一种双精氨酸途径蛋白质分泌载体的构建方法及其应用

摘要

本发明涉及一种双精氨酸途径蛋白质分泌载体的构建方法及其应用。本发明采用来源于枯草芽孢杆菌的Tat途径信号肽构建了可分泌表达细胞内已折叠蛋白质或非分泌蛋白质的载体pMKSig和pMASig，并以来源于嗜热脂肪芽孢杆菌的耐热－半乳糖苷酶作为一个目标蛋白质实例来尝试所构建分泌载体的可使用性。对使用这两个载体实现的耐热－半乳糖苷酶在枯草芽孢杆菌中的分泌进行了细胞内外酶活力的对比检测，并通过变性聚丙烯酰胺蛋白质电泳显示出分泌表达的蛋白质条带。本发明有效解决了细胞内已折叠(不可分泌)蛋白质在枯草芽孢杆菌中的分泌，该技术可以推广到其它不可分泌蛋白质的分泌表达中，因而具有良好的应用前景。

说明书

【技术领域】

本发明涉及微生物分子生物学和基因工程技术领域，涉及微生物蛋白质分泌表达。

【背景技术】

生物体在合成某些蛋白质之后，可以通过特定的机制将这些蛋白质输出到体外，这一输出过程称为分泌。对于工业级别以提高外源蛋白质产量为目标的重组表达，常采用分泌方式将目标蛋白质输出到细胞外，可以极大地简化下游的蛋白质分离纯化工艺，节约操作成本，因此蛋白质分泌一直是生物技术研究的一个热点(Tjalsma H，Bolhuis A，Jongbloed JD，et al.Signal peptide-dependent protein transport in Bacillus subtilis：a genome-basedsurvey of the secretome.Microbiology Molecular Biology Reviews，2000，64：515-547.)。蛋白质分泌过程一般需利用蛋白质前体N-端的信号肽，操作方法是将目标蛋白质的编码基因克隆到合适的信号肽编码序列之后，在宿主菌中实现目标基因和信号肽序列在转录和翻译水平的融合，依靠蛋白质前体N-端信号肽引导整个多肽链与胞内分子伴侣或分泌信号识别颗粒的结合、膜定位和分泌输出。在工业级外源蛋白质分泌表达中使用最多的信号肽是一般分泌途径(即Sec分泌途径)信号肽，例如大肠杆菌(Escherichia coli；简写为E.coli)中的外膜A蛋白(OmpA)信号肽和果胶酸酯裂解酶(PelB)信号肽，以及枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis；简写为B.subtilis)中的淀粉酶(AmyQ)信号肽和中性蛋白酶(NprB)信号肽等。

但枯草芽孢杆菌的Sec分泌途径只是比较适合于某些革兰氏阳性细菌来源的蛋白质分泌，对于其它许多外源蛋白质，尤其是革兰氏阴性细菌来源蛋白质的分泌效率不高，甚至根本无法分泌。研究发现，枯草芽孢杆菌的蛋白质分泌途径中存在着若干瓶颈会导致分泌效率低下。一个已知的瓶颈是目标蛋白质与转运酶(Translocase)之间的不兼容性。例如，在细胞内已经折叠成正确构象的蛋白质通常都不能够通过Sec途径分泌输出(vanDijl JM，Braun PG，Robinson C，et al.Functional genomic analysis of theBacillus subtilis Tat pathway for protein secretion.Journal of Biotechnology，2002，98：243-254.)。如此，这一工业界主要采用的分泌途径在进行细胞内蛋白质(Cytoplasmic Protein)分泌时，显得一筹莫展。

然而许多工业用蛋白质(酶)是定位于细胞内的，例如食品工业常用的细菌型乳糖酶、胆固醇氧化酶、酒化酶等，工业生产中需要将它们从细胞内提取出来以便催化底物反应。这些在细菌细胞内已折叠的酶不适合于像淀粉酶、蛋白酶一样采用Sec途径进行大规模重组分泌表达生产。这在一定程度上提高了这些酶的生产成本。双精氨酸分泌途径(即Tat分泌途径)是枯草芽孢杆菌中的第二大蛋白质分泌途径，具有潜在应用价值。与Sec分泌途径相比，Tat分泌途径具有如下特点(Tjalsma H，Antelmann H，Jongbloed JDH，et al.Proteomics of Protein Secretion by Bacillus subtilis：Separating the″Secrets″of the Secretome.Microbiology and MolecularBiology Reviews，2004，68(2)：207-233.)：

1)可分泌输出已在细胞内折叠和加工成为正确构象(可含有辅基)的蛋白质。

2)经由该途径分泌的蛋白质，其前体信号肽一般为36个氨基酸残基左右，信号肽N-域含有双精氨酸(RR/KR)特征二级结构。

3)Sec途径蛋白质分泌依赖于ATP水解驱动力，Tat途径蛋白质分泌依赖于质子驱动力而不依赖于ATP。

由于Tat途径可以分泌在细胞内已折叠的蛋白质，因此具有潜在应用价值，工业上有可能利用该途径实现外源的、细胞内已折叠(非分泌类型)蛋白质在枯草芽孢杆菌中的分泌生产。

【发明内容】

[要解决的技术问题]

本发明的目的是构建一种适合于在枯草芽孢杆菌中分泌表达细胞内已折叠蛋白质的通用质粒载体，并提供该载体的具体应用方法。因而本发明要解决的技术问题就是：构建该类载体所需的材料和方法，以及采用该类载体在枯草芽孢杆菌中分泌表达目标蛋白质实例(来源于嗜热脂肪芽孢杆菌的耐热-半乳糖苷酶，MW约为66.2kDa)的具体方法。该目标蛋白质在嗜热脂肪芽孢杆菌中为细胞内的、非分泌的酶。

[技术方案]

本发明采用来源于枯草芽孢杆菌的Tat途径信号肽来构建一种适合于细胞内已折叠(非分泌类型)蛋白质分泌的载体，并应用该载体分泌表达来源于嗜热脂肪芽孢杆菌的耐热-半乳糖苷酶。

本发明所构建的分泌表达载体是适用于枯草芽孢杆菌宿主的，且以Tat途径信号肽作为已折叠蛋白质的分泌输出信号。本发明采用的宿主菌为枯草芽孢杆菌168株(Bacillus subtilis 168)，以大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭载体pMK4和pMA5作为载体构建的基本骨架，以枯草芽孢杆菌来源的、采用Tat途径进行分泌的磷酸二酯酶(PhoD，其对应的编码基因为phoD)的信号肽作为分泌载体构建的信号肽序列来源。枯草芽孢杆菌磷酸二酯酶(PhoD)严格按照Tat分泌途径分泌输出，该信号肽含有54个氨基酸残基(包括信号肽切割位点后面的三个氨基酸残基)，本发明首先采用该酶(PhoD)的分泌表达元件(其天然启动子和信号肽序列)构建了Tat型分泌表达载体pMKSig。

基因phoD的启动子P_PhoD受到枯草芽孢杆菌PhoP/R双组分调控系统的调控，其启动mRNA合成的功能以及枯草芽孢杆菌Tat途径分泌必须的转运酶单元TatAd/Cd的表达都需要通过低磷酸盐培养基诱导，而在含较高磷酸盐的培养基中这两个功能受到完全抑制，因此本发明设计了适合该启动子的低磷酸盐培养基以便尝试目标蛋白质耐热-半乳糖苷酶的分泌表达。

因低磷酸盐培养基营养贫瘠，不利于重组菌株培养密度的提高，因此采用该培养基实现的蛋白质分泌量可能会比较低。为了克服这一缺陷，本发明构建了可以在丰富培养基中实现蛋白质分泌表达的Tat型分泌表达载体pMASig，该载体使用了质粒pMA5中的组成型启动子P_HpaII，且该载体包含了枯草芽孢杆菌Tat分泌转运酶单元TatAd/Cd的编码序列tatAd/Cd以便在丰富培养基中实现分泌转运酶单元TatAd/Cd的正常表达。

将嗜热脂肪芽孢杆菌耐热-半乳糖苷酶的编码基因bgaB分别克隆到分泌载体pMKSig和pMASig中，分别得到重组载体pMKSigbgaB03和pMASigbgaB05，前者转化宿主菌168株后得到的重组菌株命名为168(pMKSigbgaB03)，其在低磷酸盐培养基中进行耐热-半乳糖苷酶的分泌表达；后者转化宿主菌168株后得到的重组菌株命名为168(pMASigbgaB05)，其在丰富培养基Luria-Bertani(简称LB)中进行耐热-半乳糖苷酶的分泌表达。

上述两种表达体系的表达结果通过检测细胞外分泌的耐热-半乳糖苷酶的酶活力和/或变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)来显示和分析。

[具体实施方式]

1)Tat分泌途径信号肽编码基因的克隆：首先以枯草芽孢杆菌168株(即Bacillus subtilis 168株，由美国的Bacillus Genetic Stock Center惠赠)染色体为模板，采用引物P1和P2进行PCR扩增基因phoD的启动子P_PhoD序列以及紧接该启动子下游的信号肽编码序列(本案中称为SPC_PhoD)，并克隆到通用亚克隆载体pUC18上得到重组载体pUC18-phoDsig；对该载体中克隆的BamHI-EcoRI片段(即P_PhoD-SPC_PhoD单元片段)进行DNA序列测定以验证其正确性。

2)分泌载体pMKSig和pMASig的构建：将载体pUC18-phoDsig用限制酶BamHI和EcoRI进行降解，回收BamHI-EcoRI片段并克隆到枯草芽孢杆菌载体pMK4中得到重组分泌表达载体pMKSig，并对载体pMKSig进行DNA序列测定以验证克隆入的BamHI-EcoRI片段的正确性。

以pUC18-phoDsig载体DNA作为模板，采用引物P4和P5进行PCR反应扩增SPC_PhoD片段，并将该片段克隆入大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭载体pMA5中，得到重组载体pMA5-Sig；再以枯草芽孢杆菌168株的染色体DNA为模板，采用引物P6和P7扩增出tatAd/Cd基因单元，克隆入新构建的重组载体pMA5-Sig中，得到分泌表达载体pMASig，并对载体pMASig进行DNA序列测定以验证克隆入的P_PhoD-SPC_PhoD片段的正确性。

3)用于分泌耐热-半乳糖苷酶的重组载体pMKSigbgaB03和pMASigbgaB05的构建：以嗜热脂肪芽孢杆菌IAM11001的染色体DNA为模板，采用引物P9和P10进行PCR反应扩增耐热-半乳糖苷酶的编码基因bgaB，将该基因片段进行DNA序列测定以验证其正确性，然后克隆到载体pMKSig中，得到的重组载体命名为pMKSigbgaB03。

同样以嗜热脂肪芽孢杆菌IAM11001的染色体DNA为模板，采用引物P11和P12进行PCR反应扩增耐热-半乳糖苷酶的编码基因bgaB，将该基因片段进行DNA序列测定以验证其正确性，然后克隆到载体pMASig中，得到的重组载体命名为pMASigbgaB05。

4)分泌表达菌株的构建

将载体pMKSigbgaB03转化到枯草芽孢杆菌168株中，在含5μg/ml氯霉素的LB平板培养基上筛选得到含载体pMKSigbgaB03的枯草芽孢杆菌重组菌株，命名为168(pMKSigbgaB03)。

将载体pMASigbgaB05转化到枯草芽孢杆菌168株中，在含50μg/ml卡那霉素的LB平板上筛选得到含载体pMASigbgaB05的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)重组菌株，命名为Bacillus subtilis 168(pMASigbgaB05)，该重组菌株已于2008年10月21日送交北京市大屯中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号：CGMCCNo.2720。

5)双精氨酸途径蛋白质分泌载体的应用

将枯草芽孢杆菌CGMCC No.2720于LB液体培养基中过夜培养作为种子液，按1％比例接种到含50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基中，于37℃200r/min培养，经过18～20h培养，耐热-半乳糖苷酶总酶活力达到2.30U/ml及以上时结束培养。

6)耐热-半乳糖苷酶的酶活力检测方法

酶活力定义：以邻-硝基苯--D-半乳糖吡喃糖苷(ONPG)为底物，在55℃、pH 6.5条件下，每分钟水解产生1mol的邻硝基苯(ONP)所需的酶量定义为一个酶活力单位(U)。

酶活力测定的具体操作流程按照《酶的测定方法》(B.施特尔马赫著，钱嘉渊译，中国轻工业出版社，1992，P195-202)进行。

表1本发明实验所使用的PCR引物

注：表中下划线部分所示为限制性酶切位点。

【本发明的有益效果】

与目前国内外已报道的枯草芽孢杆菌分泌载体和分泌策略相比，本发明具有如下优点：目前国内外报道的在枯草芽孢杆菌中实现外源蛋白质分泌的载体和策略主要基于Sec途径，而本发明提供的载体、材料和方法基于Tat途径。该途径的优点是可以分泌输出已在细胞内折叠并加工成为正确构象(可含有辅基)的蛋白质，而Sec途径不具有这项特殊功能。本发明中构建的分泌表达载体可用于细胞内非分泌蛋白质耐热-半乳糖苷酶的重组分泌表达，其它细胞内(非分泌类型)蛋白质也有可能采用本发明所构建的载体实现分泌。

【附图说明】

图1枯草芽孢杆菌168的PhoD信号肽结构

黑底色白色字体部分为信号肽的N-域，该区域中的RR二级结构以粗体加下划线表示；灰底色白色字体部分为信号肽的H-域；加下划线的VGA三个氨基酸残基为C-域，即相对于切割位点的-3至-1号残基；加下划线的FEV三个氨基酸残基部分为相对于切割位点的+1至+3号残基；向下箭头指示为信号肽切割位点。该氨基酸序列末尾的残基N(天门冬酰氨)和A(丙氨酸)是PhoD成熟肽第一个残基(即丙氨酸，图中略)之前的两个残基。

()内为用三字母表示的信号肽结构。

图2重组载体pMKSigbgaB03和pMASigbgaB05的图谱

P_PhoD：枯草芽孢杆菌蛋白质PhoD编码基因phoD上游的启动子；SPC_PhoD：PhoD的信号肽编码序列；bgaB：耐热-半乳糖苷酶的编码基因；cat：氯霉素乙酰转移酶编码基因；bla：-内酰胺酶基因；P_HpaII枯草芽孢杆菌组成型启动子；rep：质粒复制酶编码基因；tatAd/Cd：Tat途径转运酶TatAd/Cd的编码基因单元。

图3低磷酸盐培养基和高磷酸盐培养基中不同时间枯草芽孢杆菌168(pMKSigbgaB03)发酵上清液中的耐热-半乳糖苷酶活力

图4枯草芽孢杆菌CGMCC No.2720的生长量、酶活力与发酵时间的关系曲线

按1％比例从种子液接种到100ml LB液体三角瓶中，于37℃200rpm培养，在不同时间取样测定培养液在600nm处的光密度OD₆₀₀和耐热-半乳糖苷酶的细胞外和细胞内酶活力，每个样品测定三次取平均值加标准偏差。■枯草芽孢杆菌CGMCC No.2720的生长曲线；□耐热-半乳糖苷酶的细胞内酶活力；○耐热-半乳糖苷酶的细胞外酶活力。

图5枯草芽孢杆菌CGMCC No.2720发酵过程中细胞外耐热-半乳糖苷酶活力占耐热-半乳糖苷酶总酶活力的比例

E_O：耐热-半乳糖苷酶细胞外酶活力；E_T：耐热-半乳糖苷酶总酶活力。

图6枯草芽孢杆菌168(pMAbgaB)的生长和酶活力曲线

按1％比例从种子液接种到100ml LB液体三角瓶中，于37℃200rpm培养，在不同时间取样测定OD₆₀₀和耐热-半乳糖苷酶的胞外和胞内酶活力，每个样测定三次取平均值加标准偏差。■枯草芽孢杆菌168(pMAbgaB)的生长曲线；□耐热-半乳糖苷酶胞内酶活力；○耐热-半乳糖苷酶胞外酶活力。

图7枯草芽孢杆菌CGMCC No.2720和枯草芽孢杆菌168(pMAbgaB)发酵液的SDS-PAGE电泳图

聚丙烯酰胺胶浓度为10％，蛋白质分子量标准上样量为10l。泳道1，2，4和5上样量为6l。泳道1：枯草芽孢杆菌CGMCC No.2720的无细胞提取液，箭头所指为含信号肽的耐热-半乳糖苷酶前体；泳道2：枯草芽孢杆菌CGMCC No.2720发酵上清液，箭头所指为耐热-半乳糖苷酶成熟蛋白；泳道3：MBI蛋白质分子量标准(图中从上至下依次为116.0KDa，66.2KDa，45.0KDa，35.0KDa，25.0KDa，18.4KDa，14.4KDa)；泳道4：枯草芽孢杆菌168(pMAbgaB)发酵上清液(阴性对照)；泳道5：枯草芽孢杆菌168(pMAbgaB)的无细胞提取液，箭头所指为耐热-半乳糖苷酶成熟蛋白。

以下结合实施例详细地描述本发明。

实施例1

1.Tat分泌途径信号肽编码序列的克隆

本发明采用的Tat途径信号肽编码序列来自于枯草芽孢杆菌内源的、经由Tat途径分泌的蛋白质PhoD的信号肽编码序列，其编码的信号肽长度为54个氨基酸残基(包括信号肽切割位点后面的三个氨基酸残基)，其二级结构如图1所示。

首先以枯草芽孢杆菌168染色体为模板，采用引物P1和P2(表1)进行聚合酶链式反应(PCR)扩增基因phoD的启动子P_PhoD序列以及紧接该启动子下游的信号肽编码序列(本发明中称为SPC_PhoD，下同)，该启动子与该信号肽编码序列组成的单元在本发明中表示为P_PhoD-SPC_PhoD，其序列参见(Ogawa K，Akagawa E，Nakamura K and Yamane K.Determination of a21548 bp nucleotide sequence around the 24degrees region of the Bacillussubtilis chromosome.Microbiology，1995，141(2)：269-275.)。引物P1的5’-端引入限制性内切酶位点(以下简称酶切位点)BamHI，引物P2的5’-端引入酶切位点EcoRI。PCR扩增出的该片段在1％琼脂糖凝胶电泳上显示的长度约为500碱基对(碱基对简写为bp，下同)，将该片段回收并克隆到亚克隆载体pUC18(宝生物工程(大连)有限公司)上得到重组载体pUC18-phoDsig。用M13Forward引物(宝生物工程(大连)有限公司，见表1，)对该重组载体pUC18-phoDsig中克隆的BamHI-EcoRI片段(P_PhoD-SPC_PhoD单元片段)进行DNA序列测定以验证其正确性。

2.分泌载体pMKSig和pMASig的构建

将重组载体pUC18-phoDsig用限制酶BamHI和EcoRI进行降解，回收BamHI-EcoRI片段并克隆到枯草芽孢杆菌载体pMK4(Sullivan MA，Yasbin，RE，Young FE.New shuttle vectors for Bacillus subtilis and Escherichia coliwhich allow rapid detection of inserted fragments.Gene，1984，29：21-26.)中得到重组分泌表达载体pMKSig，采用引物P3(见表1)对载体pMKSig进行测序验证克隆入片段的正确性。

以重组载体pUC18-phoDsig作为模板，采用引物P4和P5(见表1)进行PCR反应扩增SPC_PhoD单元片段，在该片段的5’-端引入NdeI酶切位点，3’-端引入BamHI位点。将该片段采用限制性内切酶NdeI和BamHI消化后，经由NdeI和BamHI位点克隆入大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭载体pMA5(Zyprian E，Matzura H.Characterization of signals promoting geneexpression on the Staphylococcus aureus plasmid pUB110 and development ofa Gram-positive expression system.DNA，1986，5：219-225.)中，得到重组载体pMA5-Sig。以枯草芽孢杆菌168株的染色体DNA为模板，采用引物P6和P7(见表1)扩增出约1000bp的tatAd/Cd基因单元，在该片段的5’-端引入BamHI位点，3’-端引入BglII位点。将该片段克隆入新构建的重组载体pMA5-Sig中，得到重组载体pMASig。采用引物P8(见表1)对克隆入的P_PhoD-SPC_PhoD片段测序以验证其正确性。

3.用于分泌耐热-半乳糖苷酶的重组载体pMKSigbgaB03和pMASigbgaB05的构建

以嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)IAM11001(HirataH，Negoro S，Okada H.Molecular basis of isozyme formation ofβ-galactosidases in Bacillus stearothermophilus：isolation of twoβ-galactosidase genes，bgaA and bgaB.Journal of Bacteriology，1984，160：9-14.)的染色体DNA为模板，采用引物P9和P10(见表1)进行PCR反应扩增耐热-半乳糖苷酶的编码基因bgaB，在该基因片段的5’-端引入EcoRI位点(bgaB基因的起始密码子ATG紧接该位点序列)，3’-端引入NdeI位点(该位点序列紧接着bgaB基因的终止密码子TAG)。将该2000bp左右片段经琼脂糖凝胶电泳回收后，采用限制性内切酶EcoRI和NdeI进行消化，然后经由EcoRI和NdeI位点克隆到载体pMKSig中，得到重组载体pMKSigbgaB03。同样以嗜热脂肪芽孢杆菌IAM11001的染色体DNA为模板，采用引物P11和P12(见表1)进行PCR反应扩增耐热-半乳糖苷酶的编码基因bgaB，在该基因片段的5’-端引入BamHI位点(bgaB基因的起始密码子ATG紧接该位点序列)，3’-端也引入BamHI位点(该位点序列紧接着bgaB基因的终止密码子TAG)。将该2000bp左右片段经琼脂糖凝胶电泳回收后，采用限制性内切酶BamHI进行消化，然后经由BamHI位点克隆到载体pMASig中，得到重组载体pMASigbgaB05。重组载体pMKSigbgaB03和pMASigbgaB05的图谱见图2。

4.耐热-半乳糖苷酶的酶活力检测方法

酶活力定义：以邻-硝基苯--D-半乳糖吡喃糖苷(ONPG)为底物，在55℃、pH 6.5条件下，每分钟水解产生1mol的邻硝基苯(ONP)所需的酶量定义为一个酶活力单位(U)。

酶活力测定的具体操作流程按照《酶的测定方法》(B.施特尔马赫著，钱嘉渊译，中国轻工业出版社，1992，P195-202)进行。

实施例2

在低磷酸盐培养基中分泌表达耐热-半乳糖苷酶

将载体pMKSigbgaB03按照Spizizen方法(Anagnostopoulos C andSpizizen J.Requirements for transformation in Bacillus subtilis.Journal ofBacteriology，1961，81：741-746.)转化到枯草芽孢杆菌168株中，在含5μg/ml氯霉素的Luria-Bertani培养基(简称LB培养基，配方：胰蛋白胨10g，酵母膏5g，氯化钠10g溶于1000ml纯水，需要制备成固体培养基时向1000ml LB液体培养基中添加15g琼脂粉)平板上筛选转化子并从中抽提质粒检验，含载体pMKSigbgaB03的重组菌株命名为168(pMKSigbgaB03)。将重组菌株168(pMKSigbgaB03)在低磷酸盐培养基中进行摇瓶发酵培养以检测分泌的耐热-半乳糖苷酶活力，因该重组菌株理论上不能在高磷酸盐培养基中表达，故同时将该重组菌在高磷酸盐培养基中进行摇瓶发酵以作为分泌表达的阴性对照，该低磷酸盐培养基的配方如下：

50mmol/l 2-氨基-2-羟甲基-1，3-丙二醇(Tris)(C₄H₁₁NO₃，MW 121.14)，3.03mmol/l硫酸铵((NH₄)₂SO₄)，MW 132.14)，6.8mmol/l柠檬酸钠(Na₃C₆H₅O₇·2H₂O，MW 294.10)，3.04mmol/l三氯化铁(FeCl₃·6H₂O，MW270.29)，1mmol/l氯化锰(MnCl₂·4H₂O，MW 197.92)，3.5mmol/l硫酸镁(MgSO₄·7H₂O，MW 246.47)，10mmol/l L-丙氨酸(C₆H₁₄N₄O₂，MW 174.2)，0.01mmol/l氯化锌(ZnCl₂，MW 136.30)，0.5％葡萄糖(C₆H₁₂O₆·H₂O，MW198.17)，0.05％酪蛋白酸水解物，0.065mmol/l磷酸二氢钾(KH₂PO₄，MW136.09)，将pH值调到7.1，并采用121℃湿热灭菌20min后保存备用。高磷酸盐培养基除磷酸二氢钾浓度为3.5mmol/l外，其余试剂和浓度同低磷酸盐培养基。

摇瓶发酵的具体工艺为：

168(pMKSigbgaB03)于液体LB培养基中过夜培养作为种子液，按1％比例分别接种到100ml低磷酸盐培养基(含5μg/ml氯霉素)和100ml高磷酸盐培养基(含5μg/ml氯霉素)中于37℃200r/min摇床(即摇床速度为每分钟200转，下同)培养。

在培养的10h，17h，和24h分别从枯草芽孢杆菌168(pMKSigbgaB03)的低磷酸盐培养液和高磷酸盐培养液中取样测定发酵上清液中(即细胞外)的耐热-半乳糖苷酶活力。结果见图3。从图中可以看出，在低磷酸盐培养基中枯草芽孢杆菌168(pMKSigbgaB03)发酵上清液中的耐热-半乳糖苷酶活力明显高于其在高磷酸盐培养基中的值，说明在高磷酸盐培养基中启动子P_PhoD的启动子活性受到抑制，而在低磷酸盐培养基中其功能正常，耐热-半乳糖苷酶借助于PhoD信号肽分泌到发酵液上清中。但是在低磷酸盐培养基中分泌表达的酶活非常低，其原因是表达菌株在这种营养非常贫瘠的培养基中生长量很少。

实施例3

在丰富培养基LB中分泌表达耐热-半乳糖苷酶

将载体pMASigbgaB05按Spizizen方法转化到枯草芽孢杆菌168株中，在含50μg/ml卡那霉素的LB平板上筛选转化子并从中抽提质粒检验，含pMASigbgaB05的重组菌命名为枯草芽孢杆菌168(pMASigbgaB05)[枯草芽孢杆菌CGMCC No.2720]。将该重组菌在LB液体培养基中进行摇瓶发酵培养以检测分泌的耐热-半乳糖苷酶活力，具体工艺如下：

将枯草芽孢杆菌CGMCC No.2720于液体LB培养基中过夜培养作为种子液，按1％比例接种到LB液体培养基(含50μg/ml卡那霉素)中，于37℃200r/min培养，每隔1h取样测定其生长曲线，并从第8h开始，每隔1h测定该菌细胞外(即发酵上清液中)和细胞内的耐热-半乳糖苷酶活力直至24h，结果见图4。从图中可以看出，该菌的生长呈现两个快速生长期，在培养的8～11h呈现一个平台期，耐热-半乳糖苷酶在细胞内的酶活力和细胞外的酶活力都随着发酵时间而增加，发酵18h时细胞外酶活力达到0.78U/ml，而总酶活力(总酶活力为细胞外和细胞内的耐热-半乳糖苷酶活力的加和，下同)达到1.95U/ml，发酵20h时耐热-半乳糖苷酶总酶活力达到2.30U/ml，20h后由于菌体老化出现部分溶解导致胞内酶活的下降，细胞外酶活力超过细胞内酶活力。

将图4中8～18h之间各时间点的细胞外耐热-半乳糖苷酶活力占耐热-半乳糖苷酶总酶活力的比例作图，结果见图5。从图5中可以看出，在所测的时间段内，细胞外酶活力占总酶活力的比例在22％以上，18h时这一数值达到40％。作为耐热-半乳糖苷酶分泌表达的阴性对照，将bgaB基因直接克隆到载体pMA5中构建了不含PhoD信号肽编码序列的重组载体pMAbgaB，将此载体转化到枯草芽孢杆菌168株中得到枯草芽孢杆菌168(pMAbgaB)，并在相同条件下进行了该重组菌株的生长曲线和细胞外、细胞内耐热-半乳糖苷酶活力的测定，结果见图6。该图所示数据表明，当耐热-半乳糖苷酶前体不含PhoD信号肽时，细胞外耐热-半乳糖苷酶活力只占耐热-半乳糖苷酶总酶活力的极少部分。在发酵的18h，细胞外酶活力为0.07U/ml，总酶活力为2.50U/ml，细胞外酶活力只占总酶活力的2.8％，而枯草芽孢杆菌CGMCC No.2720在相同发酵条件下表达的耐热-半乳糖苷酶其细胞外酶活力占总酶活力的22％，这一对比表明：在目标蛋白质不含PhoD信号肽的条件下，基本无法实现分泌。

实施例4

重组菌株枯草芽孢杆菌CGMCC No.2720表达产物的SDS-PAGE检测

将重组菌株枯草芽孢杆菌CGMCC No.2720和枯草芽孢杆菌168(pMAbgaB)在18h的发酵上清液和细胞内提取液进行SDS-PAGE电泳分析(图7)。结果可见枯草芽孢杆菌CGMCC No.2720细胞内耐热-半乳糖苷酶前体(含信号肽序列，图7泳道1)比发酵液上清中成熟蛋白(图7泳道2)稍大，耐热-半乳糖苷酶成熟蛋白大于66.2kDa，这两个结果与预期相符。而作为不分泌的阴性对照，枯草芽孢杆菌168(pMAbgaB)发酵上清液对应位置没有明显条带(图7泳道3)，其细胞提取液中耐热-半乳糖苷酶成熟蛋白质大小与枯草芽孢杆菌CGMCC No.2720发酵液上清中的耐热-半乳糖苷酶成熟蛋白质相同(图7泳道4)，这两个结果也与预期相符。

实施例5

耐热-半乳糖苷酶中试生产研究(300L发酵罐)

将重组菌株CGMCC No.2720接种于含有2L LB液体培养基(含50μg/ml卡那霉素)的3L发酵罐中，于37℃200r/min培养18h获得一级种子，然后该一级种子按1％比例接种到含有20L LB液体培养基的30L全自动发酵罐中(江苏省江大绿康生物工程技术研究有限公司)培养18h获得二级种子，随后该二级种子按5％比例接种到300L发酵罐中(江苏省江大绿康生物工程技术研究有限公司)进行发酵产酶，所用发酵培养基组分为：豆饼粉2.2％、尿素0.1％、玉米浆0.15％、玉米淀粉0.85％、磷酸氢二钾0.3％、磷酸二氢钾0.15％、硫酸镁0.1％、硫酸锰0.02％、消泡剂0.3％，自来水定容至1L，调pH值至7.0。发酵培养基装液量为200L，通气量保持在1L/L·min，发酵温度为37℃，搅拌转速250rpm，用工业碱(质量浓度为300g/L)控制发酵液的pH维持在6.8。发酵进行到48h时耐热-半乳糖苷酶总酶活力达到17.6U/ml，其中细胞外的该酶活力达到6.3U/ml。

<110>江南大学

<120>一种双精氨酸途径蛋白质分泌载体的构建方法及其应用

<140>

<141>

<160>14

<210>1

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>本发明实验所使用的PCR引物P1

<400>1

GGGCCCGGAT CCGTAAGAGA ACAAGAGCCT CC    32

<210>2

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>本发明实验所使用的PCR引物P2

<400>2

GGGCCCGAAT TCTACTTCAA AGGCCCCAAC CG    32

<210>3

<211>17

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>本发明实验所使用的引物M13 Forward

<400>3

GTAAAACGAC GGCCAGT                     17

<210>4

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>本发明实验所使用的PCR引物P3

<400>4

GGAGGTCAGC TGTTAGCAC                   19

<210>5

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>本发明实验所使用的PCR引物P4

<400>5

GGGCCATATG GCATACGACA GTCGTTTTG        29

<210>6

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>本发明实验所使用的PCR引物P5

<400>6

GGGCCCGGAT CCTACTTCAA AGGCCCCAAC CG    32

<210>7

<211>34

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>本发明实验所使用的PCR引物P6

<400>7

GGGCCCGGAT CCATGTTTTC AAACATTGGA ATAC        34

<210>8

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>本发明实验所使用的PCR引物P7

<400>8

GGGCCCAGAT CTCTAAGCGG CCGCCGCTGT TTC         33

<210>9

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>本发明实验所使用的PCR引物P8

<400>9

ACTTGGAAGT GGTTGCCGGA                        30

<210>10

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>本发明实验所使用的PCR引物P9

<400>10

GGGCCCGAAT TCATGAATGT GTTATCCTCA AT          32

<210>11

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>本发明实验所使用的PCR引物P10

<400>11

GGGCCCCATA TGCTAAACCT TCCCGGCTTC ATC         33

<210>12

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>本发明实验所使用的PCR引物P11

<400>12

GGGCCCGGAT CCATGAATGT GTTATCCTCA AT          32

<210>13

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>本发明实验所使用的PCR引物P12

<400>13

GGGCCCGGAT CCCTAAACCT TCCCGGCTTC ATC               33

<210>14

<211>56

<212>PRT

<213>枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)

<220>

<223>枯草芽孢杆菌168的PhoD信号肽结构

<400>13

Met Ala Tyr Asp Ser Arg Phe Asp Glu Trp Val Gln Lys Leu Lys

 1               5                    10                    15

Glu Glu Ser Phe Gln Asn Asn Thr Phe Asp Arg Arg Lys Phe Ile

                  20                   25                   30

Gln Gly Ala Gly Lys Ile Ala Gly Leu Ser Leu Gly Leu Thr Ile

                35                   40                    45

Ala Gln Ser Val Gly Ala Phe Glu Val Asn Ala

                50                   55