公开/公告号CN101379080A
专利类型发明专利
公开/公告日2009-03-04
原文格式PDF
申请/专利权人 科学与工业研究会;
申请/专利号CN200680052139.4
申请日2006-12-08
分类号C07K14/415(20060101);C12N15/82(20060101);C12N15/62(20060101);
代理机构中国国际贸易促进委员会专利商标事务所;
代理人罗菊华
地址 印度新德里
入库时间 2023-12-17 21:32:13
法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2013-04-17
授权
授权
2009-04-29
实质审查的生效
实质审查的生效
2009-03-04
公开
公开
技术领域:
本发明涉及DYAD基因的等位基因和拟南芥(Arabidopsis)、Boechera、水稻及其它植物的基因产物用于操纵配子发生和种子发育，以产生在胚中具有母体基因组的全二倍体组的种子的用途。本发明还涉及改变的DYAD基因用于产生未减数雌配子体而基本上不影响花粉发育的用途。
背景技术:
植物生活周期在二倍体孢子体世代和单倍体的配子体世代之间交替。减数分裂代表植物生活周期二倍体孢子体和单倍体配子体阶段之间的转变。减数分裂导致单倍体孢子形成。在植物中(与动物不同)，减数分裂产物经历另外的分裂以形成多细胞单倍体配子体。配子的分化在减数分裂产物分裂后，在配子体发育的较后阶段发生。受精之前的有性过程因而包括两个截然不同的阶段:包括减数分裂和单倍体孢子形成的孢子发生；以及涉及孢子发育成配子体的配子发生，包括受精和支持胚生长所需的配子和相关细胞。
大多数植物种经历有性生殖；然而一些植物种能够进行无性生殖。术语无融合生殖通常公认为是某些形式的无性生殖的任意一种对有性生殖的取代(Koltunow A.和Grossniklauss U.Annu.Rev.PlantBiol.Vol.54:547-74，2003)。无融合生殖是一种遗传控制的植物生殖方法，涉及其中胚形成而无卵细胞和精子结合的种子形成。存在三种基本类型的无融合生殖:1)无孢子生殖，其中胚由源自珠心的胚囊中的染色体未减数卵孤雌生殖发育而成，2)二倍体孢子生殖，其中胚由源自大孢子母细胞的胚囊中的未减数卵孤雌生殖发育而成，以及3)不定胚生殖，其中胚直接由体细胞发育而成。前两种类型的无融合生殖都归为配子体无融合生殖，因为在这两种情形中胚都是由雌配子体或胚囊发育而成，而在不定胚生殖中胚直接由体细胞发育而成而没有中间的雌配子体阶段。配子体无融合生殖因而包括两个部分:i)未减数孢子生殖，或保留了亲本基因型的未减数雌配子体(胚囊)的产生，以及ii)胚的孤雌发育，有或没有发育成胚乳的中央细胞的受精。
无融合生殖因而是不经过雌性减数分裂和配子配合而产生遗传上与母本相同的胚的生殖过程。该三种类型的无融合生殖具有经济潜力，因为它们可以促使任何基因型(不管多么杂合)纯育。利用无融合生殖，尤其是适应性基因型(adaptive genotype)或杂交基因型的后代将在重复的生活周期中维持它们的基因型。除了固定杂种优势，无融合生殖还可以使其中用于产生杂种的有效雄性不育系或育性恢复系未知或未研发出的作物的商业化杂种的产生成为可能。因而，无融合生殖可以使杂种研发更有效。无融合生殖还简化了杂种产生并增加了具有良好的雄性不育系的植物种中的遗传多样性。将控制专性或高水平的无融合生殖的基因引入培育的物种中并且能够容易使杂交亲和性的有性和无融合基因型杂交以产生纯种F1杂种是高度期望的。无融合生殖转移至重要作物的将使得有可能开发出纯种杂种和商业化生产杂种而无需细胞质-细胞核雄性不育以及高花费、劳动密集型的生产过程。专性无融合生殖的F1杂种将通过种子来无限地纯育并且可以考虑来通过种子来提供营养生殖方法或无性系生殖方法。研发无融合生殖培育的作物还可以为发展中国家的粮食安全提供重要作用(Spillane C，SteimerA，和Grossniklaus U，Sex.Plant Reprod.14:179-187，2001)。
事实上，大多数已知的控制无融合生殖的基因已在与培育物种亲缘关系远的野生种中找到。虽然种间杂交在培养的物种和野生种之间是可能的，但基因组之间的染色体配对通常较低或不存在，导致这种方法失败。
附图简述
图1示出了dyad突变体植株的减少的结实率。，最常见的范围是每株植物1-10粒种子。
图2示出了利用Alexander染色显示的dyad突变体植株正常花粉的活力。(图2A)为野生型。(图2B)为dyad突变体。
图3示出了野生型和dyad突变体中的雄性减数分裂和雌性减数分裂。(图3A-C)为野生型。(图3D-F)为dyad突变体。(图3A，D)为减数分裂1末(末期)的雄性性母细胞。(图3B，E)为四分体阶段的雄性性母细胞。(图3C，F)为分裂后期1阶段的雌性性母细胞。dyad经历了均等雌性减数分裂。
图4示出了二倍体dyad突变体植株的代表性后代的染色体倍性。(图4A)为显示有15条染色体的三倍体后代植株的体细胞。(图4B)为携带显示以9:6分离的15条染色体的三倍体后代植株中的雄性减数分裂1。(图4C)为显示有10条染色体的二倍体后代植株的体细胞。
图5示出了Boechera holboelli DYAD同系物对dyad突变体的补充(complementoition):(图5A)为显示了未伸长的长角果的dyad突变体。(图5B)为用BhDYAD基因转化的dyad突变体，表现为含有种子的伸长的长角果。(图5C)为dyad突变体植株(1)、补足了的植株(2)和野生型植株(3)的长角果的比较。(图5D)为补足了的植株的裂开的长角果，显示了完全的结实率。(图5E)为野生型植株的分裂的长角果。
图6是示出了用于构建DYAD条件性补充品系的pBI101.3::Dyad::(Δ)GR盒的示意图。
图7是显示CAPS多态性用以将DYAD的内源性基因座如实施例6中描述的进行基因分型的聚丙烯酰胺凝胶。图7A:解析的KNEF/KNER引物扩增产物的HinF1消化片段。图7B:解析的KKF/KKR引物扩增产物的HinF1消化片段。
图8示出了实施例6中的dyad表型的条件性补充。
图8A:在地塞米松处理之前和之后显示了未伸长的长角果(dyad表型)的花序。箭头表示在开始处理时最新开放的花朵的位置。在处理开始5-7天后长角果表现出伸长(野生型表型)。图8B:在地塞米松处理之前表现为不育(dyad)表型的分离的长角果。图8C:显示了通过地塞米松处理的条件性补充后恢复的野生型表型。图8D:在地塞米松处理后表现为完全的结实率的开裂的长角果。
图9显示了实施例6中dyad表型的条件性补充后胚珠的形态学。
图9A:在地塞米松处理前成熟胚珠阶段的显示dyad表型并且没有胚囊的纯胚珠。图9B:在地塞米松处理后恢复的胚囊。
图10示出了由dyad突变体产生的种子的大小变化以及从二倍体拟南芥株和四倍体拟南芥株之间的回交获得的种子的大小差异。
图10A:来自自交的野生型二倍体Co1-0植株的种子是均一正常的。图10B:来自四倍体植株的种子。图10C:来自自交的dyad植株的种子的大小在大(L)、正常(N)和皱缩(S)之间变化。图10D:来自与二倍体雄株杂交的四倍体雌株的母本过量-种子是皱缩的。图10E:在与来自母本过量杂交的种子比较时，来自二倍体雌株与四倍体雄株杂交的父本过量-种子的大小较大。
图11示出了用如http://www.ebi.ac.uk/clustalw中的ClustalW(为默认参数)进行的来自拟南芥(SEQ ID NO:5)、Boechera(SEQ IDNO:18)、水稻(SEQ ID NO:51)和来自杨树(毛果杨(Populustrichocarpa))(SEQ ID NO:26)的DYAD蛋白的蛋白质序列的比对。
图12示出利用Clustal W(1.82)进行的水稻DYAD多肽序列(SEQID NO:51)与推定的玉米DYAD多肽序列(SEQ ID NO:55和54)的比对。图12A:水稻DYAD氨基酸1-147的比对。图12B:水稻DYAD氨基酸317-803的比对。
图13示出了将来自水稻的DYAD多肽序列作图于确定含有DYAD-编码序列的两个玉米重叠群之上。
发明内容
存在两个可以考虑用于将无融合生殖引入培养作物的一般策略。第一个策略是通过从野生近缘种基因渗入进培育种中。第二个通过从有性种鉴定能够赋予无融合生殖特征的基因，然后累进这些基因以产生无融合生殖的全部成分。然后用转基因方法将这些基因导入培育作物中。因而例如，一个或多个基因的表达可用于设计未减数孢子生殖，并且这些基因可以与另一组基因或其它处理组合来诱导单性胚的发育。用于在植物中诱导孤雌生殖的方法是本领域已知的(参见，例如美国专利No.5,840,567)。一种用于诱导用于本发明的孤雌发育的优选方法是用已经受辐射的花粉给植物授粉，由此使它的受精作用失活。(Pandey K.K.和Phung M.，Theoret.Appl.Genet.，Vol.62:295-300，1982；Lofti M.等，Plant Cell Reprod.，Vol.21:1121-1128，2003)。
这种方法是优选的，因为它已经用于许多植物种并且显示是普遍适用的，最易于用于具有不完全花的植物(雌雄同株的和雌雄异株植物)。然而，该方法可应用于这样的具有完全花的雌雄同株植物:所述完全花已经处理成雄性不育的或者能育的花粉已经从其上机械移除或分离。
用于绝育花粉的辐射的具体量将不同，这取决于种的具体情况。一般而言，大约10至2000戈瑞(Gray)的量是足够的。优选地，所述量为约100-500戈瑞，更优选200-250戈瑞。
孤雌生殖的成功诱导可以通过筛选种子的胚的存在检测，例如在液体培养基中培养后通过解剖种子或在看片灯上观察种子，如Lofti M.等，Plant Cell Reprod.，Vol.21:1121-1128，2003所描述。
已经尝试了将单性生殖性状引入正常有性生殖的作物中。据Asker S.(Hereditas，Vol.91:231-241，1979)报道，该尝试在小麦、甜菜和玉米中没有成功。PCT公开号WO 89/00810(Maxon等，1989)公开了用来自非驯养的不育苜蓿植物的提取物来在培育植物中诱导单性生殖形式的生殖。当在高梁、向日葵、珍珠粟和蕃茄中评估雄性不育的诱导时，据报道在高梁、珍珠粟和向日葵中存在减少的结实率并且在马铃薯中存在减少的坐果率。
虽然无融合生殖有效地用于了柑桔属(Citrus)来产生均一的且无疾病和无病毒的根状茎(Parlevliet J.E.等，in Citrus.Proc.Am.Soc.Hort.Sci.，Vol.74:252-260，1959)并且用于绿毛蒺藜草(Bashaw，Crop Science，Vol.20:112，1980)和Poa(Pepin等，Crop Science，Vol.11:445-448，1971)来产生改良的栽培品种，但其尚不能成功地转移至栽培作物中。
设计无融合生殖的第二个方法涉及鉴定和操纵来自有性生殖种的无融合生殖相关基因。有关无融合生殖的一个发展的观点认为，无融合生殖与有性生殖相关并涉及在有性途径中也起作用的基因的作用(Tucker M.R.等，Plant Cell，Vol.15(7):1524-1537，2003)。在有性生殖中，通常由接近发育中的胚珠顶端的下皮层产生的大孢子母细胞扩大并且经历减数分裂和两次细胞分裂来形成大孢子的直列四分孢子，每个直列四分孢子具有单倍染色体数。在不同的植物种之间最常见的是，三个最顶端的孢子退化，同时功能性合点孢子经历三轮伴随细胞扩大的核分裂来形成具有一个卵细胞、两个助细胞和三个反极细胞的胚囊。无融合生殖是需要多个步骤和控制无融合生殖的整个途径的过程，因为已经显示，在某些种中需要多个基因的作用(vanDijk等，Heredity，Vol.83:715-721，1999；Matzk F.等，Plant Cell，17(1):13-24，2005)。已经认为，由途径中的一个基因或一亚组基因控制的各个组成步骤分开操作将对生殖力具有负面影响(Spillane，C，Steimer A.和Grossniklaus U.，Sex.Plant Reprod.Vol.14:179-87，2001)，并认为只有包括整个途径的整组基因协同作用才能有效地促进无融合生殖。对拟南芥突变体的遗传分析和分子分析已经导致鉴定了许多在孢子发生阶段和配子发生阶段起作用的基因(YangW.C.和Sundaresan V.，Curr.Opin.Plant Biol.Vol.3(1):53-57，2000)。拟南芥的dyad突变体经鉴定为导致雌性不育(Siddiqi I.等，Development，Vol.127(1):197-207，2000)并且对它的分析显示dyad突变体植株在雌性减数分裂中是有缺陷的。在该dyad突变体中大多数雌性性母细胞经历了单次减数分裂而产生两个细胞而不是四个细胞，之后停留在进一步的发育阶段(包括配子发生)。该dyad突变体中的雄性减数分裂、花粉发育和雄性能育性发现是正常的(Siddiqi I.等，Development，Vol.127(1):197-207，2000；ReddyT.V.等，Development，Vol.130(24):5975-5987，2003)。对雌性减数分裂过程中减数分裂的染色体的分析表明，同源染色体没有经历联会并且减数分裂1的减数分裂由均等分裂取代(Agashe B.，Prasad C.K.，和Siddiqi L，Development，Vol.129(16)，3935-3943，2002)。一项独立的研究已导致鉴定了与DYAD一致的SWI1基因(Motamayor J.C，等，Sex.Plant Reprod.Vol.12:209-218，2000；Mercier R.等，Genes and Dev.Vol.15:1859-1871，2001)。由这些研究鉴定的基因在下文中称为DYAD基因。来自拟南芥的野生型DYAD基因编码639个氨基酸的蛋白质(SEQ ID NO:5)。拟南芥中的DYAD基因的三个等位基因已经有所描述。这些等位基因是:i)dyad，在氨基酸508处截断；所得的蛋白质因而缺失了野生型蛋白质中存在的C-端130个氨基酸；ii)swil.1，其导致产生了减少量的野生型蛋白质，导致一些雌性性母细胞经历减数分裂1的均等分裂而其它性母细胞则经历减数分裂；以及iii)swil.2，其在位置394处产生终止密码子并导致类似于dyad的雌性表型，但是还另外导致在雄性减数分裂中有缺陷，导致雄性不育。Boechera中对应于dyad等位基因的位置应该是一个突变，导致在氨基酸序列的位置508移码并导致终止密码子在10个另外的密码子之后(即位置518)的。大米中的相应位置分别在563和572处。
不受本发明的任何理论的约束，本发明人认为具有多肽羧基端至位置394(在拟南芥中，并且在其它物种的相应位置)的部分的DYAD蛋白的量的减少，产生了其中雌性性母细胞经历减数分裂1的均等分裂，导致在雌配子中保留了母本基因型(并因而保留了杂合性)的表型。正常(或近似)量的具有从位置394至位置508(在拟南芥中，在其它物种的相应位置中)的结构域的DYAD蛋白的保持提供了正常的花粉发育，而植物中该结构域的缺失产生了雄性不育的表型。
在产生本发明之前，尚未报导dyad或swil.2等位基因纯合的植物显示出结实。已经报导携带有swil.1等位基因的植物在纯合时显示出减少的结实率，但已经分析了所产生的种子的染色体结构并发现它们是二倍体，因而表明该种子是由正常的大孢子发生和大形配子发生产生(Motamayor J.C等，Sex.Plant Reprod.Vol.12:209-218，2000)。如先前描述的，由于dyad、swil.1和swil.2中均等分裂、单次分裂的减数分裂而产生的孢子保持停止并且在产生本发明以前，还未知道任何这些是否具有发育成雌配子的潜能。在产生本发明以前也不知道是否染色体在均等的单次分裂的雌性减数分裂过程中经历了重组并因而该分裂产物丧失亲本的杂合性。伴随均等分裂发生的重组的似真性得到了在酵母中的研究的支持，该研究证明二倍体细胞可以进入减数分裂，经历减数分裂重组，然后在转移至生长培养基时停止减数分裂并进行有丝分裂。如果重组在基因和着丝点之间发生，则这种有丝分裂可导致遗传标记的杂合性丧失(Esposito R.E.和Esposito M.S.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA Vol.71(8):3172-31761974)。本发明涉及这样的发现:在不同的dyad纯合的突变体植株中所观察到的减数分裂1均等分裂的产物能够产生功能性的未减数胚囊，所述胚囊具有未减数孢子生殖的特性(无融合生殖的一种重要组分)。
本发明涉及使用拟南芥、Boechera、水稻、杨属(Populus)和其它植物的DYAD基因，尤其是其突变体等位基因，以及它们的基因产物来操纵配子发生和种子发育，以产生其胚基因型包含母体基因组的全二倍体组的种子。在一个实施方案中，在拟南芥和其它植物类型中产生了三倍体种子。
本发明还提供了用DYAD基因的突变体等位基因和基因产物产生杂种优势植物的方法。在一些实施方案中，植物和种子包含母体基因组的全二倍体组，并且没有父体基因组的贡献，因而表现为理想的无融合生殖体。在这些实施方案的一些实例中，贡献母体基因组的植株是拥有具有理想表型的等位基因的分配的杂种，并且本发明的方法使得能固定并且容易繁殖这样的等位基因的组合。
本发明涉及导致含有母体基因组的全二倍体组的种子形成的DYAD基因及其基因产物的使用。本发明可用于产生可用以产生无籽果、构建三体品系用于基因定位研究，以及保持亲本植株的杂合性和无融合生殖的三倍体植株。用于本发明的DYAD的等位基因导致未减数的(二倍体的)胚囊形成。本发明还涉及DYAD基因用于引起未减数胚囊的形成而基本上不影响花粉发育的用途。本发明还涉及DYAD基因用于通过三倍体自交来产生更高级别的多倍体的用途，所述多倍体将可用于产生具有增加的生物量的植物。
应该理解，本发明的多个实施方案将显示本发明的不同方面，并且可以提供本发明的不同优点。并不是每个实施方案都将享有本发明的所有优点。
定义:
短语“核酸序列”指从5′末端至3′末端读取的脱氧核糖核酸或核糖核酸碱基的聚合物的结构。在双链核酸的情况中，“核酸序列”包括其在另一条链上的互补链。
“核酸”或“多核苷酸”指单链或双链的DNA或RNA聚合物(或者在一些情况中为脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的类似物，例如硫代磷酸酯或PNA类似物，或具有核苷酸碱基的衍生物的核苷酸)并包括染色体DNA、自我复制的质粒、DNA或RNA(或类似物)的感染性聚合物和起一级结构作用的DNA或RNA(或类似物)。
术语“多核苷酸序列”常常可与“多核苷酸”互换，但有时可以指分子的序列信息，而不是指分子本身。
“启动子”定义为引导有效连接的核酸转录的一组核酸控制序列。如本文所用的，“植物启动子”是在植物中发挥功能的启动子。启动子包括转录起始位点附近的必需核酸序列，例如，在聚合酶II型启动子的情形中，为TATA元件。启动子还任选包括远端增强子或抑制元件(repressor element)，其可位于离转录起始位点数千个碱基对之多处。“组成型”启动子是在大多数环境和发育条件下有活性的启动子。“诱导型”启动子是在环境或发育调节下有活性的启动子。术语“有效连接的”指核酸表达控制序列(例如启动子，或一组转录因子结合位点)和另一核酸序列之间的功能性连接，其中所述表达控制序列引导对应所述的另一序列的核酸的转录。
“表达盒”包括三个主要元件:i)启动子；ii)另一多核苷酸，其可以称作“编码多核苷酸”或“编码序列”，所述多核苷酸有效连接至所述启动子并且在表达盒导入细胞时它的转录由所述启动子引导；以及iii)终止子多核苷酸，其引导转录停止并直接位于所述另一多核苷酸的下游。
术语“植株”包括整个植物、植物器官(例如叶、茎、花、根等)、种子和植物细胞及它们的后代。可用于本发明方法的植物类型通常是可接受转化技术的高等植物类型范围，包括被子植物(单子叶植物和双子叶植物)以及裸子植物。它包括多种多倍性程度的植物，包括多倍体、二倍体和单倍体。在本发明的一些实施方案中，优选所述植物是雌雄同株植物。
如果多核苷酸具有不同的序列并源自外来种，或者如果来自相同种则是从它原始形式修饰产生的，则所述多核苷酸是与有机体或另一多核苷酸“异源的”。例如，有效连接至启动子的异源编码序列指来自与该启动子源自的种不同的种的编码序列，或者如果来自相同种，则指与任何天然存在的等位基因变体不同的编码序列。
对单独株“外源性的”多核苷酸是通过除有性杂交外的任何手段导入所述植物体中的多核苷酸。通过其可以实现外源性多核苷酸导入的方法的实例在下面描述，并且包括农杆菌(Agrobacterium)-介导的转化、基因枪方法、电穿孔等。这种含有外源性核酸的植物在这里称作R1代转基因植物。由有性杂交或通过自交产生的转基因植物是这种植物的后代。
用于本发明的“DYAD核酸”或“DYAD多核苷酸序列”是核酸的子序列或该核酸的全长多核苷酸序列，所述核酸编码参与控制减数分裂的多肽并且其在突变时使得能发生关于未减数雌配子体形成的无融合生殖。
“DYAD基因”包含DYAD核酸以及一起的供DYAD基因产物在宿主细胞(优选植物)中表达的启动子以及其它转录和翻译控制序列。
DYAD基因是一类产生包含蛋白质编码部分的转录产物的植物基因并且已经在水稻(Genbank ID:62733414)和其它植物中鉴定，所述的蛋白质编码部分编码的多肽与拟南芥DYAD基因(SEQ ID NO:1)编码的多肽具有基本的序列同一性。DYAD基因也已经在毛果杨和玉米中鉴定(实施例9)。DYAD基因在野生型拟南芥中以单拷贝存在。而且，转录产物的丰度非常低，因为它只在孢母细胞中表达，所述孢母细胞在生殖组织中构成非常小的细胞群。以前已显示拟南芥DYAD基因在减数分裂的染色体组建中起关键作用(Agashe B.，Prasad C.K.，and Siddiqi I.，Development Vol.129(16):3935-39432002)。因此，它的这种作用极可能在其它植物种中观察到，正如在水稻中存在密切相关的基因所表明的。本申请中的数据确定Boechera也具有在序列上与所述拟南芥DYAD基因密切相关的DYAD基因。
在转基因的表达和内源基因的抑制(例如，通过RNA干扰、反义或有义抑制)这两种情形中，技术人员将认识到，使用的多核苷酸序列不需要与其源自的基因序列或待抑制的多核苷酸序列一致，而是可以仅“基本上一致”。如下文中说明的，这些基本上一致的变体特别是由术语DYAD核酸所涵盖。
在其中多核苷酸序列转录和翻译产生功能性多肽的情形中，技术人员将认识到，由于密码子简并性许多多核苷酸序列将编码相同的多肽。这些变体特别是由术语“DYAD核酸”所涵盖。另外，该术语特别是包括与本文公开的DYAD多核苷酸序列基本一致(根据下面描述测定)的那些序列以及编码是野生型DYAD多肽的突变体或保持了所述DYAD多肽的功能的多肽(例如，保守置换DYAD多肽中的氨基酸而产生)的那些序列。而且，变体可以是编码如下描述的显性负性突变体以及导致过早转录终止的无义突变体或移码突变体的那些序列。
如果两个核酸或多肽分子中的核苷酸序列或氨基酸残基序列分别在如下描述进行比对获取最大对应性时是相同的，则这两种核酸或多肽称为是“一致的”。在两个或多个核酸或多肽序列的情况下，术语“一致的”或“百分比一致性”指在比较窗口比较和比对获取最大对应性时，为相同的或具有指定百分比的氨基酸残基或相同核苷酸的两个或多个序列或子序列，所述的最大对应性是用一种下列的序列比较算法或者通过手动比对和目测来测量。当序列一致性百分比用于指蛋白质或肽时，应该认识到，不一致的残基位置通常因为保守性氨基酸置换而不同，其中氨基酸残基置换成了具有相似化学性质(例如，电荷或疏水性)的其它氨基酸残基并因而没有改变该分子的功能性质。如果序列因保守置换而不同，则可以上调百分比序列一致性来校正取代的保守性性质。用于进行这种调整的方法是本领域那些技术人员熟知的。通常，，这涉及将保守置换打分为部分错配而不是完全错配，从而增加了百分比序列一致性。因此，例如，如果一致的氨基酸的打分为1，而非保守置换的打分为0，则保守置换的打分在0和1之间。保守置换的打分可根据(例如)Meyers & Miller的算法(ComputerApplic.Biol.Sci.4:11-17(1988))，例如根据在程序PC/GENE(Intelligenetics，Mountain View，Calif.，USA)中实现的该算法来计算。
在两个核酸或多肽的情形中，短语“基本一致的”指利用其中一种下列的序列比较算法或者通过手动比对和目测测量，在比较窗口比对获取最大对应性时，具有至少60％，优选80％，最优选90-95％的核苷酸或氨基酸残基一致性的序列或子序列。该定义也指测试序列的互补序列，所述的互补序列在所述测试序列与参考序列具有基本一致性时具有基本的序列互补性或子序列互补性。
对于序列比较，通常将一个序列用作测试序列与其比较的参考序列。当使用序列比较算法时，将测试序列和参考序列输入电脑中，指定子序列坐标，并且如果需要，指定序列算法程序参数。通常使用程序参数的默认值，但可以指定参数的备选值。然后基于程序参数，序列比较算法计算出测试序列相对参考序列的百分比序列一致性。
如本文使用的，“比较窗口”包括对连续位置的片段，通常为20-600，通常约50至约200，更常见约100至约150个连续位置的指代，在所述的连续位置中在两个序列经最佳比对后，一个序列可以与相同数量的连续位置的参考序列进行比较。用于比较的序列的比对方法是本领域所熟知的。用于比较的序列的最佳比对可以例如通过以下方法进行:Smith & Waterman(Adv.Appl.Math.2:482(1981))的局部同源性算法、Needleman & Wunsch(J.Mol.Biol.48:443(1970))的同源性比对算法、Pearson & Lipman(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:2444(1988))的相似性搜索方法、这些算法的计算机实现(GAP、BESTFIT、FASTA以及Wisconsin Genetics软件包中的TFASTA(Genetics Computer Group、575 Science Dr.，Madison，Wis.))或手动比对和目测。
可用的算法的一个实例是PILEUP。PILEUP用渐进成对比对(progressive pairwise alignment)来产生相关序列组的多序列比对，以便显示关系和百分比序列一致性。它还绘制了显示聚类关系的关系树或树状图，用于产生比对。PILEUP采用了对Feng D.F.，&Doolittle，R.F.，J.Mol.Evol.Vol.35:351-360(1987)的渐进比对法的简化。使用的方法类似于Higgins & Sharp，CABIOS 5:151-153(1989)描述的方法。该程序可以比对最多300个序列，每个序列的最大长度为5,000个核苷酸或氨基酸。多序列比对方法起始于两个最相似序列的成对序列比对，产生了两个比对序列的簇。然后将该簇与下一个最相关的序列或比对序列簇进行比对。两个序列簇通过两个独立序列的成对序列比对的简单延伸来进行比对。最终的比对通过一系列的渐进成对比对完成。该程序通过指定具体序列及它们序列比较区域的氨基酸或核苷酸坐标以及通过指定程序参数来运行。例如，可以使用以下参数:默认的空位权重(gap weight)(3.00)、默认的空位长度权重(gap length weight)(0.10)和加权的末端空位(weighted endgap)，将参考序列与其它测试序列比较以便测定百分比序列一致性关系。
适用于测定百分比序列一致性和序列相似性的算法的另一个实例是BLAST算法，其在Altschul S.F.等，J.Mol.Biol.Vol.215:403-410(1990)中有所描述。用于实施BLAST分析的软件是可通过Nationa lCenter for Biotechnology Information(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)公开获得的。该算法涉及首先通过确定查询序列中的长度为W的短字串(word)来确定高得分序列对(HSP，high scoring sequence pair)，所述查询序列的长度W的短字串在与数据库序列中相同长度的字串比对时匹配或满足一些为正值的得分阈值T。T称为邻近字串(neighborhood word)得分阀值(Altschul S.F.等，J.Mol.Biol.Vol.215:403-410(1990))。将这些初始的命中邻近字串(neighborhood word hit)作为种子用于起始搜索以找到含有它们的更长HSP。将命中字串(word hit)沿着每个序列的两个方向延伸直到累积的比对打分不可以增加。在下列情况下停止命中字串在每个方向上的延伸:累积的比对打分从它的最大获得值下降了数量X；累积打分由于一次或多次负得分残基比对的累积而成为0或低于0；或者到达了任一序列的末端。BLAST算法的参数W、T和X决定了比对的敏感性和速度。所述BLAST程序以默认设置使用:字串长度(W)为11、BLOSUM62打分矩阵(参见Henikoff &Henikoff，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10915(1989))比对(B)为50、期望值(E)为10、M＝5，N＝-4以及两条链都比较。
BLAST算法也进行两个序列之间的相似性的统计分析(参见，例如Karlin & Altschul，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873-5787(1993))。由BLAST算法提供的一种相似性测量是最小加和概率(smallest sum probability)(P(N))，其提供了有关两个核苷酸或氨基酸序列之间的匹配将偶然发生的可能性的指示。例如，如果在测试核酸与参考核酸的比较中最小加和概率小于约0.2，更优选小于约0.01，并且最优选小于约0.001，则认为该核酸与参考序列相似。“经保守修饰的变体”适用于氨基酸和核酸序列两者。对于特殊的核酸序列，经保守修饰的变体指编码相同的或基本相同的氨基酸序列的那些核酸，或者如果核酸不编码氨基酸序列，则指基本上一致的序列。由于遗传密码子的简并性，大量的功能相同的核酸编码任意给定的蛋白质。例如，密码子GCA、GCC、GCG和GCU都编码氨基酸丙氨酸。因此，在每个丙氨酸由一个密码子确定的位置处，可将该密码子改变成任意描述的相应密码子而不会改变编码的多肽。这种核酸变异是“沉默变异”，其为经保守修饰的变异的一种。这里的编码多肽的每种核酸序列也描述了该核酸的每种可能的沉默变异。技术人员将认识到，可以修饰核酸中的每个密码子(除了AUG，其通常为甲硫氨酸的唯一密码子)来产生功能相同的分子。因此，编码多肽的核酸的每种沉默变异在每种描述的序列中是隐含的。
“基本一致的序列”，是指其中序列的改变没有影响分子的期望功能的序列。
对于氨基酸序列，技术人员将认识到，对核酸、肽、多肽或蛋白质序列的单独的取代、删减或添加(其改变、添加或删减了编码序列中的单个氨基酸或小比例的氨基酸)在该改变导致氨基酸由化学相似的氨基酸置换时是“经保守修饰的变异”。提供功能相似的氨基酸的保守置换表是本领域所熟知的。
下面的6组每组包含为相互保守置换的氨基酸:
1)丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；
2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；
3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；
4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)；
5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V)；和
6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)。(参见，例如Creighton，Proteins(1984))。
两个核酸序列或多肽基本上一致的指示是由第一核酸编码的多肽可与产生对抗由第二核酸编码的多肽的抗体发生免疫杂交反应。因而，例如，如果两个肽仅因保守置换而不同，则所述的一个多肽通常与另一个多肽基本一致。两个核酸序列基本一致的另一指示是两个分子或它们的互补序列在如下描述的严格条件下互相杂交。
短语“选择性(或特异性)杂交”指当核苷酸序列存在于复杂混合物(例如，整个细胞或文库DNA或RNA)中时，在严格杂交条件下分子仅与特定的核苷酸序列结合、形成双链体或杂交。
短语“严格杂交条件”指这样一种条件:在该条件下探针将与其靶子序列杂交，通常是与核酸的复杂混合物中的靶序列杂交，但是不与其它序列杂交。严格条件是序列-依赖性的，并且在不同的环境下将会不同。更长的序列在更高的温度下特异性杂交。对核酸杂交的广泛指导在Tijssen，Techniques in Biochemistry and MolecularBiology--Hybridization with Nucleic Probes，“Overview ofprinciples of hybridization and the strategy of nucleic acidassays”Elsevier(1993)中找到。通常，在确定的离子强度pH下，选择严格条件为比特定序列的热解链温度(Tm)约低5-10℃。低严格条件通常选择为低于Tm约15-30℃。Tm指这样的温度(在确定的离子强度、pH和核酸浓度下):在该温度下，平衡时，50％的与靶标互补的探针与靶序列杂交(在靶序列过量存在时，在Tm下，平衡时50％的探针被占据)。严格条件是其中盐浓度低于约1.0M钠离子，通常约0.01-1.0M钠离子浓度(或其它盐)，pH为7.0-8.3，并且对于短的探针(例如10-50个核苷酸)温度至少约30℃，而对于长的探针(例如大于50个核苷酸)温度至少约60℃的那些条件。严格条件也可以通过加入去稳定剂例如甲酰胺实现。对于选择性或特异性杂交，阳性信号是背景的至少2倍，优选是背景杂交的10倍。
如果它们编码的多肽是基本一致的，则在严格条件下不互相杂交的核酸仍然是基本一致的。例如，当核酸的一个拷贝用遗传密码允许的最大密码子简并产生时出现这种情况。在这种情形中，核酸通常在中度严格杂交条件下杂交。
在本发明中，包含用于本发明的DYAD核酸的基因组DNA或cDNA可以在严格条件下，用在这里公开的核酸序列在标准DNA印迹中确定。为了本公开内容的目的，用于该杂交的合适的严格条件是包括下列情况的那些条件或等效的条件:在37℃下于40％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS的缓冲液中杂交，以及在至少约50℃，优选约55℃，高达约60℃的温度下，在0.1×至1×SSC，优选0.5×SSC，更优选0.2×SSC中至少洗涤一次，洗涤20分钟。阳性杂交是背景的至少2倍。一般技术人员将容易认识到，可以利用备选的杂交和洗涤条件来提供类似的严格性。
两个多聚核苷酸基本一致的另一个指示是，由一对寡核苷酸引物对扩增的参考序列是否随后可在严格杂交条件下用作探针来从cDNA或基因组文库中分离出测试序列，或在例如RNA印迹或DNA印迹中确定测试序列。
“植物杂种”定义为通过使相同植物种的两个品种杂交而获得的植物。
“种间杂种”定义为通过杂交不同种的两种植物获得的植物。
生殖事件中的“母本”定义为具有种子的植株。
本发明提供了DYAD基因及其产物以及涉及应用分子遗传方法来控制种子发育和无融合生殖的方法。本发明还涉及DYAD基因的突变体等位基因，所述突变体等位基因表达缺失了天然蛋白质C-端部分的截短形式的DYAD多肽，并导致未减数雌配子体的发育而同时保持了花粉发育基本不变，这可通过花粉活力检测和雄性减数分裂中的染色体分离的显微镜检查确定。本发明也涉及DYAD基因的雌性特异性突变体等位基因的核苷酸序列，所述雌性特异性突变体等位基因编码缺失天然DYAD多肽C-端部分的DYAD多肽，并使得植物中该突变多肽的表达特异性地导致未减数雌配子体的发育但基本不影响花粉发育。这种突变体等位基因将表达这样的DYAD多肽，例如在拟南芥的突变体等位基因的情形中，该多肽缺失了全部或部分的在SEQ ID NO:5中的氨基酸509和氨基酸639之间的天然多肽序列部分，但确实含有编码最多至氨基酸394的多肽序列的所有区域。此外，本发明还提供了这样的核苷酸序列:其在严格条件下与SEQ ID NO:4中给出的序列杂交并编码天然DYAD多肽的C-端缺失型衍生物，其中所述缺失部分对应于SEQ ID NO:5中氨基酸509和639之间的区域，这通过利用比较窗口与SEQ ID NO:5比较测定。Boechera、水稻和杨树的DYAD蛋白的对应部分可以结合图11确定。本发明的组合物还包括天然DYAD多肽序列的C-端缺失型衍生物，以及由上述DYAD多肽序列和蛋白质序列(例如糖皮质激素受体蛋白)形成的融合蛋白和编码它们的核酸，所述蛋白质序列条件性地运送该融合蛋白至植物细胞的细胞核内。
本发明的方法包括在植物中表达DYAD多核苷酸序列以产生保留了母体基因型的未减数雌配子。这种未减数雌配子的产生可用于设计无融合生殖和固定杂种优势，以及用于产生三倍体植物。在本发明的一个实施方案中，DYAD多肽序列可以通过任意几种熟知的转化方法导入植物的基因组中，其中所述DYAD多肽序列在所述植物中表达为反义RNA或双链RNA，从而导致对内源DYAD基因的抑制并导致未减数雌配子的产生。在本发明的另一个实施方案中，将C-端缺失的DYAD多核苷酸序列作为表达盒的部分导入植物的基因组中并导致未减数雌配子体的形成，而同时保持花粉的发育基本不受影响。导致未减数雌配子体形成的DYAD多核苷酸序列在植物中的表达可随后用于通过卵细胞孤雌发育成胚来产生无融合种子。这种DYAD多核苷酸序列在植物杂种中的表达导致未减数雌配子的形成，该未减数雌配子保留了母体的基因型从而导致在下一世代中固定了杂种优势。杂种优势的固定是非常有用的，因为它将使得能通过自交而不必借助于不同基因型的两种亲本品种之间的杂交来进行杂种种子的繁殖。
本发明还有另一个实施方案是导致未减数雌配子形成的DYAD多核苷酸序列在植物种的种间杂种中的表达，其可用于产生无融合种子。这种无融合种子的产生可用于将一种植物种的农艺学上有用的基因渗入进另一物种中。然而，本发明的又一个实施方案涉及DYAD多核苷酸序列或DYAD多肽序列的条件性表达或可控表达和/或其活性。这种条件性表达可用于促进未减数雌配子的产生并从而促进无融合种子的产生(仅在需要时)。用于影响多核苷酸序列和多肽序列在植物中的条件性表达或活性的方法是本领域中熟知的，并且包括(但不限于)乙醇可诱导的基因表达(Devaux等，Plant J.，Vol.36(6):918-930，2003)、类固醇激素可诱导的活性控制(Schena M.，Lloyd A.M.和Davis R.W.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA Vol.88(23):10421-10425，1991)以及四环素介导的表达控制(Bohner S.等，PlantJ.Vol.9(1):87-95，1999)。
下面的实施例6描述了本发明的一个实施方案，其中可以开发出显示dyad突变表型的纯系的植物群体。所述植物群体可以通过采用条件性DYAD RNAi或反义来实现，其中所述DYAD RNAi或反义构建体在条件性启动子的控制下表达。本发明的另一个表现形式是这样一种形式:其中将DYAD基因的互补拷贝在dyad突变体等位基因是纯合的遗传背景中，在条件性启动子的控制下在植物中表达。本发明的另一个表现形式将采用第一种植物与表达反式激活因子的第二种植物杂交，所述第一种植物携带有在启动子的控制下表达的DYAD RNAi或反义构建体，所述启动子在所述反式激活因子的控制下表达，并且其中所述第一种植物缺少所述反式激活因子。
如本文描述制备的分离的序列可用于许多技术中，例如用于抑制或改变内源性DYAD基因的表达。植物中DYAD基因表达或DYAD活性的调节是特别有用的，例如作为产生无融合种子的系统的部分。
DYAD核酸的分离
一般而言，在下面描述的重组DNA技术中的术语和实验室方法是本领域所熟知且通常采用的那些。将标准技术用于克隆、DNA和RNA分离、扩增和纯化。通常，涉及DNA连接酶、DNA聚合酶、限制性内切酶等的酶促反应按照产商的说明书进行。这些技术和多种其它技术通常根据Sambrook等的Molecular Cloning—A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，N.Y.，(1989)进行。
DYAD核酸的分离可以通过许多技术完成。例如，可将基于在此公开的序列的寡核苷酸探针用于在cDNA或基因组DNA文库中鉴定所需基因。为了构建基因组文库，基因组DNA的大片段通过随机产生断裂而产生，例如用限制性内切酶产生，并将所述片段与载体DNA连接以形成可以包装成合适载体的连环体。为了制备cDNA文库，将mRNA从理想的器官(例如胚珠)分离，并用所述mRNA制备含有DYAD基因转录物的cDNA文库。备选地，cDNA可以由从DYAD基因或同系物在其中表达的其它组织提取的mRNA制备。
然后可以用基于在这里公开的克隆DYAD基因的序列的探针筛选该cDNA文库或基因组文库。探针可用于与基因组DNA或cDNA序列杂交以分离出相同或不同植物种中的同源基因。备选地，可以将产生对抗DYAD多肽的抗体用于筛选mRNA表达文库。
备选地，可以用扩增技术从核酸样本扩增所关注的核酸。例如，可将聚合酶链式反应(PCR)技术用于直接从基因组DNA、cDNA、基因组文库或cDNA文库扩增DYAD基因的序列。PCR和其它体外扩增方法也可用于(例如)克隆编码待表达蛋白质的核酸序列、用于制备核酸以用作探针用于检测样品中所需mRNA的存在、用于核酸测序或用于其它目的。对于PCR的综述，参见PCR Protocols:A Guide to Methodsand Applications.(Innis，M，Gelfand，D.，Sninsky，J.和White，T.，eds.)，Academic Press，San Diego(1990)。
用于鉴定植物组织的DYAD序列的合适引物和探针通过将在这里提供的序列与其它DYAD相关基因或它们编码的蛋白质进行比较而产生。例如，可以将Boechera holboelli DYAD与来自水稻的密切相关的基因(Genbank ID No.50917243)进行比较。利用这些技术，技术人员可以确定在这里公开的基因或多肽中的保守区域以便制备合适的引物和探针序列。与DYAD相关基因的保守区域特异性杂交的引物可用于扩增来自差异大的植物种的序列。然后可将使用上面所公开的条件的标准核酸杂交技术用于确定全长的cDNA或基因克隆。
DYAD活性或基因表达的控制
由于DYAD基因涉及控制减数分裂和雌配子体的倍性，抑制内源DYAD活性或基因表达可用于许多方面。例如，通过利用携带有如上描述的C-端缺失的等位基因抑制表达或修饰DYAD活性可用于产生没有种子或具有小的/退化了的种子的果实(这里称作“无籽果”)。在多数植物种中，三倍体的产生导致生殖细胞的形成有缺陷(归因于减数分裂中染色体的不平衡分离)并导致没有种子或形成小的/退化了的种子。对内源DYAD表达或活性的抑制可使得能控制倍性。因而，在其中DYAD活性受到抑制或修饰的本发明植物的实施方案中，种子缺乏或退化而产生了无籽果。
本发明的核酸的另一个用途是用于开发无融合生殖的植物系(即，其中无性生殖过程在胚珠中发生的植物，对于无融合生殖的论述，参见KoltunowA.，Plant Cell，Vol.5:1425-1437(1993))。无融合生殖提供了一种选择和固定不容易通过传统育种来保持的复杂的杂合基因型的新手段。因而，例如，可以获得并容易保持具有理想形状(例如杂种优势)的新的杂交系。
技术人员将认识到许多方法可用于调节DYAD活性或基因表达。可以在植物细胞中在基因水平、转录水平、转录后水平、翻译水平或翻译后水平上调节DYAD活性。用于在每种这些水平上调节DYAD活性的技术通常是技术人员所熟知的并且一些技术在下面简要论述。
用于将遗传突变导入植物基因中的方法是熟知的。例如，可以根据标准技术，用诱变化学物质处理种子或其它植物材料。这样的化学物质包括(但不限于)下列物质:硫酸二乙酯、氮丙啶、甲基磺酸乙酯和N-亚硝基-N-乙脲。备选地，可以使用来自放射源例如X射线、γ射线或快中子的电离辐射。携带DYAD序列突变的植物可以通过用PCR引物扩增DYAD核苷酸序列，之后分析PCR产物以鉴定具有DYAD多核苷酸序列遗传突变的植物来分子筛选经诱变处理的收集的植物种群而鉴定。用于筛选和鉴定携带特异性基因序列突变的植物的方法已有所描述(Henikoff S.，Bradley T.J.和Comai L.，Plant Physiol.Vol.135(2):630-636，2004)。
备选地，同源重组可用于通过特异性删减或改变DYAD基因来在体内诱导靶基因分裂(通常，参见Grewal和Klar，Genetics 146:1221-1238(1997)以及Xu等，Genes Dev.10:2411-2422(1996))。同源重组已经在植物中得到证实(Puchta等，Experientia 50:277-284(1994)、Swoboda等，EMBO J.13:484-489(1994)、Offringa等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:7346-7350(1993)以及Kempin等，Nature 389:802-803(1997))。
在将同源重组技术应用于本发明的基因中，DYAD基因序列选择部分(包括5′上游区、3′下游区和基因内区段)中的突变(例如在这里公开的那些突变)可在体外进行并然后利用标准技术导入所需植物中。由于已经知道同源重组技术的效率取决于使用的载体，如Mountford等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:4303-4307(1994)，以及Vaulont等，Transgenic Res.4:247-255(1995)描述的双顺反子基因靶向载体的使用可便利地用于增加选择改变的DYAD基因在转基因植物中表达的效率。突变基因将以这样的方式与靶标野生型基因相互作用，该方式使得将在转基因植物细胞中发生野生型基因的同源重组和靶向置换，导致抑制DYAD活性。
备选地，可以使用由在末端具有双发夹帽(double hairpin cap)的双链体构象的一段连续的RNA和DNA残基组成的寡核苷酸。将RNA/DNA序列设计成与靶标DYAD基因的序列对齐并包括所需的核苷酸变化。染色体外的T-DNA质粒上的嵌合寡核苷酸的导入导致少量转化的植物细胞中由嵌合分子引导的有效且特异性的DYAD基因转换。这种方法在Cole-Strauss等，Science 273:1386-1389(1996)和Yoon等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:2071-2076(1996)中描述。
基因表达可用重组DNA技术，通过用含有转座子或T-DNA序列的构建体转化植物细胞来失活。通过这些方法制备的DYAD突变体可根据标准技术鉴定。例如，突变体可以通过PCR检测或者通过(例如)RNA印迹或反转录，之后通过PCR(RT-PCR)检测DYAD mRNA的存在或缺失而得以检测。也可以通过筛选生殖力、雌性减数分裂和大孢子发育的改变来选择突变体。
如本文描述制备的分离的核酸序列还可以用于许多技术中以在多种水平上控制内源DYAD基因的表达。来自在此公开的序列的子序列可用于控制转录、RNA积聚、翻译等。
许多方法可用于抑制植物中的基因表达。例如，可以便利地使用RNA干扰(RNAi)技术。为实现这个目的，将来自所需基因的核酸片段克隆为反向重复序列，其中两个拷贝由通常为5至2000个核苷酸长，优选为30至500个核苷酸并且更优选为50至200个核苷酸的间隔序列隔开。将所述反向重复序列有效地连接至启动子，之后有效连接至终止子，使得这两个拷贝都将被转录并产生沿其长度的全部或部分自我互补的RNA类型。然后将该构建体转化进植物中并产生双链RNA。
作为另一个实例，反义技术可便利地用于抑制DYAD基因的表达。为实现该目的，将来自所需基因的核酸片段克隆并有效地连接至启动子，使得将会转录RNA反义链。然后将该构建体转化进植物中并产生RNA反义链。在植物细胞中，据认为反义抑制可以在所有水平的基因调节上起作用(包括RNA翻译的抑制)(参见Bourque Plant Sci.(Limerick)105:125-149(1995)、Pantopoulos In Progress inNucleic Acid Research and Molecular Biology，Vol.48.Cohn，W.E.和K.Moldave(Ed.).Academic Press，Inc.:San Diego，Calif.，USA、London，England，UK.p.181-238；Heiser等，Plant Sci.(Shannon)127:61-69(1997))并且通过防止编码所关注蛋白质的mRNA积聚而发挥作用(参见，Baulcombe Plant Mol.Bio.32:79-88(1996)；Prins和Goldbach Arch.Virol.141:2259-2276(1996)；Metzlaff等，Cell 88:845-854(1997)，Sheehy等，Proc.Nat.Acad.Sci.USA，85:8805-8809(1988)以及Hiatt等，美国专利No.4,801,340)。
待导入的核酸片段通常将与内源DYAD基因或待抑制的基因的至少一部分基本一致。然而，该序列不需要完全一致来抑制表达。可以设计本发明的载体，使得抑制效果适用于显示与靶基因同源或基本同源的基因家族中的其它基因。
对于反义抑制，相对于初级转录产物或完全加工的mRNA，所述的导入序列也不需要是全长的。通常，较高同源性可用于补偿较短序列的使用。此外，所述的导入序列不需要具有相同的内含子或外显子模式，并且非编码片段的同源性可以同样有效。通常，应使用约30或40个核苷酸至约全长的核苷酸之间的序列，但是优选为至少约100个核苷酸的序列，更优选为至少约200个核苷酸的序列，并且尤其优选为约500至约1700个核苷酸的序列。
可靶向许多基因区用以抑制DYAD基因的表达。靶标可包括(例如)编码区、内含子、来自外显子/内含子接合处的序列、5′或3′非翻译区等。在一些实施方案中，可以设计该构建体以消除调节蛋白结合至DYAD基因序列的能力，所述的调节蛋白是DYAD基因序列的细胞特异性和/或组织特异性表达所需要的。这种转录调节序列可以位于基因的5′-、3′-或编码区内并且可以促进(正调节元件)或抑制(负调节元件)基因转录。这些序列可以用本领域技术人员熟知的标准的缺失分析来确定。一旦该序列确定，将靶向这些序列的反义构建体导入植物中以控制特定组织(例如发育中的胚珠和/或种子)中的基因转录。
基于寡核苷酸的三螺旋形成可用于破坏DYAD基因的表达。三链DNA可以抑制DNA转录和复制，产生位点特异性突变、分裂DNA并诱导同源重组(参见，例如Havre和Glazer J.Virology 67:7324-7331(1993)；Scanlon等，FASEB J.9:1288-1296(1995)；Giovannangeli等，Biochemistry 35:10539-10548(1996)；Chan和Glazer J.Mol.Medicine(Berlin)75:267-282(1997))。三螺旋DNA可用于靶向确定用于反义调节的相同序列。
催化性RNA分子或核酶也可以用于抑制DYAD基因的表达。有可能设计实际上与任何靶标RNA特异性配对并在特定位置处切割磷酸二酯主链，从而在功能上使靶标RNA失活的核酶。在实施这种切割时，所述核酶自身不受改变，并因而能够回收利用并切割其它分子，使其成为真正的酶。在反义RNA中包含核酶序列在其上赋予了RNA切割活性，从而增加了该构建体的活性。因而，核酶可用于靶向确定用于反义调节的相同序列。
已经鉴定了许多类型的核酶。一种类型的核酶源自植物中的许多能够自我切割和复制的小环状RNA。所述RNA可单独复制(类病毒RNA)或者与辅助病毒一起复制(卫星RNA)。实例包括来自鳄梨日斑类病毒的RNA、来自烟草环斑病毒、紫花苜蓿短暂条纹病毒、绒毛烟草斑驳病毒、茄属植物斑驳病毒和地下三叶草斑驳病毒的卫星RNA。靶标RNA-特异性核酶的设计和使用在Zhao和Pick，Nature 365:448-451(1993)；Eastham和Ahlering J.Urology 156:1186-1188(1996)、Sokol和Murray，Transgenic Res.5:363-371(1996)、Sun等，Mol.Biotechnology 7:241-251(1997)和Haseloff等，Nature，334:585-591(1988)中有所描述。
另一种抑制方法是正义共抑制(sense cosuppression)。以有义取向构造的核酸的导入已显示为一种通过其阻断靶基因转录有效的手段。对于使用该方法来调节内源基因的表达的实例，参见Assaad等，Plant Mol.Bio.22:1067-1085(1993)、Flavell Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:3490-3496(1994)、Stam等，Annals Bot.79:3-12(1997)、Napoli等，The Plant Cell 2:279-289(1990)以及美国专利No.5,034,323、No.5,231,020、和No.5,283,184。
如果导入序列本身不含有编码序列，而仅含有内含子或与内源序列的初级转录物中存在的序列同源的非翻译序列，则可能会发生抑制作用。导入序列通常将与想要抑制的内源序列基本一致。这种最低限度的一致性通常将大于约65％，但更高的一致性可能起到更有效抑制内源序列表达的作用。大于约80％的充分更高的一致性是优选的，但是约95％至完全一致将是最优选的。如同反义调节的情况一样，这种作用应该适用于显示同源或基本同源的相似基因家族中的任何其它蛋白质。
对于正义抑制，相对于初级转录产物或完全加工的mRNA，所述的导入序列(要求低于绝对一致)也不需要是全长的。这对于避免一些植物(过表达者)的同时产生来说是优选的。比全长序列短的序列的较高一致性抵偿了较长的、较低一致性的序列。此外，导入序列不需要具有相同的内含子或外显子类型，并且非编码片段的一致性将同样有效。通常，使用上面提及的用于反义调节的尺寸范围的序列。另外，可利用共抑制技术靶向关于反义调节而提及的相同的基因区域。
备选地，消除DYAD细胞特异性基因表达所需的蛋白质可调节DYAD活性。因而，调节蛋白质的表达和/或控制DYAD基因表达的序列的表达可用这里描述的方法调节。
另一种方法是使用设计的DYADmRNA翻译的tRNA抑制。该方法涉及将抑制型tRNA用于反式激活含有提前终止密码子的靶基因(参见Betzner等，Plant J.11:587-595(1997)，以及Choisne等，Plant J.11:597-604(1997))。首选产生含有组成型表达的DYAD基因的植物系，所述DYAD基因包琥珀终止密码子。还产生了多个植物系，每个植物系含有在细胞型特异性启动子引导下的tRNA抑制基因构建体。然后将该tRNA基因构建体杂交进该DYAD系中以便以靶向的方式激活DYAD活性。这些tRNA抑制系也可以用于靶向相同细胞或组织类型的任何类型的基因的表达。
显性阴性形式的DYAD多肽的产生是抑制内源DYAD活性的一种便利手段，所述DYAD多肽在它们结合至其它蛋白质的能力方面是有缺陷的。该方法涉及用编码突变体DYAD多肽的构建体转化植株，所述突变体DYAD多肽与内源性蛋白质形成缺陷型复合物并从而阻止该复合体正常形成。该突变体多肽通过氨基酸置换、添加、缺失等而在一级结构水平上与天然存在的序列不同。这些修饰可以以许多种组合使用以产生最终的经修饰的蛋白质链。将显性阴性突变体用于使靶基因失活在Mizukami等，Plant Cell 8:831-845(1996)中有所描述。
影响DYAD蛋白与自身或其它蛋白质相互作用的能力的另一个策略涉及DYAD特异性抗体的使用。在这种方法中，将DYAD特异性抗体的细胞特异性表达用于通过抗体:抗原识别来使功能性结构域失活(参见，Hupp等，Cell 83:237-245(1995))。
本发明的核酸用于增强DYAD基因表达的用途
如本文描述制备的分离的序列也可用于引入特定DYAD核酸的表达以增强或增加内源性基因的表达。增强表达也可用于(例如)通过防止植物结籽来增加营养生长。如果基因过表达是期望的，则可以将来自不同种的所需基因用于减小潜在的正义抑制作用。
技术人员将认识到，由本发明基因编码的多肽，与其它蛋白质一样，具有行使不同功能的不同结构域。因而，所述基因序列不需要是全长的，只要能表达所述蛋白质的所需功能性结构域。
经修饰的蛋白质链也容易用本领域技术人员熟知的和在下面详细描述的多种重组DNA技术设计。例如，所述链可以通过氨基酸置换、添加、缺失等而在一级结构水平上与天然存在的序列不同。这些修饰可以以许多种组合使用以产生最终的经修饰的蛋白质链。
重组载体的制备
为了在上述技术中使用分离的序列，制备了适用于植物细胞转化的重组DNA载体。用于转化各种种类的高等植物种的技术是熟知的并且在科技文献中有描述。参见，例如Weising等，Ann.Rev.Genet.22:421-477(1988)。编码所需多肽的DNA序列(例如编码全长蛋白质或DYAD与细胞内定位序列的融合蛋白或截短的DYAD蛋白的cDNA序列)将优选与转录和翻译起始调节序列组合，所述调节序列将在转化植物的期望组织中引导序列从基因转录。
例如，对于过表达，可以采用将引导基因在再生植株的所有组织中表达的植物启动子片段。这种启动子在本文中称为“组成型”启动子并且在大多数环境条件下和发育阶段或细胞分化阶段是有活性的。组成型启动子的实例包括花椰菜花叶病毒(CaMV)35S转录起始区域。1′-或2′-启动子源于根癌农杆菌的T-DNA，并且来自多种植物基因的其它转录起始区域是技术人员已知的。这样的基因包括(例如)来自拟南芥的ACT11(Huang等，Plant Mol.Biol.33:125-139(1996))、来自拟南芥的Cat3(GenBank No.U43147，Zhong等，Mol.Gen.Genet.251:196-203(1996))、来自甘蓝型油菜(Brassica napus)的编码硬脂酰-酰基载体蛋白脱饱和酶的基因(Genbank No.X74782，Solocombe等，Plant Physiol.104:1167-1176(1994))、来自玉米的GPcl(GenBank No.X15596，Martinez等，J.Mol.Biol 208:551-565(1989))，以及来自玉米的Gpc2(GenBank No.U45855，Manjunath等，Plant Mol.Biol.33:97-112(1997))。
备选地，所述植物启动子可引导DYAD核酸在特定组织中的表达或者可能另外处于在更精确的环境或发育调控。可通过诱导型启动子实现转录的环境条件的实例包括缺氧条件、温度升高或存在光照。这样的启动子在这里称作“诱导型”启动子或“组织特异性”启动子。技术人员将认识到，组织特异性启动子可以驱动有效连接的序列在除靶组织之外的组织中表达。因而，如本文使用的，组织特异性启动子是这样一种启动子，其优先在靶组织中驱动表达，但是也可以导致在其它组织中的一些表达。条件性表达、组织特异性表达或两者的组合也可以通过用反式激活基因实现，其中可以将DYAD核酸置于合成启动子的控制之下，该启动子通过异源的或合成的反式激活因子驱动。反式激活因子的组织特异性表达和/或条件性表达随后可驱动所述DYAD核酸的相应表达。已经在植物中使用的可反式激活的系统和可诱导的系统的实例包括mGa14:VP16/UAS、pOp/LhG4、GVE/VGE、GVG、pOp6/LhGR和XVE(在Moore等，The Plant Journal 45:651-683(2006)中综述)。
发育调控的启动子的实例包括只在(或者主要只在)某些组织，例如果实、种子或花中起始转录的启动子。引导核酸在胚珠、花或种子中表达的启动子在本发明中是特别有用的。如本文使用的，种子特异性启动子是引导在种子组织中表达的启动子。这种启动子可以是(例如)胚珠特异性的(其包括引导在母体组织或雌配子体，例如卵细胞或中央细胞中表达的启动子)、胚特异性的、胚乳特异性的、珠被特异性的或一些它们的组合。实例包括在Reiser等，Cell 83:735-742(1995)中描述的来自胚珠特异性BEL1基因(GenBank No.U39944)的启动子，以及来自雄性性母细胞特异性DUET基因的启动子(Reddy T.V.等，Development，Vol.130(24):5975-5987，2003)。其它合适的种子特异性启动子源自下列基因:来自玉米的MACl(Sheridan等，Genetics 142:1009-1020(1996))、来自玉米的Cat3(GenBank No.L05934，Abler等，Plant Mol.Biol.22:10131-1038(1993))、来自玉米的编码油质蛋白18kD的基因(GenBank No.J05212，Lee等，Plant Mol.Biol.26:1981-1987(1994))、来自拟南芥的vp1基因(Genbank No.U93215)、来自拟南芥的编码油质蛋白的基因(GenbankNo.Z17657)、来自拟南芥的Atmycl(Urao等，Plant Mol.Biol.32:571-576(1996))、来自拟南芥的2S种子储藏蛋白基因家族(Conceicao等，Plant J.5:493-505(1994))、来自甘蓝型油菜的编码油质蛋白20kD的基因(GenBank No.M63985)、来自甘蓝型油菜的napA(GenBank No.J02798，Josefsson等，JBL 26:12196-1301(1987)、来自甘蓝型油菜的napin基因家族(Sjodahl等，Planta 197:264-271(1995)、来自甘蓝型油菜的编码2S储藏蛋白的基因(Dasgupta等，Gene 133:301-302(1993))、来自大豆的编码油质蛋白A的基因(Genbank No.U09118)和油质蛋白B的基因(Genbank No.U09119)以及来自大豆的编码低分子量富硫蛋白的基因(Choi等，Mol.Gen.，Genet.246:266-268(1995))。
另外，在此公开的DYAD基因的启动子序列可用于驱动本发明的DYAD多核苷酸或异源序列的表达。如果期望正常的多肽表达，则应包含位于编码区的3′末端的多腺苷酸化区域。该多腺苷酸化区域可源自天然的基因、多种其它植物基因或T-DNA。
包含来自本发明基因的序列(例如启动子或编码区域)的载体将通常包含赋予植物细胞可选择的表型的标记基因。例如，该标记可编码杀虫剂抗性(特别是抗生素抗性，例如卡那霉素抗性、G418、博来霉素抗性、潮霉素抗性)或者除草剂抗性，例如氯磺隆(chlorosulfuron)抗性或Basta抗性。
转基因植物的产生
本发明的DNA构建体可通过多种常规技术导入所需植物宿主的基因组中。例如，DNA构建体可以用诸如植物细胞原生质的电穿孔和显微注射之类的技术直接导入植物细胞的基因组DNA中，或者DNA构建体可以用轰击法例如DNA粒子轰击来直接导入进植物组织中。
显微注射技术是本领域已知的并且在科学和专利文献中有很好的描述。利用聚乙二醇沉淀导入DNA构建体在Paszkowski等，Embo J.3:2717-2722(1984)中描述。电穿孔技术在Fromm等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:5824(1985)中描述。轰击转化技术在Klein等，Nature 327:70-73(1987)中描述。
备选地，可以将DNA构建体与合适的T-DNA旁侧区结合并导入常规的根癌农杆菌宿主载体中。在细胞受该细菌感染时，根癌农杆菌宿主的致病功能将引导所述构建体和邻接的标记插入该植物细胞的DNA中。根癌农杆菌介导的转化技术(包括解毒和双元载体的使用)在科学文献中有很好的描述。参见，例如Horsch等，Science 233:496-498(1984)，以及Fraley等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80:4803(1983)。
可培养通过任意上述的转化技术驱动的转化植物细胞以再生出完整的植株，所述植株具有转化的基因型并因而具有理想的表型例如种子量增加。这种再生技术依赖于组织培养培养基中的某些植物激素的使用，通常依赖于与所需核苷酸序列一起导入的杀虫剂和/或除草剂标记。从培养的原生质体开始的植物再生在Evans等，ProtoplastsIsolation and Culture，Handbook of Plant Cell Culture，pp.124-176，MacMillilan Publishing Company，New York，1983，以及Binding，Regeneration of Plants，Plant Protoplasts，pp.21-73，CRC Press，Boca Raton，1985中描述。也可以从植物愈伤组织、外植体、器官或其部分获得再生。这样的再生技术在Klee等，Ann.Rev.of Plant Phys.38:467-486(1987)中有一般性描述。
本发明的核酸可用于赋予基本上任何植物所需的性状。因而，本发明使用了广范围的植物，包括来自下列属的种:槚如树属(Anacardium)、花生属(Arachis)、天门冬属(Asparagus)、颠茄属(Atropa)、燕麦属(Avena)、芥属(Brassica)、柑桔属(Citrus)、西瓜属(Citrullus)、辣椒属(Capsicum)、红花属(Carthamus)、椰子属(Cocos)、咖啡属(Coffea)、黄瓜属(Cucumis)、南瓜属(Cucurbita)、胡萝卜属(Daucus)、油棕属(Elaeis)、草莓属(Fragaria)、大豆属(Glycine)、棉属(Gossypium)、向日葵属(Helianthus)、Heterocallis、大麦属(Hordeum)、茛菪属(Hyoscyamus)、莴苣属(Lactuca)、亚麻属(Linum)、黑麦草属(Lolium)、羽扇豆属(Lupinus)、番茄属(Lycopersicon)、苹果属(Malus)、木薯属(Manihot)、Majorana、苜蓿属(Medicago)、烟草属(Nicotiana)、洋橄榄属(Olea)、稻属(Oryza)、黍属(Panieum)、Pannesetum、鳄梨属(Persea)、菜豆属(Phaseolus)、黄连木属(Pistachia)、豌豆属(Pisum)、犁属(Pyrus)、李属(Prunus)、萝卜属(Raphanus)、蓖麻属(Ricinus)、黑麦属(Secale)、千里光属(Senecio)、白芥属(Sinapis)、茄属(Solanum)、高粱属(Sorghum)、Theobromus、胡芦巴属(Trigonella)、小麦属(Triticum)、蚕豆属(Vicia)、葡萄属(Vitis)、缸豆属(Vigna)和玉米属(Zea)。
技术人员将认识到，在表达盒稳定地整合进转基因植物中并确认为有效后，所述表达盒可以通过有性杂交来导入其它植物中。可以使用任意的许多标准育种技术，这取决于待杂交的物种。
可以根据熟知的方法分析从本发明植物获得的种子以鉴定具有所需性状的植株。如果将反义技术或其它技术用于控制DYAD基因的表达，则可以将PT-PCR或RNA印迹分析用于筛选所需植株。此外，可以检测不依赖于受精的生殖发育的存在。可以(例如)根据形成无胚种子、形成在受精后败育的种子或在无受精的情况下坐果的能力来筛选植株。这些步骤将部分取决于所使用的具体植物种，但将根据技术人员熟知的方法进行。
下面的实施例是以说明本发明的方式给出，并且不应该理解为限制本发明的范围。
实施例1:dyad突变体显示了有缺陷的雌性能育力和减少的结实率
在对EMS诱变的M2植物种群中的拟南芥不育突变体的筛选中分离出dyad突变体(Siddiqi I等，Development Vol.127(1):197-207(2000))。通过回交分析能育性表明，该突变体是雌性不育的，但是雄性能育的。对雌孢子发生和胚珠发育的分析表明，dyad经历了有缺陷的雌性减数分裂，由于减数分裂细胞周期的有缺陷的发展而导致单次减数分裂，之后该减数分裂停止并无法在多数胚珠中发育雌配子。通过观察性母细胞的染色体分散而分析雌性减数分裂表明，雌性减数分裂在dyad突变体中是不正常的:染色体不能联会并且经历了均等分裂而不是减数分裂，这通常是在减数分裂1阶段发生的(Agashe B.，Prasad C.K.，和Siddiqi I.，Development Vol.129(16):3935-3943(2002))。
如图1中显示，dyad突变体的结实率在与野生型比较时极度减小，并且观察到了不同dyad突变体植株之间的结实率程度的变化。结实率是散发性的和随机的，使得在群体的植株间没有观察到数量的一致性。结实率的模式是每株植株1-10粒，但是可达到最多约275粒，这是极少观察到(500株植株中有1株)。
实施例2:雄性减数分裂和能育性在dyad突变体中是正常的
用Alexander染色检测花粉的活力并发现花粉是完全有活力的并且与野生型相当(图2)。通过分析性母细胞的染色体分散来检查雄性减数分裂表明，雄性减数分裂是正常的并且导致产生了单倍体孢子四分体(图3)。因而，雄性减数分裂、雄性能育性和花粉发育及功能在dyad突变体中是正常的。另一方面，雌性减数分裂在dyad中是异常的。在dyad中没有观察到同源染色体的联会发生并且野生型雌性减数分裂的减数分裂1的减数分裂(图3C)由均等减数分裂(图3E)取代。
实施例3:从dyad突变体收获的种子萌发产生三倍体植株
有可能的是，dyad突变体中产生的种子是由少量雌性性母细胞中的正常减数分裂产生，所述雌性性母细胞继续发育产生正常功能的胚囊，其随后由单倍体花粉受精而发育成种子。如果是这种情况，这些种子将表现为避免了dyad突变体中发生的异常雌性减数分裂。为了检验这种可能性，将来自dyad植株的种子(n＝169)萌芽并发现其具有高的萌发率(>90％)并产生形态学上正常的幼苗，除了一些种子产生异常幼苗(10％)外。在萌发的幼苗中没有观察到形状、对称性和子叶数目的变异情况。这与源自其它减数分裂突变体(例如AtSpoll-1和AtDmcl)的幼苗相反，所述的其它减数分裂突变体经历了减数分裂1中的染色体随机分离，导致了更高比例的在幼苗阶段显示出一系列发育异常的非整倍体后代(Grelon M.等，The EMBO J.，Vol 20:589-600，2001，Couteau F.等，Plant Cell，Vol.11(9):1623-1634，1999)。幼苗在转移至土壤时随后的营养生长也是正常的，并且产生了其中营养生长与野生型及亲本dyad突变体植株相似的植株。观察到的主要区别在于植株开始抽苔时花的大小。在大部分植株(n＝41/52)中，观察到花的大小相对于野生型来说相对增大。花的大小增加有可能归因于活力增加或有利的环境影响。由于所述植株是在控制环境中生长，我们排除了后者的可能性。花器大小的增加的其它可能原因可能是倍性增加。倍性增加表现为营养体和花结构(尤其是花粉粒)的大小增加(Altmann T.，等，Plant Cell Reports.Vol.13:652-656，1994)。将来自随机挑选的植株的花芽通过分析体细胞和雄性性母细胞中的染色体来检测它们的倍性水平。通过检测减数分裂的染色体分散发现，17/19的植株是三倍体并且发现剩余的2个是二倍体(图4)。由于花粉发育和雄性减数分裂在dyad突变体中是正常的而减数的雌性减数分裂由均等分裂取代，这些结果表明，多数种子是由于未减数(二倍体)的卵细胞通过正常的单倍体精子受精而产生而不是由少数胚珠中的正常雌性减数分裂产生，即大多数种子没有表现出避开了异常减数分裂。
实施例4:源自dyad的三倍体植株显示保留了所有杂合标记
dyad突变体中形成的三倍体种子可能是未减数胚囊通过正常单倍体花粉受精的产物，这符合dyad中发生的均等雌性减数分裂。如果这种未减数胚囊是由未减数大孢子形成，那么该未减数胚囊的基因型将与二倍体亲本植株的基因型一致，所述未减数大孢子是由其中染色体保持为单价体并未能经历重组的大孢子母细胞的均等分裂产物产生。因而，如果亲本植株对分子标记是杂合的，那么所述三倍体后代将对该标记来说也是杂合的。如果未连接至着丝点的标记认为是在杂合的条件下，那么在完全不存在重组的情况下，亲本杂合性的100％传递将在产生的雌配子和所述三倍体后代中实现。如果重组和交换发生，那么100％杂合性将不能在产生的三倍体后代中维持。对于未连接至着丝点的标记，预期的未减数胚囊中的纯合性频率为33％，并且三倍体后代中的纯合性的频率为16.7％，而在完全不存在重组的情况下将不会存在纯合子。未丧失杂合性的未减数胚囊的形成对于设计无融合生殖和固定杂种优势来说是非常期望的。我们使用微卫星来测量dyad突变体植株的三倍体后代之间的杂合性丧失。在野生型Nossen(No-O)和dyad突变体Columbia(Col)生态型之间的分离的F2代杂种中鉴定dyad突变体植株。从TAIR数据库(www.arabidopsis.org)获得分布在5条拟南芥染色体的每条的整条上并且未连接至着丝点的候选标记(>35cM)。检验用于产生所述F2代群体的亲本植株以确定多态性并且基于结果我们选出了50株基因型F2代dyad突变体植株的4条染色体上的5个不同的标记(表1)并确定对于每株植株来说都是杂合的那些标记。单独从所述50株F2代植株收集自交种子并且让其生长为50个不同的家族，每个家族由可变数量的同胞组成。这总共产生了分布涵盖50个家族的196株植株。对每个家族的所有成员进行基因型分析，分析对于亲本植株来说是杂合的那些标记，所以对于每个标记分析了分布涵盖所有50个F2代家族的74-119株植株。
表1:对dyad植株后代进行标记分析以测量杂合性丧失和重组。
a在第6列括号中的数字表示用于分析那些标记的全部植株的纯合子百分比。
在筛选的196株植株中，我们获得了35株对至少一种对亲本植株来说是杂合的标记是纯合的植株。通过进行减数分裂的染色体分散测定了这35株植株中的22株植株的倍性。发现有21株植株是二倍体而另一株是具有13条染色体的超二倍体。因此根据该分析，杂合性丧失几乎只发现于二倍体中。在未显示杂合性丧失的植株中，从单独的F2家族随机选择15株植株并检验它们的倍性。发现这15株都是三倍体。
因而，结果表明在三倍体中不存在杂合性丧失，所述三倍体构成了二倍体dyad突变体植株后代的主要类型。在三倍体中未能发现杂合性丧失也排除了关于它们的形成的一个备选的可能机制，也就是多精受精，即单倍体雌配子由两个单独的雄配子受精，该机制也将预示杂合性丧失。我们的发现表明，dyad突变体植株的三倍体后代是由保留了亲本基因型的未减数胚囊受精产生。未减数的胚囊的形成是无融合生殖的一个关键方面。
实施例5:Boechera holboelli的DYAD同系物的分离和功能鉴定
用Bho5Bam(SEQ ID NO:39)和Bho3Bam(SEQ ID NO:40)引物从兼性无融合生殖的Boechera holboellii品系(accession)二倍体Greenland和三倍体Colorado(Naumova T.N.等，Sex.Plant Reprod.Vol.14:195-200，2001)克隆DYAD同系物的3kB基因组编码区。将BhDYAD基因克隆(SEQ ID NO:16)有效连接至拟南芥DYAD启动子并用于转化dyad突变体植株以检测补充性。还扩增了BhDYAD cDNA并进行测序(SEQ ID NO:17)。农杆菌介导的植物原位真空渗入转化将所述表达载体转移进dyad杂合的F1代植株中。我们获得了42株转化株，其中9株转化株是dyad突变体等位基因纯合的，这通过dyad等位基因座旁侧的CAPS和微卫星标记测定(Agashe B，Prasad C.K.，和Siddiqi I.，Development Vol.129(16):3935-3943(2002))。在所述的9株转化株中，有4株转化株显示了对dyad突变表型的补充，这可以通过充分伸长的长角果(图5)来判定，发现具有完全的结实率。剩余的5株植株可能由于共抑制而不育。
拟南芥植株的生长
具有dyad突变的拟南芥株是如早先描述的(Siddiqi I.等，Development.Vol.127(1):197-207(2000))。用于微卫星标记分析的F2代是源自如所描述的No-O株(Nossen生态型)和Col-0生态型背景中的dyad突变体之间的杂交(SiddiqiI.等，Development.Vol.127(1):197-207(2000))。让植株在如所描述的控制环境下生长(Siddiqi I.等，Development.Vol.127(1):197-207(2000))。
对于陪替氏平皿中的种子萌发，将种子用乙醇表面灭菌10分钟，之后用0.025％的氯化汞处理它们5分钟。另外，将该种子用无菌水洗涤3次以除去任何氯化汞痕迹。将种子再悬浮于微温的0.5％顶层琼脂中并均匀散布在补充有2％蔗糖的MS琼脂平板(0.7％)上。让该平板在层流通风橱中干燥1小时，将平板用石蜡膜密封并保持在4℃的冷库中层化3天。之后，将平板转移至生长室中。在其后的两周后，计算萌发率。
对于盆中的种子生长，通过混合等比例的Soilrite:珍珠岩:蛭石制备用于植物生长的合成培养基(Keltech Energies Ltd.，Karnataka574108，India)。将盆栽用混合物均匀施加在底部有孔(允许毛细上升)的盆中并将该盆浸入1X MS溶液中，所述溶液含有每升加入有1ml(1000X)次要盐:(H3BO3(70mM)、MnC12(14mM)、CuSO4(0.5mM)、ZnSO4(1mM)、NaMoO4(0.2mM)、NaCl(10mM)、CoC12(0.01mM))的主盐:CaCl2(4mM)、MgSo4(1.5mM)、KNO3(18.8mM)、NH4N03(20.6mM)、KH2Po4(1.25mM pHb 5.6)、Fe-EDTA(20mM)。将种子均匀散布在盆的表面上，盖上Saran包装膜，并保持在4-8℃下3天以便层化，然后转移至生长室中。在移栽的时，在幼苗转移至土壤培养基后将盆盖上Saran包装膜并直接置于生长室中。一旦植株在盆栽混合物中固定即移除Saran包装膜。用蒸馏水以有规律的间隔进行浇灌。
结实率分析
将具有Co1-0生态型背景的dyad突变的F2代分离群体用于对dyad纯合的植株的结实率进行打分，让dyad突变体植株生长直至它们的末期(这时植物停止开花)。在这一阶段后，停止浇灌以便使长角果达到采收成熟度。期间，变黄且将落果的最低处的长角果分别裂开并且按单株收获种子(若有的话)。同样需要以有规律的间隔时间收获种子以避免可能的种子丢失。最后，将收集的种子按单株合并以计算每株植株的种子总数。
花粉活力
花药中的小孢子母细胞的活性染色如已描述的进行(Alexander M.P.，Stain Technol.Vol.44(3):117-122，1971)。
减数分裂分散
对雄性减数分裂和雌性减数分裂分散的分析是如所描述的(Agashe B，Prasad C.K.和Siddiqi I.，Development Vol.129(16):3935-3943(2002))。
植株DNA分离
用于微卫星标记分析的基因组DNA根据Dellaporta S.L.等，Plant Mol.Bio.Rep.，Vol.1:19-21(1983)描述的方法(具有小的修改)分离。从单独的植株收集大约500mg的叶组织于1.5ml埃彭道夫管中并将其在液氮中速冻。然后，用微研杵将该组织碾磨成细小粉末。将200μl新鲜制备的提取缓冲液(100mM Tris(pH8)、50mMEDTA、500mM NaCl、1.4％SDS和10mMβ-巯基乙醇)加入至该粉末中并用微研杵将其细微均化。然后，加入等体积的2 × CTAB并轻微涡旋该混合物。随后，将该混合物在65℃下于振荡水浴中孵育5分钟。之后，让该样品冷却并加入等体积的24:1的氯仿:异戊醇，将其轻微混合并在13000rpm下离心10分钟。将含有DNA的水相转移至新的埃彭道夫管中并加入2/3体积的冰冷的异丙醇以使DNA沉淀。将DNA通过在4℃下以13000rpm离心20分钟来获得沉淀颗粒。将该DNA沉淀颗粒用70％乙醇洗涤并将该颗粒风干30分钟并悬浮于含有无DNA酶的RNA酶(20ug/ml)的50μl无菌水或TE缓冲液(pH8.0)中。
标记分析
基于对Co1-0和No-O生态型的亲本调查，从4条不同染色体选择了合理地未连接至着丝点的5个微卫星标记。将这些标记用于F2代(No-O × Col-0(dyad))分离群体以选择对所给标记来说是杂合的dyad植株。收集这些dyad植株的种子并将其在单独的陪替氏平皿中萌发，使得每个后代构成了具体母本dyad植株的同胞。同样，将来自对所给标记来说是杂合的多株植株的同胞的数据一同考虑用于标记分析。
微卫星标记和它们的位置的列表是如表1中所描述的。用于扩增微卫星的引物序列来自TAIR网站(www.arabidopsis.org):
nga 162
nga162F SEQ ID NO:6
nga162R SEQ ID NO:7
nga225
nga225F SEQ ID NO:8
nga225R SEQ ID NO:9
nga168
nga168F SEQ ID NO:10
nga168R SEQ ID NO:11
nga1107
nga1107F SEQ ID NO:12
nga1107R SEQ ID NO:13
nga6
nga6F SEQ ID NO:14
nga6R SEQ ID NO:15
PCR在55℃的退火温度下(在72℃下延伸)于1X PCR缓冲液(Perkin Elmer)中进行20秒钟，该PCR缓冲液含有2mM MgCl、0.2mM的每种dNTP、1单位的Taq DNA聚合酶(Perkin-Elmer/Cetus)以及5pmol正向侧翼引物和反向侧翼引物。将PCR产物在150V的8％的聚丙烯酰胺凝胶中解析3小时，用溴化乙锭染色并用Syngene凝胶成像系统(Synoptics公司，UK)捕获。
植物材料
Boechera holboellii的兼性无融合生殖的二倍体Greenland和三倍体Colorado品系是由Kim Boutilier赠送(Naumova T.N.等，Sex.Plant Reprod.Vol.14:195-200，2001)。植株在含有如描述用于拟南芥的培养基的器皿中生长并且在与用于拟南芥的条件相同的条件下生长。
DYAD启动子的克隆
用引物pg2r4(SEQ ID NO:48)和PDYBAM(SEQ ID NO:47)从Col-0生态型扩增1.8kb的DYAD启动子区并且按照生产商的说明书将该产物克隆进pGEMT载体(Promega)中。
从Boechera holboellii克隆DYAD同系物
用在5′末端具有BamH1位点的引物:Bho5BAM(SEQ ID NO:39)和Bho3BAM.(SEQ ID NO:40)从Boechera holboellii扩增拟南芥DYAD同系物(BhDYAD)的基因编码区。将所得的3kb片段克隆进pGEMT中。
在拟南芥DYAD启动子下驱动BhDYAD的双元载体pCAMBIA1300的构建
将Bh DYAD从pGEMT中作为3kb BamHI片段释放并克隆进携带有植物可选标记潮霉素的pCAMBIA1300载体中。用引物BDY3(SEQ IDNO:36)和OCSR(SEQ ID NO:38)检验取向。将1.6kb DYAD启动子区(SEQID NO:22)作为SacI片段从pGEMT载体释放并插入pCAMBIA1300载体中的BhDYAD上游。该启动子相对于BhDYAD基因组序列的取向用引物ismr4(SEQ ID NO:37)和bdyl(SEQ ID NO:35)确定。
三亲本杂交
将上面构建的双元载体pCAMBIA转移进农杆菌(AGL1)中是如所描述的通过三亲本杂交进行(Agashe B，Prasad C.K.和Siddiqi I，Development，Vol.129(16):3935-3943(2002))。
拟南芥植株的转化
对于BhDYAD的补充分析，将Col-0×dyad的F1代植株用携带有由拟南芥DYAD启动子驱动的BhDYAD的构建体转化。农杆菌介导的植物原位真空渗入转化根据Bechtold N.和Pelletier G.，Methods Mol.Biol.，Vol.82:259-66(1998)进行。
转化株的选择
将来自经真空渗入的F1代植株的TO粒种子置于含有0.8％细菌培养用琼脂粉、1mM KNO3和1％蔗糖(含20μg/ml潮霉素)的陪替氏平皿中。在低温层化3天后，将平板转移至生长室中。抗潮霉素的转化株最早可在转移5天后根据充分伸长的胚根、直立的胚轴和充分伸展的子叶确定。将选择的转化株另外转移至含有潮霉素的MS平板中并且在建立抗性后将它们最终转移至土壤介质中。此外，如先前描述的用bdy3和OCSR引物检验植株中插入序列的存在。
dyad基因座处的接合性(zygosity)的基因分型
将分离的dyad F2代种群的三种基因型通过共显性的CAPS标记(Konieczny A.和Ausubel F.M.，Plant J.，Vol.4(2):403-410，1993)和可变的微卫星鉴定。dyad突变体等位基因的旁侧序列源自Landsberg erecta生态型并且来自野生型等位基因的那些旁侧序列具有Colombia生态型序列。因此，将这些旁侧序列中的SNP用于产生紧连接dyad基因座(KNEF(SEQ ID NO:31)和KNER(SEQ ID NO:32)、KKF(SEQ ID NO:33)和KKR(SEQ ID NO:34))任一侧并位于其旁侧的CAP标记以及紧连接至DYAD的微卫星标记引物(KMF(SEQ ID NO:29和KMR(SEQ ID NO:30))(Agashe B，Prasad C.K.和Siddiqi I.，Development Vol.129(16):3935-3943(2002))。利用上述标记在dyad基因座处进行基因分型是如所描述的(Agashe B，Prasad C.K.和Siddiqi I.，Development Vol.129(16):3935-3943(2002))。
RNA分离和cDNA合成
将来自二倍体Greenland植株的发育良好的单芽用于根据生产商的说明书通过TriZol制剂(Invitrogen)进行总RNA的分离。使用用于cDNA合成的SuperscriptTM Choice system(GIBCO BRL)，将4μg总RNA用于进行第一链cDNA合成。通过使用引物5RF3(SEQ IDNO:41)和Bho3BAM(SEQ ID NO:40)对该cDNA另外的扩增用于克隆。将所得的1.9KB片段克隆进pGEMT中并测序。结果作为SEQ ID NO:17在序列列表中示出。相应的DYAD蛋白的氨基酸序列在SEQ ID NO:18中示出。
实施例6:条件性DYAD等位基因的构建和表现dyad突变体表型的纯系转基因植物群的发展
用于构建条件性DYAD基因的等位基因的策略是基于将大鼠糖皮质激素受体(GR)的激素结合结构域(SEQ ID NO:27)与DYAD的C-端融合并将该融合构建体整合进dyad突变体等位基因纯合的(dy/dy)植株的基因组中。所述DYAD-GR融合蛋白其本身不能补足dyad突变体，因为所述GR结构域在不存在类固醇激素时赋予了胞质定位，而DYAD的作用位点是位于细胞核内。然而在存在类固醇激素时，该融合蛋白从胞质结合位点释放并变得能够转移至细胞核中，在那里其可以补足dyad突变体。所述构建步骤如下:将植物双元载体pBI101.3用BamHI和SacI消化以除去GUS报告基因并将其用包含GR结构域的BamH1-Sac1片段代替(A.M.Lloyd等，Science 266,436-439(1994))。
将所得质粒命名为pBI101.3::GR。接下来，将引物DyCF(SEQ IDNO:43)和DyPB(SEQ ID NO:42)(其含有用以修饰终止密码子和引入BamHI和PstI限制性位点的序列)用于PCR扩增DYAD基因的304bp的C-端区。将该经修饰的序列作为216bp的PstI片段克隆进携带有5.8kb基因克隆(SEQ ID NO:28)的pBS(KS)::Dyad质粒中以产生pBS(KS)::Dyad*，所述基因克隆含有对应P1克隆MFG13(Acc No.AB025621)的坐标9684-3878的整个DYAD基因。所得的质粒含有这样的DYAD基因:它的终止密码子TGA已由GGG替换并且其还携带有与替换密码子一起的BamHI位点。将含有MFG13的核苷酸9684-9416的来自pBSII(KS)::Dyad*的269bp SalI-BamHI片段克隆进pBI101.3::GR中，之后用SalI加BamHI消化。然后，将9417-5335的剩余DYAD部分作为来自pBS(KS)::Dyad*的BamHI-BamHI片段克隆进前一步骤的产物中，导致GR结构域与DYAD的C-端框内融合。命名为pBI101.3::DyadΔGR的质粒终产物在图6中示出。
将该构建体通过用辅体大肠杆菌菌株HB101[pRK2013]进行三亲本杂交来导入农杆菌菌株AGL1中。通过植物原位转化(Bechtold N.和Pelletier G.，Methods Mol.Biol.，Vol.82:259-66，1998)将T-DNA区转化进dyad突变体等位基因杂合的(+/dy)拟南芥植株(T0)中。通过将种子铺于含卡那霉素(50mg/升)的MS琼脂平板上来选择卡那霉素抗性T1幼苗并将其转移至MS+卡那霉素平板来确认抗性表型。转化株通过用DyCF(SEQ ID NO:43)和GRrev(SEQ ID NO:44)引物进行PCR来进一步鉴定。将确定的卡那霉素抗性幼苗转移至土壤中并生长至成熟体阶段。在最初的8-10粒长角果抽苔和发育后，除了每天用10μM地塞米松+0.015％Silwet L-77喷灌植株外，还每三天一次用10μM地塞米松浇灌植株。注意到在地塞米松处理之前显示为不育的几株植株在地塞米松处理开始5-7天后发育了能育的长角果。将部分植物材料用于DNA印记分析以测定插入序列的拷贝数，并且还用基于PCR的紧连接dyad基因座并位于其旁侧的CAPS标记对dyad基因座进行基因分型。dyad突变体最初在Ler背景下分离并随后基因渗入进Col株中。因而，CAPS标记的Ler等位基因判定dyad突变体而Col等位基因指示野生型(图7)。在具有至少一个拷贝的dyad突变体等位基因的植株中鉴定单拷贝插入序列并且将这些植株的种子铺在MS+卡那霉素平板上。将卡那霉素抗性幼苗转移至土壤中并关于dyad基因座进行基因分型。鉴定dyad突变体等位基因纯合的植株并将其栽培至成年期。在抽苔后，所有植株在最初阶段直至最初的8-10朵花开花期间都用水栽培，之后用如上描述的含地塞米松的溶液浇灌。通过筛选不同的单拷贝插入序列鉴定表现条件性不育的品系。例如，图8中显示的一种品系No.33产生了这样的dyad突变体植株(dy/dy)，所有这些dyad突变体植株在生殖生长的最初阶段都表现为不育并且它们在地塞米松处理后变成为能育的了。在地塞米松处理前分离的芽的胚珠显示为dyad突变表型，而在地塞米松处理后分离的那些显示为野生型表型(图9)。从纯合的dyad突变体植株收获种子以产生T3家族并且通过筛选全部产生了卡那霉素抗性幼苗的家族来鉴定DYAD-GR插入序列纯合的T3家族。这些结果举例说明了条件性DYAD等位基因的构建及它引入进植株从而产生了在一组条件(不存在地塞米松)下显示出dyad突变表型并且在供给(或喷灌)地塞米松时显示为野生型表型的植株。这些结果还使得能开发全部显示出dyad突变表型的纯系植物种群。
用于该研究的糖皮质激素受体的结构域序列(914bp)(SEQ ID NO:27)
GGATCCTGAAGCTCGAAAAACAAAGAAAAAAATCAAAGGGATTCAGCAAG
CCACTGCAGGAGTCTCACAAGACACTTCGGAAAATCCTAACAAAACAATAG
TTCCTGCAGCATTACCACAGCTCACCCCTACCTTGGTGTCACTGCTGGAGGT
GATTGAACCCGAGGTGTTGTATGCAGGATATGATAGCTCTGTTCCAGATTC
AGCATGGAGAATTATGACCACACTCAACATGTTAGGTGGGCGTCAAGTGAT
TGCAGCAGTGAAATGGGCAAAGGCGATACCAGGCTTCAGAAACTTACACCT
GGATGACCAAATGACCCTGCTACAGTACTCATGGATGTTTCTCATGGCATTT
GCCCTGGGTTGGAGATCATACAGACAATCAAGTGGAAACCTGCTCTGCTTT
GCTCCTGATCTGATTATTAATGAGCAGAGAATGTCTCTACCCTGCATGTATG
ACCAATGTAAACACATGCTGTTTGTCTCCTCTGAATTACAAAGATTGCAGGT
ATCCTATGAAGAGTATCTCTGTATGAAAACCTTACTGCTTCTCTCCTCAGTT
CCTAAGGAAGGTCTGAAGAGCCAAGAGTTATTTGATGAGATTCGAATGACT
TATATCAAAGAGCTAGGAAAAGCCATCGTCAAAAGGGAAGGGAACTCCAG
TCAGAACTGGCAACGGTTTTACCAACTGACAAAGCTTCTGGACTCCATGCA
TGAGGTGGTTGAGAATCTCCTTACCTACTGCTTCCAGACATTTTTGGATAAG
ACCATGAGTATTGAATTCCCAGAGATGTTAGCTGAAATCATCACTAATCAG
ATACCAAAATATTCAAATGGAAATATCAAAAAGCTTCTGTTTCATCAAAAA
TGACTGACCTAGTTCTAGAGCGGCCGCCACCGCGGTGGAGCTC
用于在pBS(KS)::Dyad中作为Sal1片段克隆的dyad基因组序列(5807bp)(SEQ ID NO:28)
GTCGACTTTTTGTTTGACCAGTGTATTTGGTTTGACTTCAGATTTGGCAAGT
ACGAAGCTTATGCGCTTTTGCAATCGAAACAAGGGAAAAATCTGTACTTTG
TTAGCTGCGTGACTTGAGCTCTTTTGGTCCGGAGACGGTAGAAGACGACAAA
GCACTGACCTTTCATCTCTCGGCGATCGAAAAAATCACTCTCTTTCCTCATC
AGACCCGACCCGTTATGAAGGTATCCAGACCCGTTTATTTTGATCCATCTCA
TAGTCGGATCCCCAAAAAAATTCAGCTTAGATTGGCCCATTTAGGCCCGTTT
ACAGTTTTTTACTTTTTTCTTAATTATCTTTTTAACATCTTACATTATACATAT
TTGACTCAACAAAAAAATATAACTTAAATGTATTGTTGACTGTTTTTGATAA
TTAAGAAAAAAATATTTTTAAATTATTAAAAATATTGTTGACTCAACAAAA
AAATATAACTTAAATGTATTGGGCAAATAATCATGGTCATAAGTCCTCAAG
CTTATTATTTGTTTTGATTGGTTTAAATACTTTATAAAAAAAATATCAATTAT
ATCATGTTATTACGTAAATTAAGCTTTTTGATTTTAAAAAAGCTTCAGCTCA
ATAAAGAAAAACAGATTCAGTTATCATTGGAGTATAAAATTGGTCGATACA
TTAGAGACATTAATCCTTACATCATAAACAATTTAATGTGAATAAAACATC
ATAAATCACATATCATTATCCGAAAATAATCATATGTAAGAATAATCACTG
TGACAAAAAAAAAAAACAATTCCTCACGTGTGTAGTCGGTCCCCACTCTAG
TAGCAGTAGCTTAATGATGCCTTCTCCGCACGTGTAACACGAAATTTATTCG
CTACGGCCAATTACATTAACCTTCAGGTCTTATCACCGTTAAATTTTCAAAA
TGACACACGTGGCATCAATCCGTAATATCACTACGTCTGCTTTCAATCTTTC
ATTGTAGATGATTTCGTACACCAATTTCCGCGAACGTTTACAGTTTAGATAC
AGTTTGAGGGCAAATCTGTCAATATACGCCAACTTGCTGCGAAAGCAATAT
AGTCACGTGCCGTGCACACGCATATAAGACTCACACACTCACACCACTCTC
TCTCTCTCTCTAACCTCATATATAAAGCCACCTCCCAGATTCATTAAATGCG
ACATTTCAAAACTTTTCTTTTTGCTGTCTTCCCCATAAGCTCTCTGCTGATTA
AAAAGATTTTCTGGTATAAAACAAAATTCTTCAAATATTTCTGGGTTTATGT
TTTCTCTCTATTTCTCAGAAATGCTTTAATTTCTCCATCCGCGTCCATGTTTT
TTTTTCTCCGTTGCTGATTTTGATTTTTTTAATCCAGTGAAAAGGAGGAACG
AAGATTATCGAGAGCAAAAATCATGAGTGTAAGATCTCTCTCGCTCTCAGA
TTTTATTTTTTTTCGCTGTGATATAAATGGCTCAGTCACTATCAGTCTCATGA
TGAGAAAAATAAAACTCATCACCGCTTGATTCTGTTTCCTTAGTGTCTCCCA
CGCGCGTACCAGAAAGCGCGTGTGTGTTTCTTGTTATACTCGCAGAGTCAG
GTTTTTTCAAATATATTCTCTCCAGGCAGCAGCAACAACAACAAACCGATTT
TTCATTATTCCTTATAACAATTTTTGATTCTCCAGAAAAAAAATATCTCTCT
TAGTTTTTCTCTTGTTCTACAGAGTACGATGTTCGTGAAACGGAATCCGATT
AGAGAAACCACCGCCGGGAAAATCTCTTCGCCGTCGTCACCGACTTTGAAT
GGTAAACTACTGAAGCTATAGTTTCTTCGTTTTTGTTGATTTTCTCGCTTCTC
TTCTAATTTCTGAATTTTTGGTTTGGGTTTGTTCTTACAGTTGCAGTCGCGCA
TATAAGAGCTGGATCTTATTACGAAATCGATGCTTCGATTCTTCCTCAGAGA
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CTGCTTTTTTCACCTTTTATTATAGACAGATCTCGTTTTTTGTTGTTCGTCTG
GGTTTTCGAGTGATTTTTTAAGGTTTATTGATGCAGGTGAGCAAAATCACGG
CGAGTGACGTGTCTCTCCGGTACCCAAGCATGTTTTCACTCCGATCGCATTT
CGATTACAGTAGGATGAACCGGAATAAACCGATGAAGAAGAGGAGTGGTG
GTGGTCTTCTTCCTGTTTTCGACGAGAGTCATGTGATGGCTTCGGAGCTAGC
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AAATTCCTGGGGTTTCTGGGTTTCTAGTTCTTCTCGCAGGAACAAATTTCCA
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GCTTCACCGGAGGGAAAGTGCTCGTCTGAGCTGAAATCGGGAGGGATGATC
AAGTGGGGAAGGAGATTGCGTGTGCAGTATCAGAGTCGGCATATTGATACT
AGGAAGAATAAGGAAGGTGAGGAGAGTTCTAGAGTGAAGGATGAAGTTTA
CAAAGAAGAAGAGATGGAGAAAGAAGAGGATGATGATGATGGGAATGAA
ATAGGAGGCACTAAACAAGAGGCAAAGGAGATAACTAATGGAAATCGTAA
GAGAAAGCTGATTGAATCAAGTACTGAGAGACTCGCTCAGAAAGCTAAGG
TTTATGATCAGAAGAAGGAAACTCAAATTGTGGTTTATAAGAGGAAATCAG
AGAGGAAGTTCATTGATAGATGGTCTGTTGAGAGGTAAAATGCATAAAAAT
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TGTGGTTAATTTTGAAGGTACAAACTAGCTGAGAGGAACATGTTAAAAGTG
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AGGTCAGAAGCAAGGAAGCTGATTGGTGACACAGGTCTATTGGATCATCTG
CTTAAGCACATGGCTGGTAAGGTGGCTCCTGGAGGTCAAGATAGGTTTATG
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TTGATTCACATAAGGAAAGAAGCAGGAGTTAAAGATCCTTACTGGACTCCT
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GAGAAATCCGTGACATCAGAGAAGAATTAGCTAGCCTGAAAAGGTAGAAA
AGTTATTGAATTGGTTATACGATCATCTCCCTTTAGTTGTCTTATTGCAATTT
TAACTCATGTCTGTCTTGGTCTTGAGAAGAGAATTGAAGAAACTTGCGTCA
AAGAAGGAAGAGGAGGAGCTTGTTATCATGACTACGCCTAATTCTTGTGTT
ACTAGTCAGAATGATAATCTGATGACTCCAGCAAAGGTAAGAGCTCGAAAC
AATAGCTGAGGCCTCTCTCTTGTGAAAATGTTTTATGCTACTTTGTGAACAT
CTCTGCTGCTTTTTTCTTAGGAAATCTACGCTGATCTGCTGAAAAAGAAATAC
AAAATTGAGGACCAGCTAGTGATTATTGGAGAAACCTTGCGTAAAATGGAG
GTATGTATATCCCTAGATTGAGTTTCCAAGTAGACACAAACCCTTACTTAAA
ATGTAAAATCTTGATTTAGTAACTATCACAAGTAGTCATAGGAAACTCCCTT
GGAGGATAACAGTGAACCATGTAAAATGGGCCCATTTAGCGTATGTGATAA
ATGATTTCCTCTGTCTCTATGAGAGACCACTTTGCTGATAGTCGAATAATGA
TGAAACATTTGTGTTACTATAAATGCAAATATTGCAGGAAGACATGGGATG
GCTTAAGAAAACAGTGGACGAGAACTATCCTAAAAAGCCAGACTCAACAG
AGACACCTTTGCTACTAGAGGATTCACCACCAATACAGACACTAGAAGGAG
AAGTGAAGGTGGTGAACAAGGGTAACCAAATCACAGAGTCACCTCAAAAC
AGAGAAAAAGGAAGGAAGCATGATCAACAAGAAAGATCACCACTTTCACT
AATAAGCAACACTGGTTTCAGAATCTGCAGGCCTGTGGGGATGTTCGCATG
GCCCCAATTGCCTGCTCTTGCTGCTGCTACTGATACTAATGCTTCTTCGCCA
AGTCACAGACAAGCCTACCCATCCCCTTTTCCAGTCAAGCCACTTGCAGCT
AAGCGTCCTCTTGGCTTGACGTTTCCCTTCACCATCATACCCGAAGAAGCTC
CCAAGAATCTCTTCAACGTTTGAAGTTGTCACTGGAAACTGATGCATCAGA
TCTTACTTTCCCTACAAGTAAGCTGATGTGAACTGGTAAGGTCTCTTCCATG
AAATATATAATAACTTACAAGCGAGCAGGTATTTAAAAGTACCACTTATAT
TTATATAAGGAACTATATTTATGGGAATAATTTGGCAACTTTTTGAAATTAT
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ACAGGGATCATCATATTCTGTATTACTGAACAATTTCTATAATGATACAGTT
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AGAAAAGAAAAAAAAAAACTTTTTTCTCATTTCGAGATTTCCTAACCATTTG
GTGGTGCAGGTTTAAGTTTCGCTCGCTCTCCTAAAACCAAACGTCCAAACC
CGTTCTCTAGACTAGTTCTGCTGCGAAACACGACACACACCAAGTCACCAA
TATTACTTGAATCCACGTCAAATAAACAATGGTCATTCAATATGGTTAATGC
AACACTCGAGTAACTTTATTTTCAAAGAAATTTGCACAAAGTCATGTTATGA
TATGGTGTATAATATTTGTGTATATATCCGGCCAAAAAACATAACAAGTTTT
TTATAAAAAAAAAAATTAATTATATATCTAAAATATAGAATAGCTAGTAAT
AAAACTAGTGAGAAACAAATTTAAAACAAATTAAGCAACTATGTTATTTGC
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CTTGTGATTTATTTGTATCAACTAGTAAATTTTAAACATAAAAATCATTTAT
AAATATAAATAAATATTATCATATTTATGTAGAAAGAGTCTCATCAGTCTG
ATAGTCAATCACTTGTGCGCAAAGAAATTTGACGAAAGGGGTTACAAAAAA
ATGGCCAGCACAGCATCATCATGTCCCCGACCTTATATTATAAGATTTGTAT
ATTTTATCCATAAATTGTATATAACCGTCGAC
实施例7:三倍体(3n)的dyad突变体的自交种子含有来自雌配子的二倍体(2n)贡献
在四倍体(4n)和二倍体(2n)野生型拟南芥植株之间进行回交。在这两种情形中，产生的种子都是三倍体。然而，当父本是四倍体而母本是二倍体时，产生的种子较大，而当父本是二倍体而母本是四倍体时种子皱缩。这些结果在图10中描述并且每类种子的100粒种子的重量在表2中示出。
表2:从多种杂交植株获得的100粒种子的重量
种子类型 种子重量(μg)
二倍体Columbia WT种子 -2142
四倍体Landsberg erecta -3352
二倍体Columbia × 四倍体La-erμg(父本过量) -3004
四倍体La-er × 二倍体Columbia(母本过量) -1302
dyad的较大类型的种子 -3453
dyad的正常类型的种子 -2012
dyad的皱缩类型的种子 -1379
这些发现再现了当前领域已知的那些(Scott RJ等，Development125，3329-3341，1998)。不受任何机理理论的约缚，父本基因组和母本基因组在调节种子发育中的非等价性已经根据亲子冲突理论(Haig D.和Westoby M.，Am.Nat.Vol.134:147-155，1989)解释为是由于母本和每个胚之间的资源分配竞争引起，母本通过促进所有种子之间的资源公平分配来限制胚的生长，而每个胚的适应性是通过获得更多资源来增强。根据HaigD.和Westoby M.，Am.Nat.Vol.134:147-155，1989，在胚中母本表达的印记基因将起限制胚生长的作用而父本表达的基因将促进胚加快生长。因而，含有额外的父本基因组当量的种子将由于有过量的促进胚生长的基因产物而比正常种子大，而含有额外的母本基因组当量的种子将由于有过量的限制胚生长的基因产物而比正常种子小。
为了了解dyad突变体自交种子中的母本和父本贡献，对种子大小进行了分析。从dyad突变体植株获得的自交种子在大小上是不均匀的，并且如图10中描述的归类为三种类型:大的、正常的和皱缩的。7株独立的dyad突变体植株的大小级分布在下面示出:
表3:来自dyad突变体植株的种子的大小级分布:
植株号 N L S
1. 18 7 79
2. 44 26 64
3. 25 25 36
4. 47 21 33
5. 46 5 52
6. 58 16 98
7. 16 6 37
总数 254 106 399
从多株植株取样每种类型的种子，将其萌发并生长成植株。每株植株的倍性通过减数分裂分散中的染色体计数测定。结果在下面的表4中示出:
表4:来自自交的dyad突变体的每种种子类型的植株的倍性
括号中的数字表示每种类型中检验的总植株的百分比
这些数据显示，大多数三倍体在大小上是皱缩的并且构成了皱缩类型的种子的大部分。大多数三倍体是皱缩的这一现象表明，它们由过量的母本贡献(2n)产生而不是由过量的父本贡献(因而在三倍体中其应该是1n)产生。结合实施例4中的所有三倍体保留了亲本杂合性这一发现，这些结果表明，杂合性的保留是从母本获得，并因而表明所述三倍体由保留亲本杂合性的未减数雌配子产生。
为了证实dyad中的三倍体由2n的母本贡献产生，我们将dyad突变体作为雌株与作为雄株的品系ETC60(DYAD野生型)杂交来产生F1种子。所述ETC60品系(在美国专利申请No.10/857,539中描述)携带有单拷贝的具有卡那霉素抗性基因的Ds转位子。通过进行卡那霉素抗性分离，之后将F1植株与野生型二倍体植株进一步杂交，有可能确定雄配子在F1植株中的倍性作用。将来自第一次杂交的种子萌芽并且将幼苗转移至土壤中。用卡那霉素抗性基因-特异性引物(KanF SEQ IDNO:49和KanR SEQ ID NO:50)检验6株F1植株的卡那霉素抗性基因的存在，而且用转位子特异性Ds5-2引物(SEQ ID NO:45)结合基因-特异性引物GLTF(SEQ ID NO:46)检验ETC60中的转位子拷贝。所有这6株植株都是具有卡那霉素抗性的Ds元件阳性的，并且还都是如对含野生型DYAD拷贝的杂交植物所预期的一样为能育的。这6株植株的倍性用减数分裂的染色体分散检验。发现3株植株是具有15条染色体的三倍体，2株植株具有16条染色体，并且1株植株具有17条染色体。这些结果暗示了雌配子是由未减数的/超二倍体孢子产生这一可能性。未减数雌配子通过单倍体花粉受精将产生(接近)卡那霉素抗性基因是单显性组合的三倍体(Kkk)。备选地，所述三倍体可能由单倍体雌配子通过一个未减数雄配子或两个减数雄配子受精而产生，在这种情形中，该三倍体将是卡那霉素抗性基因的双显性组合(KKk)。
如果单显性组合条件的植株与不具有卡那霉素抗性的野生型植株杂交，那么所得植株中卡那霉素抗性与敏感性的分离比率将是1:1。然而，如果双显性组合条件的植株与野生型植株杂交，那么该分离比率应该预期为5:1。将上面获得的两株三倍体植株与野生型进行杂交并且将获得的种子为卡那霉素抗性的分离打分。表5中显示的结果表明卡那霉素抗性为1:1分离，排除了多精受精，并且表明所述三倍体由未减数雌配子产生。
表5:杂交植株中KanR表型的分离
*由于种子是三倍体亲本与二倍体亲本的杂交产物，一些种子由于非整倍性而不能萌芽。
**1:1比率的拟合优度的显著性检验是排除了未萌发的种子而进行计算。
***5:1比率的拟合优度的显著性检验是通过把KanR类型中未萌发的种子包括在内而进行计算。理论上，只有50％未萌发的种子应包括在任一类型中(基于获得的KanR和Kans幼苗的比率)，但是为了增加显著水平，我们将全部未萌发的种子批包括在KanR类型中。这避免了这样的情况:即使我们将所有未萌发的种子批包括在了KanR类型中，5:1比率的拟合优度也不是显著性的，并因而强烈支持了赞成只有1:1比率的情况。
S x2检验为显著的，表明没有遵循所给出的比率
NS x2检验为不显著的，表明遵循了所给出的比率
实施例8:来自杨树(毛果杨)的DYAD基因和编码序列
来自杨树的DYAD基因的另一个实例可在http://www.ornl.gov/sci/ipgc找到。
cDNA序列的编码部分的翻译提供了一个氨基酸序列，用图11中的Clustal W程序将其与拟南芥的野生型DYAD蛋白的氨基酸序列比较。
AtDyad同系物毛果杨
如http://www.ornl.gov/sci/ipgc中的
基因组区域(SEQ ID NO:24)
外显子
内含子
包括第一个ATG上游的2444bp
cattcgttatggctaacggagtcactgggccttacatgcatccacagaccaggtgccggagtgctggtgcaaaaccaatttatt
gaatttctgaacaattggagacgaaataaatgtctttacttcttcaaacccttgatttaaaagtaaatgtattatcttttattgattttttt
attcaattcctagaattagtagcttgaagaatttattaaatttatcagataaatgagagggatatacccttaaaatcgtcaaaaataa
atctcaatttacttataaattgaagaataccttcttaaaaataaaataaaattgcgtgccatccctctttagtagattttggcgctactc
gtgtggtgtgggtacagagaagaatattaatatacccgagctggaactagaaggtcacccgccatatccaatgaggcaatcc
cgaacctctcccacaagcaagcatccgccacgtggtcagaagctacagaggttatgacctggctaaacgattggctaccagg
aaccaatggctcctcaaaggccatagataaataaatctaagagccagtttctttagctctcaactctctcaaccatctatacaaca
tttccagaggcaacaagactcgggaggggtaaaacggtaaaatgggagacgttactgtagaggagggagggggggacca
gaatccaggtcacgtgaggcgcatcccgtctggtaataatcattactatttttttctctctttatagcagaaatgcaccaccatcgtt
ggtttcacaacagaaaaaactccctcccccttctctctgcgttttctctcaagctgttttttcttgctctccaaacaatccatcacaag
tagcttttgaaacagaaattgaaaaaaaaaggtctcgttttatatttatttttgctgtttaattttcaacctgatttttttcatgtgcattaa
ttaattaatgctggtgtagttactctttggctggttgaatcggtgctggtactggataaaacatctcaaaaggaatgacccatttgc
atgtcattaaggggtgcatgtgtttgaatgaggaattcaaacaagtcctgacatgagtatgcattttcctgtggttaacagatatag
gttgtttggctcctggaagattctcaaaattgagatttcaagctcaaaagtgtttttgatacactttccaagcttcatgatctttaattt
accagtggtgtttttcctagttagtgtactttaaaggtcgcataatgatcggtagtacttagctttgattttgcattcccgttcgcttctt
cttgttttcagtctctgcgtaccaacaatatagagattctcctggctgtgcaagaatcactatatctatctatctatctatcaggcctt
aaccttgctttcttttctgatcaatccttgtgtttatgattgattaatgagattaattgtatgtttgcttcaaatgattatcttatatatagtc
tgattttccctttctttaatcatgtccatatatgtttattcgccggggggccgggaaggacgagaggtacgactagctagtattaac
ttgtgcagttgaaactgtttctctatgtgcagaagatgactaccatggagctggttgatgttgcagtgatagaccacccatcggtg
agtttgttctctcttctcctcaatcccactcccactctccactccccaaccaccacacccctttctttctgttactcctctatttctcttct
cgtaacccacgcgctcttttatctctcaaatcaagtcgctgattactagtctactaaagttttcaaatactcaaccgaattcctaatct
ttgtctcacgctcacacacataccaaatccacacgcgcgtcccctacaatttgttacgcaaatcaaaccccgctctacacatcct
tggtgcccaagtaagtgaaatgatgattttacataacaaaaaccacataattattatgctatgtaacggtatattctatacattctcta
tcgagtattgcacacgaggggcttatgcatacataaatcctcaccccttttaaaggagaagggcaatacagtgattttggttgtg
cttgtgaaaatgcaggaaataaaaaggaggcagaactccgaggacgccgatagaaggctttttttgggcggacattgcctgc
atcacccaacatttaccacagcaccaccatttggtaatatttgtaacacacacgcacacacgcccgagcaacaaatctctccct
cttttttatcccttttgtttcctctctctctctctctctctctcacttgatttctctcttctgatttgctgattttttttactgctcgtactagcta
gctagctctactcctatagctcacagtactgcaagtacgtagtactactgcagctgctgctagtgctagtagtagctATGTC
GTTTTCCACGCTAAGAGCTCTTGTTTCTGATCAAAATAAGGAATTCTCTGATT
ACTCTTTGTTTTCCATGCTTAATAATGAAGACCCAGCTGAGCATATTAAAGTG
AGCTCTTTTTATGAAGTTGATCACTCCAAGCTGCCTCATAAATCCCCTGATCA
ACTCAACAAAACCCGGGTTGTGATGGTATTTTTTATACAATTCAACAATATT
CTTAAACCCGGCTCAACATTTTTTTCTCTCTGCTTTAAAATTTGTTGGTGTTT
GTTTCTGCTTGAATAAATATCTCAGGTGAATGAAAAGACCAGGATGAGAGTC
TCGCTGAGGTTTCCAAGCATCAATTCTCTAAGATGTTACTTCAATGAGATTGA
AGCTATTAATTACAAGAAAGACATGAAAACGAAGAAGCAGCAGCTACCAGCA
TTCGACGAGAAATACATTATAGGATCAGAAGTTGCAGGGGAAGCTCTTTATA
GGAGAATCTCTTCTCAAGAAATGGCAGACAAGAGTTACTCATGGAGTTTCTG
GATGGTTAAACATCCTTCGGTTTCACCTCGAAAAGTGTCATACCCACCTACAA
GTACTCATGTTAATAAATTTGTTGGTGCAAGGAAGGTGTCTCTCATGTCTGAG
CTCAACGGGACAGGCATGGTTAAGTGGGGTCAGCGCCGGCAGGTCAGGTTC
TTGGCTAAACACGTAGAGGATAAACGTGAAATAGTGATTGCATCGAAGGATT
TGATTAAAAGCGAAGAAGAAAGACAGTGATGGTAGTGATGATGACACAGA
CGATGAGGACGAGGAGGAGGTCGATGTTAAGTTAGTAGTAAACAAGTCAAGT
GAAGCTAAAAGGAAATTACGTAAGAGAAAGTGTCAAGGTGGGTCTGGTATTA
GCAAATTATCACCAAAAAAGAAAAGGCGTAAAATTGAAAAGAAGAACCAGAT
TGTGGTCTATAGGCAAAAGAAGAACAAACTCATCAAGAATTCTATTGACAGAT
GGTCTGCGGGGAGGTAATAAAGCTTTTATTAGTTAATAAACTAAATTCAGA
TCGTCATTTGTGTTAATATATTTTTTTGATTAGTGTCTATATGTAGCTAGCTA
ATTTGGTTGGGTGATTTCTGTGAAGGTATAAATTGGCTGAGGAAAACATGTT
AAAGGTAATGAAAGAGCAAAATGCTGTGTTTCGACGCCCAATTTTAAGGCCA
GAATTGAGAGCTGAGGCACGGAAGTTGATTGGGGATACTGGGCTGTTAGACC
ACTTGTTGAAGCATATGTCAGGGAAGGTGGCTCCGGGAGGAGAAGAGAGATT
CAGAAGGAGGCATAACGCAGATGGAGCAATGGAGTATTGGCTGGAGAAGGC
TGATTTGGTTGATATCAGGAAAGAGGCTGGTGTGCAGGATCCTTATTGGACA
CCTCCACCTGGGTGGAAACCTGGTGATAATCCTAGTCAGGATCCAGTTTGTG
CTAGAGAGATCAAGGAACTCAGAGAAGAAATTGCTAAAATTAAAGGGTACTG
GTCCTTCTGTTTTAACTAGGATTGATTGTCTTTCAATTTTGTGTGGTCTTTTA
GCTTGTTAGTGCTGTTGATCTGGTAATGCCCACCAGTTTTTCTCTGTTACTCT
TGGGGTGAATTGTGTGCGCTACTGATTCCATCTCTCGCGTATGTGTTGTTCT
TATGGGGGGCAGGGAGATGGAGGCAATGGTGTCTAAAAAACACGGGGAGGA
ATTAGCAATGGTGGCAGCACCGAATTATTCTCCTACAAGTCAGGACATGGAG
CATGACAACTTCTTAATTCCACTGAAGGTAATAGATATGAAAGTTTGACCAG
ATTTTTGGACTGACCCAAGTTCTTCTCTTGACAATCCATGTACTATTTTTGCA
GGAAATGTACATTGATTTGGTGAATAAGAAGGTAAAGATGGAGGAACAACTA
AAGGAAATTTCAGAATCTTTGTATGGGATGAAGGTAGGAGAGCATGAGAATT
CTTCCTTTAATAATTATCATTTTCTTTTCAATTGAAGTGTGTAAGATTTGATA
TGAATGATTCTTTCCACGTTATGACGTTCTGGGTGCTACTAGTGTATATAAG
ATTCGTTCAAATAAGAAATTCCTGGGTGATTGCATGATCCACATCATTGAA
AGATGGTAGTAACAAACTGACCATCTGATGCATGTATCTATTCTAGATAAT
AAGTTGATGCATAAATTGCCATGAAACCATTTGAGAAGCTGTTATATTTAG
AGGCTTGATATGGGAGTGTTGCTTATTCCAGACTAGATTTTTGCAATTATTT
AGTTCAATTTAAAGCTCAAAATCCCACATTAAATAGTTTCATAAATGATGA
ATGTTCTGGCAGTGGATTTCCGTTGTCCTTGGTAGTACTTTCTAATCTGGAC
AGCATTTATATTGTAACAATGATACGCTTAATGATGATCTTAGGATGAATTG
GTTAGTTATGAATTTTAGTTGTCCTTACAGTGCAACGGGGAGGCTTGGCTGCA
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TGGAAATATTTAATTGATGCAGGAAGAAATGGAGAAGCTAAAAACCAGAGT
GGAGAAATCAAACAGAGCAGAATCAACTGAAAAGCCAGCTTTATTAATGGGC
TCAACAGAGTCAATCACGCCAGCAGGAACTGGAAGAAAGGGGAAAGGAGTA
ATGCATCAGGAAAAAGAAGCAACGGTTTTAGGGGAATCAGCACAAGAACAAT
GCAAGTCATCATCAGGAGGCATCATAGCACCAAGAACAGAATCACCAGCACC
AACGGAGGACAGGGCAGCAAAGATAGAGAGGCTGAAAAGCGGGTTTAGAAT
ATGCAAGCCCCAGGGAAGTTTCCTGTGGCCGGATATGACTACCTTAACCCCT
CACCCTCAGGTTGTGGTCCTACTAGAAGACCTCATTGCGGTACAAACACCTC
CCTCAGTGTCCTCCACTACACCAAAACAATCTCACTTCCTCTTTGCTCCTCCA
TCTCAAACCCATACACCCCACCGTACTTTCCCTGTGAAGCCATTAGCTGAGAG
AAGGCCTGTCACCATTCCCCAAATCCACAGCTGCCACGACTCCAACCAGCTGT
CCTCCCCTTGATCAAATGACTCACTCCCAGTATGAGAATAGCAGCATTTCCAC
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CACTGAATACCAATCAAACTGATGATTATGGATTGTTTTATGGGTCTCAGTCT
CATGCTGAAGCCTCTCCTCACCCTGTCACTTACCAAAGAAGACATCATCAAAA
TGTGACCACCAGTATTGCCATGCCAAGTGTATGTGTACTTATCAAATCTCAA
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CCTTTTTCATTTTCTGTATGTTTTACACAGTTGGGACCCACAAGAAAGGGAT
GATGAGCCAATGGGAGGAAGGTGATCGGAGAAAAGGAATGATAAGGTACTG
TGAGCAGTGTGAGCAGCAACAGGGATGCTCCTCTGCCTCTTCCATTGCATCT
TCTTCCTTGCCAATGGGAAAGGGGACTTGGTTGGCTCTGGCTACTTCTAAGG
CTTCCGTGGAGCACAAATCTAAAAGGGGTTAAACAATCTATAATAATAATAG
TAGTAGTAATAATGGCTAGTTTATTATGCTAGAGTAGTTATTAGTTAAACCC
CTGGAAAAACATTGATTAGGTTGGGTTTCACTTAATGCTTTCCCTGTCTTTG
GGCAAGGAATCTTCTTAACATAGTTATATACATATGGCATATACAAGGCAC
AAAGAGCTTTTAGCGTATAGGAAAA
数据库中的转录体/CDS(2493bp)(SEQ ID NO:25)
atgtcgttttccacgctaagagctcttgtttctgatcaaaataaggaattctctgattactctttgttttccatgcttaataatgaagac
ccagctgagcatattaaagtgagctctttttatgaagttgatcactccaagctgcctcataaatcccctgatcaactcaacaaaac
ccgggttgtgatggtgaatgaaaagaccaggatgagagtctcgctgaggtttccaagcatcaattctctaagatgttacttcaat
gagattgaagctattaattacaagaaagacatgaaaacgaagaagcagcagctaccagcattcgacgagaaatacattatag
gatcagaagttgcaggggaagctctttataggagaatctcttctcaagaaatggcagacaagagttactcatggagtttctggat
ggttaaacatccttcggtttcacctcgaaaagtgtcatacccacctacaagtactcatgttaataaatttgttggtgcaaggaagg
tgtctctcatgtctgagctcaacgggacaggcatggttaagtggggtcagcgccggcaggtcaggttcttggctaaacacgta
gaggataaacgtgaaatagtgattgcatcgaaggatttgattaaaagcgaagaagagaaagacagtgatggtagtgatgatg
acacagacgatgaggacgaggaggaggtcgatgttaagttagtagtaaacaagtcaagtgaagctaaaaggaaattacgta
agagaaagtgtcaaggtgggtctggtattagcaaattatcaccaaaaaagaaaaggcgtaaaattgaaaagaagaaccagat
tgtggtctataggcaaaagaagaacaaactcatcaagaattctattgacagatggtctgcggggaggtataaattggctgagg
aaaacatgttaaaggtaatgaaagagcaaaatgctgtgtttcgacgcccaattttaaggccagaattgagagctgaggcacgg
aagttgattggggatactgggctgttagaccacttgttgaagcatatgtcagggaaggtggctccgggaggagaagagagat
tcagaaggaggcataacgcagatggagcaatggagtattggctggagaaggctgatttggttgatatcaggaaagaggctg
gtgtgcaggatccttattggacacctccacctgggtggaaacctggtgataatcctagtcaggatccagtttgtgctagagaga
tcaaggaactcagagaagaaattgctaaaattaaaggggagatggaggcaatggtgtctaaaaaacacggggaggaattag
caatggtggcagcaccgaattattctcctacaagtcaggacatggagcatgacaacttcttaattccactgaaggaaatgtacat
tgatttggtgaataagaaggtaaagatggaggaacaactaaaggaaatttcagaatctttgtatgggatgaaggaagaaatgg
agaagctaaaaaccagagtggagaaatcaaacagagcagaatcaactgaaaagccagctttattaatgggctcaacagagt
caatcacgccagcaggaactggaagaaaggggaaaggagtaatgcatcaggaaaaagaagcaacggttttaggggaatc
agcacaagaacaatgcaagtcatcatcaggaggcatcatagcaccaagaacagaatcaccagcaccaacggaggacagg
gcagcaaagatagagaggctgaaaagcgggtttagaatatgcaagccccagggaagtttcctgtggccggatatgactacct
taacccctcaccctcaggttgtggtcctactagaagacctcattgcggtacaaacacctccctcagtgtcctccactacaccaa
aacaatctcacttcctctttgctcctccatctcaaacccatacaccccaccgtactttccctgtgaagccattagctgagagaagg
cctgtcaccattccccaatccacagctgccacgactccaaccagctgtcctccccttgatcaaatgactcactcccagtatgag
aatagcagcatttccacttctactaccatcaccaccactaccaaaacccctctcatcaaccttaatgagccactgaataccaatc
aaactgatgattatggattgttttatgggtctcagtctcatgctgaagcctctcctcaccctgtcacttaccaaagaagacatcatc
aaaatgtgaccaccagtattgccatgccaagtttgggacccacaaagaaagggatgatgagccaatgggaggaaggtgatc
ggagaaaaggaatgataaggtactgtgagcagtgtgagcagcaacagggatgctcctctgcctcttccattgcatcttcttcctt
gccaatgggaaaggggacttggttggctctggctacttctaaggcttccgtggagcacaaatctaaaaggggttaa
如数据库中的蛋白质序列(830aa)(SEQ ID NO:26)
>eugene3.00030791[Poptrl:554158]
MSFSTLRALVSDQNKEFSDYSLFSMLNNEDPAEHIKVSSFYEVDHSKLPHKSPD
QLNKTRVVMVNEKTRMRVSLRFPSINSLRCYFNEIEAINYKKDMKTKKQQLPA
FDEKYIIGSEVAGEALYRRISSQEMADKSYSWSFWMVKHPSVSPRKVSYPPTST
HVNKFVGARKVSLMSELNGTGMVKWGQRRQVRFLAKHVEDKREIVIASKDLI
KSEEEKDSDGSDDDTDDEDEEEVDVKLVVNKSSEAKRKLRKRKCQGGSGISKL
SPKKKRRKIEKKNQIVVYRQKKNKLIKNSIDRWSAGRYKLAEENMLKVMKEQ
NAVFRRPILRPELRAEARKLIGDTGLLDHLLKHMSGKVAPGGEERFRRRHNAD
GAMEYWLEKADLVDIRKEAGVQDPYWTPPPGWKPGDNPSQDPVCAREIKELR
EEIAKIKGEMEAMVSKKHGEELAMVAAPNYSPTSQDMEHDNFLIPLKEMYIDL
VNKKVKMEEQLKEISESLYGMKEEMEKLKTRVEKSNRAESTEKPALLMGSTES
ITPAGTGRKGKGVMHQEKEATVLGESAQEQCKSSSGGIIAPRTESPAPTEDRAA
KIERLKSGFRICKPQGSFLWPDMTTLTPHPQVVVLLEDLIAVQTPPSVSSTTPKQ
SHFLFAPPSQTHTPHRTFPVKPLAERRPVTIPQSTAATTPTSCPPLDQMTHSQYE
NSSISTSTTITTTTKTPLINLNEPLNTNQTDDYGLFYGSQSHAEASPHPVTYQRR
HHQNVTTSIAMPSLGPTKKGMMSQWEEGDRRKGMIRYCEQCEQQQGCSSASS
IASSSLPMGKGTWLALATSKASVEHKSKRG*
实施例9:玉米DYAD多核苷酸和多肽的鉴定
在网站(www.plantgdb.org)上用TBLASTN和水稻DYAD蛋白(SEQID NO:51)作为查询序列搜索玉米基因组显示推定的DYAD基因存在于对应重叠群ZmGSStuc11-12-04.1016.1(SEQ ID NO:52)和ZmGSStuc11-12-04.1016.2(SEQ ID NO:53)的玉米基因组区域内。用GENSCAN(http://genes.mit.edu)结合手动编辑注解该区域导致确定了可以与水稻DYAD多肽序列比对(图12)的推定的玉米多肽序列。本发明包括使用所述玉米多肽序列和编码所述多肽的多核苷酸序列。
将从玉米获得的多肽序列定位至通过下面的核苷酸坐标显示的重叠群核苷酸序列。还显示了组装的部分由所述重叠群序列编码的ZmDYAD多肽序列。
ZmGSStuc11-12-04.1016.1(SEQ ID NO:52)坐标和概念性翻译
5335 ESKDGDPR..........GVKRYI 4882；4724 EQLLCK.........DYSSLK 4662；
4142 EKYQRA....QVLCLK 4080；3805 DMCEN......EVSSFK 3743；3605
EKYEHI.....FLSFK 3522；3413 DQLVVAL......GLTRRDV 2865：2697
DTSSS.....LATPSYC 2563；
玉米的组装的多肽:
(SEQ ID NO:54)
ESKDGDPRHGKDRWSAERYAAAEKSLLNIMRSRDARFGAPVMRQVLREEARK
HIGDTGLLDHLLKHMAGRVPEGSVHRFRRRHNADGAMEYWLEPAELAEVRK
QAGVSDPYWVPPPGWKPGDDVSLVAGDILVKRQVEELTEEVNGVKRYIEQLL
CKDDGDFGAERDYSSLKEKYQRAVRANEKLEKQVLCLKDMCENVVQMNGEL
KKEVSSFKEKYEHIADKNDKLEEQVTYLSSSFLSFKDQLVVALKLELAPSEAVP
RTALFVASGEQMTGTVIQGGQDRAERKSSFRVCKPQGKFLLPSMASGMTIGRG
ASSTCPAAATPGPGIPRSTSFPSMPGLPRSSRGPVEVVAAASGLDEHVMFGAHF
STPPSASSTNDAAKLQLSLPSPRSPLQPQKLFDTVTAAASGFSPQKLMHFSGLTR
RDVDTSSSSSGACGSGLLEGKRVLFDADAGGISAVGTELALATPSYC
ZmGSStuc11-12-04.1016.2(SEQ ID NO:53)坐标和概念性翻译
774 MSLFIS 757；574 KPQVKK......PTYHA 418；315 GAFYEID......SIRVVK 237；
144 VSECTN......SNHAAR 1；
玉米的组装多肽:
(SEQ ID NO:55)
MSLFISKPQVKKYYFKKKTSSSHSRNGKDDVNHDSTIQPRSPLSRQSLTFDAIPT
YHAGAFYEIDHDKLPPKSPIHLKSIRVVKVSECTNLDITVKFPSLQALRSFFSSYP
APGTGPELDERFVMSSNHAAR
实施例10:孤雌生殖的一般方法
最佳辐射量的确定:
1.从与待使用的母本植株相同的种或近缘种的父本植株收集花药并用剂量范围包括1、5、10、20、30、50、70、100、150、200krad的电离辐射进行辐射。
2.给去雄的花或来自雌株植物的雌花授粉，所述雌株植物因为携带有一个或多个隐性表型标记或者DNA标记(微卫星、CAPS或RAPD)方面与经放射的花粉亲本不同。对于每种剂量的电离辐射，优选将10-50朵花用于授粉。
3.收集授粉了的花的种子并合并来自用接受相同辐射量的花粉授粉的花的种子。
4.让种子萌芽并生长成植株，这样对于每一剂量的辐射产生了大约20-100株植株。
5.关于表型标记或DNA标记对植株的基因型打分并计算出与母本相似的植株的比例。
6.选择产生了高比例的有活力植株以及高比例的与母本相似的植株这两者的最佳组合的剂量。
在dyad突变植物中诱导孤雌生殖:
1.用使用如上描述确定的合适电离辐射剂量辐射的花粉给dyad突变体植株授粉。
2.收集种子。
3.使种子萌芽并生长成植株。
孤雌生殖植株的鉴定:
1.关于由母本携带的隐性表型标记给植株打分。将显示隐性表型的植株归类为孤雌生殖植株。另外，可以通过从植物组织分离DNA，之后分析DNA的多态性标记来关于DNA标记给植株打分。将显示这样的标记模式的植株归类为孤雌生殖植株，所述标记模式表现母本的特征并且缺少父本的标记带。因而可以计算出来自授粉试验的孤雌发育的植株的比例。
2.可以检验孤雌生殖植株的对母本来说是杂合的标记。保留了对母本dyad突变体亲本来说是杂合的所有标记的杂合性的那些植株是无融合生殖的植株。
可用于不同玉米种的可能的分子标记的参考文献在下面列出:
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水稻:www.gramene.org
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www.gramene.org
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甘蓝:Bohuon等，(1998).″Comparison of a Brassica oleraceagenetic map with the genome of Arabidopsis thaliana″.Genetics150:393-401。
芥菜:Pradhan等，(2003).A high-density linkage map inBrassica juncea(Indian mustard)using AFLP and RFLP markers.Theor Appl Genet.2003 Feb；106(4):607-14。
油菜:Piquemal等，(2005).Construction of an oilseed rape(Brassica napus L.)genetic map with SSR markers.Theor ApplGenet.2005 Nov；111(8):1514-23。
芜青:Kole等，(1997).Genetic linkage map of a Brassica raparecombinant inbred population.J.Hered.88:553-557。
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杨树:Yin等，(2001).Preliminary interspecific genetic mapsof the populus genome constructed from RAPD markers.Genome 2001Aug；44(4):602-9。
Tuskan等，(2004).Characterization of microsatellitesrevealed by genomic sequencing of Populus trichocarpa.CanadianJ.Forest Res.34(1):85-93。
用质粒pBI101.3::DyadΔGR转化的大肠杆菌菌株DH5α的样品已经存放在了International Depository Authority、Microbial TypeCulture Collection and Gene Bank(MTCC，Institute of MicrobialTechnology(IMTECH)，Council of Scientific and IndustrialResearch(CSIR)，Sector-39A，Chandigarh-160 036，India)。该样品于2006年12月1日存放并且具有Internal Reference No BI507。包含至少2500粒dyad突变体(作为雄株)与野生型雌株植物的F2代杂种的种子并且dyad突变体分离的样品已经由美国菌种保藏中心(Manassas，VA20108，USA)保藏。该样品于2006年12月1日发送并且具有Internal Reference No ISDYF2C。一种包含至少2500粒种子(源自品系no.33)的样品已经由美国菌种保藏中心(Manassas，VA20108，USA)保藏，所述种子对dyad和DyadΔGR插入物来说是纯合的并且其响应地塞米松表现为条件不育。该样品于2006年12月1日发送并且具有Internal Reference No.33-5DYGR。
在这里引入了多篇科学期刊和专利文献的文章。每篇这样的文章由此以全文引用的方式并入本文并且通过这样的引用来用于所有目的。
序列表
机译： 核酸和在胚胎中产生具有母体基因组全二倍体补体的种子的方法
机译： 核酸和在胚胎中产生具有母体基因组全二倍体补体的种子的方法
机译： 核酸和在胚胎中产生具有母体基因组全二倍体补体的种子的方法
