Sabin株脊髓灰质炎病毒灭活疫苗中佐剂应用的初步研究

摘要

随着全球消灭脊髓灰质炎(脊灰)目标的临近，疫苗衍生病毒(VDPV)的流行、疫苗相关麻痹型病例(VAPP)的发生等对无脊灰状态成果的巩固威胁很大。在消灭脊灰的最后阶段，应尽快消灭脊灰野毒株，并使用灭活疫苗(Inactivated poliovirus vaccine，IPV)替代目前广泛使用的脊髓灰质炎减毒活疫苗(Oral poliovirus vaccine，OPV)来维持无脊灰状态，消除自然界的活病毒。对于新的生产厂家考虑到疫苗生产的生物安全性等因素，WHO鼓励研制Sabin株脊髓灰质炎灭活疫苗(Sabin IPV)[2]。 目前尚无成品Sabin IPV上市，于是Sabin IPV的定量检测、质量指标和免疫剂量等都还没有统一标准。前期研究显示，Sabin IPV与野毒株IPV(WT—IPV)在抗原性、稳定性等方面均有差别，于是建立在WT—IPV基础上的定量检测方法和质量控制指标并不适用于Sabin IPV。另外，Sabin IPV与WT—IPV抗原性也有差异，Sabin2型的免疫原性只是野毒株MEF—1株的1/10。为解决疫苗免疫原性不佳的问题，最常用的方法即添加疫苗佐剂。本论文旨在于建立适用于Sabin IPV的D抗原定量方法及蛋白质含量测定方法，完善Sabin IPV检定和质量控制体系；并进一步探索SabinIPV中添加佐剂对免疫效果产生的影响，探讨Sabin IPV中佐剂应用的意义和最适剂量等。 本研究第一部分即建立Sabin株脊髓灰质炎病毒灭活疫苗(Sabin IPV)中D抗原含量及蛋白质含量的检测方法。首先通过摸索各步骤反应条件，优化本实验室建立的多抗ELISA法测定Sabin IPV中D抗原含量的体系，对3个批次的样品进行5次重复测定，结果的变异系数均小于10％。另外，利用蛋白质遇三氯乙酸产生沉淀的特点，对Lowry法进行改良，建立了能够准确测定Sabin IPV中微量蛋白质含量的方法，实验证明，该方法能够排除Sabin IPV中的游离氨基酸、多肽和酚红指示剂等物质的干扰，线性范围为2.5～40ug/ml，r=0.9998，最佳条件下加标平均回收率为95.32％，精密度试验结果批内和批间变异系数均小于10％。 研究的第二部分通过将Al(OH)3、DC—Chol和Al(OH)3+ DC—Chol3种不同疫苗佐剂按不同剂量与Sabin IPV(每剂含D抗原Ⅰ型15DU、Ⅱ型16 DU和Ⅲ型22.5 DU)配伍后分别免疫Wistar大鼠，主要检测各组大鼠免疫后血清中和抗体水平、特异性IFN—γ的产生情况以及免疫后各组大鼠CD3/CD4/CD8分子表达的差异。综合上述结果评价在Sabin IPV中添加Al(OH)3或/和DC—Chol对大鼠体液免疫和细胞免疫的影响。通过微量中和实验检测Sabin株脊髓灰质炎特异性中和抗体发现，在Sabin IPV中添加佐剂，普遍于第1针免疫后提高了大鼠血清中3个型特异性中和抗体阳转率；而且3种佐剂还在第2针免疫后提高了Ⅱ型中和抗体的阳转率；Sabin IPV中添加佐剂后，对特异性中和抗体的水平也有不同程度的影响。添加Al(OH)3或DC—Chol在第2针免疫后就产生了高效价的Ⅰ型中和抗体，如添加0.5mgDC—Chol第2针免疫后Ⅰ型中和抗体效价几何均数(GMT)达到未添加佐剂组的3倍以上，显著提高了早期Ⅰ型中和抗体的水平；添加0.1mgAl(OH)3组与未添加佐剂组相比，第3针免疫后Ⅱ型特异性中和抗体效价的几何均数增长2倍以上；添加Al(OH)3或DC—Chol或Al(OH)3+DC—Chol联合佐剂在第2针免疫后就获得了高水平的Ⅲ型特异性中和抗体，GMT比未添加佐剂组增长15倍和12倍，即大大提高了早期Ⅲ型中和抗体的水平。ELISPOT测定针对Sabin株脊髓灰质炎病毒的特异性IFN—γ的结果显示，注射不含佐剂Sabin IPV的大鼠未产生特异性IFN—γ斑点，注射添加了Al(OH)3或DC—Chol佐剂Sabin IPV的大鼠产生了少量特异性IFN—γ斑点，其中添加0.25mgDC—Chol组效果最好，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型各产生特异性IFN—γ斑点22.25±6.24、13.75±3.77和22.50±5.92 SFC/106cell提示添加Al(OH)3或DC—Chol佐剂可能对大鼠针对Sabin株脊髓灰质炎病毒的特异性细胞免疫有少许增强作用；流式细胞仪检测各组大鼠CD3/CD4/CD8分子表达的差异的结果显示，Al(OH)3或DC—Chol佐剂的应用能提高大鼠CD3+CD4+/CD3+CD8+值，提示2种佐剂的应用均能增强大鼠的免疫功能，但这种增强作用在佐剂的不同剂量组之间差别不显著。综上所述，Al(OH)3或DC—Chol能够增强Sabin IPV的体液免疫效果，对细胞免疫也有一定增强作用，能在更短的时间内使Wistar大鼠获得更好的保护效果。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一部分Sabin株脊髓灰质炎病毒灭活疫苗主要指标的检测：D抗原含量的检测和蛋白质含量的测定

前言

一、材料和方法

二、结果和分析

三讨论

四小结

参考文献

第二部分不同佐剂按不同剂量与Sabin IPV配比后免疫大鼠后体液免疫和细胞免疫效果的评价

前言

一材料和方法

二、结果和分析

三讨论

四小结

参考文献

论文综述 消灭脊髓灰质炎的挑战与措施

附录

致谢

个人简历