一种基于分子和细胞水平研究药物代谢的方法

摘要

本发明涉及了一种基于分子和细胞水平研究药物代谢的方法，其特征在于：使用专门的微流控芯片同时从分子和细胞水平进行药物代谢研究。本发明能使基于分子和细胞水平的药物代谢研究在同一块微流控芯片上完成，能获得药物代谢物的分子结构信息和其细胞毒效应，适用于低效耗，高通量、高内涵的药物代谢筛选和药物相互作用研究。

说明书

技术领域

本发明涉及微流控芯片和药物代谢研究平台技术，特别提供了一种使用专门的微流控芯片用于基于分子和细胞水平研究药物代谢的方法。

背景技术

药物代谢是指药物在体内经药物代谢酶的生物转化。药物经代谢后，理化性质发生了变化，从而引起了其药理和毒理活性的改变。因此，研究药物代谢和明确其代谢途径，对制定合理的临床用药方案、剂型设计及新药开发工作都具有重要的指导意义，也是临床药理学、毒理学、高通量药物筛选等领域的研究热点。当前，国内外对药物代谢的研究主要集中在代谢产物的生成和确定代谢途径。在分子生物学技术的推动下，药物代谢酶领域的研究因其对临床药物间相互作用的研究有着积极的意义，已得到广泛的重视。体外代谢研究可以排除体内因素的干扰，直接观察酶对底物的选择代谢性，为整体试验提供了可靠的理论依据；体内代谢转化率低，对于毒性大及缺乏灵敏检测手段的药物来说，体外代谢研究成为了良好的研究手段。肝脏是药物代谢的重要器官，是机体进行生物转化的主要场所，富含参与药物代谢的一个庞大的依赖细胞色素P450的混合功能氧化酶系统，大多数药物的I相及II相反应都依赖于肝脏酶系统而发生。药物代谢研究策略一般是药物离线或在线经代谢酶生物转化为药物代谢物，一方面药物代谢物可分离检测，获取其分子结构信息，进而研究其代谢途径；另一方面药物代谢物与细胞(如肝细胞)孵化，考察药物经代谢后的毒副作用或者药物的相互作用。目前常用的方法如HPLC-MS和微孔板均无法实现同时获取药物代谢物的分子结构信息和其细胞毒作用信息。如果在同一个平台上能同时满足这两个要求，这对高通量药物代谢筛选的发展势必具有重要的意义。

微流控芯片实验室又称芯片实验室(Lab-on-A-Chip)或微流控芯片(Microfluidic)，指的是把化学和生物等领域中所涉及的样品制备、反应、分离、检测、细胞培养、分选、裂解等基本操作单元集成或基本集成到一块几平方厘米(甚至更小)的芯片上，由微通道形成网络，以可控流体贯穿整个系统，用以取代常规化学或生物实验室的各种功能的一种技术。微流控芯片实验室的基本特征和最大优势是多种单元技术在整体可控的微小平台上灵活组合、规模集成。

将芯片实验室技术应用到药物代谢研究中，充分利用其灵活组合和规模集成的特点，将药物代谢酶反应器、细胞培养、细胞孵化、药物代谢物分离检测等单元操作集成在一块微流控芯片上，势必能实现低效耗，高通量、高内涵的药物代谢筛选研究。

发明内容

本发明的目的在于提供了一种使用专门的微流控芯片用于基于分子和细胞水平研究药物代谢的方法。

本发明提供了一种使用专门的微流控芯片同时从分子和细胞水平对药物代谢进行研究的方法；

所述的微流控芯片由上层、下层和夹心层三部分封接而成，芯片的上层和下层含有微流体通道，夹心层为刻蚀有微通孔阵列的基片，微通孔中固定有药物代谢酶；

方法过程为：

将细胞充入芯片下层进行培养，药物从上层进入，经夹心层固定化药物代谢酶的作用产生代谢物，代谢物有两条通路：一条为直接从上层进入分离检测通道，得到代谢物的分子结构信息；另一条为进入下层与细胞孵化，评价其细胞毒效应：每三个微孔为一组，分别为药物代谢酶空白、药物空白和药物代谢物与细胞作用，三组数据对比准确地获取药物代谢物细胞毒作用。

本发明提供了一种专门用于基于分子和细胞水平研究药物代谢的微流控芯片，所述的微流控芯片由上层、下层和夹心层三部分封接而成，芯片的上层和下层含有微流体通道，夹心层为刻蚀有微通孔阵列的基片，微通孔中固定有药物代谢酶。

本发明提供了所述的微流控芯片的上层和下层的芯片材料为弹性硅橡胶PDMS；夹心层材料为弹性硅橡胶、玻璃、石英、聚甲基丙烯酸甲酯PMMA或其它芯片材料。

本发明提供了微通孔阵列的微孔数目为3～90个。

本发明提供了微流控芯片的制作方法：

在预先制作好的上、下层模板上分别浇注PDMS，在烘箱中聚合20～60分钟后，将固化后的PDMS层从模板剥离，按所需尺寸切割成上、下层，在上层打出供流体出入的小孔；

通过光学蚀刻或机械钻孔的方法制备夹心层的微通孔阵列，利用硅溶胶-凝胶或水凝胶方法将药物代谢酶固定于此微孔中；

将下层PDMS贴在夹心层基片上，再与上层PDMS紧密粘在一起，使两层通道对齐，形成完整的三层立体夹心式芯片。

本发明提供了固定于微通孔中的药物代谢酶为肝微粒体或基因重组药物代谢酶。

本发明提供的凝胶透明，可直接在显微镜下观察下层细胞的状态；通孔表面经PVAc涂层，凝胶与通孔表面结合紧密，不易脆裂；PDMS表面硅烷化，固定化完成后，易于脱离，不会影响凝胶的结构。

本发明能使基于分子和细胞水平的药物代谢研究在同一块微流控芯片上完成。能同时获取药物代谢物的分子结构信息和其细胞毒效应，适用于低效耗，高通量、高内涵的药物代谢筛选和药物相互作用研究。

本发明中的微流控芯片设计灵活，可根据不同的应用需求选用多种不同的芯片材料。提供与多种检测设备的灵活接口。

附图说明

图1为药物代谢微流控芯片的结构示意图，

图2为药物代谢微流控芯片制备过程示意图，

图3为芯片上溶胶-凝胶处细胞成像图，

图4为扑热息痛在线代谢分离检测电泳谱图，

图5为药物代谢物-细胞作用后细胞荧光显微镜成像图；

具体实施方式

实施例1：微流控芯片的制作

微流控芯片(如图1)是由固定化有药物代谢酶于微通孔阵列中的夹心层基片和刻蚀有微流体通道的上、下层PDMS封接而成。

具体步骤如下(如图2)：

(1)在预先制作好的上、下层模板上分别浇注PDMS，在烘箱中聚合20～60分钟后，将固化后的PDMS层从模板剥离，按所需尺寸切割成上、下层，在上层打出供流体出入的小孔。

(2)在厚度为0.5-2.0mm的夹心层的石英片超声打孔，孔的直径为1-3mm，数目可依据研究的通量而定。清洗并干燥后，每个微孔分别滴入适量的PVAc(5％m/v甲苯)，吹干，将一块预先表面硅烷化的PDMS贴在石英片下，形成半封闭的微孔阵列。

(3)药物代谢酶固定化：利用硅溶胶-凝胶或水凝胶方法将超声水解的四甲氧基硅烷与肝微粒体按体积比1:2混合，然后用微量注射器依次加入微孔中，密闭，置于4℃冰箱中固化24小时。

(4)芯片封接：撕去PDMS层，上、下层刻蚀有微流体通道的PDMS芯片与夹心层的石英片对准后贴在一起，使两层通道对齐，形成完整的三层立体夹心式芯片。为保证封接牢固，需保持芯片洁净。

实施例2：扑热息痛药物的代谢研究

实施例1所述的微流控芯片的液池中加入缓冲液，加电冲洗30分钟，然后在下层芯片通道中加入已培养好的肝癌HEPG2细胞，再加入营养液，细胞贴壁过夜(如图3)；然后往芯片液池中加入5mM扑热息痛药物、20mMMgCl和10mM UDPGA辅酶，电压进样60秒，使之与药物代谢酶葡醛酸转移酶UGT作用，反应一段时间后，药物代谢产物糖基化扑热息痛和未反应的药物被加电引入上层芯片的分离通道，并用紫外检测器检测，分离检测结果如图4所示。同时为了评价药物代谢的细胞毒效应，药物代谢产物被引入下层细胞通道：实验中每三个微孔为一组，其中两个微孔溶胶-凝胶固定化药物代谢酶UGT，另一个微孔中溶胶-凝胶固定化牛血清白蛋白而无UGT酶；然后在无UGT酶的微孔和一个固定化有UGT酶的微孔中加电充入药物扑热息痛，而另一个固定化有UGT酶的微孔中加电充入不含药物扑热息痛的缓冲液；这样形成三组细胞存活率的结果，即药物代谢酶空白、药物空白和药物代谢物与HEPG2细胞作用，最后加入荧光染料碘化吡啶PI和丫靛橙AO，在荧光显微镜下通过染料标记死活细胞数来确定其细胞的存活率(如图5所示)，三组数据对比便可准确地获取药物代谢物细胞毒作用。

实施例3：4-硝基酚药物的代谢研究

实施例1所述的微流控芯片的液池中加入缓冲液，加电冲洗30分钟，然后在下层芯片通道中加入已培养好的肝癌HEPG2细胞，再加入营养液，细胞贴壁过夜；然后往芯片液池中加入5mM4-硝基酚、20mM MgCl和10mMUDPGA辅酶，电压进样60秒，使之与药物代谢酶UGT作用，反应一段时间后，药物代谢产物葡醛酸化4-硝基酚和未反应的药物被加电引入上层芯片的分离通道，并用紫外检测器检测。同时为了评价药物代谢的细胞毒效应，药物代谢产物被引入下层细胞通道：实验中每三个微孔为一组，其中两个微孔溶胶-凝胶固定化药物代谢酶UGT，另一个微孔中溶胶-凝胶固定化牛血清白蛋白而无UGT酶；然后在无UGT酶的微孔和一个固定化有UGT酶的微孔中加电充入药物4-硝基酚，而另一个固定化有UGT酶的微孔中加电充入不含药物4-硝基酚的缓冲液；这样形成三组细胞存活率的结果，即药物代谢酶空白、药物空白和药物代谢物与HEPG2细胞作用，最后加入荧光染料碘化吡啶PI和丫靛橙AO，在荧光显微镜下通过染料标记死活细胞数来确定其细胞的存活率(如图5所示)，三组数据对比便可准确地获取药物代谢物细胞毒作用。