黄芪多糖佐剂及其在I型鸭疫里氏杆菌灭活疫苗中的应用

摘要

本发明涉及一种疫苗免疫佐剂和疫苗，具体地说是一种黄芪多糖佐剂及其在I型鸭疫里氏杆菌灭活疫苗中的应用。该疫苗佐剂为黄芪多糖溶液，黄芪多糖溶液浓度为30mg/ml。本发明I型鸭疫里氏杆菌黄芪多糖灭活疫苗，它由作为疫苗的鸭疫里氏杆菌RA－1灭活菌液和作为佐剂的黄芪多糖溶液混合而成。本发明提高了传统灭活苗的免疫效果，有效地防控鸭传染性浆膜炎，也为新型免疫佐剂的研究提供依据。本发明疫苗具有良好的安全性和免疫原性，能有效预防鸭传染性浆膜炎的发生。

说明书

技术领域

本发明涉及一种疫苗免疫佐剂和疫苗，具体地说是一种黄芪多糖佐剂及其在I型鸭疫里氏杆菌灭活疫苗中的应用。

背景技术

黄芪多糖(Astragalus polysaccharide，APS)是中药黄芪中主要的天然活性成分，具有促进机体免疫功能、增加白细胞和淋巴细胞数量、提高淋巴细胞转化率和巨噬细胞活性、诱生干扰素等作用。黄芪多糖一般制成药物组合物，作为提高免疫力的药物使用。但是作为疫苗佐剂使用未见报道。由于家禽特别是鸭子容易感染疾病，而且传染速度很快，一旦鸭子感染疾病往往对养殖户造成巨大的经济损失。因此对雏鸭通过注射疫苗进行早期防疫是非常必要的。而目前家禽的疫苗品种非常少，而家禽的传染病种类又非常多。因此研究开发一些效果良好的家禽疫苗非常有益和必要。公开日为2008年6月18日、公开号为CN101200710A的发明专利申请公开了一种鸭瘟疫疫苗及其专用毒株，它对鸭病毒性肠炎有很好的免疫效果，但是它对鸭传染性浆膜炎却没有免疫效果。因此发明一种能够有效地防控鸭传染性浆膜炎的疫苗，防止该病的发生非常有意义。

发明内容

本发明的目的就是针对现有家禽疫苗的缺陷，提供一种疫苗佐剂和I型鸭疫里氏杆菌黄芪多糖灭活疫苗，它能够提高传统灭活苗的免疫效果，有效地防控鸭传染性浆膜炎，也为新型免疫佐剂的研究提供依据。

本发明疫苗免疫佐剂为黄芪多糖溶液，其中黄芪多糖溶液浓度优选为30mg/ml。将本发明黄芪多糖溶液作为疫苗免疫佐剂能够提高传统灭活苗的免疫效果。

本发明疫苗的技术方案是这样实现的：它由作为疫苗的鸭疫里氏杆菌RA-1灭活菌液和作为佐剂的黄芪多糖溶液混合而成。

本发明的鸭疫里氏杆菌RA-1(Riemerella anatipestifer，RA-1)于2008年9月10日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO：M208128。

其中鸭疫里氏杆菌RA-1灭活菌液浓度为1×10¹⁰CFU/ml，黄芪多糖溶液浓度为20-50mg/ml。

其中鸭疫里氏杆菌RA-1灭活菌液和黄芪多糖溶液按1∶1的比例混合。

本发明较好的技术方案是：黄芪多糖溶液浓度为30mg/ml；所述的混合液中加入了混合液总体积的0.01％的硫柳汞。

本发明的制备方法包括以下步骤：

(1)、将鸭疫里氏杆菌RA-1菌株用TSA平板复苏后接种于TSB中，37℃摇振培养18～24h，取培养液接种于TSA和血液琼脂平板进行纯度检查合格后作为种子液，4℃保存；

(2)、将种子液按培养液体积的5％接种到TSB中，37℃通气摇振培养24小时，纯检合格后采用平板计数法进行细菌计数，同时按菌液体积的0.4％加入甲醛溶液37℃灭活24h，灭活后调整菌液浓度至1×10¹⁰CFU/mL，接种于血液琼脂和TSA平板，5％CO₂、37℃培养48h，无菌生长者用于制备疫苗；

(3)、将黄芪多糖配成浓度为20-50mg/ml的溶液；

(4)、将鸭疫里氏杆菌RA-1灭活菌液和黄芪多糖溶液混合均匀即得到本发明。

本发明更好的制备方法是在上述混合液中加入了混合液总体积的0.01％的硫柳汞。

本发明提高了传统灭活苗的免疫效果，有效地防控鸭传染性浆膜炎，也为新型免疫佐剂的研究提供依据。本发明疫苗具有良好的安全性和免疫原性，能有效预防鸭传染性浆膜炎的发生。

附图说明

图1I型鸭疫里氏杆菌黄芪多糖灭活疫苗免疫后血清抗体水平

图中折线上字母不同者，表示差异极显著(P＜0.01)。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明作进一步描述：

实施例1

(1)、将鸭疫里氏杆菌RA-1菌株用TSA平板复苏后接种于TSB中，37℃摇振培养18～24h，取培养液接种于TSA和血液琼脂平板进行纯度检查合格后作为种子液，4℃保存；

(2)、将种子液按培养液体积的5％接种到TSB中，37℃通气摇振培养24小时，纯检合格后采用平板计数法进行细菌计数，同时按菌液体积的0.4％加入甲醛溶液37℃灭活24小时，灭活后调整菌液浓度至1×10¹⁰CFU/mL，接种于血液琼脂和TSA平板，5％CO₂、37℃培养48h，无菌生长者用于制备疫苗；

(3)、将黄芪多糖配成浓度为30mg/ml的溶液；

(4)、将鸭疫里氏杆菌RA-1灭活菌液和黄芪多糖溶液按1∶1的比例混合均匀即得到本发明。

实施例2

步骤(1)、(2)与实施例1相同；

(3)、将黄芪多糖配成浓度为20mg/ml的溶液；

(4)、将鸭疫里氏杆菌RA-1灭活菌液和黄芪多糖溶液按1∶1的比例混合均匀；

(5)、在上述混合液中加入混合液总体积的0.01％的硫柳汞。

下面对本发明所用材料和方法以及免疫效果实验作进一步说明：

1材料与方法

1.1材料

1.1.1菌种

I型RA菌株分离自武汉郊区某肉鸭场，鉴定后冻干保存。

1.1.2培养基

胰酶大豆琼脂(Tryptic Soy Agar，TSA)和胰酶大豆肉汤(TrypticSoy Broth，TSB)分别为Difco、Bacto产品，使用时加10％小牛血清。

1.1.3佐剂原料

黄芪多糖提取物购自安徽致和堂药业有限公司，纯度为75％。

1.1.4试验动物

1日龄樱桃谷鸭，购自武汉天绿农业科技有限公司，自由采食。

1.2疫苗制备

1.2.1种子液制备

I型RA菌株用TSA平板复苏后接种于TSB中，37℃摇振培养18～24h，取培养液接种于TSA和血液琼脂平板进行纯度检查合格后作为种子液，4℃保存，使用期不超过5d。

1.2.2菌液制备

将种子液按培养液体积的5％接种到TSB中，37℃通气摇振培养24h。纯检合格后采用平板计数法进行细菌计数，同时按菌液体积的0.4％加入甲醛溶液37℃灭活24h。灭活后调整菌液浓度至1×10¹⁰CFU/mL，接种于血液琼脂和TSA平板，5％CO₂、37℃培养48h，无菌生长者用于制备疫苗。

1.2.3APS佐剂制备及配苗

取APS配制成所需浓度溶液，115℃灭菌15min后置4℃保存备用。

将灭活菌液与佐剂按等体积混合，同时按总体积的0.01％加入硫柳汞，制成棕色混悬液，即为鸭传染性浆膜炎黄芪多糖灭活疫苗。

1.2.4疫苗的无菌及安全检查

疫苗分别接种于TSA、TSB、血液琼脂及厌氧肉肝汤，37℃培养5～7d，观察有无细菌生长。

30只5日龄健康未免疫樱桃谷鸭，随机分为3组，n＝10，分别于颈部皮下注射疫苗0.5、1.0、2.0mL/只，观察7d。

2疫苗的免疫效果检验

2.1攻毒菌量的测定

I型RA强毒株经复苏、增菌后分别调整浓度至2×10¹⁰、2×10⁹、2×10⁸、2×10⁷、2×10⁶及2×10⁵CFU/mL；取70只15日龄健康未免疫鸭随机分为7组(n＝10)，分别对应上述6个攻毒剂量和1个对照组(生理盐水)进行攻毒，0.5mL/只，腿部肌肉注射，观察7d，将导致全组试验鸭死亡的最小攻毒剂量定为攻毒剂量。

2.2最佳免疫剂量的筛选

50只5日龄健康未免疫鸭，随机分为5组(n＝10)，对应4个免疫剂量(0.2、0.3、0.5、1.0mL/只)和1个对照组(生理盐水)，颈部皮下注射。免疫后15d按照1.3.1测定结果进行攻毒，观察10d。

2.3免疫接种及攻毒保护试验

100只5日龄健康未免疫鸭，随机分为两大组，免疫组和对照组，每组又分为5小组(n＝10)，分别对应5个攻毒时间点：免疫后3、7、10、14和21d。

疫苗组按1.3.2筛选的最佳免疫剂量注射疫苗，对照组注射生理盐水，然后在相应的时间按照1.3.1测定结果进行攻毒，腿部肌肉注射，观察7d。

2.4免疫后血清抗体效价检测

50只健康未免疫雏鸭，随机分为5组(n＝10)，分别对应5个采样时间(免疫后3、7、10、14和21d)，全部于5日龄注射疫苗，然后在相应的时间颈静脉采血，采用琼脂扩散方法检测血清抗体效价，结果用log2表示，应用统计软件SPSS 11.5进行分析。

3实验结果

3.1疫苗的无菌及安全检查

制备的疫苗经实验室细菌学检查，无任何细菌生长；

5日龄雏鸭颈部皮下接种0.5、1.0、2.0mL疫苗(n＝10)，均未见异常反应。

3.2攻毒菌量测定

表1显示，导致整组全部死亡的最小攻毒剂量为2×10⁸CFU/mL、0.5mL/只，该剂量即为1型RA强毒的攻毒剂量。

表1  1型RA强毒攻毒剂量测定结果

3.3最佳免疫剂量筛选

试验鸭按0.2、0.3、0.5、1.0mL/只剂量免疫后攻毒保护率分别为90％、100％、100％和100％，对照组无一存活，表明该疫苗的最佳免疫剂量为0.3mL/只，见表2。

表2  I型RA黄芪多糖灭活疫苗最佳免疫剂量筛选结果

3.4免疫接种及攻毒保护试验

由表3可见，试验鸭接种I型RA黄芪多糖灭活疫苗后3、7、10、14和21d的攻毒保护率分别为100％、90％、100％、100％和90％，平均保护率达96％。对照组注射生理盐水后同样进行攻毒，3、7、10和14d后攻毒死亡率为100％，21d的死亡率为80％，余下的2只处杀后剖检可见明显的纤维素性肝周炎和心包炎。

表3  I型RA黄芪多糖灭活疫苗接种后的攻毒保护试验结果

3.5血清抗体水平检测

见图1，免疫后3d即能在试验鸭血清中测出1型RA的特异性抗体，随后抗体效价逐步升高，至免疫后10d达高峰(P＜0.01)。

本发明将APS作为免疫佐剂进行配苗，成功研制出I型鸭疫里氏杆菌黄芪多糖灭活苗，最佳免疫注射剂量为0.3mL/只，5日龄雏鸭接种后3、7、10、14和21d的攻毒保护率分别为100％、90％、100％、100％和90％，平均保护率高达96％，且安全性高，近7倍剂量免疫未见异常反应。该疫苗产生保护力较早，在免疫后3天保护率即高达100％，血清抗体检测的结果却显示此时抗体效价相当低，这可能与免疫后时间间隔太短，以至实验动物体内未能产生足够的特异性抗体；APS是一种天然的免疫增强剂，能在疫苗本身产生足够保护以前，提升整体的免疫水平，尤其是非特异性免疫水平，使机体不受强毒进攻的影响。