DNA依赖蛋白激酶催化亚基单链抗体及其编码基因与应用

摘要

本发明公开了DNA依赖蛋白激酶催化亚基单链抗体及其编码基因与应用。DNA依赖蛋白激酶催化亚基单链抗体，是氨基酸序列为序列表中序列2自氨基末端第1－109位的多肽通过连接肽与氨基酸序列是序列表中序列2自氨基末端第135－250位的多肽连接获得的融合蛋白。所述单链抗体具体可为其氨基酸序列为序列表中序列2的蛋白。所述编码基因具体可为其核苷酸序列是序列表中的序列1。本发明的单链抗体及其编码基因可用于制备治疗肿瘤的药物。

说明书

技术领域

本发明涉及DNA依赖蛋白激酶催化亚基单链抗体及其编码基因与应用。

背景技术

恶性肿瘤严重威胁着人类健康。放射治疗是恶性肿瘤主要治疗手段之一。然而，放疗可导致肿瘤周围正常组织受损，从而导致严重的副作用。同时，部分肿瘤细胞具有耐放射的生物学特性或在放疗过程中肿瘤细胞产生诱导耐受性，导致治疗效果降低。目前，如何降低放疗剂量、提高治疗效果和减少肿瘤细胞耐受，即增强肿瘤放疗的辐射敏感性已成为肿瘤研究领域的热点之一。

放疗对肿瘤细胞的杀伤效应主要是通过诱发其DNA双链断裂(DNA double-strand breaks，DSBs)，从而导致肿瘤细胞程序性死亡或坏死。出现DSBs后，细胞会对其修复，以保证基因组结构的完整性，这也是肿瘤细胞抵抗放疗的主要机制之一。DNA修复能力越强，对放射的抗性越突出。哺乳动物细胞对DSB损伤修复主要有非同源末端连接(nonhomologous end-jioning，NHEJ)和同源重组(homologousrecombination，HR)两条途径。DNA依赖的蛋白激酶复合物(DNA-dependent proteinkinase，DNA-PK)是NHEJ途径中重要的组成成分。该复合物由调节亚单位Ku 70/Ku80异源二聚体和催化亚基DNA-PKcs(DNA-dependent protein kinase catalyticsubunit)组成。DNA-PKcs通过自磷酸化及磷酸化其他效应蛋白如XRCC-4、Artemis等在DSB修复中发挥重要作用。另外，DNA-PKcs还参与细胞周期G₂期调控及细胞凋亡和自吞噬死亡，还可参与V(D)J重组过程，维护端粒长度。近年来，研究表明DNA-PKcs在多种类型癌组织细胞中普遍高表达，具有高转移特性和放化疗抗性的癌细胞中DNA-PKcs的表达活性显著增高；特异性抑制DNA-PKcs导致细胞对γ射线及紫外线的敏感性增加，DNA-PKcs表达沉默细胞的生长速度和接种裸鼠后形成肿瘤的生长速度减慢，显示DNA-PKcs具有作为放射增敏抗癌分子靶标的重要价值。

目前已有多种方式用以抑制DNA-PKcs功能，如典型的PI3K抑制剂渥漫青霉素(Wortmannin)、LY294002，特异的DNA-PKcs抑制剂OK-1035、NU7026，反义寡核苷酸，单克隆抗体以及Ku片段等。然而这些抑制剂或特异性较差或用于机体可导致肝毒性或引起免疫反应，限制其实际应用。

近年来人源抗体制备技术得到了快速的发展。由于这类抗体与人体本身产生的抗体同源，不会或较少引发自身免疫反应，加之抗体作用的特异性，因而治疗性单链抗体已成为目前发展最快的生物药物，迄今国外已有19个治疗性单链抗体被批准上市，而针对恶性肿瘤的治疗性抗体更是开发最为活跃的领域。尤其通过噬菌体抗体库筛选特异性单链抗体(single chain antibody fragment，scFv)技术的完善，为人源抗体的制备提供了更为有效的手段。噬菌体抗体技术是以噬菌体的基因作为载体，用抗体基因与其融合，在噬菌体表面表达出抗体。其特点是将抗体基因型和表型统一在同一病毒颗粒内，通过筛选有特定功能的蛋白，同时可获得相应的编码基因。单链抗体(scFv)仅为完整抗体的六分之一，相对分子质量约为27kD，由轻链可变区(V_L)和重链可变区(V_H)之间通过14～15个氨基酸的连接肽(linker)连接形成。具有许多优点如体积小，免疫原性低，不易引起人体排斥反应；无Fc段，不易与具有Fc受体的非靶细胞结合，成像清晰；穿透能力强，能有效穿透致密的组织屏障；易于基因操作和基因工程大量生产。

发明内容

本发明的目的是提供一种DNA依赖蛋白激酶催化亚基单链抗体及其编码基因与应用。

本发明所提供的单链抗体，命名为anti-DPK3-scFv，是氨基酸序列为序列表中序列2自氨基末端第1-109位的多肽通过连接肽与氨基酸序列是序列表中序列2自氨基末端第135-250位的多肽连接获得的融合蛋白。

其中，anti-DPK3-scFv具体可为如下a)或b)的蛋白：

a)其氨基酸序列为序列表中序列2；

b)将a)限定的氨基酸序列经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸且能与DNA依赖蛋白激酶催化亚单位特异结合的由a)衍生的多肽。

为了使本发明的a)的蛋白便于纯化，可在由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

    表1.标签的序列

 

标签残基序列Poly-Arg5-6(通常为5个)RRRRRPoly-His2-10(通常为6个)HHHHHHFLAG8DYKDDDDK

 

Strep-tag II8WSHPQFEKc^-myc10EQKLISEEDL

所述b)中的anti-DPK3-scFv可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述b)中的anti-DPK3-scFv可通过将序列表中序列1所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

序列表中序列2由250个氨基酸残基组成。其中，序列表中序列2自N末端第1-109位为抗DPK3的特异性单链抗体的轻链可变区；序列表中序列2自N末端第135-250位为抗DPK3的特异性单链抗体的重链可变区；序列表中序列2自N末端第110-134位为连接肽。

anti-DPK3-scFv的编码基因也属于本发明的保护范围。

anti-DPK3-scFv的编码基因具体可为如下①或②或③的基因；

①其核苷酸序列是序列表中序列1；

②在严格条件下与①限定的DNA片段杂交且编码能与DNA依赖蛋白激酶催化亚单位特异结合的单链抗体的DNA分子；

③与①的基因具有90％以上的同源性，且编码能与DNA依赖蛋白激酶催化亚单位特异结合的单链抗体的DNA分子。

所述步骤③中的基因，与①的基因最好有95％以上的同源性。

上述严格条件可为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液中，在65℃下杂交并洗膜。

其中，序列表中序列1由750个核苷酸组成，序列表中序列1自5’末端第1-327位编码抗DPK3的特异性单链抗体的轻链可变区(序列表中序列2自氨基末端第1-109位)，自5’末端第403-750位编码抗DPK3的特异性单链抗体的重链可变区(序列表中序列2自氨基末端第135-250位)，自5’末端第328-402位编码连接肽(序列表中序列2自氨基末端第110-134位)。

含有所述编码基因的重组表达载体、转基因细胞系或重组菌也属于本发明的保护范围。

扩增所述编码基因全长或任一片段的引物对也属于本发明的保护范围。

本发明的另一目的是提供一种抗肿瘤的药物。

本发明所提供的抗肿瘤的药物，它的活性成分为anti-DPK3-scFv或含有anti-DPK3-scFv基因的重组真核表达载体。

所述抗肿瘤的药物可通过注射、喷射、滴鼻、滴眼、渗透、吸收、物理或化学介导的方法导入机体如肌肉、皮内、皮下、静脉、粘膜组织；或是被其他物质混合或包裹后导入机体。

本发明获得了DNA-PKcs中抗原性高且与其他蛋白没有同源性的蛋白片段，经原核表达及蛋白纯化得到DPK3蛋白片段，采用噬菌体抗体库等平台，筛选鉴定了DPK3的特异性抗体anti-DPK3-scFv，首次获得针对人DNA-PKcs的单链人源抗体；实验结果表明，表达anti-DPK3-scFv的转染anti-DPK3-scFv基因的HeLa细胞增殖能力下降、辐射敏感性增强，DNA损伤修复能力受到抑制。因此，本发明的anti-DPK3-scFv编码基因可用来制备抗DNA依赖蛋白激酶催化亚单位的单链抗体，该抗体可用于制备治疗肿瘤的药物。

附图说明

图1为DPK3的表达纯化。

图2为特异性结合DPK3的克隆的质粒酶切的DNA指纹图。

图3为不同抗体与游离抗原的竞争抑制率。

图4为Western blotting检测纯化DPK3与anti-DPK3-scFv的特异性。

图5为anti-DPK3-scFv与DNA-PKcs抗体(H-163)相比的特异性。

图6为不同克隆中anti-DPK3-scFv的表达。

图7为anti-DPK3-scFv对HeLa细胞增殖的影响。

图8为4Gyγ射线照射的细胞活存率。

图9为γ射线照射后细胞活存曲线。

图10为中性单细胞凝胶电泳检测DNA双链断裂修复。

图11为彗星细胞尾长以及DNA迁移到尾的比例参数。

图12为荧光检测各细胞双链断裂修复-γ-H2AX位点。

图13为细胞平均γ-H2AX位点比较。

图14为各细胞照射前后caspase-3活性。

图15为各细胞DNA-PKcs表达情况。

图16为各细胞系照射前后的Akt磷酸化水平。

具体实施方式

实施例1、抗DNA-PKcs单链抗体(anti-DPK3-scFv)的基因的克隆及其功能

一、DNA依赖蛋白激酶催化亚单位抗原性分析及相应蛋白片段(DPK3)的表达和纯化

通过NCBI数据库对DNA-PKcs蛋白包含的功能域进行分析：

包括亮氨酸拉链基序(AA1503-1531)、自磷酸化丛(AA2609-2647)、caspase-3作用位点、FAT domain(AA3023-3472)、FATC domain(AA4096-4128)、Ku结合区域(AA3002-3580)及激酶活性区(PI3K/PI4K domain)(AA3748-4128)。

利用Biosun软件对DNA-PKcs的抗原性进行分析，初步筛选出AA1960-2227(DPK3)蛋白质片段。DPK3蛋白质的氨基酸序列长250个氨基酸，分子量为29KD，等电点为5.4。经BLAST比对DPK3位于亮氨酸拉链基序与自磷酸化丛之间，caspase-3作用位点之前。

HeLa细胞以1×10⁵接种于含10ml/100ml胎牛血清的DMEM培养液中，5％CO₂/95％空气，37℃孵育培养。提取HeLa细胞的总RNA，按M-MLV逆转录酶说明书反转录成cDNA。

设计上游引物和下游引物，引物序列如下：

上游引物：5’CGCATATGTTTTACCAAGGTTTTCTGTT3’(划线部分为Nde I识别序列)；

下游引物：5’CGCCTCGAGCACTTCATCTTTAGGGAC3’(划线部分为Xho I识别序列)。

PCR体系如下：10×buffer 10μl；dNTP(2.5μM)16μl；上游引物(5μM)8μl；下游引物(5μM)8μl；cDNA10μl；Taq1.0μl；ddH₂O57μl；总体积100μl。

PCR反应条件：94℃变性10min后，94℃变性45sec，55℃退火30sec，72℃延伸1min，共扩增30个循环。

PCR产物经PCR产物纯化试剂盒进行回收纯化，然后克隆到pGEM-T Easy载体上，构建重组质粒pGEM-T-DPK3，pGEM-T-DPK3转化感受态E.coliDH5 α，挑取阳性克隆后酶切鉴定，用Nde I和Xho I双酶切重组质粒，获得750bp左右的片段为鉴定正确的pGEM-T-DPK3。用Nde I和Xho I双酶切pGEM-T-DPK3，回收750bp左右的DPK3基因片段，与经Nde I和Xho I双酶切的载体pET-22b(+)连接构建原核表达载体pET22b-DPK3。对pET22b-DPK3进行测序，测序结果表明克隆的DPK3基因无碱基突变和读码框移位。

将重组表达载体pET22b-DPK3转化感受态E.coli BL21(DE3)，经IPTG诱导表达，接种于10ml LB(含有氨苄青霉素)培养基中，于37℃培养过夜；按1％比例转接于度为0.8mmol/L IPTG诱导表达，于37℃培养3h。取50ml培养3h的E.coli BL21(DE3)菌体，超声破菌后，分别取离心后的上清组分和沉淀组分进行15％SDS-PAGE分析。

15％SDS-PAGE电泳分析结果表明，融合蛋白DPK3以包涵体形式表达存在(图1)。

由于包涵体中的重组蛋白缺乏生物学活性，加上剧烈的处理条件，使蛋白的高级结构破坏，因此重组蛋白的复性特别必要。可通过缓慢去除变性剂使目标蛋白从变性的完全伸展状态恢复到正常的折叠结构，同时去除还原剂使二硫键正常形成，具体方法如下：

(1)上述超声破菌后的离心沉淀物用1ml/100ml Triton X-100/PBS漂洗后用缓冲液A(2mol/L尿素，20mmol/L PBS，pH7.5)，于4℃洗涤2h，离心收集沉淀；

(2)步骤1的沉淀溶解于缓冲液B(8mol/L尿素，20mmol/L PBS pH 7.5，0.5mol/LNaCl，20mmol/L咪唑)，4℃搅拌2h，使其充分溶解；

(3)离心后取上清经0.22μm滤膜过滤后以1ml/min的流速上样于经缓冲液B平衡后的HisTrap HP亲和柱；

(4)上样后以1ml/min的流速，用缓冲液B洗柱；

(5)通过梯度混合器形成从缓冲液B到C(1mol/L尿素，20mmol/L PB pH 7.5，0.5mol/L NaCl，3mmol/LGSH，0.3mmol/LGSSG，20mmol/L咪唑)尿素浓度从8mol/L到1mol/L的线性梯度，以0.2ml/min的流速，总体积50ml缓冲液进行梯度柱上复性；

(6)最后用缓冲液D(20mmol/L PBS，0.5mol/L NaCl，500mmol/L咪唑)洗脱蛋白；

(7)洗脱的蛋白再经20mmol/L PBS 4℃透析24h，每4h换液一次。

每一步留取10μl样品以备SDS-PAGE分析，并用Bradford法测定蛋白质浓度。

经过8M尿素变性及柱上复性后，得到纯度达95％的可溶性蛋白(图1)。经紫外分光光度法测定复性后的蛋白质浓度，DPK3的浓度约为0.4mg/ml。

图1中“M”为Marker，“1”为未诱导的总菌体，“2”为诱导后总菌体，“3”为8M尿素溶解包涵体，“4-6”为上柱后流出液；“7-9”为洗柱回收液，“10-15”柱上复性后洗脱液。

二、用DPK3从大容量噬菌体抗体库中筛选抗DNA-PKcs人源单链抗体常规方法收集6名成年健康人外周血及10例新生儿脐血，用淋巴细胞分层液密度梯度离心收集单个核细胞，Trizol常规提取总RNA，逆转录合成单链cDNA，再以轻梯度离心收集单个核细胞，Trizol常规提取总RNA，逆转录合成单链cDNA，再以轻重链可变区上下游引物分别PCR扩增不同家族的轻重链可变区基因。将获得的不同亚群的VL和VH片段按照正常人抗体胚系可变区基因使用频度以一定比例混合，用外延引物进行二次PCR，获得包含有内切酶位点的VL’和VH’片段，再将二次PCR扩增出的VL’和VH’通过重叠PCR拼接成特异性单链抗体(scFv)基因。将所获scFv及噬菌体载体pDF(乔媛媛，王琰，陈晓穗，王欲晓，化冰.大容量噬菌体抗体库的构建及鉴定，中华微生物学和免疫学杂志，2004，24(3)，194-197)(中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所)用BSSH II+Nhe I双酶切后进行连接，转化大肠杆菌XL1-Blue，取适量菌液稀释后铺含有氨苄青霉素的培养盘计算库容，并提取质粒检测scFv重组率。其余部分加500ml SB培养液扩大培养，加辅助病毒VCSM13(Merck，ST200251)(PFU＝1.7×10¹²)超感染，30℃培养过夜，次日收集上清，PEG沉淀获得初级噬菌体抗体库，测定所获初级抗体库上清的滴度。

计数集落测定库容为10⁷，测定噬菌体库的克隆效率为86％。经辅助病毒超感染获的噬菌体抗体库，沉淀浓缩后测定滴度为10¹³CFU/ml。

初级噬菌体抗体库以200:1的比例(multiplicity of infection，MOI＝200)超感染BS1365菌(乔媛媛，王琰，陈晓穗，王欲晓，化冰.大容量噬菌体抗体库的构建及鉴定，中华微生物学和免疫学杂志，2004，24(3)，194-197)(中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所)，37℃水浴保温1h，使多副本载体进入同1个细胞，加含有氨苄青霉素的2YT培养液振荡培养至对数生长期，加辅助病毒VCSM13(PFU＝1.7×10¹²)，30℃培养过夜，次日收集噬菌体抗体库，测定滴度。再以MOI≤1的比例感染1000ml对数生长期的大肠杆菌XL1-Blue菌，37℃静置30

min，取少许铺于含有氨苄青霉素的培养盘计算库容，其余菌液补足氨苄青霉素，加入VCSM13，30℃过夜，次日回收上清，常规PEG沉淀，获得大容量重组噬菌体抗体库。测定其滴度，并挑取克隆提取质粒，BSSH II+Nhe I双酶切鉴定重组率。

重组噬菌体抗体库库容为7×10¹⁰，scFv基因的重组率为13/14(92％)，所获抗体库滴度为5×10¹²CFU/ml。

噬菌体抗体库筛选方法如下：

(1)将步骤一中纯化的DPK3用0.05mol/L碳酸盐缓冲液稀释至100μg/ml，以1ml包被免疫管，4℃过夜；

(2)3％脱脂奶粉封闭2h后，加入1ml噬菌体抗体库(约1×10¹³个CFU)，37℃孵育2h；

(3)以0.05ml/100ml Tween20-PBS洗5次，(第二轮洗15次，以后洗涤20次以上)，用2种方法回收结合于固相的噬菌体抗体：

①先加入1ml新鲜XL1-Blue菌直接感染，37℃孵育15min后，转入10ml SB培养液中；

②再将细菌感染回收后的免疫管中加入1ml洗脱液37℃静置15min后再进行洗脱回收。用吸管将洗脱液吸出后，加入45μl 2mol/L Tris中和，再加入2mlXL1-Blue细胞37℃静置15min后，加入7ml的SB培养液。

(4)从2次回收的菌液分别取出适量铺盘测定CFU，其余细菌37℃培养3h，扩大体积到100ml，加入1.7×10¹²pfu辅助病毒VCSM13，30℃振荡培养过夜；

(5)次日回收上清，常规PEG沉淀，所得次级噬菌体抗体库再进行下一轮的筛选。

每轮筛选后均测定次级库的滴度，并计算噬菌体抗体的投入产出比(回收率)，作为特异性噬菌体抗体富集的指标。

经过4轮吸附—洗脱—扩增的筛选，测定每轮洗脱回收的噬菌体滴度，发现有一定的富集。从第三，第四轮洗脱回收菌落中随机挑取100个克隆，在含有氨苄青霉素的2YT培养液中培养过夜，第二天取30μl细菌到1ml SB培养基中，37℃培养至对数生长期，加入辅助病毒VCSM13，30℃培养过夜，收取上清即得到噬菌体抗体。

DPK3蛋白作为抗原稀释至10μg/ml，以50μl包被ELISA板，1h后弃去孔内液体，用3g/100ml脱脂奶-PBS封闭后加入噬菌体抗体液，37℃孵育1h，用0.05ml/100ml Tween20-PBS洗涤3次，加入HRP-抗M13鼠单抗进行反应，洗涤后加入0PD底物显色，读取A490。

ELISA结果表明，56个能与DPK3抗原结合，阳性率为56％。随后用卵清蛋白(Sigma公司)，铁蛋白(Sigma公司)及DPK3相互作为对照鉴定，其中特异性结合DPK3的克隆为26个。

用质粒提取试剂盒提取26个克隆的质粒，以质粒为模板，PCR扩增scFv基因，PCR引物序列如下：

上游引物P1：5’-CGGCAGCCGCTGGATTGTTA-3’；

下游引物P2：5’-CTAAACAACTTTCAACAGT-3’。

PCR体系如下：10×buffer 3μl；dNTP(2.5μM)0.6μl；MgCl₂1.8μl；P1(10μM)0.6μl；P2(10μM)0.6μl；DNA模板 1μl；Taq酶 0.3μl；ddH₂O 22.1μl；总体积30μl。

PCR反应条件：94℃变性10min后，94℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸1min，共扩增30个循环。

PCR产物用CL-6B凝胶(Phamacia)微型柱离心纯化，再用限制性内切酶MvaI37℃消化，将消化反应后的产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳。

聚丙烯酰胺凝胶电泳结果表明，特异性结合DPK3的克隆的质粒酶切后获得了5种不同的指纹图谱(图2)。

“M”为DNA Marker；“1-6”为特异性结合DPK3的克隆的质粒酶切后得到的5种不同的DNA指纹。

将ELISA鉴定出的特异性阳性的DNA-PKcs噬菌体抗体一定倍数稀释后感染大肠杆菌HB2151，37℃孵育15min铺培养盘。挑取单个集落在含有氨苄青霉素的2YT培养液中过夜，第二天取30μl细菌到1ml SB培养基中，37℃培养至对数生长期，加入IPTG至1mmol/L，30℃培养过夜，收取上清即得到可溶性抗体。DPK3蛋白作为抗原稀释至10μg/ml，以50μl包被ELISA板，1h后弃去孔内液体，用3％脱脂奶-PBS封闭后加入噬菌体抗体液，37℃孵育1h，用0.05ml/100ml Tween20-PBS洗涤3次，加入HRP标记的抗V5抗体(Invitrogen，R961-25)进行反应，0.05％Tween20-PBS洗涤3次后加入HRP-羊抗人Fab(Sigma，I5260)，37℃孵育1小时后OPD底物显色，读取A490。用卵清蛋白(Sigma公司)，铁蛋白(Sigma公司)作为对照。

可溶性抗体与不同抗原反应的ELISA检测结果如表1所示，其中，抗DPK3可溶性抗体有3个克隆ELISA检测有活性且特异性较高。

         表1.抗DPK3可溶性抗体与不同抗原反应的ELISA检测

^*P<0.01与对照相比

为进一步核实所获得的抗DNA-PKcs单链抗体的特异性，以DPK3包被ELISA板，以游离的DPK3与无关蛋白作为竞争抗原进行ELISA竞争抑制实验。

将DPK3被ELISA板，3g/100ml脱脂牛奶封闭后，加入上述可溶性抗体25μl的同时，分别加入不同浓度25μl的DPK3抗原和无关抗原，37℃孵育2小时，0.05ml/100ml Tween20-PBS洗涤后，加入50μl/孔HRP标记的抗M13抗体(Pharmacia，27-9420-01)(1:5000)，37℃孵育1小时后OPD显色。

抑制率的计算：抑制率(％)＝(对照组A490-实验组A490)/对照组A490×100％

对照组A490为不加竞争抗原时所测值，实验组A490为加竞争抗原时所测值。

抑制率的计算结果显示游离的抗原产生与剂量相关的抑制效应(图3)。其中，抗DPK3可溶性抗体中有两个竞争抑制率较高，为1和2号克隆。

图3中“anti-DPK3-1”ELISA检测有活性且特异性较高的3个克隆中的1号克隆；“anti-DPK3-2”ELISA检测有活性且特异性较高的3个克隆中的2号克隆；“anti-DPK3-3”ELISA检测有活性且特异性较高的3个克隆中的3号克隆。

挑取1和2号克隆送上海英骏生物技术有限公司进行可变区基因序列测定，并应用软件进行单链抗体重链、轻链的亚群分析。

分析结果表明，1和2号克隆中的抗体基因来源于不同的胚系，重链可变区基因分属VH3、VH4亚群，轻链可变区同属于VL2亚群。2号克隆中的轻链可变区氨基酸序列为序列表中序列2自氨基末端第1-109位，重链可变区为序列表中序列2自氨基末端第135-250位。

将所保存2号克隆菌种摇菌过夜，取1ml菌液扩大培养至100ml SB培养基中，37℃培养至对数生长期，加入IPTG至1mmol/L，30℃培养过夜，收取上清即得到可溶性的抗DPK3的特异性单链抗体(anti-DPK3-scFv)。

将纯化的DPK3蛋白进行Western blotting特异性检测，所用抗体为anti-DPK3-scFv。以卵清蛋白作为对照。

Western blotting结果如图4所示，表明anti-DPK3-scFv特异的与DPK3结合，说明anti-DPK3-scFv特异性较好。

将从HeLa细胞中提取的总蛋白进行Western blotting特异性检测，所用抗体分别为以DNA-PKcs抗体(H-163)(santa cruz公司，sc-9051)(1:2000稀释)，actin抗体(I-19)(Santa Cruz公司，sc-1616-R)(1:2000稀释)及可溶性的抗DPK3的特异性单链抗体(anti-DPK3-scFv)孵育，4℃过夜；TBST洗膜后分别以HRP标记的羊抗兔IgG(北京中杉金桥生物公司，ZB2301)及HRP标记的抗V5抗体(Invitrogen，R961-25)室温孵育1h，ECL显色试剂盒显色，暗室压片至出现显色反应。

Western blotting结果如图5所示，表明可溶性的抗DPK3的特异性单链抗体(anti-DPK3-scFv)可以特异的检测到HeLa细胞中的DNA-PKcs蛋白，与商品化抗体相比非特异性条带明显减少，说明特异性高。

图5中，“1”代表用DNA-PKcs抗体(H-163)杂交的Western blotting结果“2”代表用可溶性的抗DPK3的特异性单链抗体(anti-DPK3-scFv)杂交的Westernblotting结果。

2号克隆中的插入片段即为可溶性的抗DPK3的特异性单链抗体(anti-DPK3-scFv)的基因，其核苷酸序列为序列表中的序列1，自5’末端第1-327位编码抗DPK3的特异性单链抗体的轻链可变区(序列表中序列2自氨基末端第1-109位)，自5’末端第403-750位编码抗DPK3的特异性单链抗体的重链可变区(序列表中序列2自氨基末端第135-250位)，自5’末端第328-402位编码连接肽(序列表中序列2自氨基末端第110-134位)。序列表中序列1自5’末端第1-750位编码序列表中序列2的蛋白。

三、抗DNA-PKcs单链抗体(anti-DPK3-scFv)对HeLa细胞放射增敏效应的影响

a、抗DNA-PKcs单链抗体(anti-DPK3-scFv)基因的合成

人工合成序列表中序列1的核苷酸序列并在其5’和3’末端分别引入NotI和HindIII酶切位点。

b、表达anti-DPK3-scFv基因的HeLa细胞的制备

步骤a中人工合成的anti-DPK3-scFv基因，经NotI和Hind III双酶切后，与经过同样双酶切的pcDNA^TM3.1/myc-His B(Invitrogen)载体连接，构建重组载体pcDNA-DPK3-scFv。

接种HeLa细胞(1×10⁵/孔)于24孔培养板中，经Lipofectamine 2000介导pcDNA-DPK3-scFv质粒转染HeLa细胞，方法参照按试剂盒说明。以用pcDNA^TM3.1/myc-His B(Invitrogen)载体转染的HeLa细胞作为对照细胞。

真核表达载体pcDNA^TM3.1/myc-His B带有His标签，可以通过Western Blotting检测anti-DPK3-scFv基因的表达。方法如下：

从对照细胞及pcDNA-DPK3-scFv转染的细胞中提取的蛋白进行12％的聚丙烯酰胺凝胶，然后将蛋白转移到硝酸纤维素膜上；蒸馏水脱色后TBST洗膜3次；TBST+5％脱脂奶粉室温封闭1h，分别以His-Tag抗体(Novagen公司，70796)(1:2000稀释)，actin抗体(I-19)(Santa Cruz公司，sc-1616-R)(1:2000稀释)孵育，4℃过夜；TBST洗膜4次×10min；HRP标记的羊抗兔IgG(北京中杉生物公司)室温孵育1h，TBST洗膜4次×10min；ECL显色试剂盒显色，暗室压片至出现显色反应。

Western Blotting结果如图6所示，不同克隆中anti-DPK3-scFv均有表达，克隆2、4、5中anti-DPK3-scFv的表达量较高。

图6中，“C”为对照细胞；“1-5”为不同的pcDNA-DPK3-scFv转染的HeLa细胞克隆。

c、表达anti-DPK3-scFv基因的HeLa细胞的细胞克隆形成能力

为了进一步明确各细胞克隆的生物学特性，进行了细胞克隆形成实验。

HeLa细胞、对照细胞和表达anti-DPK3-scFv基因的HeLa细胞分别用胰蛋白酶消化后制成细胞悬液，细胞计数后以每孔1×10⁴接种于12孔板中，37℃恒温二氧化碳培养箱中常规培养。从接种第二日起，每天每个细胞系取3个孔消化，并在显微镜下观察确认，用1ml的移液器准确加入0.5ml含10ml/100ml胎牛血清的培养液终止消化，并轻轻吹打脱落培养皿壁上的细胞，使之形成均匀细胞悬液(总体为1ml)。吸取一定体积细胞悬液用血球计数板计数细胞。在培养3天后，随着细胞的增殖，细胞数量增加，一般在细胞计数前需要进行适当的稀释。计数活细胞求平均值，连续6d，绘制细胞生长曲线，实验重复3次。

细胞总数＝4个中方格细胞总和÷4×10⁴×稀释倍数

绘制的细胞生长曲线如图7所示，表达anti-DPK3-scFv的HeLa细胞系其增殖速度较HeLa细胞和对照细胞慢。

图7中的数据为平均值±标准差，“1”代表HeLa细胞，“2”代表对照细胞，“3-5”代表表达anti-DPK3-scFv的HeLa细胞系。

HeLa细胞、对照细胞和表达anti-DPK3-scFv基因的HeLa细胞处于指数生长期时，分别用胰酶快速消化细胞后收集细胞，将细胞重悬于一定体积培养液中，精确计数，将一定体积的不同密度细胞悬液加入到不同离心管中，分别标记待照剂量。室温下用⁶⁰Co γ射线照射细胞，剂量率为1.6Gy/min，分别进行0Gy、0.5Gy、1Gy、2Gy、4Gy和8Gy照射。接种一定数量细胞于60mm直径培养皿中，每个剂量点设置两个接种浓度，每个浓度各种三皿，在37℃恒温二氧化碳培养箱中培养9天，期间更换一次培养液。其后用75ml/100ml的乙醇固定细胞，Gemsia染色半小时，计数约含50个以上细胞的克隆。活存曲线将使用线性平方模型S＝exp-(αD+βD²)通过计算机软件DRFIT分析。

4Gy γ射线照射后活存曲线如图8所示，表达anti-DPK3-scFv基因的HeLa细胞(2、4和5号克隆)的细胞活存率与HeLa细胞及对照细胞相比均明显降低，其中表达anti-DPK3-scFv基因的HeLa细胞2号克隆的细胞活存率降低幅度最大，仅为HeLa细胞的50％左右。

图8中的数据为平均值±标准差，“1”代表HeLa细胞，“2”代表对照细胞，“3”代表表达anti-DPK3-scFv的HeLa细胞2号克隆。“4和5”代表表达anti-DPK3-scFv的HeLa细胞4和5号克隆。

同时检测了0-8Gy γ射线照射后表达anti-DPK3-scFv的HeLa细胞2号克隆的细胞活存率。

0-8Gy γ射线照射后活存曲线如图9所示，anti-DPK3-scFv没有明显改变HeLa细胞接种率。

图9中，“1”代表HeLa细胞(接种率63.7±8.3％)，“2”代表对照细胞(接种率64.2±8.3％)，“3”代表表达anti-DPK3-scFv的HeLa细胞(接种率62±4.8％)。

0-8Gy γ射线照射后的活存曲线的3次实验结果的线性平方模型统计分析结果表明，转染anti-DPK3-scFv的细胞辐射敏感性明显增加。

γ射线照射后细胞活存曲线参数的结果如表2。

拟合参数中α值有明显差异，HeLa细胞α＝0.416±0.01Gy^-1；对照细胞α＝0.265±0.01Gy^-1；表达anti-DPK3-scFv基因的的HeLa细胞α＝0.709±0.02Gy^-1，P<0.05。这些结果说明转染anti-DPK3-scFv，照射后细胞活存明显下降，从活存曲线看，D0值(平均致死剂量)下降大约20％，但在HeLa细胞和对照细胞之间，细胞活存没有明显差异。

            表2.γ射线照射后细胞活存曲线参数

*P<0.05vsHeLa；α值是从3次实验结果的线性平方模型推导而来，代表斜率；D0值为平均致死剂量。

d、表达anti-DPK3-scFv基因的HeLa细胞的DNA双链断裂修复能力

中性单细胞凝胶电泳(comet assay)是一种快速检测单细胞DNA损伤的实验方法。有核细胞的DNA分子量很大，DNA超螺旋结构附着在核基质中，用琼脂糖凝胶将细胞包埋在载玻片上，在细胞裂解液作用下，细胞膜、核膜及其它生物膜遭到破坏，使细胞内的RNA、蛋白质及其它成分进入凝胶，继而扩散到裂解液中，但核DNA仍保持缠绕的环区附着在剩余的核骨架上，并留在原位。如果细胞未受损伤，电泳时，核DNA因其分子量大多停留在核基质中，荧光染色后呈现圆形的荧光团，无脱尾现象。若细胞受损，在中性电泳液(pH＝8)中，核DNA仍保持双螺旋结构，虽偶有单链断裂，但并不影响DNA双螺旋大分子的连续性。只有当DNA双链断裂时，其断片进入凝胶中，电泳时断片向阳极迁移，形成荧光拖尾现象，形似彗星。细胞DNA受损愈重，产生的断链就愈多，其断链或断片也就愈小，在电场作用下迁移的DNA量多，迁移的距离长，表现为尾长增加和尾部荧光强度增强，因此，通过测定DNA迁移部分的光密度或迁移长度可定量地测定单个细胞DNA损伤的程度。

HeLa细胞、对照细胞和表达anti-DPK3-scFv基因的的HeLa细胞经4 Gy γ射线照射后，分别收集未照射及照射后0.25h，0.5h，1h，2h和24h细胞并做细胞计数，以适量PBS重悬细胞，然后进行中性单细胞凝胶电泳。

使用CASP软件分析DNA双链断裂程度—细胞拖尾的长度以及DNA迁移到尾部的比例(Tail Moment)。

中性单细胞凝胶电泳荧光显微镜观察结果如图10所示，表明4 Gy γ射线照射后，经过0.25h～4h修复，表达anti-DPK3-scFv基因的HeLa细胞的拖尾明显比HeLa和对照细胞拖尾长。

图10中，“1”代表HeLa细胞，“2”代表对照细胞，“3”代表表达anti-DPK3-scFv的HeLa细胞。

CASP软件分析结果如图11所示，表达anti-DPK3-scFv基因的HeLa细胞的DNA双链断裂细胞拖尾的长度以及DNA迁移到尾部的比例明显高于对照细胞和HeLa细胞。表明anti-DPK3-scFv基因的的HeLa细胞的DNA双链断裂修复能力明显降低，与对照组相比具有统计学意义。

图11中，“1”代表HeLa细胞，“2”代表对照细胞，“3”代表表达anti-DPK3-scFv的HeLa细胞。

DNA双链断裂能诱导组蛋白H2AX磷酸化(γ-H2AX)，其位点的检测是早期检测双链断裂的方法，γ-H2AX位点数可以代表细胞核内DSB双链断裂损伤数。方法如下：

HeLa细胞、对照细胞和表达anti-DPK3-scFv基因的的HeLa细胞经1Gyγ射线照射后0.5h，1h，2h和4h收集细胞，接着细胞在2ml/100ml多聚甲醛固定30min，用PBS洗3×10min，使用0.1％ Triton X-100室温透化20min，然后使用含1g/100ml的牛血清白蛋白的PBS室温封闭3×10min。用鼠抗γ-H2AX抗体(Upstate公司)(1:200稀释)，4℃孵育过夜，PBS洗4×10min，接着使用荧光标记羊抗鼠的AlexaFluor 488/TRITC(北京中杉公司)(1:400稀释)室温孵育1h，再用PBS洗4×10min。细胞使用Hoechst33258染色校DNA 20min，脱色后使用激光共聚焦扫描显微镜观察γ-H2AX位点图像。

激光共聚焦扫描显微镜观察结果如12和13所示，表达anti-DPK3-scFv基因的HeLa细胞在1Gy γ射线照射后0.5h-4h，其γ-H2AX位点数明显高于对照HeLa和HeLa-pcDNA细胞，进一步证实了表达anti-DPK3-scFv基因的HeLa细胞DSBs修复能力降低。

图12中，“1”代表HeLa细胞，“2”代表对照细胞，“3”代表表达anti-DPK3-scFv的HeLa细胞，“4”代表“3”中1Gy γ射线照射后1h的表达anti-DPK3-scFv的HeLa细胞的局部放大图。

图13中，“1”代表HeLa细胞，“2”代表对照细胞，“3”代表表达anti-DPK3-scFv的HeLa细胞。

e、表达anti-DPK3-scFv基因的HeLa细胞的凋亡

Caspase-3是细胞凋亡途径中关键的执行分子，其活性水平反映了细胞的凋亡情况。Promega公司Homogeneous Caspase-3/7 Assay试剂盒测定了细胞中caspase-3活性。

caspase-3活性检测结果如图14所示，表明照射前表达anti-DPK3-scFv基因的的HeLa细胞的caspase-3活性虽有所增加，但与对照相比没有统计学意义；而经4 Gyγ射线照射以后，各细胞的caspase-3活性均显著提高，表达anti-DPK3-scFv基因的的HeLa细胞的caspase-3活化程度显著高于HeLa细胞和对照细胞。表明经4 Gy γ射线照射以后表达anti-DPK3-scFv基因的的HeLa细胞凋亡明显增加。

图14中，“1”代表HeLa细胞，“2”代表对照细胞，“3”代表表达anti-DPK3-scFv的HeLa细胞。

f、表达anti-DPK3-scFv基因的HeLa细胞内DNA-PKcs的表达

应用Western blotting检测HeLa细胞、对照细胞和表达anti-DPK3-scFv基因的的HeLa细胞中DNA-PKcs表达情况。Western blotting检测方法同步骤b。

Western blotting结果如图15所示，表明各细胞系之间DNA-PKcs表达没有明显差别，anti-DPK3-scFv对DNA-PKcs表达不产生影响。

图15中，“1”代表HeLa细胞，“2”代表对照细胞，“3”代表表达anti-DPK3-scFv的HeLa细胞。

g、表达anti-DPK3-scFv基因的HeLa细胞内Akt的磷酸化

Akt是DNA-PKcs的下游磷酸化蛋白之一，通过检测其磷酸化水平可以反映DNA-PKcs的磷酸化激酶活性。Western blotting检测HeLa细胞、对照细胞和表达anti-DPK3-scFv基因的的HeLa细胞中Akt及磷酸化的Akt表达情况。Westernblotting检测方法同步骤b。

Western blotting结果如图16所示，表明对照细胞及HeLa细胞在经4Gy γ射线照射后Akt磷酸化水平均明显增高，而表达anti-DPK3-scFv基因的的HeLa细胞经γ射线照射后Akt磷酸化水平没有明显改变。

图16中，“1”代表HeLa细胞，“2”代表对照细胞，“3”代表表达anti-DPK3-scFv的HeLa细胞。

转染了anti-DPK3-scFv的细胞受辐射发生DNA损伤后，DNA-PKcs不能相应的激活下游的效应蛋白，从而不能完成对DNA损伤的修复。

序列表

<110>中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所

<120>DNA依赖蛋白激酶催化亚基单链抗体及其编码基因与应用

<130>CGGNARW81642

<160>2

<210>1

<211>750

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<223>

<400>1

<210>2

<211>250

<212>PRT

<213>人工合成

<220>

<223>

<400>2