转化外植体分离：消毒后的花生种子浸泡后，在无菌环境中除去花生种子皮，沿子叶间缝隙切开种子，将完整的胚从子叶中剥离，切除胚根和胚芽，保留余下的花生成熟种子休眠芽胚轴部分作为待转化的休眠芽胚轴外植体；将上述休眠芽胚轴外植体在预培养基上于24～28℃预培养0.5～1天，得到预培养后的休眠芽胚轴外植体。

(2)侵染液制备：将含待转化质粒的农杆菌菌株接种至YEB液体培养液中，28℃振荡培养过夜；将培养物离心收集农杆菌菌体，并重悬于预冷至4℃的含有100mMol/L乙酰丁香酮的液体MS培养基中，使农杆菌重悬液的浓度在OD₆₀₀＝0.2～1.5，即得到含有农杆菌的液体MS培养基。

(3)转化：将预培养后的休眠芽胚轴外植体浸浮在上述含有农杆菌的液体MS培养基中，使农杆菌与休眠芽胚轴外植体充分接触5～30分钟进行转化后，取出休眠芽胚轴外植体，滤干菌液后平铺于共培养培养基于24～28℃，16小时光照/8小时黑暗的培养条件中，共培养2～4天，得到共培养后的休眠芽胚轴外植体。

(4)芽诱导培养：将共培养后的休眠芽胚轴外植体转移至芽诱导培养基上进行诱导培养。

(5)筛选培养：将芽诱导培养后的休眠芽胚轴外植体转移至筛选培养基上进行筛选，每隔10天更换一次筛选培养基，共转移2～3次，得到筛选培养的丛生芽。

(6)生根培养：将经过筛选培养的丛生芽转移至生根培养基，在生根培养基上生长2～4周，代根长至4～12厘米长，得到生根的植株。

(7)移植：将步骤(6)中生根的植株移至湿度为70～85％的灭菌砂土中，培养驯化后；便可将其移入温室生长、开花、结实。

所述预培养基组成为：固体MS+3mg/L6-BA(6-苄氨基嘌呤)；所述共培养培养基组成为：MS+3mg/L6-苄氨基嘌呤+100uM Acetosyringone(乙酰丁香酮)；所述芽诱导培养基组成为：MS+3mg/L6-苄氨基嘌呤+300mg/L头孢霉素；所述筛选培养基组成为：MS+3mg/L6-苄氨基嘌呤+300mg/L头孢霉素+20mg/L潮霉素；所述生根培养基组成为：1/2MS+3mg/L IBA(吲哚丁酸)+0.1mg/L NAA(奈乙酸)。

为了再生和转化效果最为稳定和高效，实验过程中两个步骤十分关键：在步骤(1)中，制备待转化的休眠芽胚轴外植体时，芽原基去除要彻底，避免产生由芽原基直接发育而成幼芽；使休眠芽胚轴外植体在含有3mg/L6-苄氨基嘌呤的预培养基上预培养0.5～1天，是提高再生率的关键因素。

所述步骤(1)中消毒是将成熟花生种子经0.1％的升汞溶液表面消毒10分钟，再用无菌水清洗3次。所述步骤(1)中浸泡是在50℃的温水中浸泡3小时。

所述步骤(2)中待转化质粒为植物表达载体pCAMBIA1301-PR10、pCAMBIA1301-LjCYC或pCAMBIA1301-GmFAD3C。

所述步骤(2)中农杆菌为EHA105菌株。

所述步骤(4)中芽诱导培养条件为：24～28℃，16小时光照/8小时黑暗，培养时间为5～10天。

本发明原理是：休眠芽胚轴部分的细胞层具有高度分化能力，且分裂速度快，此时是导入外源基因的最佳时期。植物基因工程上较好的器官形成途径是采用由体细胞直接发生的方式，例如直接诱导外植体分化不定芽。因为直接发生方式具有获得再生植株周期短，不经过脱分化，体细胞无性系变异小，能较好保持受体细胞的遗传稳定性以及转化的外源基因也能实现稳定遗传等优点。花生成熟种子休眠芽的胚轴部分的细胞具有较强分化能力，能够在合适的激素组合下通过直接发生方式形成再生芽，从而实现花生的高效、快速再生。

本发明与现有技术相比，具有如下优点和有益效果：

1、以花生成熟种子休眠芽的胚轴部分作为转化外植体，由于被侵染的组织为具有高度分生能力的活跃分生组织细胞，而且易于脱分化，因此再生率和转化率更高，再生效率达91.5％。

2、花生成熟种子休眠芽的胚轴部分细胞具有活跃的高度分生能力且易于脱分化这是不同基因型花生的共性，因此本发明方法在不同基因型花生的遗传转化中的效果稳定。

3、本发明方法中再生芽的发生途径绕开了由愈伤组织离体培养再生植株的漫长途径，3个月内可形成生根的植株；使转化周期缩短了50％。

4、外植体来源不受花生种植、发育时间的限制。

附图说明

图1为本发明中花生成熟种子休眠芽的胚轴外植体的制备图。

其中，1a、消毒后的完整花生种子材料；1b、花生胚与子叶分离开来；1c、胚从上至下被切为三部分，分别是芽原基、休眠芽的胚轴、胚根；1d、用作外植体的休眠芽胚轴。

图2为本发明中花生成熟种子休眠芽胚轴外植体上再生芽的形成过程图，其中2d已有明显可见的丛生的再生芽。

其中，2a、在芽诱导培养基上5天以后的休眠芽胚轴外植体；2b、在芽诱导培养基上10天以后的休眠芽胚轴外植体；2c、在芽诱导培养基上15天以后的休眠芽胚轴外植体；2d、在芽诱导培养基上25天以后的休眠芽胚轴外植体，已出现绿色丛生芽。

图3为本发明中的转化方法转化AhPR10基因的转基因植株图。

其中，3a、用本发明中转化方法转化AhPR10基因的花生转基因丛生芽；3b、用本发明中的转化方法转化AhPR10基因的转基因植株。

图4为采用PCR方法对实施例一中转PR10基因的转基因植株进行PCR鉴定的PCR鉴定电泳图。

图5为采用PCR方法对实施例二中转LjCYC基因的转基因植株进行鉴定的PCR鉴定电泳图。

图6为采用PCR方法对实施例三中转GmFAD3C基因的转基因植株进行鉴定的PCR鉴定电泳图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例一：以花生成熟种子休眠芽胚轴为外植体的农杆菌介导的遗传转化方法用于AhPR10基因的转化

(1)选取成熟饱满的花生种子，在超淨工作台的无菌环境中，将花生种子经0.1％(W/V)的升汞溶液表面消毒10分钟，再用无菌水清洗3次。用50℃的温水浸泡3小时后，除去种皮，用无菌解剖刀沿子叶间缝隙切开种子，用解剖刀将完整的胚从子叶中剥离，切除胚根和芽原基，保留余下的花生成熟种子休眠芽胚轴部分作为待转化的休眠芽胚轴外植体，并在预培养基(固体MS+3mg/L6-苄氨基嘌呤)上预培养0.5天。如图1所示，为花生成熟种子胚休眠芽胚轴外植体的制备图。图2为本发明中花生成熟种子休眠芽胚轴外植体上再生芽的形成过程图，其中2d已有明显可见的丛生的再生芽。

(2)以花生AhPR10基因为待转基因，将花生AhPR10基因两端分别连上NcoI和SpeI酶切位点，用NcoI和SpeI双酶切后连入用NcoI和SpeI双酶切的pCAMBIA1301载体，构建包含花生AhPR10基因的植物表达载体pCAMBIA1301-AhPR10。将该载体导入农杆菌EHA105菌株，将经鉴定为阳性的克隆按照1：100的体积比接种至200ml YEB液体培养液中(含有50mg/L庆大霉素，50mg/L卡那霉素，100mMol/L乙酰丁香酮)中，28℃振荡培养过夜。将培养物于2800转/分钟，离心10分钟收集菌体，重悬于4℃预冷的液体MS培养基，并添加100mMol/L乙酰丁香酮，使OD₆₀₀＝0.2，得到重悬的菌液。

(3)将预培养的休眠芽胚轴外植体浸浮在OD₆₀₀＝0.2的上述步骤(2)中重悬的菌液中，使农杆菌与花生休眠芽胚轴外植体充分接触进行转化后，间或轻轻摇动，接触(转化)时间为30分钟，然后用镊子轻轻夹起休眠芽胚轴外植体，稍滤干菌液，平铺于共培养基上，于24℃，16小时光照/8小时黑暗的培养条件中进行共培养3天。

(4)将共培养后的休眠芽胚轴外植体转移至芽诱导培养基(MS+3mg/L6-苄氨基嘌呤+300mg/L头孢霉素)上诱导丛生芽，培养条件：24℃，16小时光照/8小时黑暗，培养时间为5天。

(5)将芽诱导培养后的休眠芽胚轴外植体转移至筛选培养基(MS+3mg/L 6-苄氨基嘌呤+300mg/L头孢霉素+20mg/L潮霉素)上进行筛选，每隔10天更换一次筛选培养基，共转移2次。

(6)将经过筛选培养的丛生芽转移至生根培养基(1/2MS+3mg/L吲哚丁酸+0.1mg/L奈乙酸)，一周后即可生根。生根培养基上生长两周后，代根长至4～12厘米长。

(7)将生根的植株移至高湿度(湿度为70～85％)的灭菌砂土中，用透明的保鲜膜封好以保持湿度，于23～27℃下、相对湿度为75％、光照强度为150μmol m^-2s^-1、光周期为18h的培养室培养1～2周。2～7d内逐渐揭去保鲜膜使苗驯化。然后便可将其移入温室生长、开花、结实。

图3为本发明中的转化方法转化AhPR10基因的转基因植株图。如图4所示，为采用PCR方法对本实施例转AhPR10基因的转基因植株进行PCR鉴定的PCR鉴定电泳图。其中，Marker：DL2000；1-5：不同转化植株的PCR鉴定结果。6：以非转化植株为摸板的阴性对照；7：以PR10基因质粒为模板的阳性对照；PCR引物为筛选标记基因hpt基因的特异性引物。

实施例二：花生成熟种子休眠芽胚轴为外植体的农杆菌介导的遗传转化方法用于百脉根LjCYC基因的转化

(1)选取成熟饱满的花生种子，在超浮工作台的无菌环境中，将花生种子经0.1％(W/V)的升汞溶液表面消毒10分钟，再用无菌水清洗3次。用50℃的温水浸泡3小时后，除去种皮，用无菌解剖刀沿子叶间缝隙切开种子，用解剖刀将完整的胚从子叶中剥离，切除胚根和芽原基，保留余下的花生成熟种子休眠芽胚轴部分作为待转化的休眠芽胚轴外植体，并在预培养基(固体MS+3mg/L6-苄氨基嘌呤)上预培养1天。

(2)以百脉根LjCYC基因为待转基因，采用实施例一相同的方法，将LjCYC基因序列连入pCAMBIA1301载体，构建包含LjCYC基因的植物表达载体pCAMBIA1301-LjCYC。将该载体导入农杆菌EHA105菌株，将经鉴定为阳性的克隆按照1∶100的体积比接种至200ml YEB液体培养液中(含有50ug/ml庆大霉素，50ug/ml卡那霉素，100mMol/L乙酰丁香酮)中，28℃振荡培养过夜。将培养物于2800转/分钟，离心10分钟收集菌体，重悬于4℃预冷的液体MS+100mMol/L乙酰丁香酮培养基中，使OD₆₀₀＝1.0。

(3)将预培养的休眠芽胚轴休眠芽胚轴浸浮在OD₆₀₀＝1.0的上述(2)重悬好的菌液中，使农杆菌与花生休眠芽胚轴外植体充分接触进行转化后，间或轻轻摇动，接触(转化)时间为15分钟，然后用镊子轻轻夹起休眠芽胚轴外植体，稍滤干菌液，平铺于共培养基上，于28℃，16小时光照/8小时黑暗的培养条件中进行共培养2天。

(4)将共培养后的休眠芽胚轴外植体转移至芽诱导培养基(MS+3mg/L6-苄氨基嘌呤+300mg/L头孢霉素)上诱导丛生芽，培养条件：28℃，16小时光照/8小时黑暗，培养时间为10天。

(5)将芽诱导培养后的休眠芽胚轴外植体转移至筛选培养基(MS+3mg/L6-苄氨基嘌呤+300mg/L头孢霉素+20mg/L潮霉素)上进行筛选，每隔10天更换一次筛选培养基，共转移2次。

(6)将经过筛选培养的丛生芽转移至生根培养基(1/2MS+3mg/L吲哚丁酸+0.1mg/L奈乙酸)，一周后即可生根。生根培养基上生长四周后，代根长至4～12厘米长。

(7)将生根的植株移至高湿度(湿度为70～85％)的灭菌砂土中，用透明的保鲜膜封好以保持湿度，于23～27℃下、相对湿度为75％、光照强度为150μmol m^-2s^-1、光周期为18h的培养室培养1～2周。2～7d内逐渐揭去保鲜膜使苗驯化。然后便可将其移入温室生长、开花、结实。

如图5所示，为采用PCR方法对本实施例中转LjCYC基因的转基因植株进行鉴定的PCR鉴定电泳图。其中，Marker：DL2000；1-3：不同转化植株的PCR鉴定结果。4：以非转化植株为摸板的阴性对照；5：以LjCYC基因质粒为模板的阳性对照；PCR引物为筛选标记基因hpt基因的特异性引物。

实施例三：以花生成熟种子休眠芽胚轴为外植体的农杆菌介导的遗传转化方法用于大豆GmFAD3C基因的转化

(1)选取成熟饱满的花生种子，在超浮工作台的无菌环境中，将花生种子经0.1％(W/V)的升汞溶液表面消毒10分钟，再用无菌水清洗3次。用50℃的温水浸泡3小时后，除去种皮，用无菌解剖刀沿子叶间缝隙切开种子，用解剖刀将完整的胚从子叶中剥离，切除胚根和芽原基，保留余下的花生成熟种子休眠芽胚轴部分作为待转化的休眠芽胚轴外植体，并在预培养基(固体MS+3mg/L6-苄氨基嘌呤)上预培养0.5～1天。

(2)以大豆GmFAD3C基因为待转基因，采用实施例一相同的方法，将大豆GmFAD3C基因序列连入pCAMBIA1301载体，构建包含GmFAD3C基因的植物表达载体pCAMBIA1301-GmFAD3C。将该载体导入农杆菌EHA105菌株，将经鉴定为阳性的克隆按照1：100的体积比接种至200mlYEB液体培养液中(含有50ug/ml庆大霉素，50ug/ml卡那霉素，100mMol/L乙酰丁香酮)中，28℃振荡培养过夜。将培养物于2800转/分钟，离心10分钟收集菌体，重悬于4℃预冷的液体MS+100mMol/L乙酰丁香酮培养基中，使OD₆₀₀＝1.5。

(3)将预培养的休眠芽胚轴外植体浸浮在OD₆₀₀＝1.5的上述(2)重悬好的菌液中，使农杆菌与花生休眠芽胚轴外植体充分接触进行转化后，间或轻轻摇动，接触(转化)时间为5分钟，然后用镊子轻轻夹起休眠芽胚轴外植体，稍滤干菌液，平铺于共培养基上，于26℃，16小时光照/8小时黑暗的培养条件中进行共培养4天。

(4)将共培养后的休眠芽胚轴外植体转移至芽诱导培养基(MS+3mg/L6-苄氨基嘌呤+300mg/L头孢霉素)上诱导丛生芽，培养条件：26℃，16小时光照/8小时黑暗，培养时间为10天。

(5)将芽诱导培养后的休眠芽胚轴外植体转移至筛选培养基(MS+3mg/L 6-苄氨基嘌呤+300mg/L头孢霉素+20mg/L潮霉素)上进行筛选，每隔10天更换一次筛选培养基，共转移3次。

(6)将经过筛选培养的丛生芽转移至生根培养基(1/2MS+3mg/L吲哚丁酸+0.1mg/L奈乙酸)，一周后即可生根。生根培养基上生长三周，代根长至4～12厘米长。

(7)将生根的植株移至高湿度(湿度为70～85％)的灭菌砂土中，用透明的保鲜膜封好以保持湿度，于23～27℃下、相对湿度为75％、光照强度为150μmol m^-2s^-1、光周期为18h的培养室培养1～2周。2～7d内逐渐揭去保鲜膜使苗驯化。然后便可将其移入温室生长、开花、结实。经检测，转化效率达80％以上。

如图6所示，为采用PCR方法对本实施例转GmFAD3C基因的转基因植株进行鉴定的PCR鉴定电泳图。其中，Marker：DL2000；1-4：不同转化植株的PCR鉴定结果；PCR引物为筛选标记基因hpt基因的特异性引物，阳性对照和阴性对照结果未显示。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。