通过实时聚合酶链反应探测和同时进行多重量化病原体的方法

摘要

李斯特菌，金黄色葡萄球菌，空肠弯曲菌和/或大肠杆菌O157∶H7的任一组合在一个或多个测试样品中，通过复合扩增反应实时作用于聚合酶链反应的检测和同时进行的多重量化的方法步骤是(a)从试验样品中现场提取DNA；(b)准备病原体的特有反应混合物来检测和量化，这样，该反应混合物包括对于提取的DNA的酶的扩增的必要试剂和对这些病原体的检测和量化的鉴定；(c)通过作用于聚合酶的复合扩增反应，发挥反应混合物；(d)同时确定这些病原体在上述样品或检验样品的存在与否和量化，这个方法有其特殊性：(i)对于DNA酶的扩增，此反应混合物有几对确定序列编号为1和2，序列编号4和5，序列编号7和8，序列编号10和11的寡核苷酸发端及确定序列编号为3，6，9，12的寡核苷酸序列探针；(ii)上述病原体在任何组合的存在与否和量化由一种荧光信号或每个病原体特有的荧光发射决定的。

说明书

技术领域

从其本质上讲，这项新的发明是一项用来对于病原体进行多量化实时检测、鉴定的新技术。特别值得一提的是，本项发明提供的这种技术通过使用多聚酶链实时反应，进行大规模扩展增殖，可以对所有病原体进行多量化实时检测鉴定，比如：李斯特菌，金黄色葡萄球菌，空肠弯曲菌、大肠杆菌O157:H7，以及可以检测出这四种病原体在样品中组合出现的情况。

背景技术

实际上，针对这些容易通过饮食传播的这些病原体，(比如说：李斯特菌，金黄色葡萄球菌以及大肠杆菌O157:H7)的检测，是医学界和公共卫生学界长期以来的一项重大任务。不但如此，农业和食品工业的原材料以及初级产品的生产商、经销商对于这些病原体的检测也非常关注，同样显示出浓厚的兴趣。基于这个原因，已经发现了很多对于这些病原体进行检测和鉴定的技术。

目前在使用的诸多检测这些病原体的技术中，比较有效的一种方法是以分子技术为基础的。这种技术使用多聚酶链反应进行反应，这项技术就是目前为人们所熟知的PCR技术。特别是在对于很多送检验样品的检测和鉴定中，这项技术是被认为是一种可以以最快的速度并且最灵敏的精度的检测出病原体核酸的技术。我们可以在凯瑞-比-慕伊斯的在美国专利部门申请的一系列专利：美国专利-4683195，美国专利-4683202，美国专利-4800159，美国专利-4889818，美国专利-4965188，美国专利-5008182，美国专利-5038852，美国专利-5079352，美国专利-5176995，美国专利-5310652，美国专利-5310893，美国专利-5322770，美国专利-5333675，美国专利-5352600，美国专利-5374553，美国专利-5386022，美国专利-5405774，美国专利-5407800，美国专利-5418149，美国专利-5420029中找到对于这项技术的这些描述。

为了利用PCR技术针对病原体进行检测，就必须在在模板DNA、引物和四种脱氧核糖核苷酸存在的条件下，依赖于DNA聚合酶来进行酶促合成反应。在这个反应中，DNA聚合酶以单链DNA为模板，借助一小段双链DNA来启动合成，通过一个或两个人工合成的寡核苷酸引物与单链DNA模板中的一段互补序列结合，形成部分双链。在适宜的温度和环境下，DNA聚合酶将脱氧单核苷酸加到引物3＇-OH末端，并以此为起始点，沿模板5＇→3＇方向延伸，合成一条新的DNA互补链。这就是PCR技术的基本技术流程。

由于使用PCR技术可以迅速而敏锐地在样品中检测出病原体个体的存在，同时使用这种技术也可以检测出样品中大量病原体的具体数量。但是毫无疑问，使用PCR技术来同时对于同一份样品中存在的多种病原体进行检测仍然有很大的疑惑和困难。因为利用PCR技术同时进行一份样品中多种病原体的检测的障碍在于，由于使用了多种核苷酸序列，除了出现检测结果需要的反应外，还会出现其他多个交叉的反应，从而影响检测的结果精度。

利用PCR技术，对于样品中存在的病原体进行检测和鉴定的相关叙述可以在下列的文件中找到：约翰-维-司撒卡的WO-0314704号国际专利申请，以及林晓沃等在美国的一系列专利：美国专利-5612473，美国专利-5738995，美国专利-5753444，美国专利-5756701和美国专利-5846783.

根据已经公布的WO-0314704号国际专利申请中所做的相关技术流程叙述，这份专利申请涉及到了一种比较独特的技术方法。通过这种技术方法，可以在一份样品同时检测出不同的弯曲杆菌属的多种细菌。包括空肠弯曲杆菌和大肠弯曲杆菌在内都可以被检测出来。送检的这些样品可以是食物的样品，也可以是水样品，或者是一系列从送检样品的表层再次提取的样品。这种方法使用扩展的PCR技术，并对寡核核苷酸的气势序列部分进行适当的修饰。大量不同种类的病原体可以在同一次反应中被检测出来。

在其它的一系列美国专利中：美国专利-5612473，美国专利-5738995，美国专利-5753444，美国专利-5756701，美国专利-5846783描述了另外一种技术。通过这种技术，可以在同一份样品中通过一次反应，迅速的检测出多种易传染的病原体。这些可以被检测出的易传染的病原体包括：沙门氏菌，痢疾杆菌，弯曲杆菌，大肠埃希氏菌和耶尔森氏菌以及大肠杆菌O157:H7.上述的这些专利中所叙述的这种技术的缺陷和限制在于，在寡核核苷酸和其他的核酸序列的扩展增殖过程中，允许寡核核苷酸和探针发生最少的交叉反应。

在现在已经得到使用的，所有的这些分子技术中，有的技术已经在检测食品样品中的病原体方面得到了商业化的应用。有的技术通过DNA(基因单向追踪技术)，也可以得到非常灵敏的结果，但是整个过程要耗费将近50个小时。有的通过核酸扩展技术(巴克斯，佛慕斯-杜邦，布诺波利亚，赛诺菲巴斯德诊断)需要24个小时。上述的任何一种技术都不能在送出食品样品的同一天得出检测结果，也不能得出实时的鉴定报告。

在上述的所有技术中，针对一些特定的病原体进行检测，需要增加上述技术的灵敏度，以便得出迅速和可靠的检测结果。由于食品中存在的病原体会对消费者的身体健康构成威胁，为了界定食品中病原体的数量和浓度，所以在有的检测中需要对于样品中的病原体进行多量化的检测。

根据以上的这些叙述可以看出，无论是从食品工业的角度出发，还是从人类食品健康安全的角度出发，拥有一种可以在五个小时以内，并且快速的检测出样品中是否存在病原体的技术是非常重要的。可以检测出的病原体，应该包括最重要的四种容易通过饮食或是公共场所传播的病原体，比如说李斯特菌，金黄色葡萄球菌，空肠弯曲菌和大肠杆菌O157:H。这种实时的多量化检测技术是通过对于多聚酶链反应来进行大量扩展应用来实现的。这种技术拥有检测成本低，耗时短，由于食品工业对于食品生产时间段有着严格的要求，因此这项技术对于食品工业也有着极其关键的意义和价值。

发明概述

上面已经提到了多项技术，但是都存在着不足之处，为了找到改善上述技术的不足的方法，本发明提供了一种可以在同一份样品或是多份混合样品中，通过多聚酶链的反应多量化实时检测病原体的技术。可以检测出的这些病原体包括最重要的李斯特菌，金黄色葡萄球菌，空肠弯曲菌和大肠杆菌O157:H。本技术的整个流程是这样的：1，提取出样本和测试样本中的出现的DNA。2，准备需要多量化检测的多种病原体的特殊反应，也包括为了提取和识别病原体的而进行量化检测而对DNA扩展酶进行激活。3，DNA扩展，通过使用PCR技术进行大规模扩展从而获得不同的病原体所独有的不同特殊反应。4，实时的检测出送检样品中是否有病原体的存在。5，为了提取和识别病原体的量化检测，利用DNA扩展酶进行进行混合反应，来鉴定李斯特菌，金黄色葡萄球菌，空肠弯曲菌和大肠杆菌O157:H在样品中存在的任何组合形式。(而这一步骤又包括如下的部分：a，需要准备将要鉴定的寡核核苷酸的起始部分，标记为序列编号：1和序列编号：2以及序列编号：3的探针，这个探针是第一个目标核酸比如说李斯特菌核酸的起始序列进行反应的。b，需要准备将要鉴定的寡核核苷酸的第二部分部分，标记为序列编号：4和序列编号：5以及序列编号：6的探针，这个探针是和第二个目标核酸金黄色葡萄球菌核酸进行反应的。C，需要准备将要鉴定的寡核核苷酸的第三部分部分，标记为序列编号：7和序列编号：8以及序列编号：9的探针，这个探针是和第三个目标核酸空肠弯曲菌核酸进行反应的。d，需要准备将要鉴定的寡核核苷酸的第四部分部分，标记为序列编号：10和序列编号：11以及序列编号：12的探针，这个探针是和第四个目标核酸大肠杆菌O157:H核酸进行反应的。)6，李斯特菌，金黄色葡萄球菌，空肠弯曲菌和大肠杆菌O157:H在送检样品中会有很多组合存在形式。通过每个扩展产物中的荧光或是放射性特殊标示，每一种上述四种病原体的组合存在形式在送检样品中是否存在，就可以被检测出来。

我们的这项技术的另外一个目的是，可以提供这样一种寡核核苷酸，它包含由顺序编号：1，序列编号：2和序列编号：3所形成的核苷酸序列，而这个核苷酸序列已经被选定而且得到识别。

我们的技术的目的之一是可以提供这样一种寡核核苷酸，它包含由顺序编号：4，序列编号：5和NO的序列编号：6所形成的核苷酸序列，而这个核苷酸序列也已经被选定而且得到识别。

我们的技术的目的之一是可以提供这样一种寡核核苷酸，它包含由顺序编号：7，序列编号：8和NO的序列编号：9所形成的核苷酸序列，而这个核苷酸序列也已经被选定而且得到识别。

我们的技术的目的之一是可以提供这样一种寡核核苷酸，它包含由顺序编号：10，序列编号：11和NO的序列编号：12所形成的核苷酸序列，而这个核苷酸序列也已经被选定而且得到识别。

同上述的目标联系在一起，本技术也可以提供一个已经被识别的探针，这个探针包括序列编号：3的寡核核苷酸，这个探针至少可以被用作一个标记。

本技术也可以提供另外一个已经被识别的探针，这个探针包括序列编号：6的寡核核苷酸，这个探针至少可以被用作一个标记。

本技术也可以提供另外一个已经被识别的探针，这个探针包括序列编号：9的寡核核苷酸，这个探针至少可以被用作一个标记。

本技术也可以提供另外一个已经被识别的探针，这个探针包括序列编号：12的寡核核苷酸，这个探针至少可以被用作一个标记。

最后，我们的这项技术发明也可以被用作是对一个送检样品的检测做出最终的检测结果。这项技术是通过多聚酶链的反应，多量化实时检测出李斯特菌，金黄色葡萄球菌，空肠弯曲菌和大肠杆菌O157:H，以及这四种病原体在一份或是多份送检样品中的每一种组合存在形式。检测结果包括：1，根据已经被识别的由顺序编号：1，序列编号：2和序列编号：3所形成的核苷酸序列，由顺序编号：4，序列编号：5和NO的序列编号：6所形成的核苷酸序列，顺序编号：7，序列编号：8和NO的序列编号：9所形成的核苷酸序列，来检测一种或多种寡核核苷酸的存在。2，根据已被识别的序列编号：3所形成的核苷酸序列，序列编号：6所形成的核苷酸序列，序列编号：9所形成的核苷酸序列，序列编号：12所形成的核苷酸序列，来检测拥有以上序列的寡核核苷酸所形成的探针。3，为了进行检测，所需的其他成分和试剂。

附图说明

关于本技术发明的一些详细特征，将在下面的段落里进行详细的阐述。而且还有一些图像作为佐证一并呈现出来。拿出这些图像的目的是为了给本项发明做出一个清晰地界定，但是这些图像的作用并不局限于此。

图像一展示了一条根据本项技术得出的，拥有刻度并且可以用于测算李斯特菌的曲线。在这张图像上，A1是一个高浓度条件下得出的可供参考的曲线，A4是在一个低浓度条件下得出的可供参考的曲线。而为了更好地了解UFC/ml，在对一个样品的数据图像阅读的时候，插入了其它可供参考样品的数据图像。

图像二展示了一条根据本项技术得出的、拥有刻度并且可以用于测算金黄色葡萄球菌的曲线。在这张图像上，A1是一个高浓度条件下得出的可供参考的结果，A4是在一个低浓度条件得出的下可供参考的结果。而为了更好的了解UFC/ml，在对一个样品的数据图的阅读的时候，插入了其它可供参考样品的数据图像。

图像三展示了一条根据本项技术得出的、拥有刻度并且可以用于测算空肠弯曲菌的曲线。在这张图像上，A1是在一个高浓度条件下得出的可供参考的结果，A2是在一个低浓度条件下得出的可供参考的结果。而为了更好的了解UFC/ml，在对一个样品的数据图像阅读的时候，插入了其它可供参考样品的数据图像。

图像四展示了一条根据本项技术得出的、拥有刻度并且可以用于测算大肠杆菌O157:H7的曲线。在这张图像上，A1是在一个高浓度条件下得出的可供参考的结果，A3是在一个低浓度条件下得出的可供参考的结果。而为了更好的了解UFC/ml，在对一个样品的数据图像阅读的时候，插入了其它可供参考样品的数据图像。

发明详述

DNA扩展酶应用这个术语，正如在本文现在的描述中所使用的一样，这个术语指的是通过利用多聚酶链的反应(PCR)，在很多混合的DNA的序列中，对某一个DNA中的特定序列进行扩增的技术。而这个DNA的特定序列就是我们所说的目标序列，被大规模的扩展放大。

起始部分这个术语，仅仅是局限的指寡核核苷酸的起始序列部分。而寡核核苷酸的这部分起始序列正是和目标序列互补连接的。寡核核苷酸的起始序列里包括了一个上游序列，而这个上游序列里的核酸和目标序列里的上游序列形成互补连接。而寡核核苷酸的起始序列也包括了一个下游序列，这个下游序列里的核酸也和目标序列里的下游序列形成了互补连接。

大量扩增反应这个术语的的意思，正如在本文现在的描述中所使用的一样，是一种基于PCR技术而进行的扩增过程。这个扩增过程是对于某个特定的送检样品中的许多目标DNA序列进行扩增。

在本项新的技术发明中，通过利用PCR技术，利用多聚酶链的反应，多量化可以实现实时检测到四种病原体。同其他的技术相比，本项技术不需要对于要检测的病原体预先进行增殖培养，也不需要为每个要检测的病原体准备许多具有它们各自特殊反应的试管。需要特别强调的是，本项技术发明在实时检测四种病原体方面实现了巨大的突破，远远的超越了其他技术，而且大大的节省了化验分析的时间，最短只需2.5个小时，就可得出检测结果。本技术只需要一份混合的特殊反应试剂，而不像其他技术，需要很多份这样的试剂。除了使用本技术检测的灵敏度非常高以外，对于样品的准备(已经包括在2.5个小时以内)也有助于获得更好地检测结果，因为不存在那些可能对扩展过程产生不利影响的因素，这些因素已经被消除。

本项技术发明提供的这种方法，能够对于这些容易通过饮食传播和公共场所环境传播的这些病原体(比如说：李斯特菌，金黄色葡萄球菌，空肠弯曲菌以及大肠杆菌O157:H7)，在一份或是多份送检的食物样品，水样品或是其他样品中，通过利用多聚酶链的反应进行大规模的扩展增殖，从而对送检样品进行多量化实时检测和鉴定。送检的样品可以是任何类型的样品，只要想知道这份样品是否被上述四种病原体所污染，就可以进行检测。在特定的情况下，我们所提到的样品一般是指食物样品，比如说，肉制品和乳制品，或是表层材料和收到污染的环境空气材料。

寡核核苷酸：序列的模本和信息库

本项技术发明里提到的寡核核苷酸，它们被使用的目的是在鉴别一份送检样品中，检测出李斯特菌，金黄色葡萄球菌，空肠弯曲菌以及大肠杆菌O157:H7的特异性存在。免除可能出现的，在一份送检样品中还有其他的病原体，测验结果被其他病原体的存在而被干扰的情况。

首先需要掌握将要进行检测的四种病原体(李斯特菌，金黄色葡萄球菌，空肠弯曲菌以及大肠杆菌O157:H7)，每一种病原体的寡核核苷酸起始序列。而这些寡核核苷酸起始序列都拥有一个它们本身所形成的一个上游序列，而这个特意强调出来的上游序列是和目标核酸的5’顶端序列所形成互补链接的。而这些起始序列也拥有一个它们本身所有的下游序列，而这个特别需要强调的下游序列是和目标核酸的3’顶端序列形成互补链接的。这些核酸的序列应该拥有所要检测的这些病原体所各自拥有的寡核核苷酸的起始序列部分。因此，对于每个要检测的病原体，经过这些过程，它们所拥有的这些寡核核苷酸都已经在测验中形成了一条新的合成链接。合成的这些寡核核苷酸详细的见于图表1：

 

识别类型类型病原体种类核苷酸序列序列编号：1“上游”起始序列F李斯特菌CTTGACATCCTTTGACCACTCTG序列编号：2“下游”起始序列R李斯特菌GACTTAACCCAACATCTCACGAC序列编号：3P试验李斯特菌AGCTGACGACAACCATGCACCACC序列编号：4“上游”起始序列F金黄色葡萄球菌AACAAAACAGACCATCTTTAAGCG序列编号：6P试验金黄色葡萄球菌ACTCAACCGACGACACCGAACCCT序列编号：“上游”起始序列F空肠弯曲菌GCAGCAGTAGGGAATATTGCG

 

7序列编号：8“下游”起始序列R空肠弯曲菌TACGCTCCGAAAAGTGTCATCC序列编号：9P试验空肠弯曲菌AACCCTGACGCAGCAACGCCGC序列编号：10“上游”起始序列F大肠杆菌O157:H7GCAGATAAACTCATCGAAACAAGG序列编号：11“下游”起始序列R大肠杆菌O157:H7TAAATTAATTCCACGCCAACCAAG序列编号：12P试验大肠杆菌O157:H7ACCCTGTCCACACGATGCCAATGT

图表1

在本技术发明中所推荐使用的是序列编号：3，序列编号：6，序列编号：9，序列编号12的序列，它们是被用作检测探针。它们的5’序列顶端被做了荧光处理，或是被一种可以放射能量的染料做处理。它们的3’序捕获列顶端被去掉了荧光，或是被一种可以捕获荧光放出的能量的染料处理。为了检测和鉴定出李斯特菌，金黄色葡萄球菌，空肠弯曲菌以及大肠杆菌O157:H7，这些具有荧光的和没有荧光的序列是被用作标记，他们之间是没有交叉反应的。而其他的组成部分，在表2里都清楚的显示了出来：

 

识别类型病原体类型核酸序列5’顶端有荧光物质标示3’顶端没有荧光物质标示序列编号：3李斯特菌AGCTGACGACAACCATGCACCACCTETBHQ-1序列编号：6金黄色葡萄球菌ACTCAACCGACGACACCGAACCCTTxRBHQ-2序列编号：9空肠弯曲菌AACCCTGACGCAGCAACGCCGCCy5BHQ-3序列编号：12大肠杆菌O157:H7ACCCTGTCCACACGATGCCAATGTFAMBHQ-1

图表2

一份或多份送检样品中DNA材料的准备

为了按照本项技术发明创造的方法进行检测，需要按照如下的步骤对于送检样品进行进行准备：

首先取一段待检测的样品，食物样品或是其它的样品，随后把待检样品浸入盐水溶液中，让样品悬浮其中。随后将对于样品进行离心处理，从而获得第一层的沉积物。不过为了后续的步骤，要除去这层沉积物里所带的溶液里的水分。

在得到送检样品的沉积物之后，用溶菌酶对于这些沉积物中进行处理，从而破坏沉积物中的细胞的细胞壁，在随后的步骤里，用蛋白酶K来对加过溶菌酶的沉积物进行处理，从而使蛋白质成分完全水解成氨基酸，包括前一步使用的溶菌酶也会被蛋白酶水解掉。

在除去蛋白质成分和其他脂溶性化合物之后，应该通过氯仿-酒精-苯酚处理的溶剂进行处理。在取出来经过处理的样品之后，就立即的喷洒乙醇溶液。然后加入乙醇溶液迅速搅拌，随后需要的DNA就从溶液中析出，而这样得出大量的DNA应该做静置处理。

最后，把得到的大量DNA在大约65摄氏度的温度条件下进行加热处理，使在样品中得到的这些DNA能够迅速的溶解。

在每一个实验过程中的有关联的因素，都被相关的试验所反复证实。比如：加入试剂的数量，自旋孵化的时间，反复洗涤，这次因素都被反复试验，直到找到一个最好的条件。在准备样品的整个过程中，应该考虑到这样的一个要求：所有的试剂和样品在整个过程中必须在冷却的条件下存放。

下面的部分将叙述准备一份或是多份样品的示例步骤：

示例一：在一份或是多份肉类制品或奶酪制品待检样品中提取所需DNA的全部过程

1.在一个容积是50ml的无菌的锥形管内放置25g的待检测食物样品，同时加入40ml的无菌生理盐水，盐水的温度保持在室温条件下。

2.把试管垂直放置10分钟，以便使试管里的样品充分沉淀

3.处理样品，用离心机以每分钟3500转速(min^-1)离心处理样品15分钟，并且小心的取出上层清液，不要碰到下面的沉积物。

4.左右摇晃震荡沉积物10秒钟

5.把全部的沉积物转移到一个容积为2ml的无菌试管内，用1ml的无菌生理盐水冲洗锥形试管，并把冲洗后的液体与沉积物合并在同一个无菌试管内。

6.以每分钟14 000转(14 000min^-1)的速度，离心处理8分钟。

7.用自动吸量管吸取所有的上层清液。

8.添加100μl，100mmol的Tris-HCl溶液，和30μg，pH＝8的溶菌酶，震荡混合10秒钟。

9.在37摄氏度的水温中，水浴加热30分钟。

10.添加100μl的TE 1X溶液，和1％ SDS溶液，以及3μl的K蛋白酶(20mg/ml)。

11.混合均匀，并且在55摄氏度的水温条件下，水浴加热30分钟。

12.添加500μl苯酚-氯仿-酒精异戊溶液(配置比例为24:24:1)，再加入100μl TE 1X，并且倒置震荡5分钟。

13.以13 500转每分钟的速度(min^-1)离心处理8分钟，并且从末层向另外的一个试管转移250μl。

14.添加582.5μl的无水乙醇，并且在冰箱里冷藏保存10分钟。

15.以13500转每分钟的速度进行离心处理，时间是8分钟。

16.进行澄清和干燥处理。

17.再次加入25μl的TE 1X，确保底部的DNA也溶解掉。

18.加热15分钟，温度为65摄氏度。

19.在室温下静置处理三十分钟。

示例二：从空气样品和待检物质表层样品中提取所需DNA的全部步骤。

1.用一块20cm x 20cm无菌纱布在待检测的样品表面擦过，以便完成测验的取样过程。

2.在无菌皿里积压这块纱布，使里面的液体流出。把流出的液体倒入一个50ml的无菌锥形试管里，并且加入40ml的无菌生理盐水。

3.处理样品，用离心机以每分钟3500转速(min^-1)离心处理样品15分钟，并且小心的取出上层清液，不要碰到下面的沉积物。

4.左右震荡晃动沉积物10秒钟

5.把全部的沉积物转移到一个容积为2ml的无菌试管内，用1ml的无菌生理盐水冲洗锥形试管，并把冲洗后的液体与沉积物合并在同一个无菌试管内。

6.以每分钟14000转(14 000min^-1)的速度，离心处理8分钟。

7.用1.5ml的无菌生理盐水再清洗两遍。

8.用自动吸量管吸取所有的上层清液。

9.添加100μl，100mmol的Tris-HCl溶液，和30μg，pH＝8的溶菌酶，震荡混合10秒钟。

10.在37摄氏度的水温条件下，水浴加热30分钟。

11.添加100μl的TE 1X溶液，和1％SDS溶液，以及3μl的K蛋白酶(20mg/ml)。

12.混合均匀，并且在55摄氏度的水温条件下，水浴加热30分钟。

13.添加500μl苯酚-氯仿-酒精异戊溶液(配置比例为24:24:1)，再加入100μl TE 1X，并且倒置震荡5分钟。

14.以13 500转每分钟的速度(min^-1)离心处理8分钟，并且从末层向另外的一个试管转移250μl。

15.添加582.5μl的无水乙醇，并且在冰箱里冷藏保存10分钟。

16.以13500转每分钟的速度进行离心处理，时间是8分钟。

17.进行澄清和干燥处理。

18.再次加入25μl的TE 1X，确保底部的DNA也溶解掉。

19加热15分钟，温度为65摄氏度。

20.在室温下静置处理三十分钟。

混合反应的准备过程

在取得一份或者多份DNA样本之后，就开始准备混合反应所需要的各种试剂，需要用到的试剂见于表3：

图表3

随后的步骤，开始准备一个有100种成分参与的混合反应，反应所需的试剂见于表格四4：

表格4

应该通过将试剂倒置震荡的方法，使试剂混合均匀。并且利用多种方法配置19.75μl的溶剂。其中有0.5ml的试剂应该在避光的条件下冷藏保存。

利用PCR大规模扩展增殖技术实时多量化检测鉴定多种病原体

本项技术发明提供的方法，即使用PCR实时大规模扩展增殖技术，和其它的只对一种目标进行检测的常规PCR技术相比，拥有极其明显的优势。利用PCR大规模扩展增殖技术进行反应，需要对于寡核核苷酸的起始序列进行扩增反应，而对于和要检测的病原体的目标序列有特殊反应的探针，也同样要进行扩增反应。通过这种方法，在40摄氏度到65摄氏度的这个温度区间，寡核核苷酸的起始序列和探针是可以兼容存在的，也可以在相同的条件下发生化学反应，最后允许出现杂交或是联结。通过这种杂交，两段互补的核酸序列联结在了一起。于此同时，在整个扩展增殖过程中，寡核核苷酸的起始序列和探针却不能够和其他任何别的的核酸序列，发生任何类型的交叉反应或是联结反应。

综上所述，接下来所有别的寡核核苷酸的起始序列，都被用来和其它的，要检测的目标病原体的核酸进行反应。一对用来鉴定李斯特菌的寡核核苷酸序列，即所知的序列编号1和序列编号2，这组寡核核苷酸会被用来和李斯特菌的基因组中的序列进行杂交反应和联结反应。一对用来鉴定金黄色葡萄球菌的寡核核苷酸序列，即所知的序列编号4和序列编号5，这组寡核核苷酸会被用来和金黄色葡萄球菌的基因组中的序列进行杂交反应和联结反应。一对用来鉴定空肠弯曲菌的寡核核苷酸序列，即所知的序列编号7和序列编号8，这组寡核核苷酸会被用来和空肠弯曲菌的基因组中的序列进行杂交反应和联结反应。一对用来鉴定大肠杆菌O157:H7的寡核核苷酸序列，即所知的序列编号7和序列编号8，这组寡核核苷酸会被用来和大肠杆菌O157:H7的基因组中的序列进行杂交反应和联结反应。

在利用PCR技术大规模实时扩展增殖技术中所使用的鉴定探针，即序列编号：3，序列编号：6，序列编号：9，序列编号：12。这些核酸序列是被双重标示的寡核核苷酸。这些寡核核苷酸和经过大规模扩展后的核酸序列一一互补对应，形成新的链接。每个探针的在它的5’顶端被荧光，或是能够放射能量的染料标示，而每个探针的3’顶端都被暗淡的，或是能够吸收上述染料放出能量的另外一种染料所标示。对于这一点，纳撒伦科在他的美国专利5866336号里有提及到。他在专利里写到了能够转移能量的荧光物质，以及在核酸大规模扩展技术里，这种物质怎么样在寡核核苷酸里得到应用的。

在本技术发明提供的方法里，使用的荧光物质是TET，TxR，Cy5，FAM，而在这个测验过程中使用的吸收能量的物质是BHQ-1，BHQ-2 y BHQ-3.在检测过程中被用作探针的寡核核苷酸序列(序列编号3，序列编号6，序列编号9，序列编号12)都根据上文所提到的表格二中的组合，在它们的3’和5’顶端做了标示。

在本技术发明提供的方法里，用作大规模扩展的DNA样本是在下列的条件下准备的：

乳制品样品和空气的送检样品：解冻小瓶溶液需用预先准备19.75μl的混合溶液，并且添加0.25μl的嗜热DNA聚合酶，4μl的水和1μl待检测分析的DNA。

肉制品和奶酪制品的送检样品：解冻小瓶溶液需用预先准备19.75μl的混合溶液，0.25μl的嗜热DNA聚合酶，和5μl待检测分析的DNA。

利用PCR大规模扩展增殖技术进行反应的时候，需要有一种仪器来控制实时的大规模扩展增殖过程。罗塞尔-沃斯顿在他已经公布的欧盟专利EP-640828里对于这种仪器有所有所描述。这个仪器的主要构成是：一个可以把大量进行待检测病原体DNA扩增的试管放入其中的仪器架。仪器架上的专用光源，为仪器架上的多个试管提供光源，以及一个荧光探测器，可以实时检测释放的荧光。

为了多量化检测样品里存在的微生物，需要制出每种待检测病原体(李斯特菌，金黄色葡萄球菌，空肠弯曲菌和大肠杆菌O157:H)在溶液中的存在数量的曲线。通过对试管的浑浊度调整0.5个Mc Farland单位，并且将溶液稀释为10^-1，10^-2，10^-3，10⁴，10⁵，10⁶，10⁷ y 10⁸的倍数，随后用25g的待检食物样品加入到每份溶液中，每份溶液都加入同样份额的样品。接着进行DNA样本的提取，并且记录下每瓶不同溶液的反应，确定不同的溶液里相对应的病原体的数量。最后在图像上加上单位cT和ug/g，最后就得到了一条溶液中病原体数量的曲线。李斯特菌的曲线见于图像一，金黄色葡萄球菌的曲线见于图像二，空肠弯曲菌的曲线见于图像三，大肠杆菌O157:H的曲线见于图像四。

在本技术提供的方法里，使用到的仪器包括实时检测荧光的荧光探测仪，可以实时检测大规模扩展增殖过程的仪器。在这个流程中使用到的一种仪器是赛普伊德公司生产的“灵敏循环仪”。

通过DNA多量化实时检测鉴定样品中的病原体

这四种病原体(李斯特菌，金黄色葡萄球菌，空肠弯曲菌和大肠杆菌O157:H)可能在样品中出现的所有组合形式，存在与否都能够被检测出来。检测的结果很直观的由样品里的DNA所具有的不同荧光或是放射性的荧光标志显现出来。因此要确定不同荧光的波长，这样就可以容易得辨别出哪种荧光是由哪种DNA所发射出的。

检测结果

根据本技术提供的方法，图表五显示了结束整个大规模扩展步骤的条件，图表六显示了检测可以达到的水平，图表七显示了读取出的检测结果里的四种病原体(李斯特菌，金黄色葡萄球菌，空肠弯曲菌和大肠杆菌O157:H)的浓度，检测结果分别来自冷肉，乳制品和从表层获取的样品，通过利用一种单一的混合试剂，在相同温度下四种来自不同病原体的寡核核苷酸在扩增的过程中进行混合。当然，图像一二三四也显示了多量化检测结果。

图表5

图表6

图表7

使用本技术提供的方法进行检测不需要对送检样品预先进行培养，因此整个过程的时间被缩短了很多。最短在2.5个小时左右，就可以得出具体的检测结果，这个结果包括具体的病原体的数量和种类。

相关配置的诊断

一般来讲，本项技术相关配置的诊断包括：每一个待检测的病原体(李斯特菌，金黄色葡萄球菌，空肠弯曲菌和大肠杆菌O157:H)所特有对应的寡核核苷酸的起始序列部分，以及检测所需要的和每种病原体所特殊对应的每个探针。通过上述的步骤，利用上述步骤的材料最后可以实现对于特定的四种病原体中的每一个病原体进行多量化实时检测。根据不同情况下的不同需要，四种病原体的组合存在组合也可以通过上述的方法进行多量化实时检测(仅仅使用寡核核苷酸起始序列部分和对应的探针)。

本技术所提供的方法所使用的相关的试剂，包括可以装在盒子里的核酸序列，或是前面提到过的一些装有寡核核苷酸起始部分序列或是探针的器皿。为了完成检测，应该拥有下列的条件：一些装有全部或是部分试剂的容器，以及纯净无菌水，NTPs(dATP，dCTP，dGTP，y dTTP)，扩展酶法适当的补充和储备，一种嗜热DNA聚合酶(比如说，DNA聚合酶Taq)，一种镁盐(比如MgCl₂)。上述的这些都应该根据需要进行相关的配置和补充。此外根据本技术的提供的方法所使用的试剂，还包括盛有李斯特菌，金黄色葡萄球菌，空肠弯曲菌和大肠杆菌O157:H的器皿，来作为阳性对照的比对。

根据上文所述，为了进行上述的检测，已经叙述了很多检测的步骤和程序。在这些检测过程中，应该对于所有需要的这些条件进行最大的改善，以期得到最好的检测结果。包括上文所叙述的这些检测的步骤和检测的条件，这些都不是不会发生变化的。以上的这些叙述，都可能会有改正的余地，这些由我们负责，这一点需要格外的注意。

序列表

<110>西格马食品可变资本有限公司，

     加尔萨·冈萨雷斯，埃尔维拉

     博格斯·帕迪拉，弗朗西斯科·哈维尔

     莫雷诺·卡帕娜，维克托·曼努埃尔

<120>通过实时聚合酶链反应探测和同时进行多重量化病原体的方法

<130>PCT003适马

<140>PCT/MX2007/000052

<141>2007-04-19

<150>MXNL/a/2006/000028

<151>2006-04-24

<160>12

<170>版本3.3专利

<210>1

<211>24

<212>DNA

<213>人造的

<220>

<223>寡核苷酸，李斯特菌的上流F

<400>1

<210>2

<211>23

<212>DNA

<213>人造的

<220>

<223>寡核苷酸，李斯特菌的下游R

<400>2

<210>3

<211>24

<212>DNA

<213>人造的

<220>

<223>李斯特菌检验P的寡核苷酸

<400>3

<210>4

<211>24

<212>DNA

<213>人造的

<220>

<223>金黄色葡萄球菌“上游”F的寡核苷酸

<400>4

<210>5

<211>24

<212>DNA

<213>人造的

<220>

<223>金黄色葡萄球菌“下游”R的寡核苷酸

<400>5

<210>6

<211>24

<212>DNA

<213>人造的

<220>

<223>金黄色葡萄球菌试验P的寡核苷酸

<400>6

<210>7

<211>21

<212>DNA

<213>人造的

<220>

<223>空肠弯曲菌“上游”F的寡核苷酸

<400>7

<210>8

<211>22

<212>DNA

<213>人造的

<220>

<223>空肠弯曲菌“下游”R的寡核苷酸

<400>8

<210>9

<211>22

<212>DNA

<213>人造的

<220>

<223>空肠弯曲菌试验P的寡核苷酸

<400>9

<210>10

<211>24

<212>DNA

<213>人造的

<220>

<223>大肠杆菌“上游”F的寡核苷酸

<400>10

<210>11

<211>24

<212>DNA

<213>人造的

<220>

<223>大肠杆菌“下游”R的寡核苷酸

<400>11

<210>12

<211>24

<212>DNA

<213>人造的

<220>

<223>大肠杆菌试验P的寡核苷酸

<400>12