儿童肺炎流行特征、病原体诊断方法评价和肺炎链球菌多重PCR分型方法研究

摘要

急性呼吸道感染是儿童最为常见的疾病。在广大发展中国家,肺炎是5岁以下儿童死亡的首要原因。自上世纪70年代以来,儿童肺炎一直也是我国5岁以下儿童的首要死亡原因。然而,迄今为止,我国5岁以下儿童的肺炎死亡率和发病率等流行病学特征仍不清楚。对儿童肺炎病原体的正确诊断是预防和控制儿童呼吸道感染的关键所在。然而,由于难以获取高质量的下呼吸道标本,肺炎病原体的诊断一直是医学界的难题。深部吸痰法是近年发展起来的损伤性小的下呼吸道标本采集方法。为了正确地使用和推广该方法,本研究结合鼻咽拭子的检测结果,对深部吸痰法的有效性和特异性等进行综合性的评价。此外,为了了解我国肺炎链球菌菌株的血清分布和监测其血清型的变更等,迫切需要寻找一种可替代荚膜肿胀试验,且适用于发展中国家流行病学研究的肺炎链球菌分型方法,以控制肺炎链球菌感染,并为制定肺炎链球菌疫苗免疫策略提供依据。
　　第一部分系统性回顾中国儿童肺炎流行病学特征
　　系统的检索了1950-2007年间公开发表的关于儿童肺炎发病、死亡和病原体等相关的文献。通过对NCBI,Cochrane,CNKI,VP,万方等主要数据库的检索和手工检索,共获得6310篇文献。经过筛选、全文阅读、质量评价和文献信息提取等,最终采纳并进入分析的文献共142篇。
　　20世纪90年代,来自黑龙江、内蒙古、宁夏、山东、北京、江苏、云南、广东等地以人群为基础的儿童呼吸道感染监测结果显示,中国5岁以下儿童肺炎发病率为26.6％。儿童年龄越小,发病率越高。随着年龄的增长,肺炎的发病率迅速下降。不同地域儿童肺炎的发病率也有差异。总体来说,南方高于北方,尤其是西南、华南地区比华北、华东地区高。
　　肺炎一直是我国儿童,尤其是5岁以下儿童的首位死亡原因。1991-2000年间,全国儿童死亡调查结果显示儿童总死亡率随着时间有所下降,肺炎在所有死亡原因中占首位。年龄不同,儿童肺炎死亡率也不相同。低年龄组儿童肺炎死亡率高,随着年龄的增长,肺炎死亡率迅速下降。在各地区之间,儿童肺炎死亡率差异较大,西部地区的儿童肺炎死亡率比中东部地区高,而北方地区儿童肺炎死亡率高于南方地区。
　　病死率是反映疾病严重程度的一个重要指标。从年龄上看,新生儿的肺炎死亡率最高,达21.3％(95％CI:19.8％-22.9％)。5岁以下儿童的肺炎病死率明显下降,仅为0.6％(95％CI:0.5％-0.7％)。北方地区儿童肺炎病死率为18.0‰(95％CI:13.7‰-22.2‰),高于南方地区的5.3％(95％CI:4.7‰-5.99‰)。西部地区儿童肺炎病死率高达11.3960(95％CI:8.5‰-14.1‰),显著高于中东部地区。
　　儿童肺炎的细菌检出率为31.2％(95％CI:30.7％-31.8％),其中以新生儿肺炎的细菌检出率较高。在阳性分离细菌中,新生儿以金黄色葡萄球菌为较为常见。较大年龄儿童中,肺炎链球菌,流感嗜血杆菌的阳性率也较高。不同年代、不同地区儿童肺炎的细菌学感染谱有所不同。
　　总而言之,我国属于儿童肺炎高负担国家,尤其是经济相对落后地区5岁以下儿童的发病率和死亡率居高不下。
　　第二部分对深部吸痰法诊断儿童肺炎病原体的评价
　　本研究旨在对深部吸痰法诊断下呼吸道感染儿童病原体的可行性、有效性和特异性等进行综合评价。研究以2006年3月.2007年3月期间于苏州儿童医院住院治疗的下呼吸道感染住院儿童(病例组)和无呼吸道感染的外科患儿(对照组)为研究对象,在征得其父母或监护人的知情同意之后,对研究对象父母或监护人进行面对面的问卷调查、病史摘录及病案回顾等以收集相关的信息,同时采集研究对象的鼻咽拭子和深部吸痰标本,送实验室进行细菌学检测,在标本的采集和实验室操作过程中分别采取了严格质量控制和盲法。研究共入选了839名儿童,其中66人因标本采集不合格等原因而被剔除,最终773人(病例组379人,对照组394人)被纳入数据分析。两组研究对象在性别、年龄和入选时间等方面存在差异,并且86％的病例组儿童在入院前使用过抗生素。
　　根据研究假设,对照组儿童的深部吸痰结果的阳性率应为零或很低,病例组儿童的深部吸痰的阳性结果可认为是下呼吸道感染的病原菌。然而,研究结果与研究假设相比有差异。即无呼吸道感染症状的对照组儿童的深部吸痰标本细菌阳性率高,如流感嗜血杆菌阳性率高达27.2％(95％CI:22.8％-31.5％),卡他莫拉菌的阳性率为22.1％(95％CI:18.0％-26.2％),肺炎链球菌的阳性率为8.4％(95％CI:5.6％-11.1％)。病例组儿童由于受到大量使用的抗生素的影响,深部吸痰标本的细菌阳性率相对较低,如流感嗜血杆菌阳性率为15.3％(95％CI:11.7％-18.9％),卡他莫拉菌的阳性率为4.7％(95％CI:2.6％-6.9％),肺炎链球菌的阳性率为10.3％(95％CI:7.2％-13.3％)。两组对象深部吸痰法的流感嗜血杆菌和卡他莫拉菌的阳性率差异有统计学意义。59名对照组儿童鼻咽部携带了肺炎链球菌,其中20名儿童的深部吸痰标本肺炎链球菌阳性,即深部吸痰法的假阳性率为33.9％(95％CI:20.7-47.0％)。鼻咽拭子和深部吸痰法检测结果一致性较高,Kappa值位于0.37至0.64之间。可见深部吸痰法的标本受到上呼吸道正常菌群的干扰,假阳性率高,特异性较差。
　　当然,深部吸痰法也有其可取之处。虽然受到广泛应用的抗生素的影响,但与鼻咽拭子相比,深部吸痰法的细菌分离率高。根据对采样部位的分析,结合鼻咽拭子的检测结果,深部吸痰法的检测结果可以反映细菌向下侵袭的趋势,对下呼吸道感染病原体的诊断有提示作用。结合临床检验的结果,如结合革兰氏染色和瑞氏染色,局部痰液标本中找到G+球菌和脓细胞,有助于肺炎链球菌等常见呼吸道感染细菌的分离;血液中C反应蛋白水平和中性粒白细胞计数等,可以有助于下呼吸道感染病原体的诊断。
　　综上所述,深部吸痰法检测下呼吸道感染病原菌的特异性较差,容易受到上呼吸道携带细菌的干扰,不适合直接用于儿童肺炎病原体的诊断。
　　第三部分肺炎链球菌多重PCR分型方法的研究
　　本研究结合我国儿童肺炎链球菌常见的血清型和基因库序列分析,设计血清型特异的PCR引物,以初步建立肺炎链球菌多重PCR分型方法。通过与传统的肺炎链球菌血清分型方法一荚膜肿胀试验和经典的分子分型方法多位点序列分型方法(MLST)进行比较,研究和评价多重PCR的分子生物学分型方法用于判别肺炎链球菌血清分型的可行性、敏感性和特异性,旨在寻找一种适合于我国流行病学调查和研究的肺炎链球菌血清分型方法。
　　根据肺炎链球菌血清型相关基因cps的结构和组成,以及国内既往研究结果,设计我国较为常见血清型1,3,5,6,7F,9V,14,15A,15B/C,18C,19F,19A,20,22F,23F等的特异引物,并优化建立了多重PCR反应体系。从临床分离的肺炎链球菌中成功区别血清型19F,19A,23F,14,18C,6A/B,15A,15B/C等常见血清型。对多重PCR的的初步分型结果,进行普通PCR反应验证和PCR反应产物的测序等确认分型结果的准确性。
　　多重PCR分型结果与荚膜肿胀试验分型结果相比,63株肺炎链球菌中,两者分型结果一致的有52株菌,结果一致性达82.5％(95％CI:73.2％-91.9％),灵敏度为89.2％(95％CI:79.2％-99.2％),阳性预测值82.5％(95％CI:70.7％-94.3％)。在分型结果不一致的11株菌中,7株荚膜肿胀试验尚未分出具体血清型别,多重PCR方法可区分其血清型,分别为血清型23F,19A,18C,6A/B等非常常见的血清型。此外,多重PCR方法还识别了两种血清型19F和23F共存的现象。多重PCR分型结果与MLST分型结果相比,45株肺炎链球菌血清分型结果一致的有40株,结果一致性达88.9％(95％CI:79.7％-98.1％),灵敏度为88.4％(95％CI:78.8％-98.0％),阳性预测值100％。
　　可见多重PCR分型方法与荚膜肿胀试验和MLST分型结果一致性高,分型结果准确,可以同时筛查多种血清型,具有快速、便捷、客观等优点,其分型成本为各种分型方法中最低。此外,多重PCR方法可以对荚膜阴性肺炎链球菌菌株进行分型,也可识别多种血清型共存的现象,还可直接用于临床标本的肺炎链球菌感染的检测和分型。今后可将其分型范围扩展至更多血清型,并在现场应用和进一步评价该方法。
　　总之,肺炎链球菌多重PCR分型方法是一种经济、快速、便捷、客观的分型方法,适用于发展中国家和大规模的流行病学调查。