通过早期引入不规则结构,生产生物成像的纳米颗粒及其制造方法

摘要

本发明公开了一种通过早期引入不规则结构，生产生物成像的纳米颗粒及其制造方法。本发明的目的是提供制备生物成像纳米颗粒的方法，其中通过借助部分表面改性，早期引入不规则结构到纳米颗粒的表面内，允许在结构上妨碍因纳米颗粒内部氢键吸引导致的聚集和沉淀现象，从而在没有损失纳米颗粒的情况下，高产率地在非极性有机溶剂或水溶液内制备具有高分散性和稳定性的生物成像的纳米颗粒。

说明书

技术领域

本发明涉及通过早期引入不规则的表面结构，高产率地制备在水溶液内具有高度分散性、生物相容性和靶向性的生物成像的纳米颗粒的方法。

背景技术

由于建立了在含表面活性剂的有机溶剂内化学合成具有均匀尺寸分布的疏水无机纳米颗粒的方法，因此，进行了各种尝试将该方法付诸使用。特别地，由于在水溶液中制备的纳米颗粒显示出比有机溶剂和水中制备的那些大得多的非均匀尺寸分布，是最便宜、最环境友好，和地球上存在的最有用的溶剂，因此在有机溶剂内制备的具有均匀尺寸分布的疏水纳米颗粒的表面改性以便稳定地分散在水溶液内是非常重要的且是研究者的主要关注领域。可溶量子点(quantum dots)或在其中心处仅仅含单一量子点或单一无机纳米颗粒和在其表面处粘结具有有用官能团的有机材料的可溶的纳米颗粒可有效地用作生物成像材料以及制造一些类型的纳米结构，例如生物传感器或记忆器件的基础材料。因此，对这些纳米颗粒的表面改性进行了深入的研究。

这种表面改性的常用方法包括下述步骤：使疏水纳米颗粒与过量含硫醇(-SH)基的有机配体反应，从而用金属硫醇盐(M-S)键替代在纳米颗粒表面上的所有表面活性剂配体并向外暴露亲水基团，从而导致亲水纳米颗粒；和在纳米颗粒的亲水基团与官能分子，例如靶向生物分子之间形成共价键，获得仅仅在其中心处包括无机纳米颗粒的生物成像的纳米颗粒(参见图1)。这种共价键由在纳米颗粒的亲水基团和新的官能分子之间的酰胺键或酯键组成。研究的主要目的是其中选自胺(NH₂)、羧酸(COOH)、硫醇和羟基(OH)中的亲水基团借助烃链连接到硫醇基上的极性有机配体。公知这些有机配体与量子点(例如，CdSe、ZnS，或核/壳CdSe/CdS、CdSe/ZnS和类似物)、贵金属纳米颗粒(例如，Au、Ag)或氧化铁磁性纳米颗粒容易形成金属-硫醇盐(M-S)键，所有这些的特征在于在表面上含有丰富的金属成分。然而，由于在中性或近中性的溶液内羟基或胺基容易聚集且沉淀，因此没有进行进一步研究。另一方面，由于羧酸基在很大程度上以电离状态存在于中性溶液内，在溶液内显示出高的分散性和稳定性，因此它广泛地用作亲水基团以供通过酰胺键耦合官能分子到纳米颗粒上。

然而，上述方法必须经历在弱酸性水溶液内活化在纳米颗粒表面上的羧酸基的步骤，所述弱酸性水溶液将引起许多纳米颗粒聚集和沉淀(WC Chan和SNie，Science 281：2016，1998；Wen Jiang，et al.，Chem.Mater.18：872，2006)。特别地，在其中磁性纳米颗粒的情况下，聚集和沉淀更加严重。聚集和沉淀的这种纳米颗粒难以在下一步中键合到官能分子上，和即使进行键合到官能分子上，官能分子也仅仅键合到聚集的纳米颗粒表面上(参见图1的步骤B，右侧的一组)。这样制备的纳米颗粒太大，以致于无法沿着血管迁移并显示出显著降低的分散性。此外，在使用量子点的情况下，纳米颗粒的荧光显著下降，这归因于自猝灭。由于最终必须除去这些沉淀和仅仅使用溶液层的充分地分散的部分，因此存在大量的纳米颗粒损失的严重问题。

为了克服聚集和沉淀问题，报道了通过使疏水无机纳米颗粒直接与具有硫醇基的聚乙二醇(PEG)反应，制备具有金属-硫醇盐(M-S)键的有机/无机复合纳米颗粒的方法(美国专利No.7,041,371)。然而，所公开的该方法仍然具有反应产率低的问题，这是因为通过长烃链连接的亲水硫醇基必须渗透到被表面活性剂包围的纳米颗粒的表面内。

为了尝试克服现有技术中亲水纳米颗粒聚集和沉淀的问题，本发明的发明人发现，因具有均匀结构的亲水纳米颗粒表面上存在的过量亲水基团导致的氢键吸引，引起这种聚集和沉淀。基于上述发现，发明人开发了在结构上阻碍这种氢键吸引并在整个反应工艺过程中固定单独和独立的纳米颗粒的方法。本发明的方法可制备生物成像纳米颗粒，在没有引起聚集和沉淀的情况下，它在其中心处含有单一的颗粒，且显示出优良的物理性能，例如均匀的尺寸分布，高的分散性和在溶液内的稳定性，生物相容性、靶向性和类似性能。

发明内容

本发明的目的是提供制备生物成像纳米颗粒的方法，其中通过借助部分表面改性，早期引入不规则结构到纳米颗粒的表面内，允许在结构上妨碍因纳米颗粒内部氢键吸引导致的聚集和沉淀现象，从而在没有损失纳米颗粒的情况下，高产率地在非极性有机溶剂或水溶液内制备具有高分散性和稳定性的生物成像的纳米颗粒。

本发明的另一目的是提供根据本发明方法制备的具有高的分散性和稳定性的生物成像的纳米颗粒。

本发明提供制备生物成像的纳米颗粒的制备方法，该方法包括：

1)添加1-30当量含有通过8-20个碳原子的烃链连接的硫醇基和亲水基的有机配体到用表面活性剂保护的核或核/壳结构的疏水无机纳米颗粒中，从而用有机配体部分替代表面活性剂和在纳米颗粒表面上形成金属-硫醇盐(M-S)键，这导致产生其表面仅仅部分改性为亲水性质且仍然维持它在非极性有机溶剂内的单独的分散性的疏水纳米颗粒；

2)将官能分子键合到在步骤1)制备的纳米颗粒的表面上引入的亲水基团上，以提供纳米颗粒表面官能度和不规则的结构，同时维持它们单独的分散性；和

3)用其中至少两个亲水基团通过1-7个碳原子的烃链连接的有机配体替代在步骤2)制备的纳米颗粒表面上残留的其余表面活性剂，从而将疏水纳米颗粒转化成亲水纳米颗粒。

此外，本发明提供根据本发明方法制备的生物成像的纳米颗粒，它仅仅在其中含通过8-20个碳原子的烃链连接的硫醇基和亲水基团的有机配体引入到用表面活性剂保护的核或核/壳疏水纳米颗粒表面内的部分处部分亲水，但整体上仍然疏水，并维持它们在非极性有机溶剂内单独的分散性。

本发明还提供根据本发明方法制备的生物成像的纳米颗粒，它具有官能度和不规则结构，这归因于在纳米颗粒的表面内引入的亲水基团键合到官能分子上，且仅仅在其中官能分子键合到其上的部分处部分亲水，但整体上仍然疏水。

最后，本发明提供根据本发明方法制备的生物成像的纳米颗粒，其中通过用至少两个亲水基团借助1-7个碳原子的烃链连接的有机配体替代在纳米颗粒表面上残留的其余表面活性剂，从而在整体上亲水，并在水溶液内维持它们单独的分散性。

根据本发明的优选实施方案，借助分步的部分表面改性，在合成具有小于或等于20纳米的圆形形状且具有荧光性能的核或核/壳纳米颗粒或氧化铁磁性纳米颗粒的条件下，在有机溶液内通过按序偶联长链有机配体和官能分子到纳米颗粒上，和固定该颗粒的均匀度，从而制备具有不规则结构的疏水官能的生物成像的纳米颗粒。此外，上述纳米颗粒的疏水性转化成亲水性，其中引入到纳米颗粒表面内的来自不规则结构的位阻防止纳米颗粒内部的氢键吸引，从而以100％的产率制备能在水溶液内维持单独的分散性的生物成像的纳米颗粒。

附图说明

参考下述附图，详细地描述本发明的实施方案。

图1描述了制备生物成像的纳米颗粒的常规方法以及每一步中获得的纳米颗粒的结构；

图2描绘了根据本发明制备生物成像的纳米颗粒的方法，以及在每一步中获得的纳米颗粒的结构；

图3示出了用作起始材料的量子点和本申请的实施例1-5中制备的量子点的红外光谱：a)用作起始材料的CdSe/CdS-ODA量子点；b)实施例1中制备的CdSe/CdS-DA量子点；c)实施例2中制备的CdSe/CdS(-DA)ex(-MUA)5量子点；d)实施例3中制备的CdSe/CdS(-DA)ex(-MUA-en-FA)5量子点；e)实施例4中制备的CdSe/CdS(-MPA)ex(-MUA-aPEGa)5量子点；f)实施例5中制备的CdSe/CdS(-MPA)ex(-MUA-aPEGa-FA)5的量子点；

图4示出了用作起始材料的量子点和本申请的实施例1-5的量子点的透射电子显微图(TEM)：a)用作起始材料的CdSe/CdS-ODA；b)实施例1中制备的CdSe/CdS-DA量子点；c)实施例2中制备的CdSe/CdS(-DA)ex(-MUA)5的量子点；d)实施例3中制备的CdSe/CdS(-DA)ex(-MUA-en-FA)5的量子点；e)实施例4中制备的CdSe/CdS(-MPA)ex(-MUA-aPEGa)5的量子点；f)实施例5中制备的CdSe/CdS(-MPA)ex(-MUA-aPEGa-FA)5的量子点；

图5示出了分别用作对照剂和靶向剂的用本申请实施例4和5的量子点处理的HT1080细胞和KB细胞的荧光显微图像：QD：CdSe/CdS(-MPA)ex(-MUA-aPEGa)5量子点用作对照；QD-FA：CdSe/CdS(-MPA)ex(-MUA-aPEGa-FA)5量子点用作靶向剂；+FA：存在过量游离的FA；-FA：不存在游离的FA；

图6示出了本申请的实施例6中制备的量子点的红外光谱：a)CdSe/CdS(-DA)ex(-MUA-aPEGa)5量子点；b)CdSe/CdS(-DA)ex(-MUA-aPEGa)10量子点；c)CdSe/CdS(-DA)ex(-MUA-aPEGa)30量子点；

图7示出了本申请实施例6中制备的量子点的TEM图像：a)CdSe/CdS(-DA)ex(-MUA-aPEGa)5量子点；b)CdSe/CdS(-DA)ex(-MUA-aPEGa)10量子点；

图8示出了用作起始材料的磁性纳米颗粒和本申请实施例7-11中制备的磁性纳米颗粒的红外光谱：a)用作起始材料的SPION-OA纳米颗粒；b)实施例7中制备的SPION(-OA)ex(MHA)10纳米颗粒；c)实施例8中制备的SPION(-OA)ex(MHA-aPEGa-MTX)10的纳米颗粒；d)实施例9中制备的SPION(-MPA)ex(MHA-aPEGa-MTX)10纳米颗粒；e)实施例10中制备的SPION(-Lys)ex(MHA-aPEGa-MTX)10纳米颗粒；f)实施例11中制备的SPION(-OA)ex(MHA-en-FA)5纳米颗粒；

图9示出了用作起始材料的磁性纳米颗粒和本申请的实施例7-10中制备的磁性纳米颗粒的TEM图像：a)用作起始材料的SPION-OA纳米颗粒；b)实施例7中制备的SPION(-OA)ex(MHA)10纳米颗粒；c)实施例8中制备的SPION(-OA)ex(MHA-aPEGa-MTX)10纳米颗粒；d)实施例9中制备的SPION(-MPA)ex(MHA-aPEGa-MTX)10纳米颗粒；e)实施例10中制备的SPION(-Lys)ex(MHA-aPEGa-MTX)10纳米颗粒；

图10示出了用本申请的实施例11中制备的SPION(-OA)ex(MHA-en-FA)5磁性纳米颗粒靶向的KB细胞的核磁共振(NMR)图像。

具体实施方式

制备生物成像的纳米颗粒的常规表面改性方法导致生产率的显著下降，这是因为通过引入亲水有机配体到其表面内制备的亲水纳米颗粒聚集和沉淀，这种聚集和沉淀归因于所引入的表面亲水基团本身在水溶液内或者在与生物分子的键合反应过程中均匀的结构引起的氢键吸引。

发明人已发现，在水溶液内具有均匀尺寸分布的亲水纳米颗粒的这种聚集和沉淀归因于亲水有机配体的均匀结构引起的纳米颗粒内部的氢键吸引。基于上述发现，发明人开发了高产率地单独分散在水溶液内的生物成像的纳米颗粒的制备方法，其特征在于借助逐渐的表面改性，早期引入不规则结构的官能有机物质，例如生物相容的分子、靶向分子、络合物或其混合物到纳米颗粒表面内，从而制备疏水纳米颗粒，所述疏水纳米颗粒显示出生物相容性和/或靶向性；然后将该疏水纳米颗粒转化成亲水纳米颗粒，这种转化导致抑制因官能有机物质的位阻引起的纳米颗粒内部的氢键吸引。

特别地，本发明制备生物成像的纳米颗粒的方法包括下述步骤：

1)添加1-30当量含有通过8-20个碳原子的烃链连接的硫醇基和亲水基的有机配体到用表面活性剂保护的核或核/壳结构的疏水无机纳米颗粒中，从而用有机配体部分替代表面活性剂和在纳米颗粒表面上形成金属-硫醇盐(M-S)键，这导致产生其表面仅仅部分改性为亲水性质且仍然维持它在非极性有机溶剂内的单独的分散性的疏水纳米颗粒；

2)将官能分子键合到在步骤1)制备的纳米颗粒的表面上引入的亲水基团上，以提供纳米颗粒表面官能度和不规则的结构，同时维持它们单独的分散性；和

3)用其中至少两个亲水基团通过1-7个碳原子的烃链连接的有机配体替代在步骤2)制备的纳米颗粒表面上残留的其余表面活性剂，从而将疏水纳米颗粒转化成亲水纳米颗粒。

如上所述，常规的方法可通过在含表面活性剂的有机溶液内合成具有均匀尺寸分布的疏水纳米颗粒，在纳米颗粒和有机配体(所述有机配体含有用短烃链连接的硫醇基和亲水基团)之间形成金属-硫醇盐(M-S)键，从而允许亲水官能团向外暴露，固定纳米颗粒粉末的亲水性。然而，具有向外暴露的亲水基团的这些亲水纳米颗粒极其容易聚集和沉淀，因此该纳米颗粒不可能与其他生物大分子成功地形成酰胺键或酯键。由于这一原因，没有关于高产率地成功制备在其中心处含有单一纳米颗粒的生物成像纳米颗粒的报道。

发明人已发现，如图1所示，含具有向外暴露的胺或羧基的亲水纳米颗粒的各种亲水纳米颗粒容易聚集和沉淀，这归因于在纳米颗粒表面上规则地自组装的过量亲水官能团引起纳米颗粒内部的氢键吸引。为了防止这一现象，如图2所示，本发明通过借助部分表面改性，引入不规则结构到纳米颗粒表面内，首次确立了完全抑制纳米颗粒内部氢键吸引的最佳条件。在这些条件下，在没有引起任何聚集或沉淀的情况下，纳米颗粒彼此独立地分散。首先，在纳米颗粒表面上存在的仅仅一部分表面活性剂被含有通过8-20个碳原子的烃链连接的硫醇基和亲水基团的有机配体替代，从而导致在它们之间形成金属-硫醇盐(M-S)键。之后，引入到纳米颗粒表面上的亲水基团与具有生物相容性和靶向性的官能分子耦合，从而赋予纳米颗粒官能度和不规则的结构。如此制备的疏水官能的纳米颗粒本身可有效地用于特定目的的生物成像，例如体外细胞实验。随后，其余表面活性剂被含有通过1-7个碳原子的烃链连接的至少两个亲水基团的有机配体替代，从而将疏水纳米颗粒转化成亲水纳米颗粒。结果，纳米颗粒内部的氢键吸引立体受阻，因此可高产率地制备在其中心处仅仅含有单一纳米颗粒且显示出改进的分散性和稳定性的生物成像的纳米颗粒。

参考图2，更详细地描述本发明制备生物成像的纳米颗粒的方法。

在步骤1)中，对疏水纳米颗粒进行部分表面改性(参见图2的步骤C)。向含具有核10或核/壳12结构并用表面活性剂14保护的无机纳米颗粒的有机溶液中添加小量有机配体20，所述有机配体20含有能与纳米颗粒表面上的金属元素形成化学键的硫醇基和亲水基团，其中这两个基团通过8-20个碳原子的烃链连接，然后在剧烈搅拌下使该混合物反应。优选添加用量为1-30当量的有机配体。结果，仅仅一部分表面活性剂被有机配体替代，和被替代的有机配体与纳米颗粒表面上的金属元素形成金属-硫醇盐(M-S键)。

在上述步骤中，无机纳米颗粒具有核或核/壳结构，其中它们的表面而不是内部，化学计量地富含金属元素，和所述金属元素能与有机配体中的硫醇基借助金属-硫醇盐(M-S)共价键化学键合。优选地，无机纳米颗粒是贵金属纳米颗粒、氧化铁磁性纳米颗粒或半导体纳米颗粒，所述纳米颗粒选自由属于周期表第II族的锌、镉和铅中的一种元素和选自属于周期表第VI族的硫、硒和碲中的一种元素组成。更优选，无机纳米颗粒的实例包括CdSe、ZnS、CdSe/CdS、CdSe/ZnS、PbS、Au、Ag、Fe₂O₃、Fe₃O₄和类似物，其中可没有限制地使用由能与硫醇基形成共价键的物质组成的任何纳米颗粒。

由于键合到无机纳米颗粒表面上的有机配体在分子内含有至少一个硫醇基和至少一个亲水基团，因此它可与无机纳米颗粒形成至少一个金属-硫醇盐(M-S)键，并提供至少一个键合位点以供与其他生物分子18，例如生物相容分子、靶向分子、络合物(生物相容-靶向分子)或其混合物耦合。

此外，在有机配体内的烃链长度优选范围为8-20，以便维持纳米颗粒的疏水性。若烃链的长度小于8，则纳米颗粒存在损失其疏水性的危险。此外，存在亲水基团包埋在表面活性剂下面的危险，这归因于其链长太短，所述危险可引起包埋的亲水基团难以与官能分子形成共价键的问题。不存在烃链长度超过20的有机配体，但如果它被开发的话，则也可使用这一配体。所添加的有机配体的用量范围优选为1-30当量。在添加小于或等于1当量的情况下，可能的情况是，在最初状态下保持的纳米颗粒不具有被替代的有机配体，从而引起生产率下降。在添加大于30当量的情况下，有机配体过度引入到纳米颗粒表面上，从而增强了纳米颗粒之间的氢键吸引，并引起纳米颗粒聚集和沉淀。

能借助纳米颗粒中的金属元素和有机配体中的硫醇基之间的金属-硫醇盐(M-S)共价键，化学键合到无机纳米颗粒表面上的有机配体的数量随粒度而变化，且范围可以是1-150。然而，证实若形成大于或等于30个M-S键且生物相容分子键合到其上，则纳米颗粒簇将形成聚集体，且不会分散在任何种类的溶剂中。因此，适合于借助纳米颗粒中的金属元素和有机配体中的硫醇基之间的金属-硫醇盐(M-S)共价键，化学键合到无机纳米颗粒表面上的有机配体的数量范围优选为1-30。在纳米颗粒表面处形成不规则结构的有机配体的合适实例包括，但不限于，巯基十一烷酸、巯基十二烷酸、巯基十六烷酸和类似物。

即使在上述步骤中部分表面改性的无机纳米颗粒含有向外暴露的亲水基团，由于亲水基团连接到其上的烃链长度长，因此它们实际上没有显示出亲水性。此外，由于亲水基团的数量显著低于疏水表面活性剂，因此这些纳米颗粒仍然显示出疏水性，且因此容易分散在无机溶剂内。

在步骤2)中，官能分子，例如生物相容分子、靶向分子、络合物或其混合物键合到在步骤1)制备的纳米颗粒表面上引入的亲水基团上，从而产生具有不规则结构的疏水纳米颗粒。由于如此制备的纳米颗粒仍然疏水或者为两性，因此它们容易分散在非极性溶剂内且可用于生物成像的特定目的，例如体外细胞实验中。

在步骤3)中，将含有通过1-7个碳原子的烃链连接的至少两个亲水基团的有机配体16加入到步骤2)制备的纳米颗粒中，以替代在纳米颗粒表面上残留的其余表面活性剂，这将导致疏水纳米颗粒转化成亲水纳米颗粒。在这一步骤中的有机配体的合适实例包括，但不限于，巯基己酸、巯基乙酸、巯基丙酸、二巯基琥珀酸、2-巯基乙醇、2-氨基乙二硫醇、赖氨酸、精氨酸、氨基戊酸和类似物。

根据步骤1)和2)引入到纳米颗粒表面内的不规则结构在维持单独的分散性方面扮演重要的作用，因为基本上防止了可能在步骤3)中出现的纳米颗粒内部的氢键键合。此外，在步骤3)中引入的有机配体的1-7个碳原子的短烃链增加有机物质的极性，从而改进在水中的分散性。

本发明中所使用的官能分子是合成聚合物或生物成分，它们在没有引起副作用的情况下，显示出高的生物相容性，且根据其条件具有生物降解性和各种物理状态，例如溶液、凝胶或膜。由于它们在其一个或两个端基处含有选自胺基、醛基和羧酸基中的一个官能团，因此该官能分子可与纳米颗粒中的亲水基团形成酰胺或酯键。这种官能分子例举生物相容分子、靶向分子、络合物(生物相容-靶向分子)或其混合物。

优选适合于本发明的生物相容分子在其两个端基处含有选自胺基、醛基和羧酸基中的一个官能团，或者在一个端基处含有这些官能团之一，和在另一端基处含有具有1-7个碳原子的烷氧基或羟基。这些生物相容分子的合适实例可包括，但不限于，聚乙二醇(PEG)、葡聚糖、聚(L-丙交酯)(PLLA)、聚(DL-丙交酯)(PDLLA)、聚-DL-丙交酯/乙交酯共聚物(PLGA)、壳聚糖、藻酸、透明质酸、胶原、肝素、聚(ε-己内酯)和类似物。

此外，本发明所使用的靶向分子可在体内被特异地识别，含有胺基、醛基、羧酸基、羟基和硫醇基之一，因此可借助酰胺键、酯键和硫酯键之一，连接到有机配体或生物相容分子上。这些靶向分子的实例可包括，但不限于，叶酸、氨甲喋呤(MTX)、对某一细胞具有选择性的肽(例如RGD肽或tat肽)，或者与一些抗原选择性反应的抗体(例如对链霉抗生物素蛋白特异的生物素，对PSA特异的PSA抗体)。

此外，生物相容分子和靶向分子可以以络合物形式或其混合物形式使用，其中所述络合物借助酰胺键或酯键偶联它们而制备。

含这些生物相容分子、靶向分子、生物相容-靶向络合物的官能分子或其混合物在其一个或两个端基处含有选自胺基、醛基和羧酸基中的一个官能团，因此它们可与步骤2)中单独地分散的纳米颗粒中的羧酸、羟基或胺基形成酰胺键或酯键，产生在其表面处具有不规则结构的纳米颗粒。

如图1的步骤B中所述，由于制备纳米颗粒的常规方法进行聚集形式的亲水纳米颗粒的酰胺或酯键键合反应，因此官能分子仅仅键合到聚集纳米颗粒的表面上，且不可能接触聚集体内部存在的纳米颗粒，从而使得不可能进行所得的键合反应。这一问题引起生物成像的纳米颗粒的生产率下降且无法执行成像功能。

然而，如图2的步骤D中所述，本发明的方法首先通过分步的部分表面改性，用借助8-20个碳原子的烃链连接的有机配体来部分替代纳米颗粒表面处存在的表面活性剂，然后将该官能分子偶联到在纳米颗粒表面内引入的这些有机配体上，从而制备具有不规则结构的疏水官能的纳米颗粒。然后用借助1-7个碳原子的烃链连接的有机配体替代在纳米颗粒表面处的其余表面活性剂，从而将纳米颗粒的疏水性转化成亲水性。根据本发明的方法，由于纳米颗粒内部的氢键吸引导致的纳米颗粒的聚集和沉淀受到在其表面上引入的不规则结构的立体阻碍，因此容易以100％的产率制备在其中心处含有单一纳米颗粒的有机/无机络合物纳米颗粒，同时在没有损失量子点的情况下维持其量子效率。

根据本发明的优选实施方案，借助分步的部分表面改性，在合成具有小于或等于20纳米的圆形形状且具有荧光性能的核或核/壳纳米颗粒或氧化铁磁性纳米颗粒的条件下，在有机溶液内通过按序偶联长链有机配体和官能分子到纳米颗粒上，和固定该颗粒的均匀度，从而制备具有不规则结构的疏水官能的生物成像的纳米颗粒。此外，上述纳米颗粒的疏水性转化成亲水性，其中引入到纳米颗粒表面内的来自不规则结构的位阻防止纳米颗粒内部的氢键吸引，从而以100％的产率制备能在水溶液内维持单独的分散性的生物成像的纳米颗粒。

此外，根据本发明的方法，只要在纳米颗粒表面上的金属元素可与具有硫醇基的有机配体形成共价键，则与内部无机纳米颗粒的组成组分无关，纳米颗粒能借助有机配体的亲水基团键合到官能分子上。因此，本发明的方法可有效地用于制备含有各种单一纳米颗粒，以及量子点和磁性纳米颗粒的有机/无机络合物纳米颗粒。

另外，即使在无机纳米颗粒和有机配体之间的共价键不是金属-硫醇盐(M-S)键，当借助分步的部分表面改性，使胺基、羧酸基或羟基在引入到纳米颗粒表面内的有机配体末端处暴露时，这种亲水基团也可键合到官能分子上，形成能立体阻碍纳米颗粒内部氢键键合的不规则结构，然后将上述纳米颗粒转化成亲水纳米颗粒。结果，本发明的方法可有效地应用于在转化成亲水纳米颗粒之前和之后，制备各种单独分散的生物成像的纳米颗粒。

此外，本发明提供根据本发明的方法制备的在其中心处含有单一无机纳米颗粒的生物成像的纳米颗粒。

由于本发明生物成像的纳米颗粒含有长烃链键合到在其中心处具有核或核/壳结构的无机纳米颗粒表面上的有机配体，因此该纳米颗粒仅仅在其中有机配体键合到其上的部分亲水，但在其中有机配体没有键合的部分内仍然大多数疏水(本发明方法的步骤1)。此外，通过形成酰胺键或酯键，偶联官能分子到所述纳米颗粒的亲水基团上，本发明可制备具有不规则表面结构的疏水纳米颗粒(本发明方法的步骤2)。此外，本发明可提供亲水纳米颗粒，其中在所述纳米颗粒表面上残留的其余表面活性剂可被具有至少两个亲水基团的有机配体的短链替代，从而导致将其疏水性转化成亲水性。如此制备的亲水纳米颗粒可在整个工序过程中，在水溶液内维持其单独的分散性，这是因为纳米颗粒内部的氢键键合受到引入到纳米颗粒表面内的不规则结构的位阻干扰(本发明方法的步骤3)。

本发明的亲水生物成像的纳米颗粒含有能在单一的纳米颗粒表面处形成氢键的许多亲水有机配体，但官能分子在纳米颗粒的一些部分处偶联到有机配体的长烃链上，这些部分将得使纳米颗粒具有不规则结构。由于这种不规则结构显示出对在纳米颗粒当中形成氢键的位阻效应，因此可制备具有均匀尺寸分布、高的化学稳定性、在水溶液内的分散性、生物相容性、靶向性、光度和光稳定性的纳米颗粒且没有因聚集和沉淀导致损失纳米颗粒。

因此，本发明的纳米颗粒不仅可有效地用作生物成像材料，而且作为基础医疗材料用于高效诊断和治疗疾病上。

详细地参考下述实施例，描述本发明，这些实施例不打算限制本发明的范围。

在下述实施例中，具有核/壳结构的疏水纳米颗粒CdSe/CdS-ODA用作量子点用起始材料，它具有在其表面上配位的十八烷基胺(ODA)表面活性剂。根据JJ Li等人，Journal of the American Chemical Society 125：12567-12575(2003)和WW Yu等人，Chemistry of Materials 15：2854-2860(2003)所述的方法，在CdSe核纳米颗粒表面上各自按序生长Cd、S、Cd、S和Cd，其中各自为0.5层(总计2.5层)。

此外，在下述实施例中，疏水氧化铁纳米颗粒Fe₂O₃-OA用作磁性纳米颗粒用起始材料，它具有在其表面上配位的油酸(OA)表面活性剂。根据K.Woo，等人，Chemistry of Materials 16：2814-2818(2004)和K.Woo等人，IEEE Transactionson magnetics 41，4137-4139(2005)所述的方法，在惰性氛围内合成Fe₂O₃或Fe₃O₄纳米颗粒并与10mol％前体Fe(CO)₅混合，从而制备在其表面处含有化学计量地过量的铁成分的磁性纳米颗粒。然而，对于本领域的技术人员来说，显而易见的是，与制备方法无关，若疏水纳米颗粒在其表面处的金属成分比化学计量的丰富，则可没有区分地在实施例1-11中使用它们。

此外，在下述实施例中的术语(-DA)ex和(-OA)ex是代表在纳米颗粒表面处过量癸胺或油酸的符号。尽管它们当中的一些配体被具有硫醇基的其他配体替代，但由于其下降效果不显著，和仍然存在过量的DA或OA，因此，它们被没有区分地描述为(-DA)ex或(-OA)ex。

实施例1：通过表面配体交换，制备半导体纳米颗粒CdSe/CdS-DA

真空蒸发5ml CdSe/CdS-ODA疏水量子点溶液(8×10^-5M)，以除去溶剂，并分散在20ml氯仿内。向这一分散体中添加1000当量癸胺(DA)，并在黑暗的惰性氛围内搅拌该混合物2天。混合所得溶液与丙酮，并离心，分离沉淀。如此制备的沉淀分散在氯仿内，制备20ml CdSe/CdS-DA溶液(2×10^-5M)。用红外分光计和透射电子显微镜(TEM)分析CdSe/CdS-DA样品，其中分别在图3(b)和图4(b)中示出了结果。通过在TEM图像内，CdSe/CdS-DA量子点比CdSe/CdS-ODA之间的距离短，来证实发生了表面配体的交换。

实施例2：制备部分表面改性的半导体纳米颗粒CdSe/CdS(-DA)ex(-MUA)

向17ml实施例1制备的CdSe/CdS-DA溶液中添加5当量巯基十一烷酸(MUA)，并在黑暗的惰性氛围内搅拌19小时。浓缩所得溶液，并与丙酮混合，和离心分离沉淀。如此制备的沉淀分散在氯仿内，制备17ml CdSe/CdS(-DA)ex(-MUA)5溶液(2×10^-5M)。用红外分光计和透射电子显微镜(TEM)分析所得样品，其中分别在图3(c)和图4(c)中示出了结果。TEM图像证实，不再发生纳米颗粒的自组装，这归因于部分替代MUA引起的其均匀结构的破坏，正如图2的步骤C所示。

实施例3：制备靶向疏水的半导体纳米颗粒CdSe/CdS(-DA)ex(-MUA-en-FA)5

用氯仿稀释2ml实施例2制备的CdSe/CdS(-DA)ex(-MUA)5溶液到10ml的最终体积。在添加5当量的二环己基碳二亚胺(DCC)到该稀释剂中并在黑暗的惰性氛围内搅拌3小时之后，向其中添加50当量如下所述制备的en-FA并进一步搅拌2小时。浓缩所得溶液，并与丙酮混合，和离心分离沉淀。将如此制备的沉淀分散在氯仿内，制备10ml CdSe/CdS(-DA)ex(-MUA-en-FA)5溶液(4×10^-6M)。用红外分光计和TEM分析en-FA键合到MUA上，其中分别在图3(d)和图4(d)中示出了结果。

制备靶向分子叶酸(FA)和乙二胺(en)的络合物en-FA

将441mg(1mmol)叶酸加入到10ml干馏的甲苯中，搅拌1小时，然后进行真空蒸发，除去甲苯和湿气。在将所得残渣溶解在二甲基甲酰胺(DMF)内之后，将含该混合物的烧瓶浸泡在冰浴中并搅拌10分钟。将226mg(1.1mmol)DCC加入到该混合物中，并进一步搅拌18小时。将2.5ml乙二胺(en)溶解在20ml DMF内，向其中添加所述混合物，然后搅拌3小时，向所得溶液中添加水和乙腈，形成沉淀，并用相同的溶剂重结晶，从而获得224mg en-FA。

实施例4：制备生物相容和水溶性半导体纳米颗粒CdSe/CdS(-MPA)ex(-MUA-aPEGa)5

用氯仿稀释0.5ml实施例2制备的CdSe/CdS(-DA)ex(-MUA)5溶液到最终2.5ml的体积。在将6当量的DCC加入到稀释剂中并在黑暗的惰性氛围内搅拌3小时之后，向其中添加7当量的O，O’-双(2-氨乙基)聚乙二醇(aPEGa，MW1,000)并进一步搅拌16小时。浓缩所得溶液，与丙酮混合，并离心，分离沉淀。将如此制备的沉淀分散在氯仿内，制备10ml CdSe/CdS(-DA)ex(-MUA-aPEGa)5溶液(1×10^-6M)。

随后，向如此制备的CdSe/CdS(-DA)ex(-MUA-aPEGa)5溶液中添加100当量，其中0.05M NaOH和0.05M巯基丙酸(MPA)在其内溶解的甲醇溶液并搅拌。在将蒸馏水加入到所得溶液中，提取产物之后，向其中添加甲醇/乙酸乙酯(1/4)的混合溶剂，并离心，以沉淀形式分离产物。将如此制备的沉淀分散在PBS缓冲液(pH7.4)内，制备10ml、1×10^-6M的CdSe/CdS(-MPA)ex(-MUA-aPEGa)5溶液。通过红外分光计和TEM证实了aPEGa有利地键合到MUA上且用MPA成功地取代可DA，其中图3(e)和图4(e)分别示出了结果。

实施例5：制备靶向、生物相容和水溶性半导体纳米颗粒CdSe/CdS(-MPA)ex(-MUA-aPEGa-FA)5和利用它的生物成像

用氯仿稀释2ml实施例2制备的CdSe/CdS(-DA)ex(-MUA)5溶液到最终10ml的体积。在将6当量的DCC加入到稀释剂中并在黑暗的惰性氛围内搅拌3小时之后，向其中添加15当量如下所述制备的aPEGa-FA并进一步搅拌16小时。浓缩所得溶液，与丙酮和甲醇混合，并离心，分离沉淀。将如此制备的沉淀分散在氯仿中，制备4ml CdSe/CdS(-DA)ex(-MUA-aPEGa-FA)5溶液(1×10^-5M)。

随后，将100当量通过溶解0.05M NaOH和0.05M MPA制备的甲醇溶液加入到CdSe/CdS(-DA)ex(-MUA-aPEGa-FA)5溶液中并搅拌。在将蒸馏水加入到所得溶液中提取产物之后，向其中添加甲醇/乙酸乙烯酯(1/4)的混合溶剂，并离心，以沉淀形式分离产物。将如此制备的沉淀分散在PBS缓冲液(pH7.4)内，制备10ml、4×10^-6M的CdSe/CdS(-MPA)ex(-MUA-aPEGa-FA)5溶液。通过红外分光计和TEM证实了aPEGa-FA有利地键合到MUA上且用MPA成功地取代DA，其中分别在图3(f)和图4(f)中示出了结果。

为了检验以上制备的FA-键合的量子点CdSe/CdS(-MPA)ex(-MUA-aPEGa-FA)5是否对某些细胞系显示出选择性，分别在存在或不存在FA(9×10-6M)的情况下，在含FA-键合的量子点CdSe/CdS(-MPA)ex(-MUA-aPEGa-FA)5(2×10^-7M)或不含FA的量子点CdSe/CdS(-MPA)ex(-MUA-aPEGa)5(2×10^-7M)的PBS溶液内，培养具有叶酸受体的KB细胞(人纤维肉瘤细胞，ATCC，Manassas，VA)和不具有叶酸受体的HT1080细胞(人皮样肉瘤癌细胞，ATCC，Manassas，VA)，并在37℃下保温15小时。在完成培养之后，用PBS溶液洗涤细胞三次，并固定在载玻片的表面上。采用荧光显微镜观察细胞，其中图5示出了结果。

如图5所示，当在培养溶液内不存在游离FA时，与没有显示出靶向性的量子点CdSe/CdS(-MPA)ex(-MUA-aPEGa)5相比，显示出靶向性的量子点CdSe/CdS(-MPA)ex(-MUA-aPEGa-FA)5被较大量地选择性转移到具有FA受体的KB细胞内。另一方面，当在培养溶液内存在丰富的游离FA时，在KB细胞和HT1080细胞之间不存在选择性，这是因为大多数游离FA键合到相应的受体上。

通过键合生物相容分子aPEGa和靶向分子FA，制备aPEGa-FA

将441mg(1mmol)FA加入到10ml干馏甲苯中，搅拌1小时，然后进行真空蒸发，除去甲苯和湿气。在将所得残渣溶解在14ml DMF内之后，将含该混合物的烧瓶浸泡在冰浴内并搅拌10分钟。在将226mg(1.1mmol)DCC加入到该混合物中并搅拌18小时之后，向其中添加1mmol aPEGa并进一步搅拌3小时。将二乙醚加入到所得溶液中，形成沉淀，并用相同的溶剂重结晶，获得179mgaPEGa-FA。

实施例6：制备半导体纳米颗粒CdSe/CdS(-DA)ex(-MUA-aPEGa)n(n＝5、10或30)

用氯仿稀释0.5ml实施例1制备的CdSe/CdS-DA溶液，制备最终体积为10ml的三种稀释剂。向每一稀释剂中分别添加5、10和30当量MUA，并在黑暗的惰性氛围内搅拌19小时。浓缩每一溶液，与甲醇混合，形成沉淀，然后离心，分离它。将如此制备的沉淀溶解在氯仿中，制备2.5ml每一CdSe/CdS(-DA)ex(-MUA)n(n＝5、10或30)溶液(4×10^-6M)。

向以上制备的每一CdSe/CdS(-DA)ex(-MUA)n(n＝5、10或30)溶液中分别添加5.5、11和33当量的DCC，并在黑暗的惰性氛围内搅拌3小时。随后，向每一溶液中添加6、12和36当量的aPEGa并进一步搅拌16小时。浓缩每一溶液，与甲醇混合，形成沉淀，并离心，分离它。将如此制备的沉淀分散在氯仿内，制备10ml每一CdSe/CdS(-DA)ex(-MUA-aPEGa)n(n＝5、10或30)溶液(1×10^-6M)。通过红外光谱(图6)证实在所有这三种情况下，aPEGa成功地键合到MUA上。

此外，在图7的TEM图像中发现，尽管在CdSe/CdS(-DA)ex(-MUA-aPEG)5情况下，纳米颗粒内部的氢键键合吸引不明显，但在CdSe/CdS(-DA)ex(-MUA-aPEG)10情况下，这种作用足够强，以致于诱导纳米颗粒聚集。在上式中，当n为5和10时，纳米颗粒充分地分散在氯仿内，但当n为30时，纳米颗粒形成不溶于任何溶剂内的聚集体，这是因为纳米颗粒内部的氢键吸引太强，结果不可能产生聚集的纳米颗粒的TEM图像。根据这些结果，证实当在纳米颗粒的表面处具有均匀结构的亲水基团的数量增加时，纳米颗粒内部的氢键吸引可能不可控地增加。

还发现，在弃置的上清液内不存在可检测的荧光，这表明产率为100％，所述上清液通过在实施例1-6中的反应之后添加不溶性溶剂到量子点溶液内并离心所得溶液而获得。

实施例7：制备部分表面改性的磁性纳米颗粒SPION(-OA)ex(-MHA)10

用乙醇洗涤2ml粒度为8纳米的疏水SPION-OA(用油酸保护的超级顺磁氧化铁纳米颗粒)的磁性纳米颗粒溶液2次，在20ml甲苯内分散，然后加热到100℃。向该混合物中添加10当量巯基十六烷酸(MHA)，回流1小时并冷却。在浓缩2ml所得溶液之后，向其中添加小量乙醇，然后通过使用磁力分离部分表面改性的磁性纳米颗粒SPION(-OA)ex(-MHA)10。用红外分光计和TEM分析所分离的部分表面改性的磁性纳米颗粒，其中分别在图8(b)和图9(b)中示出了结果。在TEM图像中，SPION(-OA)ex(-MHA)10纳米颗粒之间的距离类似于SPION-OA的原因是如图2的步骤C所述，用比OA短2个碳链的MHA零星取代部分OA。此外，红外光谱证实在约3300cm^-1处的O-H峰因取代MHA而增加。

实施例8：制备靶向、生物相容和疏水的磁性纳米颗粒SPION(-OA)ex(-MHA-aPEGa-MTX)10

向18ml实施例7中制备的SPION(-OA)ex(-MHA)10溶液(3×10^-7M)中添加30当量DCC并搅拌3小时。在将30当量aPEGa-MTX溶解在小量如下所述制备的DMF内之后，将所得溶液加入到所述混合物中并搅拌16小时。在浓缩所得溶液并与乙醇混合之后，通过使用磁力分离SPION(-OA)ex(-MHA-aPEGa-MTX)10并分散在9ml氯仿内。用红外分光计和TEM分析1ml分散体，其中分别在图8(c)和图9(c)中示出了结果。在TEM图像中发现，磁性纳米颗粒打破因自组装导致的六面体排列，并零星地散射，从而证明引入了归因于aPEGa-MTX的不规则结构。此外，在红外光谱中还证实，分别在约1100和1630cm^-1处检测到PEG和MTX的特征峰。

通过键合生物相容分子aPEGa到靶向分子MTX上，制备aPEGa-MTX

在将454mg(1mmol)MTX(甲氨喋呤，美国参考标准)溶解在14ml干馏DMF内之后，将含该混合物的烧瓶浸泡在冰浴中并搅拌10分钟。将226mg(1.1mmol)DCC加入到烧瓶中并搅拌18小时。向其中添加1mmol aPEGa并进一步搅拌3小时。向所得溶液中添加二乙醚，形成沉淀，并用相同的溶剂重结晶，从而获得138mgaPEGa-MTX。

实施例9：制备靶向、生物相容和水溶性磁性纳米颗粒SPION(-MPA)ex(-MUA-aPEGa-MTX)10

向8ml实施例8制备的SPION(-OA)ex(-MHA-aPEGa-MTX)10溶液(6×10^-7M)中添加150当量通过溶解0.05M MPA和0.05M NaOH而制备的甲醇溶液并搅拌2小时。将甲醇加入到所得溶液中并离心，获得固体SPION(-MPA)ex(-MUA-aPEGa-MTX)10。将SPION(-MPA)ex(-MUA-aPEGa-MTX)10分散在16ml PBS缓冲液(pH7.4)内。用红外光谱和TEM分析1ml的分散体，其中图8(d)和图9(d)分别示出了结果。红外光谱发现，C-H峰的强度显著下降，这是因为当用MPA替代OA时，碳链长度下降。此外，TEM图像证实，尽管当制备样品时，因使用水溶液引起的表面张力导致的叠加效应，但明显地观察到颗粒间的距离。

实施例10：制备靶向、生物相容和水溶性磁性纳米颗粒SPION(-Lys)ex(-MUA-aPEGa-MTX)10

向6ml实施例7和8中制备的SPION(-OA)ex(-MHA-aPEGa-MTX)10溶液(6×10^-7M)中添加1000当量四辛基溴化铵(TOAB)并搅拌16小时。将6ml、0.1M的赖氨酸(Lys)水溶液加入到该混合物中并搅拌19小时。混合所得溶液与甲醇，并通过使用磁力分离SPION(-Lys)ex(-MUA-aPEGa-MTX)10纳米颗粒。用5ml甲苯和5ml乙醇洗涤分离的纳米颗粒，并分散在PBS缓冲液(pH7.4)内。用红外光谱和TEM分析1ml分散体，其中图8(e)和图9(e)分别示出了结果。红外光谱发现，C-H峰的强度显著下降，这是因为用赖氨酸替代了OA。此外，TEM图像证实，尽管当制备样品时，因使用水溶液引起的表面张力导致的叠加效应，但明显地观察到颗粒间的距离。

实施例11：制备靶向、生物相容和疏水的磁性纳米颗粒SPION(-OA)ex(-MHA-en-FA)5和利用它的生物成像

用乙醇洗涤2ml粒度为11纳米的疏水SPION-OA磁性纳米颗粒溶液(3×10^-6M)2次，在20ml甲苯内分散，然后加热到100℃。将5当量巯基十六烷酸(MHA)加入到该混合物中，回流1小时并冷却。向所得溶液中添加15当量DCC，并在黑暗的惰性氛围内搅拌3小时。向其中添加16当量通过在小量DMF内溶解而制备的实施例13制备的en-FA并搅拌16小时。在浓缩所得溶液之后，向其中添加小量乙醇，并通过使用磁力分离SPION(-OA)ex(-MHA-en-FA)5纳米颗粒。将分离的纳米颗粒分散在10ml氯仿内。在图8(f)中示出了这些纳米颗粒的红外光谱，证明在约1630cm^-1处检测到FA的特征峰。

在稀释以上制备的SPION(-OA)ex(-MHA-en-FA)5溶液到1×10^-7M的最终浓度时，在培养皿内均匀地喷洒1ml稀释剂，并自然干燥。第二天，用70％乙醇和UV给培养皿灭菌，培养2×105个细胞的人上皮癌细胞系KB细胞(ATCCManassas，VA)，然后在37℃的恒温箱中培养细胞16小时。收集培养的细胞并进一步在未处理的培养皿内培养4小时。为了比较纳米颗粒的靶向行为，如上所述进行相同的实验，所不同的是将10μg/ml FA加入到培养溶液中。用磁共振成像(MRI)分析每一种如此处理的细胞，其中在图10中示出了结果。定量分析MR图像的结果是，证实在细胞表面上共存的过量游离FA占据受体，从而导致靶向的磁性纳米颗粒SPION(-OA)ex(-MHA-en-FA)5的靶向性下降10％。这些结果暗含疏水磁性纳米颗粒通过键合的FA显示出显著有意义的靶向性。

尽管相对于本发明的优选实施方案描述和阐述了本发明，但对于本领域的技术人员来说，显而易见的是，可在没有脱离本发明的宽泛的原理和教导的情况下，各种变化和改性是可能的，本发明应当仅仅通过所附的权利要求的范围来限制。