由肿瘤抗原衍生的优化隐蔽性肽组成的免疫原性多肽及其用途

摘要

本发明是有关抗癌疫苗领域。具体来说，本发明涉及用作抗癌疫苗的优化多肽，其包含免疫原性增强的3种隐蔽性肿瘤肽，以及包括氨基酸序列YLQVNSLQTVYLEYRQV PVYLEEITGYL。编码所述多肽的核酸和复合物，以及用这种多肽或编码该多肽的核酸改造的树突细胞也是本发明的一部分。

说明书

技术领域

本发明是有关抗癌疫苗领域。具体来说，本发明涉及用作抗癌疫苗的优 化多肽，其包含免疫原性增强的3种隐蔽性肿瘤肽(cryptic tumor peptides)。

背景技术

最近由抗肿瘤细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocytes，CTL)靶向的 肿瘤相关抗原的确定，打开了旨在激发肿瘤特异性CTL库(tumor-specific CTL repertoire)的肿瘤疫苗的方法之路。

实验性的抗肿瘤疫苗可以是多种形式，包括自由肽、负载有肽或肿瘤裂 解物的树突细胞(dendritic cells)，以及DNA。尽管基于肽的疫苗在可行性方 面比其他的形式更引人关注，但利用占主导地位的肿瘤肽的研究发现，其仅 能引发微弱的免疫学和临床应答，而且伴有患者间的强烈可变性(Rosenberg 等，2004)。几个因素可解释这些相对令人失望的结果。首先，大多数肿瘤抗 原是正常组织包括胸腺也表达的非自身突变蛋白。这就提出了肿瘤特异性 CTL库的耐受性问题(Restifo，2001；Van Pel等，1995)，其涉及占主导地位的 肽而非隐蔽性肽(Cibotti等，1992；Nanda和Sercarz，1995；Restifo，2001)。实 际上，最近证明，隐蔽性肽要比占主导地位的肽能更有效地诱导抗肿瘤免疫 (Gross等，2004)。

其次，基于单个表位的方法诱导了仅针对一种抗原的HLA-限制性CTL 应答，由于肿瘤的遗传不稳定性，而使该抗原可能并不被所有的肿瘤表达 (Brasseur等，1995；Lehmann等，1995)。引发针对多种抗原的CTL应答的方法 可能具有几种潜在优势。特别是，表达至少一种靶抗原就足以触发细胞毒性， 并且肿瘤细胞同时遗失所有靶抗原的可能性很小，特别是，当所讨论的抗原 是细胞存活和肿瘤生长所必需的时。这种方法可引发强烈的免疫应答(Oukka 等，1996)。

最后，广谱癌症免疫治疗应该靶向通用的肿瘤抗原，如TERT、 HER-2/neu、MUC-1和MAGE-A，这些肿瘤抗原被各种肿瘤超表达(Minev 等，2000；Ofuji等，1998；Ogata等，1992；Reese和Slamon，1997；Slamon等， 1987；Van den Eynde和van der Bruggen，1997；Vonderheide等，1999)。这些 抗原大多数都与肿瘤细胞存活和致癌力有关，因此为逃避免疫应答而对它们 进行负调节，可能会对肿瘤生长产生有害作用。

为了回答至少部分上述问题，本发明人将3种通用的肿瘤抗原衍生的优 化隐蔽性肽(TERT_988Y、HER-2/neu_402Y和MAGE-A_248V9)组合于几种28个氨基 酸的多肽中，并且既在HLA-A^*0201转基因(HHD)小鼠体内又在健康人供体 体外评估了所得多肽同时诱导针对所有3种肽的免疫应答的能力。以前，已 经证实了这3种肽都可引发体内和体外抗肿瘤应答(Gross等，2004；Scardino 等，2002)。令人感兴趣的是，由MAGE-A_248v9引发的CTL靶向所有的MAGE-A 抗原(-A1，-A2，-A3，-A4，-A6，-A10，-A12)(Graff-Dubois等，2002)。

如下文所述，本发明人证明了：a)与TERT_988Y、HER-2/neu_402Y和 MAGE-A_248V9的简单混合物相反，由这3种肽组成的多肽能引发多特异性 CTL应答；b)该多肽诱导多特异性CTL应答的能力依赖于其内部的结构：在 对应于这3种肽的所有可能排列的6种变体中，只有一种变体能在几乎所有 的小鼠和人细胞实验中产生三特异性CTL应答。

因此，本发明的第一方面是包含序列 YLQVNSLQTVX₁X₂X₃YLEYRQVPVX₁X₂X₃YLEEITGYL(SEQ ID NO：1)的 多肽。在该序列中，间隔区X₁X₂X₃使TERT_988Y、MAGE-A_248V9和HER-2/neu_402Y表位分隔开，其中X₁、X₂和X₃是任何氨基酸或序列中无X₁、X₂和X₃。因 此，该多肽的长度至少为28个氨基酸；其长度可通过在表位之间加入间隔 区和/或通过在其N末端和/或C末端加入有利于加工的信号来增加。特别是， 本发明的多肽可在其N末端进一步包含一内质网移位信号序列。几种内质网 移位信号序列已描述于科学文献中，并可用于本发明中。例如，可将Ig K(kappa)-链信号序列(Ishioka等，1999)和E3/19-kD蛋白信号序列(Anderson 等，1991)加于本发明多肽的N末端。可选地或另外，本发明的多肽可在其C 末端进一步包括遍在蛋白，因为蛋白的遍在蛋白化作用可使蛋白水解提高。

在本发明多肽的优选实施方案中，X₁＝X₂＝X₃＝无。这表示3种表位彼此 直接结合。在缺少遍在蛋白和ER-移位信号时，多肽因而是下文实施例阐明 的Poly-6多肽，其序列是YLQVNSLQTVYLEYRQVPVYLEEITGYL(SEQ ID NO：2)。

根据另一个实施方案，表位之间的间隔区是AAY，其表示X₁＝X₂＝A和 X₃＝Y。

在本发明的多肽中，氨基酸可以是L-氨基酸或D-氨基酸。

本发明的多肽优选具有一种和两种下述特性，这些特性是良好免疫原性 指标：

—其在大多数接种了所述多肽的HHD小鼠中，诱导针对TERT_988Y、 MAGE-A_248V9和HER-2/neu_402Y的三特异性CD8+T细胞应答。

—其在用健康HLA-A^*0201供体的人PBMC的体外分析中，诱导针对 TERT_988Y、MAGE-A_248v9和HER-2/neu_402Y的三特异性CD8+T细胞应答；这 种三特异性应答优选是用大多数更优选至少70％的健康HLA-A^*0201供体的 PMBC获得。

利用下文试验部分中所述的方案和分析，本领域熟练的技术人员可以很 容易地检测这些特性。

本发明的另一个目的是编码上述多肽的核酸分子。在优选的实施方案 中，核酸分子是表达载体。“表达载体”意指当引入哺乳动物细胞中时能让 编码蛋白表达的分子。为此，本领域熟练的技术人员可选择适当的转录启动 子(例如CMV启动子)、含有用于在人细胞中表达的优化密码子的编码序列、 适当的翻译终止序列，任选地，Kozak共有序列等。核酸分子优选是DNA 分子。

本发明的第三方面是负载有上述多肽的分离的树突细胞，或用编码所述 多肽的核酸转导的分离的树突细胞。在本发明中，“分离的”意指所述树突 细胞在患者体外。优选，离体负载或转导所述细胞。例如，可通过Vonderheide 等(Vonderheide等，2004)所述的技术使树突细胞负载多肽，或利用Firat等 (Firat等，2002)所述的方案用表达载体转导树突细胞。

本发明还涉及包含肽递送载体和本文所述多肽的复合物。可根据本发明 使用的肽递送载体的实例是细胞渗透肽(cell-penetrating peptides)、细菌毒素 如百日咳鲍特氏菌(B.pertussis)的腺苷酸环化酶(Fayolle等，1999)、白喉毒素 (Fayolle等，1999)、炭疽毒素(Doling等，1999)、志贺毒素B亚单位(Haicheur 等，2000)以及其他的载体如蜂毒PLA2(Babon等，2005)、脂质体、病毒颗粒 (Bungener等，2002)等。

本发明的另一类复合物包含基因递送载体和上述核酸分子。目前，已经 描述了种类繁多的基因递送载体，本领域熟练的技术人员可根据设计的施用 途径(离体、肿瘤内、全身等)、靶细胞类型等来进行选择。可依据本发明使 用的基因递送载体的非限制性实例是非病毒载体，如脂质体、细胞渗透肽、 纳米颗粒(与基因枪施用所用的金颗粒一样)；细菌(Vassaux等，2005)和病毒 载体如MVA(Meseda等，2005)、腺病毒、腺相关病毒、逆转录病毒、慢性病 毒等，其广泛描述于科学文献中。

本发明还涉及包含上文所述的多肽和/或核酸分子和/或复合物和/或改造 的树突细胞的药物组合物。特别是，本发明的多肽、核酸分子、复合物和树 突细胞可用于制备抗癌免疫疗法所用的免疫原性组合物。这些组合物特别有 利于肿瘤的免疫治疗，特别是用于治疗HLA-A^*0201个体，所述的肿瘤表达 至少一种选自MAGE-A家族、HER家族和TERT的抗原。

癌症接种或治疗方法，其包括向有需要的患者体内施用或向来源于所述 患者的细胞离体施用本发明的多肽和/或核酸分子和/或复合物的步骤，也是 本发明的一部分，以及包括向个体施用上文所述的经改造的树突细胞的步骤 的接种或治疗方法。

下列附图和实施例将进一步阐明本发明。

附图说明

图1：优化的隐蔽性肽诱导的小鼠CTL对同源的天然肽的识别。

CTL系衍生于免疫抵抗优化的隐蔽性肽的HHD小鼠脾细胞，如材料和 方法部分所述。以淋巴细胞：靶细胞为10：1的比例，对CTL系用不相关肽 (HIVgag76)或用同源天然肽负载的RMAS/HHD的细胞毒性进行了检测。

实施例

实施例1：材料和方法

1.1动物

HLA-A^*0201转基因HHD小鼠在别处已有描述(Pascolo等，1997)。

1.2细胞

鼠RMAS/HHD细胞在别处已有描述(Pascolo等，1997)。表达 HLA-A^*0201的人肿瘤T2细胞是TAP1/2-缺陷性的。所有的细胞都培养于补 充了10％胎牛血清(FCS)的RPMI 1640或DMEM培养基中。

1.3肽

通过Epytop(Nimes，France)合成肽。

1.4肽/HLA-A^＊0201相对亲和性和稳定性的测量

用于测量相对亲和性(relative affinity，RA)的方案在其他的地方有详细的 描述(Tourdot等，2000)。简单来说，将T2细胞用各种肽浓度(0.1-100μM)温 育16小时，随后用mAb BB7.2进行标记，以便定量HLA-A^*0201的表达。 在每种肽浓度的情况下，HLA-A^*0201特异性标记计算为用100μM的参考 肽HIVpol₅₈₉(IVGAETFYV)获得的标记百分比。相对亲和性计算为试验的肽 浓度除以诱导了20％HLA-A^*0201表达的参考肽浓度。为了测量肽 /HLA-A^*0201复合物稳定性，将T2细胞与100μM的每种肽在37℃一起温 育过夜。随后将细胞用Brefeldin A处理1小时，洗涤，37℃温育0、2、4和 6小时，并用mAb BB7.2进行标记。DC₅₀定义为损失50％HLA-A^*0201所 需的时间，如前所述(Tourdot等，2000)。

1.5CTL在HHD小鼠中的产生

向HHD小鼠皮下注射100μg九聚体/十聚体的肽(nonamer/decamer peptides)和240μg用弗氏不完全佐剂(incomplete Freund′s adjuvant，IFA)乳化 的多肽外加150μg的I-A^b限制性HBVcore₁₂₈T-辅助表位。11天后，在RPMI 1640+10％FCS中，用肽(10μM)体外刺激受免疫小鼠的脾细胞(10ml中含 5×10⁷个细胞)5天。在降低的肽浓度和50U/ml 1L-2(Proleukin，Chiron Corp.， Emeryville，CA)存在的情况下，通过用辐射处理的体外脾细胞每周进行再刺 激，建立CTL系。

1.6细胞毒性分析

鼠RMAS/HHD细胞用作靶标，如其他文献所述(Tourdot等，1997)。简 单来说，将2.5×10³个⁵¹Cr标记的靶标用肽在37℃脉冲60分钟。随后加入 100μl培养基中的效应细胞，并在37℃温育4小时。温育后，收集100μl上 清夜，并在γ计数器中测量放射性。特异性裂解百分比测定为：裂解＝(试验 释放—自发释放)/(最大释放—自发释放)×100。

1.7流式细胞术荧光免疫分析

对于四聚体标记来说，将来自免疫小鼠腹股沟和主动脉旁淋巴结(LN)的 细胞，室温下用15μg/ml PE-耦联的HLA-A2/TERT_988Y、 HLA-A2/MAGE-A_248V9和HLA-A2/HER-2/neu_402Y四聚体(Proimmune，Oxford， UK)，在存在抗-Fc受体抗体(克隆2.4G2)的条件下，在20μl PBS、2％ FCS 中，染色1小时。在PBS、2％ FCS中将细胞洗涤一次，随后用抗CD44-FITC (克隆1M.178)、抗-TCRβ-cychrome(克隆H57)和抗-CD8α-APC(克隆53.6.7) (BD Biosciences，Le Pont de Claix，France)，在50μl PBS、2％ FCS中、4℃染 色30分钟。随后在PBS、2％ FCS中洗涤一次，并直接在流式 细胞仪(Becton Dickinson，San Jose，CA，USA)中分析。

1.8来自人外周血单核细胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMC) 的CD8细胞产生

通过白细胞分离术(leukapheresis)从健康的HLA-A^*0201志愿者中收集 PBMC。从粘附细胞(2×10⁶细胞/ml)中产生树突细胞(DC)，所述的粘附细胞用 5001U/ml GM-CSF(Schering-Plough，Kenilworth，NJ)和500 IU/ml IL-4(R＆D Systems，Minneapolis，MN)，在完全培养基(补充了10％热 失活人AB血清、2μM L-谷酰胺和抗生素的RPMI 1640)中培养7天。在第 七天，用10μM肽或多肽使DC脉冲2小时；将100ng/ml熟化剂(maturation agent)Poly 1：C(Sigma，Oakville，Canada)和2μg/ml的抗-CD40mAb(克隆 G28-5，ATCC，Manassas，VA)加入到培养物中，并将DC在37℃进一步温育 过夜或最多48小时。随后对成熟DC进行辐射处理(3500rads)。根据制造商 的说明书，通过用CD8 MicroBeads(Miltenyi Biotec，Auburn，CA)进行阳性选 择，来纯化CD8⁺细胞。在圆底96孔板中，在补充了1000IU/ml IL-6和5IU/ml IL-12的完全培养基(R＆D Systems，Minneapolis，MN)中，用2×10⁴肽-脉冲的 DC刺激CD8⁺细胞(2×10⁵)+CD8^-细胞(6×10⁴)。从第7天起，用肽负载的DC， 在存在20 IU/ml IL-2(Proleukin，Chiron Corp.，Emeryville，CA)和10ng/ml IL-7(R＆D Systems，Minneapolis，MN)的条件下，对培养物每周进行再刺激。 第三次再刺激后，在IFN-γ释放分析中检测CD8细胞。

1.9细胞内IFN-γ标记

将T细胞(10⁵)与负载了刺激肽的2×10⁵T2细胞，在存在20μg/ml Brefeldin-A(Sigma，Oakville，Canada)的情况下，一起温育。6个小时后，洗 涤，用r-藻蓝蛋白轭合的抗CD8抗体(Caltag Laboratories，Burlingame，CA)在 PBS中、于4℃染色25分钟，再次洗涤，用4％的PFA固定。随后用PBS、 0.5％ BSA、0.2％皂角苷(Sigma，Oakville，Canada)渗透细胞，并在用 FACSCalibur^TM流式细胞仪(Becton Dickinson，Mountain View，CA)分析之前， 用别藻蓝蛋白轭合的抗IFNγmAb(PharMingen，Mississauga，Canada)、4℃下 标记25分钟。

实施例2：用于产生多肽的肽的免疫原性

选出3种肽包括于多肽中。HER-2/neu_402Y和TERT_988Y是低-HLA-A^*0201-亲和性隐蔽性肽HER-2/neu₄₀₂和TERT₉₈₈的优化变体，其自身衍生于广 泛表达的肿瘤抗原HER-2/neu和TERT(Scardino等，2002)。它们在位置1处 不同于天然肽，在该位置，天然残基由Y取代。这种取代增强了HLA-A^*0201- 限制性隐蔽性肽的亲和性(Tourdot等，2000)。MAGE-A_248V9是低-HLA-A^*0201-亲和性MAGE-A_248D9/G9的优化变体，所述MAGE-A_248D9/G9是所有 MAGE-A分子共有的。其在位置9不同于天然肽，在该位置，氨基酸D/G 由主锚定残基V(primary anchor residue V)取代。这种取代也增强了 HLA-A^*0201亲和性(Graff-Dubois等，2002)。

所有的3种肽显示了高HLA-A^*0201结合亲和性(RA<5)，并形成了稳 定的HLA/肽复合物(DC50>2h)(Graff-Dubois等，2002；Scardino等，2002) (表1)。如前所示，所有的3种肽在HLA-A^*0201转基因HHD小鼠中是免疫 原性的(Graff-Dubois等，2002；Scardino等，2002)。更重要的是，小鼠CTL系 能特异性识别并杀死负载了适当天然肽的RMAS/HHD靶标(图1)。

表1.肽MAGE-A_248V9、HER-2/neu_402Y和TERT_988Y的HLA-A^*0201亲和性。¹RA ＝相对亲和性；试验肽的浓度/参考肽的浓度，其诱导了用100μM参考肽获得的20％ 的HLA-A^*0201的表达。参考肽的亲和性＝1.²DC50：解离复合物50:HLA/肽复合物 的半衰期(h)。

实施例3：对肽混合物的免疫应答

体内刺激多特异性CTL应答的最简单方法是注射相关肽的混合物。 因此，本发明人检测了用肽HER-2/neu_402Y、TERT_988Y和MAGE-A_248v9等 摩尔混合物接种的HHD小鼠是否获得了体内多特异性应答。注射接种7 天后，利用特异性四聚体，通过测定在淋巴结中肽特异性CD8 T细胞的 频率，来评估免疫应答。在使用之前，如前所述(Miconnet等，2002)，用 肽特异性-CTL系使每种四聚体生效。当四聚体阳性的CD8细胞的百分比 高于6只天然小鼠中的平均百分比+四聚体阳性的CD8细胞的三个标准 偏差(MAGE-A_248V9，0.16％；HER-2/neu_402Y，0.13％；以及TERT_988Y，0.16％) 时，记录阳性应答。在两个独立的试验中，8只小鼠都接种了肽混合物(表 2)。8只小鼠都不能同时对所有三种肽产生应答。3只小鼠对一种肽产生 了应答，5只小鼠对两种肽产生了应答。对MAGE-A_248V9的应答比对 HER-2/neu_402Y(4/8小鼠)或TERT_988Y(3/8小鼠)的应答更频繁。

表2.CD8T细胞在用等摩尔的肽混合物免疫的单个小鼠中针对MAGE-A_248v9、 HER-2/neu_402Y和TERT_988Y的应答。“+”：四聚体阳性的CD8 T细胞的百分比介于 1倍和2倍的取舍点(cutoff)之间，如“材料和方法”中所定义的(MAGE-A248V9，0.16％； HER-2/neu402Y，0.13％；以及TERT988Y，0.16％)。“++”：四聚体阳性的CD8 T细 胞的百分比是取舍点的2倍多。

用体外人细胞证实了肽混合物不能刺激三特异性CD8 T细胞应答。 用MAGE-A_248v9、HER-2/neu_402Y和TERT_988Y的混合物体外刺激来自3种 HLA-A^*0201供体的PBMC，并在再刺激四轮后，检测它们识别和被负 载了每种肽的刺激细胞激活的能力。通过利用细胞内标记的方式测量产 生IFNγ的CD8细胞的百分比，来评估PMBC激活。当激活的PBMC的 百分比是用不相关的肽获得激活的PBMC的百分比的至少2倍时，记录 阳性应答。3种供体中没有任何一种获得了针对所有3种肽的特异性CD8 T细胞应答(表3)。供体#D5725对MAGE-A_248v9/HER-2/neu_402Y产生了应 答，供体#D7241对HER-2/neu_402Y产生了应答，以及供体#D7225对 MAGE-A_248v9/TERT_988Y产生了应答。

表3.通过用肽混合物刺激健康供体PBMC来诱导肽特异性CD8 T细胞。通过 用MAGE-A_248v9、HER-2/neu_402Y和TERT_988Y肽的等摩尔混合物体外刺激来自3种 健康供体的PBMC，来获得肽特异性CD8 T细胞。如“材料和方法”中所述，在用 肽负载的T2细胞刺激后，通过测量产生IFNγ的CD8细胞的百分比，来评估诱导的 CD8 T细胞的特异性。数值大于阴性对照值2倍，其表示阳性应答，以粗体显示。

这些结果表明，用免疫原性肽的简单混合物接种不能产生多特异性 应答。

实施例4：多肽的免疫原性

接着，本发明研究了接种由MAGE-A_248V9、HER-2/neu_402Y和TERT_988Y组成的多肽是否引发三特异性CD8 T细胞应答。首先，通过对各肽C末 端进行处理，而产生对于HLA-A^*0201具有高亲和性的连接肽(functional peptides)，来优化多肽。通过利用在线的蛋白酶体切割预测模型(Netchop： http://www.cbs.dtu.dk/services/NetChop/， PAProc： http://www.uni-tuebingen.de/uni/kxi/)来评估C末端的处理情况(Kesmir等， 2002；Kuttler等，2000；Nussbaum等，2001)。如果切割被两个模型都预测 到，则肽可任意地被处理。利用Bimas预测模型，评估新的连接肽的亲 和性(Parker等，1994)。6种变体，Poly-1至Poly-6，包含了所有可能的 肽重排(表4)。在预测模型中，6种变体中没有任何一种与切割所有3种 肽有关(表5)。而且，Poly-1、Poly-3、Poly-4和Poly-5产生的连接肽具 有结合HLA-A^*0201的高亲和性得分(表4)。这其中的一个肽 (YLYLQVNSL；Poly-1和3)与衍生自人免疫球蛋白可变重链区的一种同 一肽匹配。

 

多肽 序列 连接表位 (junctional epitope)的序列Brimas 得分 Poly-1 M-N-TYLEYRQVPV-YLEEITGYL-YLQVNSLQTV(SE Q ID No：3)YLYLQVNSL (SEQ ID No：11)723.245 Poly-2 M-T-NYLEYRQVPV-YLQVNSLQTV-YLEEITGYL (SEQ ID No：4)Poly-3 N-T-MYLEEITGYL-YLOVNSLQTV-YLEYRQVPV (SEQ ID NO：5)YLYLQVNSLQ (SEQ ID No：12)723.245 Poly-4 N-M-TYLEE1TGYL-YLEYRQVPV-YLQVNSLQTV (SEQ ID NO：6)YLYLEYRQV (SEQ ID No：13)307.142 Poly-5 T-N-MYLQVNSLQTV-YLEEITGYL-YLEYRQVPV (SEQ ID No：7)YLYLEYRQV (SEQ ID No：14)307.142 Poly-6 T-M-NYLQVNSLQTV-YLEYRQVPV-YLEEITGYL (SEQ ID No：2

表4：6种可能的多肽变体的计算机分析(in silico analysis)：产生预测具有高 HLA-A^*0201亲和性的连接肽

表5：6种可能的多肽变体的计算机分析：预测6种可能的多肽构型中蛋白酶体 切割位点。a：对于Paproc，(|)表示切割的可能性低。b：对于Netchopp，阈值设在 0.5并且使用的系统(network)是：“C-term 1.0.C-term2.0和20S”。c：两种模型的预 测切割都需要考虑肽可能要进行处理

因为这种预测方法不能确定具有最高理论功效的多肽变体，所以， 以实验的方式检测了这些变体的体内(HHD小鼠)和体外(健康的 HLA-A^*0201供体)产生三特异性CD8T细胞应答的能力。

将HHD小鼠接种每种多肽，并且在引流淋巴结中用特异性四聚体确 定对单个肽具有特异性的CD8 T细胞。所有6种多肽变体在HHD小鼠 中都是免疫原性的(即它们对至少一种肽产生应答)，但应答小鼠的频率在 各种变体之间有变化。最具免疫原性的变体是Poly-1、Poly-3和Poly-6， 分别应答小鼠100％，87％和83％(表6)。Poly-2、Poly-4和Poly-5分别在 57％、62％和62％的接种小鼠中诱导应答。用Poly-6(所有应答的41％)、 Poly-3(所有应答的30％)以及Poly-1(所有应答的25％)强应答(至少是取 舍值两倍的四聚体阳性的CD8 T细胞的百分比；称为++)的频率最高。应 答在74％的应答小鼠中是针对MAGE-A_248V9，在71％的应答小鼠中是针 对HER-2/neu_402Y，以及在55％的应答小鼠中是针对TERT_988Y。在单个小 鼠中的免疫应答分析表明，Poly-6在67％的接种小鼠中诱导三特异性应 答，随后是Poly-4(37.5％)、Poly-1(28.5％)、Poly-5(25％)和Poly-3(12.5％)。 Poly-2未在任何小鼠中诱导三特异性应答。

表6：在用不同的多肽免疫的单个小鼠中CD8T细胞对MAGE-A_248V9、 HER-2/neu_402Y和TERT_988Y的应答。通过测量在接种小鼠的引流淋巴结中的四聚体阳 性CD8 T细胞的百分比，来评估免疫应答。“-”：四聚体阳性CD8 T细胞的百分比低 于取舍点，如“材料和方法”中所定义的(对于MAGE-A_248v9为0.16％、对于 HER-2/neu_402Y为0.13％，以及对于TERT_988Y为0.16％)。“+”：1至2倍取舍点的百 分比。“++”：多于2倍取舍点的百分比。阴影线对应于对所有三种肽都应答的小鼠。

这些结果在体外人细胞得到证实。用来自2—5个健康供体的细胞， 试验了每一种多肽(除了Poly-2，其在HHD小鼠中的免疫原性非常弱)。 通过测量在特异性肽激活后，产生IFNγ的CD8细胞的百分比，来评估体 外免疫应答。所有5种多肽都会刺激T细胞在80％至100％的供体中对至 少1种肽产生应答。然而，仅Poly-6和Poly-1能诱导三特异性CTL应答。 与用Poly-1的25％的供体相比(表7)，Poly-6在80％的供体中诱导了对所 有3种肽的应答。Poly-6还诱导了最强烈的应答(在供体#D7017和 #D7225中，针对MAGE-A_248V9；以及在供体#D7744中针对 HER-2/neu_402Y)。

表7：通过多肽刺激健康人供体PBMC而诱导肽特异性CD8 T细胞。肽特异性 CD8 T细胞通过用不同多肽体外刺激健康供体PBMC而产生。如材料和方法中所述， 在用肽负载的T2细胞刺激后，通过测量产生IFNγ的CD8细胞的百分比，来评估诱 导的CD8 T细胞的特异性。“-”：表示IFNγ-阳性细胞的百分比小于2倍的阴性对照 (不相关肽)。“+”：IFNγ-阳性CD8细胞的百分比高于阴性对照2倍。“++”：IFNγ- 阳性CD8细胞的百分比高于阴性对照2—10倍。“+++”：IFNγ阳性CD8细胞的百 分比高于阴性对照10倍。阴影对应于对所有三种肽都应答的小鼠。

总之，这些结果表明，Poly-6既在体内(HHD小鼠)又在体外(人PMBC) 频繁而强烈的诱导三特异性CD8 T细胞应答。

讨论

这项对由3种HLA-A^*0201限制性优化隐蔽性肽组成的多肽研究， 所述肽衍生于通用肿瘤抗原hTERT、HER-2/neu和MAGE-A，确定了称 为Poly-6(SEQ ID No：2)的多肽，其既在表达HLA-A^*0201的转基因HHD 小鼠中又在健康人供体细胞中诱导CTL针对所有3种组分肽的应答。

对多肽结构(肽排列、间隔区的加入)的影响，意见较为统一，理想的 是，所述结构应该允许所有组分肽的适当切割，并且避免产生对相关HLA 分子具有高亲和性的新连接肽。多项研究表明，在肽之间存在间隔区通 过促进单个肽的切割而提高了疫苗的功效(Livingston等，2002；Velders等， 2001；Wang等，2004)。而且，Ishioka等发现多肽中肽的位置会影响其免 疫原性。这就强调了多肽整体构型的重要性(Ishioka等，1999)。本发明的 结果支持这些发现，因为检测发现6种多肽排列中的有一种是高免疫原 性的，而另一种的有效性极低。这是第一次直接证明了为了获得最大的 免疫原性，必须优化多肽结构。这些结果还表明，这种最佳的结构不能 利用当前的蛋白酶体切割预测模型来预知。实际上，没有预测到6种候 选多肽中任何一种多肽能比其他多肽更有效地得以切割。而且，Poly-2， 其不能引发多特异性应答，在Bimas模型体系中不能产生预测对 HLA-A^*0201具有高亲和性的连接肽。

本发明人还发现，接种3种肽的混合物在引发多特异性应答方面， 远没有接种多肽有效。有意思的是，来自人供体D7225的细胞，在用Poly-6 离体刺激后，对所有3种肽都产生了应答，但在用肽混合物刺激后仅对 HER-2/neu_402Y产生应答。使用外源性肽具有这样的缺点，即：肽/MHC I 复合物的数量以与该外源性肽的浓度相同的动力学方式衰减(Wang等， 2004)。这些复合物的短半衰期可能导致引发功效(priming efficiency)显著 丢失(Gett等，2003)。相反，长肽通过APC交叉呈递(cross-presentation)可 确保内源性肽的动力学更缓慢和持续。长肽策略比利用对应的短肽更具 免疫原性(Zwaveling等，2002)。

如上文所证明的，SEQ ID No：2的Poly-6多肽，其由衍生于通用肿 瘤抗原(HER-2/neu_402Y，TERT_988Y和MAGE-1A_248V9)的三种优化隐蔽性肿 瘤肽组成，能在表达HLA-A^*0201的HHD小鼠中和在离体人细胞中诱导 多特异性应答。这种多肽对于癌症患者的广谱肿瘤接种具有潜力。

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