含有新茅屋霉素衍生物的细胞毒素药物和它们的治疗用途

摘要

本发明涉及新的式(I)茅屋霉素衍生物，它们的制备方法和它们的治疗用途。

说明书

技术领域

本发明涉及新的细胞毒素药物和它们的治疗用途。更具体地，本发 明涉及含有茅屋霉素衍生物的新细胞毒素药物和它们的治疗用途。这些 新细胞毒素药物由于通过茅屋霉素衍生物化学连接到细胞结合药物将 茅屋霉素衍生物以靶向方式输送到特定细胞群落而具有治疗用途。

背景技术

对使用单克隆抗体药物结合物尝试肿瘤细胞的特定靶向发表了许 多报道(Sela等，在Immuno-conjugates，189-216(C.Vogel，ed.1987)； Ghose等，在Targeted Drugs1-22(E.Goldberg，ed.1983)；Diener等，在 Antibody Mediated delivery systems，1-23(J.Rodwell，ed.1988)；Pietersz 等，在Antibody Mediated delivery systems，25-53(J.Rodwell，ed.1988)； Bumol等，在Antibody Mediated delivery systems，55-79(J.Rodwell，ed. 1988)；G.A.Pietersz & K.Krauer，2，J.Drug Targeting，183-215(1994)；R.V. J.Chari，31 Adv.Drug Delivery Revs.，89-104(1998)；W.A.Blattler & R.V.J.Chari，在Anticancer Agents，Frontiers in Cancer Chemotherapy， 317-338，ACS Symposium Series 796；和I.Ojima等eds，American Chemical Society 2001)。本文所列的所有参考文献和专利列为本文参考 文献。

细胞毒素药物，例如甲氨蝶呤、柔毛霉素、阿霉素、长春新碱、长 春碱、美法仑、丝裂霉素C和苯丁酸氮芥已结合于各种鼠科单克隆抗体。 在某些情况下，药物分子通过中间载体分子，例如血清白蛋白(Garnett 等，46，Cancer Res.2407-2412(1986)；Ohkawa等23，Cancer Immunol. Immunother.81-86(1986)；Endo等，47Cancer Res.1076-1080(1980))， 葡聚糖(Hurwitz等，2 Appl.Biochem.25-35(1980)；Manabi等，34 Biochem. Pharmacol.289-291(1985)；Dillman等，46 Cancer Res.，4886-4891(1986)； Shoval等，85，Proc.Natl.Acad.Sci，8276-8280(1988))，或聚谷氨酸 (Tsukada等，73，J.Natl.Cane.Inst，721-729(1984)；Kato等27J.Med. Chem.，1602-1607(1984)；Tsukada等，52，Br.J.Cancer，111-116(1985))连 接到抗体分子。

各类连接物技术已应用于制备该免疫结合物，研究了可断裂和不可 断裂的连接物，然而，在大多数情况下，仅可观察到药物的完全细胞毒 素作用，即使药物分子可在靶向位置以未改性形式由结合物释放。

已用于制备抗体药物结合物的可断裂连接物是基于顺式乌头酸的 酸不稳定连接物，它利用不同细胞内腔室的酸性环境，例如在受体传递 胞吞作用中遇到的内涵体和溶酶体。Shen和Ryser介绍了用于制备柔毛 霉素和大分子载体的结合物的此类方法(102 Biochem.Biophys.Res. Commun.，1048-1054(1981))。Yang和Reisfeld将同样的技术用于结合柔 毛霉素与抗黑素瘤抗体(80 J.Natl.Cane.Inst.1154-1159(1988))。Dillman 等还以类似的方式将酸不稳定连接物用于制备柔毛霉素与抗T细胞抗体 的结合物(48 Cancer Res.6097-6102(1988))。

另外一种由Trouet等探索的方法包括将柔毛霉素经肽手臂连接于 抗体(79 Proc.Natl.Acad.Sci.626-629(1982))。这是基于游离药物可通过 溶酶体肽酶的作用由例如结合物释放为前提。

然而，体外细胞毒性试验显示抗体药物结合物很少获得与游离未连 接的药物的相同细胞毒素效力。这说明药物分子由抗体释放的机理可能 是非常无效的，在免疫毒素区域，在单克隆抗体和催化流行性的蛋白质 毒素之间经二硫化物桥形成的结合物显示比包含其它连接物的结合物 是更加细胞毒性的。参见Lambert等，260 J.Biol.Chem. 12035-12041(1985)；Lambert等，在Immunotoxins 175-209(A.Frankel，ed. 1988)；Ghetie等，48，Cancer Res.2610-2617(1988)。这归结于谷胱甘 肽的高细胞内浓度，这有利于抗体分子和毒素之间的二硫化物键的有效 断裂。尽管如此，仅存在很少的将二硫化物桥用于制备药物和大分子之 间结合物的报导实例。Shen等(260，J.Biol.Chem.10905-10908(1985)) 描述了将甲氨蝶呤转化为巯基乙基酰胺衍生物，随后经二硫化物键与聚 -D-赖氨酸结合。另一报导描述了制备含有毒素药物calicheamycin与抗 体的三硫化物结合物(Hinman等，53 Cancer Res.3336-3342(1993))。

没有连接抗体药物结合物的二硫化物的一个原因是带有容易地经 二硫化物桥用于连接药物与抗体的含硫基团的细胞毒素药物的不可获 得性，此外，现有药物的化学改性而不减少其细胞毒素效力是困难的。

现有抗体药物结合物的另一主要缺点是无能力向靶位输送足够浓 度的药物，这是因为限制数量的靶向抗原和cancerostatic药物，如甲氨 蝶呤、柔毛霉素和长春新碱的相对缓和的细胞毒性。为达到明显的细胞 毒性，需要大量药物分子的连接，无论是直接连接于抗体，还是通过聚 合物载体分子连接。然而，如此沉重地改性的抗体通常显示对目标抗原 削弱的结合能力，在体内快速从血液中清除。

尽管存在上述的困难，但已报道了称为maytansinoids的有用的含有 细胞结合部分和细胞毒素药物部分的细胞毒素药物(USP 5,208,020，USP 5,416,064，和R.V.J.Chari，31 Advanced Drug Delivery Reviews 89-104(1998))。同样，也报导了含有细胞结合部分和有效抗肿瘤抗体 CC-1065的类似物和衍生物的有用细胞毒素药物(USP 5,475,092，USP 5,585,499和USP 6,756,397)。

茅屋霉素衍生物是吡咯并[1，4]苯并二氮杂(PBD)，通过共价结合 于DNA的小沟中鸟嘌呤的N2发挥其生物学性质的已知种类的化合物。 PBD包括许多小沟结合物，例如安曲霉素、neothramycin和DC-81，然 而，由于其对正常细胞的非特异毒性，茅屋霉素抗癌活性是有限的。因 此人们需要增加茅屋霉素化合物的治疗活性，减小非特异毒性作用。本 发明人显示了通过将茅屋霉素化合物连接于细胞结合药物靶向输送该 化合物而满足该需要。此外，人们还需要开发在水溶液中溶解和稳定的 茅屋霉素衍生物。另外，茅屋霉素用于细胞结合药物的结合物不足够有 效。

近年来，公开了在潜伏期模型中的少量新PBD衍生物和其抗癌活 性(WO00/12508和WO2005/085260)。然而，最初的人体临床试验显示， 基于可向人体给药的非常低的剂量，这类化合物是剧毒的(I.Puzanov， Proc.AACR-NCl-EORTC International Conference，Philadelphia，USA 2005，Abstract #B117)。因此，需要提供更有效和/或可结合于细胞结合 药物的可供选择的衍生物。

因此，非常需要用茅屋霉素衍生物治疗疾病的方法，其中其副作用 被降低，而不影响其细胞毒性。

发明概述

如第一实施方案中所述，本发明的目的是提供茅屋霉素衍生物，它 们是十分毒性的，但仍可有效地用于治疗许多疾病。

本发明的另一目的是提供新茅屋霉素，任选可连接于或已连接于细 胞结合药物。

在第二实施方案中，本发明提供治疗组合物，其含有:

(A)有效量的一种或多种任选可连接于或已连接于细胞结合药物的 茅屋霉素衍生物，和

(B)可药用的载体、稀释剂或赋形剂。

在第三实施方案中，本发明提供杀死选择的细胞群落的方法，其包 括使目标细胞或包含目标细胞的组织与细胞毒性量的包含一种或多种 任选可连接于或已连接于细胞结合药物的茅屋霉素衍生物的细胞毒素 药物接触。

发明详述

本发明基于新茅屋霉素衍生物的合成，其保持高细胞毒性，可有效 连接于细胞结合药物。现有技术已显示用可断裂的连接，例如二硫化物 键连接高度细胞毒性药物与抗体，确保完全活性药物在细胞内的释放， 该结合物以抗原特异方式是细胞毒性的(US 6,340,701；US 6,372,738； US 6,436,931)。然而，现有技术显示改性现有药物而不减小其细胞毒性 作用是极其困难的，本发明通过用化学基团改性公开的茅屋霉素衍生物 解决了此问题。结果，公开的新茅屋霉素衍生物保护，在某些情况下， 甚至能够提高茅屋霉素衍生物的细胞毒性效力。细胞结合药物-茅屋霉素 衍生物配合物使得茅屋霉素衍生物的细胞毒性作用完全以靶向方式仅 作用于不需要的细胞，因而避免由于损害非目标健康细胞引起的副作 用。因此，本发明提供用于消除被杀死或细胞溶解的带病或不正常细胞， 例如肿瘤细胞(尤其是固体肿瘤细胞)的药物。

本发明的细胞毒素药物包含一种或多种经连接基团任选可连接于 或已连接于细胞结合药物的茅屋霉素衍生物。连接基团是部分化学基 团，其通过常规方法共价结合于茅屋霉素衍生物。在优选实施方案中， 化学基团可经二硫化物键共价结合于茅屋霉素衍生物。

用于本发明的茅屋霉素衍生物具有如下所示的式(I):

其中

---表示任选的单键；

表示单键或双键；

其前提是，当表示单键时，U和U’，相同或不同，分别表示H， W和W’，相同或不同，分别选自基团OH、醚，例如-OR、酯(例如乙酸 酯)，例如-OCOR、碳酸酯，例如-OCOOR、氨基甲酸酯，例如-OCONRR’、 环氨基甲酸酯，N10和C11是环的部分、脲，例如-NRCONRR’、硫代 氨基甲酸酯，例如-OCSNHR、环硫代氨基甲酸酯，N10和C11是环的 部分、-SH、硫化物，例如-SR、亚砜，例如-SOR、砜，例如-SOOR、磺 酸酯，例如-SO₃^-、磺酰胺，例如-NRSOOR、胺，例如-NRR’、任选环化 胺，N10和C11是环的部分、羟胺衍生物，例如-NROR’、酰胺，例如 -NRCOR、叠氮基，例如-N₃、氰基、卤素、三烷基或三芳基鏻、氨基酸 衍生的基团；优选W和W’是相同或不同的是OH、OMe、OEt、NHCONH₂、 SMe；

和当表示双键时，U和U’不存在，W和W’表示H；

R1、R2、R1’、R2’是相同或不同的，分别选自卤化物或任选被一个 或多个Hal、CN、NRR′、CF₃、OR、芳基，Het，S(O)_qR取代的烷基，或 R1和R2和R1’和R2’一起形成分别包含基团＝B和＝B’的双键。

优选R1和R2和R1’和R2’一起形成分别包含基团＝B和＝B’的双键。

B和B’是相同或不同的，分别选自任选被一个或多个Hal、CN、 NRR’、CF₃、OR、芳基、Het、S(O)_qR取代的烯基或B和B’表示氧原 子。

优选B＝B’。

更优选B＝B’＝＝CH₂或＝CH-CH₃。

X、X’是相同或不同的，分别选自一个或多个-O-、-NR-、-(C＝O)-、 -S(O)_q-。

优选X＝X’。

更优选X＝X’＝O。

A、A’是相同或不同的，分别选自任选含有一个O、N或S原子的 烷基或烯基，其任选被一个或多个Hal、CN、NRR’、CF₃、OR、S(O)_qR、 芳基、Het、烷基、烯基取代。

优选A＝A’。

更优选A＝A’＝直链未取代烷基。

Y、Y’是相同或不同的，分别选自H、OR；

优选Y＝Y’。

更优选Y＝Y’＝O烷基，更优选甲氧基。

T是-NR-、-O-、-S(O)_q-、或4-10元芳基、环烷基、杂环或杂芳基， 每个任选被一个或多个Hal、CN、NRR’、CF₃、R、OR、S(O)_qR、和/ 或连接物取代、或支链烷基，任选被一个或多个Hal、CN、NRR’、CF₃、 OR、S(O)_qR和/或连接物取代、或被一个或多个Hal、CN、NRR’、CF₃、 OR、S(O)_qR和/或连接物取代的直链烷基。

优选T是4-10元芳基或杂芳基，更优选苯基或吡啶基，任选被一 个或多个连接物取代。

所述连接物包括连接基团，合适的连接基团是现有技术中已知的， 包括硫醇、硫化物、二硫化物基团、硫醚基团、酸不稳定基团、光照不 稳定基团、肽酶不稳定基团和酯酶不稳定基团。优选二硫化物基团和硫 醚基团。

当连接基团是含硫醇-、硫化物(或所谓硫醚-S-)或二硫化物(-S-S-)基 团时，带有硫醇、硫化物或二硫化物基团的侧链可以是直链或支链，芳 香或杂环基。本领域普通技术人员可容易地确定合适的侧链。

优选所述连接物是如下通式:

-G-D-(Z)P-S-Z’

其中G是单或双键、-O-、-S-或-NR-；

D是单键或-E-、-E-NR-、-E-NR-F-、-E-O-、-E-O-F-、-E-NR-CO-、 -E-NR-CO-F-、-E-CO-、-CO-E-、-E-CO-F、-E-S-、-E-S-F-、-E-NR-C-S-、 -E-NR-CS-F-；

其中E和F是相同或不同的，分别选自直链或支链-(OCH₂CH₂)_i烷基 (OCH₂CH₂)_j-、-烷基-(OCH₂CH₂)_i-烷基-、-(OCH₂CH₂)_i-、-(OCH₂CH₂)_i环 烷基(OCH₂CH₂)_j、-(OCH₂CH₂)_i杂环基(OCH₂CH₂)_j、-(OCH₂CH₂)_i芳基 (OCH₂CH₂)_j-、-(OCH₂CH₂)_i杂芳基(OCH₂CH₂)_j-、-烷基-(OCH₂CH₂)_i烷基 (OCH₂CH₂)_j-、-烷基-(OCH₂CH₂)_i、-烷基-(OCH₂CH₂)_i环烷基(OCH₂CH₂)_j、 -烷基-(OCH₂CH₂)_i杂环基(OCH₂CH₂)_j、-烷基-(OCH₂CH₂)_i芳基 (OCH₂CH₂)_j、-烷基-(OCH₂CH₂)_i杂芳基(OCH₂CH₂)_j-、-环烷基-烷基-、- 烷基-环烷基-、-杂环基-烷基-、-烷基-杂环基-、-烷基-芳基-、-芳基-烷基 -、-烷基-杂芳基-、-杂芳基-烷基-；

其中i和j，相同或不同，是整数，分别选自0、1-2000；

Z是直链或支链-烷基-；

p是0或1；

Z’表示H、硫醇保护基团，例如COR、R₂₀或SR₂₀，其中R₂₀表示H、 甲基、烷基、任选取代的环烷基、芳基、杂芳基或杂环，其前提是当Z’ 是H时，所述化合物与通过分子内环化由PBD之一的亚胺键-NH＝上加 成硫醇基团-SH形成的相应化合物平衡。

n，n’，相同或不同，是0或1。

q是0、1或2。

R、R’是相同或不同的，分别选自H、烷基、芳基，每个任选被Hal、 CN、NRR’、CF₃、R、OR、S(O)_qR、芳基、Het取代；

或其可药用的盐、水合物或水合物盐，或这些化合物的多形态晶体结构 或其旋光异构体、外消旋体、非对映体或对映体。

本发明涉及如下优选实施方案或其任一的任何组合:

-G是单键或-O-或-NR-；

-G是-O-；

-D是单键或-E-、-E-NR-CO-、-ECO-、-CO-E-；

-D是-E-、-E-NR-CO-；

-D是-E-NR-CO-；

-E是直链或支链-烷基-、-(OCH₂CH₂)_i-或烷基-杂环基；

-E是直链或支链-烷基-；

-Z是-(CH₂)₂-C(CH₃)₂-；

-p是0或1；

Z’是H或SR₂₀，其中R₂₀表示烷基、芳基、杂环基或杂芳基；

Z’是H或SR₂₀，其中R₂₀表示烷基；

含硫醇-、硫化物-或二硫化物-连接物的具体实例包括 -(CR₁₃R₁₄)_t(CR₁₅R₁₆)_u(OCH₂CH₂)_ySZ’、 -(CR₁₃R₁₄)_t(CR₁₇＝CR₁₈)(CR₁₅R₁₆)_y(OCH₂CH₂)_ySZ’、 -(CR₁₃R₁₄)_t(NR₁₉CO)(CR₁₅R₁₆)_u(OCH₂CH₂)_ySZ’、 -(CR₁₃R₁₄)_t(OCO)(CR₁₅R₁₆)_u(OCH₂CH₂)_ySZ’、 -(CR₁₃R₁₄)_t(CO)(CR₁₅R₁₆)_u(OCH₂CH₂)_ySZ’、 -(CR₁₃R₁₄)_t(CONR₁₉)(CR₁₅R₁₆)_u(OCH₂CH₂)_ySZ’、 -(CR₁₃R₁₄)_t-苯基-CO(CR₁₅R₁₆)_uSZ’、-(CR₁₃R₁₄)_t-呋喃基-CO(CR₁₅R₁₆)_uSZ’、 -(CR₁₃R₁₄)_t-噁唑基-CO(CR₁₅R₁₆)_uSZ’、-(CR₁₃R₁₄)_t-噻唑基-CO(CR₁₅R₁₆)_uSZ’、 -(CR₁₃R₁₄)_t-噻吩基-CO(CR₁₅R₁₆)_uSZ’、-(CR₁₃R₁₄)_t-咪唑基-CO(CR₁₅R₁₆)_uSZ’、 -(CR₁₃R₁₄)_t-吗啉代-CO(CR₁₅R₁₆)_uSZ’、-(CR₁₃R₁₄)_t-哌嗪基-CO(CR₁₅R₁₆)_uSZ’、 -(CR₁₃R₁₄)_t-N-甲基哌嗪基-CO(CR₁₅R₁₆)_uSZ’、 -(CR₁₃R₁₄)_t-苯基-QSZ’、-(CR₁₃R₁₄)_t-呋喃基-QSZ’、-(CR₁₃R₁₄)_t-噁唑基-QSZ’、 -(CR₁₃R₁₄)_t-噻唑基-QSZ’、-(CR₁₃R₁₄)_t-噻吩基-QSZ’、-(CR₁₃R₁₄)_t-咪唑基 -QSZ’、-(CR₁₃R₁₄)_t-吗啉代-QSZ’、-(CR₁₃R₁₄)_t-哌嗪基-QSZ’、-(CR₁₃R₁₄)_t-N- 甲基哌嗪基-QSZ’，或 -O(CR₁₃R₁₄)_t(CR₁₅R₁₆)_u(OCH₂CH₂)_ySZ’、 -O(CR₁₃R₁₄)_t(NR₁₉CO)(CR₁₅R₁₆)_u(OCH₂CH₂)_ySZ’、 -O(CR₁₃R₁₄)_t(CR₁₇＝CR₁₈)(CR₁₅R₁₆)_t(OCH₂CH₂)_ySZ’、 -O-苯基-QSZ’、-O-呋喃基-QSZ’、-O-噁唑基-QSZ’、-O-噻唑基-QSZ’、-O- 噻吩基-QSZ’、-O-咪唑基-QSZ’、-O-吗啉代-QSZ’、-O-哌嗪基-QSZ’、-O-N- 甲基哌嗪基-QSZ’、 -OCO(CR₁₃R₁₄)_t(NR₁₉CO)(CR₁₅R₁₆)_u(OCH₂CH₂)ySZ’、 -OCO(CR₁₃R₁₄)_t(CR₁₇＝CR₁₈)(CR₁₅R₁₆)_u(OCH₂CH₂)_ySZ’、 -OCONR₁₂(CR₁₃R₁₄)_t(CR₁₅R₁₆)_u(OCH₂CH₂)_ySZ’、 -OCO-苯基-QSZ’、-OCO-呋喃基-QSZ’、-OCO-噁唑基-QSZ’、-OCO-噻 唑基-QSZ’、-OCO-噻吩基-QSZ’、-OCO-咪唑基-QSZ’、-OCO-吗啉代 -QSZ’、-OCO-哌嗪基-QSZ’、-OCO-N-甲基哌嗪基-QSZ’，或 -CO(CR₁₃R₁₄)_t(CR₁₅R₁₆)_u(OCH₂CH₂)_ySZ’、 -CO(CR₁₃R₁₄)_t(CR₁₇＝CR₁₈)(CR₁₅R₁₆)_u(OCH₂CH₂)_ySZ’、 -CONR₁₂(CR₁₃R₁₄)_t(CR₁₅R₁₆)_u(OCH₂CH₂)_ySZ’、 -CO-苯基-QSZ’、-CO-呋喃基-QSZ’、-CO-噁唑基-QSZ’、-CO-噻唑基 -QSZ’、-CO-噻吩基-QSZ’、-CO-咪唑基-QSZ’、-CO-吗啉代-QSZ’、-CO- 哌嗪基-QSZ’、-CO-哌啶子基-QSZ’、-CO-N-甲基哌嗪基-QSZ’、 -NR₁₉(CR₁₃R₁₄)_t(CR₁₅R₁₆)_u(OCH₂CH₂)_ySZ’、 -NR₁₉CO(CR₁₃R₁₄)_t(CR₁₅R₁₆)_u(OCH₂CH₂)_ySZ’、 -NR₁₉(CR₁₃R₁₄)_t(CR₁₇＝CR₁₈)(CR₁₅R₁₆)_t(OCH₂CH₂)_ySZ’、 -NR₁₉CO(CR₁₃R₁₄)_t(CR₁₇＝CR₁₈)(CR₁₅R₁₆)_t(OCH₂CH₂)_ySZ’、 -NR₁₉CONR₁₂(CR₁₃R₁₄)_t(CR₁₅R₁₆)_u(OCH₂CH₂)_ySZ’、 -NR₁₉CONR₁₂(CR₁₃R₁₄)_t(CR₁₇＝CR₁₈)(CR₁₅R₁₆)_t(OCH₂CH₂)_ySZ’、 -NR₁₉CO-苯基-QSZ’、-NR₁₉CO-呋喃基-QSZ’、-NR₁₉CO-噁唑基-QSZ’、 -NR₁₉CO-噻唑基-QSZ’、-NR₁₉CO-噻吩基-QSZ’、-NR₁₉CO-咪唑基-QSZ’、 -NR₁₉CO-吗啉代-QSZ’、-NR₁₉CO-哌嗪基-QSZ’、-NR₁₉CO-哌啶子基 -QSZ’、-NR₁₉CO-N-甲基哌嗪基-QSZ’、 -NR₁₉-苯基-QSZ’、-NR₁₉-呋喃基-QSZ’、-NR₁₉-噁唑基-QSZ’、-NR₁₉-噻唑 基-QSZ’、-NR₁₉-噻吩基-QSZ’、-NR₁₉-咪唑基-QSZ’、-NR₁₉-吗啉代-QSZ’、 -NR₁₉-哌嗪基-QSZ’、-NR₁₉-哌啶子基-QSZ’、-NR₁₉-N-甲基哌嗪基-QSZ’、 -NR₁₉CO-NR₁₂-苯基-QSZ’、-NR₁₉CO-NR₁₂-噁唑基-QSZ’、-NR₁₉CO-NR₁₂- 噻唑基-QSZ’、-NR₁₉CO-NR₁₂-噻吩基-QSZ’、-NR₁₉CO-NR₁₂-哌啶子基 -QSZ’、 -S(O)_q(CR₁₃R₁₄)_t(CR₁₅R₁₆)_u(OCH₂CH₂)_ySZ’、 -S(O)_q(CR₁₃R₁₄)_t(CR₁₇＝CR₁₈)(CR₁₅R₁₆)_t(OCH₂CH₂)_ySZ’、 -SCONR₁₂(CR₁₃R₁₄)_t(CR₁₅R₁₆)_u(OCH₂CH₂)_ySZ’、 -SCO-吗啉代-QSZ’、-SCO-哌嗪基-QSZ’、-SCO-哌啶子基-QSZ’和-SCO-N- 甲基哌嗪基-QSZ’，其中:

Z’是H、硫醇保护基团，例如COR、R₂₀’或SR₂₀’，其中R₂₀’表示H、 烷基、芳基、杂环或杂芳基；

其中Q是直接连接或具有1-10个碳原子的线性烷基或支链烷基或 带有2-20重复乙烯氧单元的聚乙二醇间隔基；

R₁₉和R₁₂是相同或不同的，是具有1-10个碳原子的直链烷基、支 链烷基或环烷基，或简单的或取代的芳基或杂环，此外R₁₂可以是H；

R₁₃、R₁₄、R₁₅和R₁₆是相同或不同的，是H或具有1-4个碳原子的 直链或支链烷基；

R₁₇和R₁₈是H或烷基；

u是1-10的整数，还可以是0；

t是1-10的整数，还可以是0；

y是1-20的整数，还可以是0。

当式(I)化合物是离子形式(例如磺酸盐)时，可以存在抗衡离子(例如 Na⁺或K⁺)。

根据优选方面，本发明的化合物是式(I)化合物，其中T是任选被一 个或多个Hal、CN、NRR’、CF₃、R、OR、S(O)_qR和/或连接物取代的 芳基，A、A’、X、X’、U、U’、W、W’、m、m’、n、n’、---、是如 上定义的。

根据另一优选实施方案，本发明的化合物选自如下:

8，8’-[1，3-苯二基二(亚甲氧基)]-二[(S)-2-亚乙-(E)-基-7-甲氧基-1，2，3，11a- 四氢-5H-吡咯并[2，1-c][1，4]苯并二氮杂-5-酮]

8，8’-[5-甲氧基-1，3-苯二基二(亚甲氧基)]-二[(S)-2-亚乙-(E)-基-7-甲氧基 -1，2，3，11a-四氢-5H-吡咯并[2，1-c][1，4]苯并二氮杂-5-酮]

8，8’-[1，5-戊二基二(氧基)]-二[(S)-2-亚乙-(E)-基-7-甲氧基-1，2，3，11a-四氢 -5H-吡咯并[2，1-c][1，4]苯并二氮杂-5-酮]

8，8’-[1，4-丁二基二(氧基)]-二[(S)-2-亚乙-(E)-基-7-甲氧基-1，2，3，11a-四氢 -5H-吡咯并[2，1-c][1，4]苯并二氮杂-5-酮]

8，8’-[3-甲基-1，5-戊二基二(氧基)]-二[(S)-2-亚乙-(E)-基-7-甲氧基 -1，2，3，11a-四氢-5H-吡咯并[2，1-c][1，4]苯并二氮杂-5-酮]

8，8’-[2，6-吡啶二基(氧基)]-二[(S)-2-亚乙-(E)-基-7-甲氧基-1，2，3，11a-四氢 -5H-吡咯并[2，1-c][1，4]苯并二氮杂-5-酮]

8，8’-[4-(3-叔丁氧基羰基氨基丙氧基)-2，6-吡啶二基二-(亚甲氧基)]-二 [(S)-2-亚乙-(E)-基-7-甲氧基-1，2，3，11a-四氢-5H-吡咯并[2，1-c][1，4]苯并二 氮杂-5-酮]

8，8’-[5-(3-氨基丙氧基)-1，3-苯二基二(亚甲氧基)]-二[(S)-2-亚乙-(E)-基-7- 甲氧基-1，2，3，11a-四氢-5H-吡咯并[2，1-c][1，4]苯并二氮杂-5-酮]

8，8’-[5-(N-甲基-3-叔丁氧基羰基氨基丙基)-1，3-苯二基二-(亚甲氧基)]-二 [(S)-2-亚乙-(E)-基-7-甲氧基-1，2，3，11a-四氢-5H-吡咯并[2，1-c][1，4]苯并二 氮杂-5-酮]

8，8’-{5-[3-(4-甲基-4-甲基二硫基(sulfanyl)-戊酰基氨基)丙氧基]-1，3-苯二 基二(亚甲氧基)}-二[(S)-2-亚乙-(E)-基-7-甲氧基-1，2，3，11a-四氢-5H-吡咯 并[2，1-c][1，4]苯并二氮杂-5-酮]

8，8’-[5-乙酰基硫代甲基-1，3-苯二基二(亚甲氧基)]-二[(S)-2-亚甲基-7-甲 氧基-1，2，3，11a-四氢-5H-吡咯并[2，1-c][1，4]苯并二氮杂-5-酮]

二-{2-[(S)-2-亚甲基-7-甲氧基-5-氧代-1，3，11a-四氢-5H-吡咯并[2，1-c][1，4] 苯并二氮杂-8-基氧基]-乙基}-氨基甲酸叔丁基酯

8，8’-[3-(2-乙酰基硫代乙基)-1，5-戊二基二(氧基)]-二[(S)-2-亚甲基-7-甲氧 基-1，2，3，11a-四氢-5H-吡咯并[2，1-c][1，4]苯并二氮杂-5-酮]

8，8’-[5-(N-4-巯基-4，4-二甲基丁酰基)氨基-1，3-苯二基二(亚甲氧基)]-二 [7-甲氧基-2-亚甲基-1，2，3，11a-四氢-5H-吡咯并[2，1-c][1，4]苯并二氮杂 -5-酮]

8，8’-[5-(N-4-甲基二硫代-4，4-二甲基丁酰基)-氨基-1，3-苯二基二(亚甲氧 基)]-二[7-甲氧基-2-亚甲基-1，2，3，11a-四氢-5H-吡咯并[2，1-c][1，4]苯并二 氮杂-5-酮]

8，8’-[5-(N-甲基-N-(2-巯基-2，2-二甲基乙基)氨基-1，3-苯二基(亚甲氧基))- 二[7-甲氧基-2-亚甲基-1，2，3，11a-四氢-5H-吡咯并[2，1-c][1，4]苯并二氮杂 -5-酮]

8，8’-[5-(N-甲基-N-(2-甲基二硫代-2，2-二甲基乙基)氨基-1，3-苯二基(亚甲 氧基))-二[7-甲氧基-2-亚甲基-1，2，3，11a-四氢-5H-吡咯并[2，1-c][1，4]苯并 二氮杂-5-酮]

8，8’-[(4-(2-(4-巯基-4-甲基)-戊酰氨基-乙氧基)-吡啶-2，6-二甲基)-二氧基]- 二[(S)-2-亚乙-(E)-基-7-二甲氧基-1，2，3，11a-四氢-吡咯并[2，1-c][1，4]苯并 二氮杂-5-酮]

8，8’-[(1-(2-(4-甲基-4-甲基二硫基)-戊酰氨基-乙氧基)-苯-3，5-二甲基)-二 氧基]-二[(S)-2-亚乙-(E)-基-7-二甲氧基-1，2，3，11a-四氢-吡咯并[2，1-c][1，4] 苯并二氮杂-5-酮]

8，8’-[(4-(3-(4-甲基-4-甲基二硫基)-戊酰氨基-丙氧基)-吡啶-2，6-二甲基)- 二氧基]-二[(S)-2-亚乙-(E)-基-7-二甲氧基-1，2，3，11a-四氢-吡咯并 [2，1-c][1，4]苯并二氮杂-5-酮]

8，8’-[(4-(4-(4-甲基-4-甲基二硫基)-戊酰氨基-丁氧基)-吡啶-2，6-二甲基)- 二氧基]-二[(S)-2-亚乙-(E)-基-7-二甲氧基-1，2，3，11a-四氢-吡咯并 [2，1-c][1，4]苯并二氮杂-5-酮]

8，8’-[(4-(3-[4-(4-甲基-4-甲基二硫基-戊酰基)-哌嗪-1-基]-丙基)-吡啶-2，6- 二甲基)-二氧基]-二[(S)-2-亚乙-(E)-基-7-二甲氧基-1，2，3，11a-四氢-吡咯并 [2，1-c][1，4]苯并二氮杂-5-酮]

8，8’-[(1-(3-[4-(4-甲基-4-甲基二硫基-戊酰基)-哌嗪-1-基]-丙基)-苯-3，5-二 甲基)-二氧基]-二[(S)-2-亚乙-(E)-基-7-二甲氧基-1，2，3，11a-四氢-吡咯并 [2，1-c][1，4]苯并二氮杂-5-酮]

8，8’-[(4-(2-{2-[2-(4-甲基-4-甲基二硫基-戊酰基氨基)-乙氧基]-乙氧基}-乙 氧基)-吡啶-2，6-二甲基)-二氧基]-二[(S)-2-亚乙-(E)-基-7-二甲氧基 -1，2，3，11a-四氢-吡咯并[2，1-c][1，4]苯并二氮杂-5-酮]

8，8’-[(1-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(4-甲基-4-甲基二硫基-戊酰基氨基)-乙氧基]-乙 氧基}-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-苯-3，5-二甲基)-二氧基]-二 [(S)-2-亚乙-(E)-基-7-二甲氧基-1，2，3，11a-四氢-吡咯并[2，1-c][1，4]苯并二 氮杂-5-酮]

8，8’-[(1-(2-{2-[2-(4-甲基-4-甲基二硫基-戊酰基氨基)-乙氧基]-乙氧基}-乙 氧基)-苯-3，5-二甲基)-二氧基]-二[(S)-2-亚乙-(E)-基-7-二甲氧基 -1，2，3，11a-四氢-吡咯并[2，1-c][1，4]苯并二氮杂-5-酮]

8，8’-[(4-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(4-甲基-4-甲基二硫基-戊酰基氨基)-乙氧基]-乙 氧基}-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-吡啶-2，6-二甲基)-二氧基]-二 [(S)-2-亚乙-(E)-基-7-二甲氧基-1，2，3，11a-四氢-吡咯并[2，1-c][1，4]苯并二 氮杂-5-酮]

8，8’-[(1-(2-[甲基-(2-甲基-2-甲基二硫基-丙基)-氨基]-乙氧基)-苯-3，5-二甲 基)-二氧基]-二[(S)-2-亚乙-(E)-基-7-二甲氧基-1，2，3，11a-四氢-吡咯并 [2，1-c][1，4]苯并二氮杂-5-酮]

8，8’-[(4-(3-[甲基-(4-甲基-4-甲基二硫基-戊酰基)-氨基]-丙基)-吡啶-2，6-二 甲基)-二氧基]-二[(S)-2-亚乙-(E)-基-7-二甲氧基-1，2，3，11a-四氢-吡咯并 [2，1-c][1，4]苯并二氮杂-5-酮]

8，8’-[(4-(3-[甲基-(2-甲基-2-甲基二硫基-丙基)-氨基]-丙基)-吡啶-2，6-二甲 基)-二氧基]-二[(S)-2-亚乙-(E)-基-7-二甲氧基-1，2，3，11a-四氢-吡咯并 [2，1-c][1，4]苯并二氮杂-5-酮]

8，8’-[(1-(4-甲基-4-甲基二硫基)-戊酰氨基)-苯-3，5-二甲基]-二氧基]-二 [(S)-2-亚乙-(E)-基-7-二甲氧基-1，2，3，11a-四氢-吡咯并[2，1-c][1，4]苯并二 氮杂-5-酮]

以及相应的巯基衍生物，

或其可药用的盐、水合物或水合物盐，或这些化合物的多形态晶体结构 或其旋光异构体、外消旋体、非对映体或对映体。

优选的化合物是如下化合物:

X、X’、A、A’、Y、Y’、T、n、n’是如上定义的。

在用于上文或下文时:

Alk表示烷基、烯基或炔基。

“烷基”是指脂族烃基，它可以是直链或支链，在链中具有1-20个碳 原子或具有3-10个碳原子的环，优选的烷基在链中具有1-12个碳原子。 “支链”是指一个或多个低级烷基，例如甲基、乙基或丙基连接于线性烷 基链。举例性的烷基包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁 基、正戊基、3-戊基、辛基、壬基、癸基、环戊基和环己基。

“烯基”是指含有碳-碳双键的脂族烃基，它可以是直链或支链的，在 链中具有2-15个碳原子，优选的烯基在链中具有2-12个碳原子，更优 选在链中具有约2-4个碳原子。举例性的烯基包括乙烯基、丙烯基、正 丁烯基、异丁烯基、3-甲基丁-2-烯基、正戊烯基、庚烯基、辛烯基、壬 烯基、癸烯基。

“炔基”是指含有碳-碳三键的脂族烃基，它可以是直链或支链的，在 链中具有2-15个碳原子，优选的炔基在链中具有2-12个碳原子；更优 选在链中具有约2-4个碳原子。举例性的炔基包括乙炔基、丙炔基、正 丁炔基、2-丁炔基、3-甲基丁炔基、正戊炔基、庚炔基、辛炔基和癸炔 基。

“卤素原子”是指氟、氯、溴或碘原子；优选氟和氯原子。

“芳基”是指6-14个碳原子，优选6-10个碳原子的芳香单环或多环 烃环系，举例性的芳香包括苯基或萘基。

“Het”是指杂环或杂芳基。

用于本文的术语“杂环”或“杂环基”是指饱和、部分不饱和或不饱和、 非芳香稳定的3-14，优选5-10元单、二或多环，其中环的至少一个元是 杂原子。通常杂原子包括，但不限于，氧、氮、硫、硒和磷原子，优选 的杂原子是氧、氮和硫。

合适的杂环还在TheHandbook of Chemistry and Physics，76版，CRC Press，Inc.，1995-1996，2-25至2-26页公开，其内容列为本文参考文献。

优选的非芳香杂环基包括，但不限于，吡咯烷基、吡唑烷基、咪唑 烷基、环氧乙烷基、四氢呋喃基、二氧戊环基、四氢吡喃基、二氧己环 基、二氧戊环基、哌啶基、哌嗪基、吗啉基、吡喃基、咪唑啉基、吡咯 啉基、吡唑啉基、噻唑烷基、四氢噻喃基、二噻烷基、硫代吗啉基、二 氢吡喃基、四氢吡喃基、二氢吡喃基、四氢吡啶基、二氢吡啶基、四氢 氮茚基(pyrinidinyl)、二氢噻喃基、氮杂环庚烷基以及与苯基稠合产生的 稠环体系。

用于本文的术语“杂芳基”或芳香杂环是指5-14元，优选5-10元芳 香杂单、二或多环。实例包括吡咯基、吡啶基、吡唑基、噻吩基、嘧啶 基、吡嗪基、四唑基、吲哚基、喹啉基、嘌呤基、咪唑基、噻吩基、噻 唑基、苯并噻唑基、呋喃基、苯并呋喃基、1，2，4-噻二唑基、异噻唑基、 三唑基、四唑基、异喹啉基、苯并噻吩基、异苯并呋喃基、吡唑基、咔 唑基、苯并嘧啶基、异噁唑基、吡啶基-N-氧化物以及与苯基稠合形成的 稠合体系。

“烷基、”“环烷基”、“烯基”、“炔基”、“芳基”、“杂芳基”、“杂环” 等还涉及相应的“亚烷基、”“亚环烷基”、“亚烯基”、“亚炔基”、“亚芳基”、 “亚杂芳基”、“亚杂环基”等，它们通过除去两个氢原子形成。

用于本文的术语“可连接于细胞结合药物”是指茅屋霉素衍生物包 含至少一个连接基团或其前体，它适合于将所述衍生物键合到细胞结合 药物；优选的连接基团是硫醇、硫化物或二硫化物或其前体。

用于本文的术语“已连接于细胞结合药物”是指结合物分子包含至 少一个经合适的连接基团或其前体键合到细胞结合药物的茅屋霉素衍 生物，优选的连接基团是硫醇或二硫化物键或其前体。

用于本文时，给定基团的“前体”是指可通过任何脱保护、化学改性 或偶合反应产生该基团的任何基团。

用于本文的术语“患者”是指动物，例如用于饲养、陪伴或保存用途 的有价值动物，或优选人类或儿童，其患有或有可能会患有一种或多种 本文描述的疾病和症状。

用于本文的“治疗有效量”是指本发明化合物的数量，其有效用于预 防、降低、消除、治疗或控制本文描述的疾病和症状。术语“控制”是指 所有过程，其中可以是减缓、中断、制止或停止本文描述的疾病和症状 的进展，但不需要显示完全消除所有疾病和症状综合症，是指包括预防 治疗。

用于本文的术语“可药用的”是指那些化合物、材料、赋形剂、组合 物或剂量形式，它们在合理的临床判断范围内，适用与人体和动物组织 接触，没有过度毒性、刺激、过敏响应或其它与合理的效果/风险比率相 当的问题并发症。

用于本文的“可药用的盐”是指所述化合物的衍生物，其中母体化合 物通过制备其酸性或碱性盐改性。可药用的盐包括母体化合物由例如无 毒无机或有机酸形成的常规无毒盐或季铵盐。例如该常规无毒盐包括由 无机酸，例如盐酸、氢溴酸、硫酸、氨基磺酸、磷酸、硝酸等得到的盐； 和由有机酸，例如乙酸、丙酸、琥珀酸、酒石酸、柠檬酸、甲磺酸、苯 磺酸、葡糖酸、谷氨酸、苯甲酸、水杨酸、甲苯磺酸、草酸、富马酸、 马来酸、乳酸等制备的盐。其它加合盐包括铵盐，例如氨丁三醇、甲葡 胺、epolamine等，金属盐，例如钠、钾、钙、锌或镁。

本发明的可药用的盐可由含有碱性或酸性部分的母体化合物通过 常规化学方法合成。通常，该类盐可通过使这些化合物的游离酸或碱形 式与化学计量的合适碱或酸在水或有机溶剂或两者混合物中反应制备。 通常非水介质，如醚、乙酸乙酯、乙醇、异丙醇或乙腈是优选的。合适 盐的列表在Remington’s Pharmaceutical Sciences，17^th ed.，mack Publishing Company，Easton，PA，1985，p.1418，其内容列为本文参考文 献。

具有几何和立体异构体的通式(I)化合物也是发明的一部分。

式(I)茅屋霉素衍生物的N-10，C-11双键已知在水、醇、硫醇、伯 或仲胺、脲和其它亲核试剂存在下容易以可逆方式转变为相应的亚胺加 合物。该过程是可逆的，在脱水剂存在下，在非质子有机溶剂中在真空 或高温下容易地再生为相应的茅屋霉素衍生物(Z.Tozuka，36，J. Antibiotics，276(1983)。

因此，本发明还提供通式(II)茅屋霉素衍生物的可逆衍生物:

其中A、X、Y、n、T、A’、X’、Y’、n’、R1、R2、R1’、R2’如式(I)中 定义，W和W’，是相同或不同，分别选自基团OH、醚，例如-OR、酯 (例如乙酸酯)，例如-OCOR、-COOR、碳酸酯，例如-OCOOR、氨基甲 酸酯，例如-OCONRR’、环氨基甲酸酯，N10和C11是环的部分、脲， 例如-NRCONRR’、硫代氨基甲酸酯，例如-OCSNHR、环硫代氨基甲酸 酯，N10和C11是环的部分、-SH、硫化物，例如-SR、亚砜，例如-SOR、 砜，例如-SOOR、磺酸酯，例如-SO₃^-、磺酰胺，例如-NRSOOR、胺， 例如-NRR’、任选环化胺，N10和C11是环的部分、羟胺衍生物，例如 -NROR’、酰胺，例如-NRCOR、-NRCONRR’、叠氮基，例如-N₃、氰基、 卤素、三烷基或三芳基鏻、氨基酸衍生的基团；优选W和W’是相同或 不同的，是OH、OMe、OEt、NHCONH₂、SMe。

因此，式(II)化合物可以被认为是溶剂化物，在溶剂是水时，包括水； 这些溶剂化物是尤其有用的。

根据另一其它目的，本发明还涉及制备式(I)化合物的方法。

本发明的化合物和方法可以本领域技术人员已知的许多方法制备。 化合物可以例如通过应用或采用如下描述的方法或技术人员根据需要 改进的方法合成。合适的改进和替代对本领域技术人员是显然的和已知 的或可以由科学文献容易地得到。

该方法尤其可以在R.C.Larock，Comprehensive Organic Transformations，Wiley-VCH Publishers，1999找到。

显然的是，本发明的化合物可含有一个或多个不对称取代的碳原 子，可分离成旋光或外消旋形式。因此，包含结构的所有手性、非对映 体、外消旋形式和所有几何异构体形式，除非特定的立体化学或异构体 形式被特定指出。现有技术中人们已知如何制备和分离这些旋光形式。 例如立体异构体的混合物可通过标准技术，包括，但不限于，外消旋形 式的拆分、正相、逆相和手性色谱法、优先盐形成、重结晶等，或通过 手性合成，由手性原料或通过目标手性中心的预计合成分离。

本发明的化合物可通过各种合成途径制备，试剂和原料是商业获得 的或容易地由本领域技术人员的已知技术合成。所有取代基，除非另有 说明，如上文所定义。

在下文描述的反应中，需要保护反应官能团，例如在最终产物中需 要的羟基、氨基、亚氨基、硫醇或羧基，以避免它们不需要地参与反应。 根据标准实践可使用常规保护基团，例如参见T.W.greene和P.g.m.Wuts in Protectivegroups in Organic Chemistry，3^rd ed.，John Wiley和Sons，1999； J.F.W.mcOmie in Protectivegroups in Organic Chemistry，Plenum Press， 1973。

某些反应可在碱存在下进行，对用于此反应的碱的性质没有特殊 限制，任何常规用于此类反应的碱可同样地使用，只要它对分子的其它 部分没有不利影响。合适的碱的实例包括:氢氧化钠、碳酸钾、三乙胺、 碱金属氢化物，例如氢化钠和氢化钾；烷基锂化合物，例如甲基锂和丁 基锂；和碱金属醇盐，例如甲醇钠和乙醇钠。

通常反应在合成溶剂中进行，可使用各种溶剂，只要它对反应或所 包含的试剂没有不利影响。合适的溶剂的实例包括:烃，它可以是芳香、 脂族或环脂族烃，例如己烷、环己烷、苯、甲苯和二甲苯；酰胺，例如 二甲基甲酰胺；醇，例如乙醇和甲醇，和醚，例如乙醚和四氢呋喃。

反应可在宽泛的温度范围内进行，通常我们发现，方便地在-20℃ -150℃(更优选约室温-100℃)的温度下进行反应。反应所需的时间也可广 泛变化，取决于许多因素，主要是反应温度和试剂性质。然而，如果反 应在上述优选条件下进行，3-20小时的时间通常是足够的。

所制备的化合物可用常规方法由反应混合物中回收。例如，化合物 可通过由反应混合物蒸馏出溶剂回收，或如果需要，在从反应混合物蒸 馏出溶剂后，将残余物倾入水中，用水不混溶的有机溶剂提取，和由提 取液蒸馏出溶剂。此外，如果需要，产物可进一步用各种已知方法，例 如重结晶、再沉淀或各种色谱技术，主要是柱色谱法或制备薄层色谱法 纯化。

本发明的式(I)化合物的制备方法是本发明的其它目的。

根据第一方面，式(I)化合物的制备方法包括脱保护相应式(III)化合 物的步骤:

其中Y、Y’、X、A、A’、X’、n、n’、W、W’、U、U’、---、R1、R2、 R1’、R2’、如式(I)中定义，T’相应于T，其中官能团已被保护。

优选SH官能团被保护，优选保护基团是乙酰基、苯甲酰基、甲磺 酰基、甲硫基、吡啶硫基、硝基吡啶硫基、三异丙基甲硅烷基(TIPS)。 通常脱保护步骤用典型条件进行，例如碱用于除去乙酰基、苯甲酰基和 甲磺酰基保护基团，还原剂，例如二硫苏糖醇或三(2-羧基乙基)膦(TCEP) 用于断裂甲硫基保护基团，或已知的通过使化合物与氟化铵反应以除去 TIPS。

式(II)化合物可由偶合相应的式(IV)、(IV’)和(V)化合物得到:

其中Y、Y’、A、A’、n、n’、T’、W、W’、U、U’、---、R1、R2、 R1’、R2’如式(III)中定义，Lg是离去基团，例如卤素、OMs、OTs、OPPh₃⁺(在 Mitsunobu反应中形成的中间体)。

式(IV)和(IV’)化合物通常是已知的，在例如专利申请WO00/12508， WW00/12507，WO 2005/040170，WO 2005/085260中描述，或是商业获得 的，和/或总体合成获得(M.mori等，42 Tetrahedron，3793-3806，1986)或 通过链霉菌种生产，尤其是根据法国专利Fr.1,516,743的方法，或通过 应用或适用实施例给出的举例性的方法制备。

式(V)化合物可由相应的式(VI)化合物得到:

HO-An-T’-A’n’-OH(VI)

其中A、A’、n、n’、T’如式(III)中定义。

反应通常在PPh₃和CHal₄存在下进行，或通过与氯磺酸在碱，例如 三乙胺或氢氧化钾，优选三乙胺存在下反应进行。

式(VI)化合物可由相应的式(VII)化合物得到；

HO-An-T”-A’n’-OH(VII)

其中A、A’、n、n’如式(III)中定义，T”是T的前体基团。T的前体基团 是指可通过任何脱保护、化学改性或偶合产生T的任何基团。优选T通 过偶合T’与补充部分得到，其中T’和补充部分包括彼此反应的官能团， 例如T’包括胺官能团，补充部分包括酸官能团。

此反应的代表性例子是:

通常反应在N-羟基琥珀酰亚胺和HOBT存在下进行。

式(VII)化合物可以商业获得的或通过适用和应用已知方法或根据 实施例制备。

如下给出用于本发明方法的此实施方案的举例非限制方案:

根据第二方面，式(I)化合物可由式(III’)的相应化合物得到:

其中Y、Y’、X、A、A’、X’、n、n’、W、W’、U、U’、---、R1、R2、R1’、R2’如式(I)中定义，T”是T的任选保护的前体基团。

T的前体基团是指可通过化学改性或偶合产生T的任何基团。优选 T通过偶合T’与补充部分得到，其中T’和补充部分包括彼此反应的官能 团，例如T’包括胺官能团，补充部分包括酸官能团。

通常此反应在N-羟基琥珀酰亚胺和HOBT存在下进行。

式(III’)化合物可由偶合相应的式(IV)、(IV’)和(V’)化合物得到:

其中Y、Y’、A、A’、n、n’、W、W’、U、U’、---、R1、R2、R1’、 R2’如式(III’)中定义，T”是T的任选保护的前体基团，Lg是离去基团， 例如卤素或OMs、OTs或OPPh₃⁺(在Mitsunobu反应中形成的中间体)。

式(IV)和(IV’)化合物通常是已知的，通过总体合成获得(M.mori等， 42 Tetrahedron，3793-3806，1986)或通过链霉菌种生产，尤其是根据法国 专利Fr.1,516,743的方法。

式(V’)化合物可由相应的式(VII)化合物得到:

HO-An-T”-A’n’-OH(VI)

其中A、A’、n、n’、T’如式(I)中定义，T”是T’的任选保护的前体基团。

反应通常在PPh₃和CHal₄存在下进行。

式(VII)化合物可以商业获得或通过适用或应用已知方法或根据实 施例制备。

根据第三方面，式(I)化合物的制备方法包括环化相应式(VIII)化合物 的步骤:

其中Y、Y’、X、A、A’、X’、n、n’、R1、R2、R1’、R2’、T如式(I)中 定义。该反应通常在试剂，例如次硫酸钠(Na₂S₂O₄)存在下，在合适的溶 剂，例如THF和水的混合物中进行，随后加入甲醇和AcCl。

式(VIII)化合物可由相应的式(IX)化合物得到:

其中Y、Y’、A、A’、n、n’、R1、R2、R1’、R2’、T如式(I)中定义。通 常该反应在试剂，例如DIBAL-H存在下，在合适溶剂，例如甲苯中进 行。

式(IX)化合物可由偶合相应的式(X)和(XI)化合物得到:

其中Y、Y’、A、A’、n、n’、R1、R2、R1’、R2’、T如式(I)中定义。

通常该反应通过在合适溶剂，例如DMF中向(X)添加试剂，例如草 酰氯，，随后在合适溶剂，例如THF中加入(XI)进行。

如下给出代表性的方案:

上述反应通过利用或适用如下实施例中举例说明的方法由技术人 员进行。

此外，本发明的方法还包括分离式(I)和(II)化合物的附加步骤，这可 由技术人员通过任何已知的常规方法，例如如上所述的回收方法进行。

原料产物是商业获得的或可通过利用或适用任何已知方法或实施 例中描述的方法得到。

合成还可以多组分反应的一锅法进行。

根据另一方面，本发明涉及结合物分子，其含有至少一个通过连接 基团共价键合于细胞结合药物的茅屋霉素衍生物。所述结合物含有一个 或多个本发明的茅屋霉素衍生物，其显示含有连接基团，例如-S-或-S-S- 的连接物，所述连接基团共价连接细胞结合药物与本发明茅屋霉素衍生 物的连接物。根据优选方面，所述茅屋霉素衍生物是式(I’):

其中

---表示任选的单键；

表示单键或双键；

其前提是，当表示单键时，U和U’，相同或不同，分别表示H，W和 W’，相同或不同，分别选自基团OH、醚，例如-OR、酯(例如乙酸酯)， 例如-OCOR、碳酸酯，例如-OCOOR、氨基甲酸酯，例如-OCONRR’、 环氨基甲酸酯，N10和C11是环的部分、脲，例如-NRCONRR’、硫代 氨基甲酸酯，例如-OCSNHR、环硫代氨基甲酸酯，N10和C11是环的 部分、-SH、硫化物，例如-SR、亚砜，例如-SOR、砜，例如-SOOR、磺 酸酯，例如-SO₃^-、磺酰胺，例如-NRSOOR、胺，例如-NRR’、任选环化 胺，N10和C11是环的部分、羟胺衍生物，例如-NROR’、酰胺，例如 -NRCOR、叠氮基，例如-N₃、氰基、卤素、三烷基或三芳基鏻、氨基酸 衍生的基团；优选W和W’是相同或不同的是OH、OMe、OEt、NHCONH2、 SMe；

和当表示双键时，U和U’不存在，W和W’表示H；

R1、R2、R1’、R2’是相同或不同的，分别选自卤化物或任选被一个或多 个Hal、CN、NRR′、CF₃、OR、芳基，Het，S(O)_qR取代的烷基，或R1和 R2和R1’和R2’一起形成分别包含基团＝B和＝B’的双键。

优选R1和R2和R1’和R2’一起形成分别包含基团＝B和＝B’的双键。 B和B’是相同或不同的，分别选自任选被一个或多个Hal、CN、NRR’、 CF₃、OR、芳基、Het、S(O)_qR取代的烯基或B和B’表示氧原子。

优选B＝B’。

更优选B＝B’＝＝CH₂或＝CH-CH₃。

X、X’是相同或不同的，分别选自一个或多个-O-、-NR-、-(C＝O)-、 -S(O)_q-。

优选X＝X’。

更优选X＝X’＝O。

A、A’是相同或不同的，分别选自任选含有一个O、N或S原子的 烷基或烯基，其任选被一个或多个Hal、CN、NRR’、CF₃、OR、S(O)_qR、 芳基、Het、烷基、烯基取代。

优选A＝A’。

更优选A＝A’＝直链未取代烷基。

Y、Y’是相同或不同的，分别选自H、OR；

优选Y＝Y’。

更优选Y＝Y’＝O烷基，更优选甲氧基。

T是-烷基-、-NR-、-O-、-S(O)_q-、或4-10元芳基、环烷基、杂环或 杂芳基，每个任选被一个或多个Hal、CN、NRR’、CF₃、R、OR、S(O)_qR 取代，和被一个或多个连接物取代。

优选T是被一个或多个连接物取代的4-10元芳基或杂芳基，更优 选苯基或吡啶基。

所述连接物包括连接基团，合适的连接基团是现有技术中已知的， 包括硫醇、硫化物、二硫化物基团、硫醚基团、酸不稳定基团、光照不 稳定基团、肽酶不稳定基团和酯酶不稳定基团。优选二硫化物基团和硫 醚基团。

当连接基团是含硫醇-、硫化物或二硫化物基团时，带有硫醇或二硫 化物基团的侧链可以是直链或支链，芳香或杂环基。本领域普通技术人 员可容易地确定合适的侧链。优选所述连接物是如下通式:

-G-D-(Z)P-S-Z’

其中G是单或双键、-O-、-S-或-NR-；

D是单键或-E-、-E-NR-、-E-NR-F-、-E-O-、-E-O-F-、-E-NR-CO-、 -E-NR-CO-F-、-E-CO-、-CO-E-、-E-CO-F、-E-S-、-E-S-F-、-E-NR-C-S-、 -E-NR-CS-F-；

其中E和F是相同或不同的，分别选自直链或支链-(OCH₂CH₂)_i烷基 (OCH₂CH₂)_j-、-烷基-(OCH₂CH₂)_i-烷基-、-(OCH₂CH₂)_i-、-(OCH₂CH₂)_i环 烷基(OCH₂CH₂)_j、-(OCH₂CH₂)_i杂环基(OCH₂CH₂)_j、-(OCH₂CH₂)_i芳基 (OCH₂CH₂)_j-、-(OCH₂CH₂)_i杂芳基(OCH₂CH₂)_j-、-烷基-(OCH₂CH₂)_i烷基 (OCH₂CH₂)_j-、-烷基-(OCH₂CH₂)_i、-烷基-(OCH₂CH₂)_i环烷基(OCH₂CH₂)_j、 -烷基-(OCH₂CH₂)_i杂环基(OCH₂CH₂)_j-、-烷基-(OCH₂CH₂)_i芳基 (OCH₂CH₂)_j、-烷基-(OCH₂CH₂)_i杂芳基(OCH₂CH₂)_j-、-环烷基-烷基-、- 烷基-环烷基-、-杂环基-烷基-、-烷基-杂环基-、-烷基-芳基-、-芳基-烷基 -、-烷基-杂芳基-、-杂芳基-烷基-；

其中i和j，相同或不同，是整数，分别选自0、1-2000；

Z是直链或支链-烷基-；

p是0或1；

Z’表示H、硫醇保护基团，例如COR、R₂₀或SR₂₀，其中R₂₀表示H、 甲基、烷基、任选取代的环烷基、芳基、杂芳基或杂环，其前提是当Z’ 是H时，所述化合物与通过分子内环化由PBD之一的亚胺键-NH＝上加 成硫醇基团-SH形成的相应化合物平衡。

n，n’，相同或不同，是0或1，m＝m’和n＝n’。

q是0、1或2。

R、R’是相同或不同的，分别选自H、烷基、芳基，每个任选被Hal、 CN、NRR’、CF₃、R、OR、S(O)_qR、芳基、Het取代；

或其可药用的盐、水合物或水合物盐，或这些化合物的多形态晶体结构 或其旋光异构体、外消旋体、非对映体或对映体，

所述衍生物通过所述连接物共价键合到细胞结合药物。

连接物优选经对硫醇、硫化物或二硫化物键活性的官能团连接细胞 结合药物。

本发明涉及如下优选实施方案或其任一的任何组合:

-G是单键或-O-或-NR-；

-G是-O-；

-D是单键或-E-、-E-NR-、-E-NR-CO-、-E-CO-、-CO-E-；

-D是-E-、-E-NR-CO-、-CO-E-、-E-CO-；

-D是-E-NR-CO-；

-E是直链或支链-烷基-、-(OCH₂CH₂)_i-或烷基-杂环基；

-E是直链或支链-烷基-；

-Z是-(CH₂)₂-C(CH₃)₂-；

-p是0或1；

Z’是H或SR₂₀，其中R₂₀表示烷基、芳基、杂环基或杂芳基；

Z’是H或SR₂₀，其中R₂₀表示烷基；

含硫醇-、硫化物-或二硫化物-连接物的具体实例包括 -(CR₁₃R₁₄)_t(CR₁₅R₁₆)_u(OCH₂CH₂)_ySZ’、 -(CR₁₃R₁₄)_t(CR₁₇＝CR₁₈)(CR₁₅R₁₆)_y(OCH₂CH₂)_ySZ’、 -(CR₁₃R₁₄)_t(NR₁₉CO)(CR₁₅R₁₆)_u(OCH₂CH₂)_ySZ’、 -(CR₁₃R₁₄)_t(OCO)(CR₁₅R₁₆)_u(OCH₂CH₂)_ySZ’、 -(CR₁₃R₁₄)t(CO)(CR₁₅R₁₆)_u(OCH₂CH₂)_ySZ’、 -(CR₁₃R₁₄)_t(CONR₁₉)(CR₁₅R₁₆)_u(OCH₂CH₂)_ySZ’、 -(CR₁₃R₁₄)_t-苯基-CO(CR₁₅R₁₆)_uSZ’、-(CR₁₃R₁₄)_t-呋喃基-CO(CR₁₅R₁₆)_uSZ’、 -(CR₁₃R₁₄)_t-噁唑基-CO(CR₁₅R₁₆)_uSZ’、-(CR₁₃R₁₄)_t-噻唑基-CO(CR₁₅R₁₆)_uSZ’、 -(CR₁₃R₁₄)_t-噻吩基-CO(CR₁₅R₁₆)_uSZ’、-(CR₁₃R₁₄)_t-咪唑基-CO(CR₁₅R₁₆)_uSZ’、 -(CR₁₃R₁₄)_t-吗啉代-CO(CR₁₅R₁₆)_uSZ’、-(CR₁₃R₁₄)_t-哌嗪基-CO(CR₁₅R₁₆)_uSZ’、 -(CR₁₃R₁₄)_t-N-甲基哌嗪基-CO(CR₁₅R1₆)_uSZ’、 -(CR₁₃R₁₄)_t-苯基-QSZ’、-(CR₁₃R₁₄)_t-呋喃基-QSZ’、-(CR₁₃R₁₄)_t-噁唑基-QSZ’、 -(CR₁₃R₁₄)_t-噻唑基-QSZ’、-(CR₁₃R₁₄)_t-噻吩基-QSZ’、-(CR₁₃R₁₄)_t-咪唑基 -QSZ’、-(CR₁₃R₁₄)_t-吗啉代-QSZ’、-(CR₁₃R₁₄)_t-哌嗪基-QSZ’、-(CR₁₃R₁₄)_t-N- 甲基哌嗪基-QSZ’，或 -O(CR₁₃R₁₄)_t(CR₁₅R₁₆)_u(OCH₂CH₂)_ySZ’、 -O(CR₁₃R₁₄)_t(NR₁₉CO)(CR₁₅R₁₆)_u(OCH₂CH₂)_ySZ’、 -O(CR₁₃R₁₄)_t(CR₁₇＝CR₁₈)(CR₁₅R₁₆)_t(OCH₂CH₂)_ySZ’、 -O-苯基-QSZ’、-O-呋喃基-QSZ’、-O-噁唑基-QSZ’、-O-噻唑基-QSZ’、 -O-噻吩基-QSZ’、-O-咪唑基-QSZ’、-O-吗啉代-QSZ’、-O-哌嗪基-QSZ’、 -O-N-甲基哌嗪基-QSZ’、 -OCO(CR₁₃R₁₄)_t(NR₁₉CO)(CR₁₅R₁₆)_u(OCH₂CH₂)_ySZ’、 -OCO(CR₁₃R₁₄)_t(CR₁₇＝CR₁₈)(CR₁₅R₁₆)_u(OCH₂CH₂)_ySZ’、 -OCONR₁₂(CR₁₃R₁₄)_t(CR₁₅R₁₆)_u(OCH₂CH₂)_ySZ’、 -OCO-苯基-QSZ’、-OCO-呋喃基-QSZ’、-OCO-噁唑基-QSZ’、-OCO-噻 唑基-QSZ’、-OCO-噻吩基-QSZ’、-OCO-咪唑基-QSZ’、-OCO-吗啉代 -QSZ’、-OCO-哌嗪基-QSZ’、-OCO-N-甲基哌嗪基-QSZ’，或 -CO(CR₁₃R₁₄)_t(CR₁₅R₁₆)_u(OCH₂CH₂)_ySZ’、 -CO(CR₁₃R₁₄)_t(CR₁₇＝CR₁₈)(CR₁₅R₁₆)_y(OCH₂CH₂)_ySZ’、 -CONR₁₂(CR₁₃R₁₄)_t(CR₁₅R₁₆)_u(OCH₂CH₂)_ySZ’、 -CO-苯基-QSZ’、-CO-呋喃基-QSZ’、-CO-噁唑基-QSZ’、-CO-噻唑基 -QSZ’、-CO-噻吩基-QSZ’、-CO-咪唑基-QSZ’、-CO-吗啉代-QSZ’、-CO- 哌嗪基-QSZ’、-CO-哌啶子基-QSZ’、-CO-N-甲基哌嗪基-QSZ’、 -NR₁₉(CR₁₃R₁₄)_t(CR₁₅R₁₆)_u(OCH₂CH₂)_ySZ’、 -NR₁₉CO(CR₁₃R₁₄)_t(CR₁₅R₁₆)_u(OCH₂CH₂)_ySZ’、 -NR₁₉(CR₁₃R₁₄)_t(CR₁₇＝CR₁₈)(CR₁₅R₁₆)_t(OCH₂CH₂)_ySZ’、 -NR₁₉CO(CR₁₃R₁₄)_t(CR₁₇＝CR₁₈)(CR₁₅R₁₆)_t(OCH₂CH₂)_ySZ’、 -NR₁₉CONR₁₂(CR₁₃R₁₄)_t(CR₁₅R₁₆)_u(OCH₂CH₂)_ySZ’、 -NR₁₉CONR₁₂(CR₁₃R₁₄)_t(CR₁₇＝CR₁₈)(CR₁₅R₁₆)_t(OCH₂CH₂)_ySZ’、 -NR₁₉CO-苯基-QSZ’、-NR₁₉CO-呋喃基-QSZ’、-NR₁₉CO-噁唑基-QSZ’、 -NR₁₉CO-噻唑基-QSZ’、-NR₁₉CO-噻吩基-QSZ’、-NR₁₉CO-咪唑基-QSZ’、 -NR₁₉CO-吗啉代-QSZ’、-NR₁₉CO-哌嗪基-QSZ’、-NR₁₉CO-哌啶子基 -QSZ’、-NR₁₉CO-N-甲基哌嗪基-QSZ’、 -NR₁₉-苯基-QSZ’、-NR₁₉-呋喃基-QSZ’、-NR₁₉-噁唑基-QSZ’、-NR₁₉-噻唑 基-QSZ’、-NR₁₉-噻吩基-QSZ’、-NR₁₉-咪唑基-QSZ’、-NR₁₉-吗啉代-QSZ’、 -NR₁₉-哌嗪基-QSZ’、-NR₁₉-哌啶子基-QSZ’、-NR₁₉-N-甲基哌嗪基-QSZ’、 -NR₁₉CO-NR₁₂-苯基-QSZ’、-NR₁₉CO-NR₁₂-噁唑基-QSZ’、-NR₁₉CO-NR₁₂- 噻唑基-QSZ’、-NR₁₉CO-NR₁₂-噻吩基-QSZ’、-NR₁₉CO-NR₁₂-哌啶子基 -QSZ’、 -S(O)_q(CR₁₃R₁₄)_t(CR₁₅R₁₆)_u(OCH₂CH₂)_ySZ’、 -S(O)_q(CR₁₃R₁₄)_t(CR₁₇＝CR₁₈)(CR₁₅R₁₆)_t(OCH₂CH₂)_ySZ’、 -SCONR₁₂(CR₁₃R₁₄)_t(CR₁₅R₁₆)_u(OCH₂CH₂)_ySZ’、 -SCO-吗啉代-QSZ’、-SCO-哌嗪基-QSZ’、-SCO-哌啶子基-QSZ’和-SCO-N- 甲基哌嗪基-QSZ’，其中:

Z’是H、硫醇保护基团，例如COR、R₂₀’或SR₂₀’，其中R₂₀’表示H、烷 基、芳基、杂环或杂芳基；

其中Q是直接连接或具有1-10个碳原子的线性烷基或支链烷基或带有 2-20重复乙烯氧单元的聚乙二醇间隔基；

R₁₉和R₁₂是相同或不同的，是具有1-10个碳原子的直链烷基、支链烷 基或环烷基，或简单的或取代的芳基或杂环，此外R₁₂可以是H；

R₁₃、R₁₄、R₁₅和R₁₆是相同或不同的，是H或具有1-4个碳原子的直链 或支链烷基；

R₁₇和R₁₈是H或烷基；

u是1-10的整数，还可以是0；

t是1-10的整数，还可以是0；

y是1-20的整数，还可以是0。

根据此目的，式(I’)的代表性化合物是:

8，8’-{5-[3-(4-甲基-4-甲基二硫基-戊酰基氨基)丙氧基]-1，3-苯二基二(亚 甲氧基)}-二[(S)-2-亚乙-(E)-基-7-甲氧基-1，2，3，11a-四氢-5H-吡咯并 [2，1-c][1，4]苯并二氮杂-5-酮]

8，8’-[5-乙酰基硫代甲基-1，3-苯二基二(亚甲氧基)]-二[(S)-2-亚甲基-7-甲 氧基-1，2，3，11a-四氢-5H-吡咯并[2，1-c][1，4]苯并二氮杂-5-酮]

8，8’-[3-(2-乙酰基硫代乙基)-1，5-戊二基二(氧基)]-二[(S)-2-亚甲基-7-甲氧 基-1，2，3，11a-四氢-5H-吡咯并[2，1-c][1，4]苯并二氮杂-5-酮]

8，8’-[5-(N-4-巯基-4，4-二甲基丁酰基)氨基-1，3-苯二基二(亚甲氧基)]-二 [7-甲氧基-2-亚甲基-1，2，3，11a-四氢-5H-吡咯并[2，1-c][1，4]苯并二氮杂 -5-酮]

8，8’-[5-(N-4-甲基二硫代-4，4-二甲基丁酰基)-氨基-1，3-苯二基二(亚甲氧 基)]-二[7-甲氧基-2-亚甲基-1，2，3，11a-四氢-5H-吡咯并[2，1-c][1，4]苯并二 氮杂-5-酮]

8，8’-[5-(N-甲基-N-(2-巯基-2，2-二甲基乙基)氨基-1，3-苯二基(亚甲氧基))- 二[7-甲氧基-2-亚甲基-1，2，3，11a-四氢-5H-吡咯并[2，1-c][1，4]苯并二氮杂 -5-酮]

8，8’-[5-(N-甲基-N-(2-甲基二硫代-2，2-二甲基乙基)氨基-1，3-苯二基(亚甲 氧基))-二[7-甲氧基-2-亚甲基-1，2，3，11a-四氢-5H-吡咯并[2，1-c][1，4]苯并 二氮杂-5-酮]

8，8’-[(4-(2-(4-巯基-4-甲基)-戊酰氨基-乙氧基)-吡啶-2，6-二甲基)-二氧基]- 二[(S)-2-亚乙-(E)-基-7-二甲氧基-1，2，3，11a-四氢-吡咯并[2，1-c][1，4]苯并 二氮杂-5-酮]

8，8’-[(1-(2-(4-甲基-4-甲基二硫基)-戊酰氨基-乙氧基)-苯-3，5-二甲基)-二 氧基]-二[(S)-2-亚乙-(E)-基-7-二甲氧基-1，2，3，11a-四氢-吡咯并[2，1-c][1，4] 苯并二氮杂-5-酮]

8，8’-[(4-(3-(4-甲基-4-甲基二硫基)-戊酰氨基-丙氧基)-吡啶-2，6-二甲基)- 二氧基]-二[(S)-2-亚乙-(E)-基-7-二甲氧基-1，2，3，11a-四氢-吡咯并 [2，1-c][1，4]苯并二氮杂-5-酮]

8，8’-[(4-(4-(4-甲基-4-甲基二硫基)-戊酰氨基-丁氧基)-吡啶-2，6-二甲基)- 二氧基]-二[(S)-2-亚乙-(E)-基-7-二甲氧基-1，2，3，11a-四氢-吡咯并 [2，1-c][1，4]苯并二氮杂-5-酮]

8，8’-[(4-(3-[4-(4-甲基-4-甲基二硫基-戊酰基)-哌嗪-1-基]-丙基)-吡啶-2，6- 二甲基)-二氧基]-二[(S)-2-亚乙-(E)-基-7-二甲氧基-1，2，3，11a-四氢-吡咯并 [2，1-c][1，4]苯并二氮杂-5-酮]

8，8’-[(1-(3-[4-(4-甲基-4-甲基二硫基-戊酰基)-哌嗪-1-基]-丙基)-苯-3，5-二 甲基)-二氧基]-二[(S)-2-亚乙-(E)-基-7-二甲氧基-1，2，3，11a-四氢-吡咯并 [2，1-c][1，4]苯并二氮杂-5-酮]

8，8’-[(4-(2-{2-[2-(4-甲基-4-甲基二硫基-戊酰基氨基)-乙氧基]-乙氧基}-乙 氧基)-吡啶-2，6-二甲基)-二氧基]-二[(S)-2-亚乙-(E)-基-7-二甲氧基 -1，2，3，11a-四氢-吡咯并[2，1-c][1，4]苯并二氮杂-5-酮]

8，8’-[(1-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(4-甲基-4-甲基二硫基-戊酰基氨基)-乙氧基]-乙 氧基}-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-苯-3，5-二甲基)-二氧基]-二 [(S)-2-亚乙-(E)-基-7-二甲氧基-1，2，3，11a-四氢-吡咯并[2，1-c][1，4]苯并二 氮杂-5-酮]

8，8’-[(1-(2-{2-[2-(4-甲基-4-甲基二硫基-戊酰基氨基)-乙氧基]-乙氧基}-乙 氧基)-苯-3，5-二甲基)-二氧基]-二[(S)-2-亚乙-(E)-基-7-二甲氧基 -1，2，3，11a-四氢-吡咯并[2，1-c][1，4]苯并二氮杂-5-酮]

8，8’-[(4-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(4-甲基-4-甲基二硫基-戊酰基氨基)-乙氧基]-乙 氧基}-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-吡啶-2，6-二甲基)-二氧基]-二 [(S)-2-亚乙-(E)-基-7-二甲氧基-1，2，3，11a-四氢-吡咯并[2，1-c][1，4]苯并二 氮杂-5-酮]

8，8’-[(1-(2-[甲基-(2-甲基-2-甲基二硫基-丙基)-氨基]-乙氧基)-苯-3，5-二甲 基)-二氧基]-二[(S)-2-亚乙-(E)-基-7-二甲氧基-1，2，3，11a-四氢-吡咯并 [2，1-c][1，4]苯并二氮杂-5-酮]

8，8’-[(4-(3-[甲基-(4-甲基-4-甲基二硫基-戊酰基)-氨基]-丙基)-吡啶-2，6-二 甲基)-二氧基]-二[(S)-2-亚乙-(E)-基-7-二甲氧基-1，2，3，11a-四氢-吡咯并 [2，1-c][1，4]苯并二氮杂-5-酮]

8，8’-[(4-(3-[甲基-(2-甲基-2-甲基二硫基-丙基)-氨基]-丙基)-吡啶-2，6-二甲 基)-二氧基]-二[(S)-2-亚乙-(E)-基-7-二甲氧基-1，2，3，11a-四氢-吡咯并 [2，1-c][1，4]苯并二氮杂-5-酮]

8，8’-[(1-(4-甲基-4-甲基二硫基)-戊酰氨基)-苯-3，5-二甲基]-二氧基]-二 [(S)-2-亚乙-(E)-基-7-二甲氧基-1，2，3，11a-四氢-吡咯并[2，1-c][1，4]苯并二 氮杂-5-酮]

以及相应的巯基衍生物，

或其可药用的盐、水合物或水合物盐，或这些化合物的多形态晶体结构 或其旋光异构体、外消旋体、非对映体或对映体。

细胞结合药物可以是任何种类，包括肽类和非肽类。通常它们可以 是抗体(尤其是单克隆抗体)或含有至少一个结合位的抗体片段、淋巴因 子、激素、生长因子、营养传递分子(例如铁传递蛋白)或任何其它细胞 结合分子或基质。可使用的细胞结合药物的更具体实例包括单克隆抗 体；嵌合抗体；人体化抗体；全人体抗体；单链抗体；抗体片段，例如 Fab、Fab’、F(ab’)₂和F_v{Parham，131 J.Immunol.2895-2902(1983)；Spring 等，113 J.Immunol.470-478(1974)；Nisonoff等，89 Arch.Biochem. Biophys.230-244(1960)}；干扰素；肽；淋巴因子，例如IL-2、IL-3、IL-4、 IL-6；激素，例如胰岛素、TRH(促甲状腺释放素)、MSH(促黑素)、类固 醇激素，例如雄激素和雌激素；生长因子和集落刺激因子，例如EGF、 TGFα、胰岛素类生长因子(IGF-I、IGF-II)G-CSF、m-CSF和GM-CSF {Burgess，5 Immunology Today 155-158(1984)}；维生素，例如叶酸和铁 传递蛋白{O’Keefe等，260 J.Biol.Chem.932-937(1985)}。

本文中术语“细胞结合药物”还包括改性的细胞结合药物，其中所述 细胞结合药物通过改性剂改性以改善所述细胞结合药物对茅屋霉素衍 生物的连接物的连接基团的反应活性。所述改性剂包括N-磺基琥珀酰亚 氨基-4-(5-硝基-2-吡啶二硫代-丁酸酯(SSNPB)、琥珀酰亚氨基4-[N-马来 酰亚氨基]环己烷-1-羧酸酯(SMCC)、4-(2-吡啶基二硫代)丁酸N-羟基琥 珀酰亚胺酯(SPDB)和如下讨论的那些。

单克隆抗体技术能够以特异单克隆抗体形式生产极其选择性细胞 结合药物，在现有技术中尤其已知的是通过用感兴趣抗原，例如完整目 标细胞、由目标细胞分离的抗原、全病毒、削弱的全病毒和病毒蛋白质， 例如病毒壳体蛋白质免疫小鼠、大鼠、仓鼠或任何其它动物产生单克隆 抗体的技术。

合适的细胞结合药物的选择是选择数量问题，其取决于所靶向的特 定细胞菌落，但通常优选单克隆抗体，如果一种合适的是可利用的。

例如单克隆抗体MY9是鼠科IgG₁抗体，它特异地结合CD33抗原 {J.D.Griffin等8 Leukemia Res.，521(1984)}，如果目标细胞表达CD33 作为急性骨髓性白血病(ALM)疾病时可以使用。同样，单克隆抗体抗-B4 是鼠科IgG₁，它结合于B细胞的CD19抗原{Nadler等，131 J.Immunol. 244-250(1983)}，如果目标细胞是B细胞或表达此抗原的疾病细胞时， 例如在非霍奇金淋巴瘤或慢性成淋巴细胞白血病中，可以使用。如上所 述，MY9和抗-B4抗体可以是鼠科、嵌合、人体化或全人体。

此外，结合骨髓细胞的GM-CSF可用作细胞结合药物用于急性骨髓 性白血病的疾病细胞。结合于活化T-细胞的IL-2可用于预防移植排异， 用于治疗和预防移植物抗宿主病，用于治疗急性T细胞白血病。结合于 黑素细胞的MSH用于治疗黑素瘤。

本发明的结合物分子可用任何技术形成，本发明的茅屋霉素衍生物 可经酸不稳定连接物或光不稳定连接物连接抗体或其它细胞结合药物。 衍生物可与带有合适序列的肽稠合，随后连接于细胞结合药物以产生肽 酶不稳定连接物。结合物可制备以包含伯羟基，它可琥珀酰基化，然后 连接于细胞结合药物以产生结合物，它可通过细胞内酯酶断裂以释放游 离衍生物。优选合成衍生物以包含游离或保护的硫醇基团，随后一个或 多个含二硫化物或硫醇衍生物各自经二硫化物键或硫醚键共价连接于 细胞结合药物。

在USP 5,416,064和USP 5,475,092教导了许多结合方法。茅屋霉素 衍生物可改性以产生游离氨基，随后经酸不稳定连接物或光不稳定连接 物连接于抗体或其它细胞结合药物。带有游离氨基或羧基的茅屋霉素衍 生物可与肽稠合，随后连接于细胞结合药物以产生肽酶不稳定连接物。 带有连接物上的游离羟基的茅屋霉素衍生物可琥珀酰基化，连接于细胞 结合药物以产生结合物，它可通过细胞内酯酶断裂以释放游离药物。最 优选茅屋霉素衍生物被处理以产生游离或保护的硫醇基团，随后含二硫 化物或硫醇的茅屋霉素二聚物经二硫化物键连接于细胞结合药物。

本发明的代表性结合物是抗体-茅屋霉素衍生物、抗体片段-茅屋霉 素衍生物表皮生长因子(EGF)-茅屋霉素衍生物、促黑素(MSH)-茅屋霉素 衍生物、促甲状腺素(TSH)-茅屋霉素衍生物、雌激素-茅屋霉素衍生物、 雌激素类似物-茅屋霉素衍生物、雄激素茅屋霉素衍生物、雄激素类似物 -茅屋霉素衍生物和叶酸-茅屋霉素衍生物。

抗体、抗体片段、蛋白质或肽激素、蛋白质或肽生长因子和其它蛋 白质的茅屋霉素衍生物结合物通过已知方法以相同的方法制备。例如肽 和抗体可用交联剂，例如N-琥珀酰亚氨基3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯、 N-琥珀酰亚氨基4-(2-吡啶基二硫代)戊酸酯(SPP)、4-琥珀酰亚氨基-氧基 羰基-α-甲基-α-(2-吡啶基二硫代)-甲苯(SMPT)、N-琥珀酰亚氨基-3-(2-吡 啶基二硫代)丁酸酯(SDPB)、琥珀酰亚氨基吡啶基二硫代丙酸酯(SPDP)、 4-(2-吡啶基二硫代)丁酸N-羟基琥珀酰亚氨基酯(SPDB)、琥珀酰亚氨基 4-[N-马来酰氨基甲基]环己烷-1-羧酸酯(SMCC)、N-硫基琥珀酰亚氨基 -3-{-2-(5-硝基-吡啶二硫基)丁酸酯(SSNPB)、2-亚氨基硫烷或通过S- 乙酰基琥珀酸酐通过已知方法改性。参见Carlsson等，173 Biochem.J. 723-737(1978)；Blattler等，24 Biochem.1517-1524(1985)；Lambert等， 22 Biochem.3913-3920(1983)；Klotz等，96 Arch.Biochem.Biophys. 605(1962)；和Liu等，18 Biochem.690(1979)，Blakey和Thorpe，1Antibody， Immunoconjugates & Radiopharmaceuticals，1-16(1988)，Worrell等1 Anti-Cancer Drug Design 179-184(1986)。由此衍生的含游离或保护的硫 醇细胞结合药物随后与含二硫化物或硫醇的茅屋霉素衍生物反应以生 产结合物。结合物可用HPLC或凝胶过滤法纯化。

优选单克隆抗体-或细胞结合药物-茅屋霉素衍生物结合物是经如上 讨论二硫化物键连接的物质，它们能够释放茅屋霉素衍生物。该细胞结 合药物通过已知方法制备，例如用琥珀酰亚氨基吡啶基-二硫基丙酸盐 (SPDP)改性的单克隆抗体(Carlsson等，173 Biochem.J.723-737(1978))。 生成的硫代吡啶基随后通过用含硫醇的茅屋霉素衍生物替代以产生二 硫化物连接的结合物。或者，在芳基二硫基-茅屋霉素衍生物的情况下， 细胞结合结合物的形成通过用预先引入抗体分子的巯基直接置换茅屋 霉素衍生物的芳基硫醇实现。含有1-10个经二硫化物桥连接的茅屋霉素 衍生物的结合物容易用两种方法的任何一种制备。

更具体地，在含有2mM EDTA，pH7.5的0.05M磷酸钾缓冲液中浓 度为2.5mg/ml的二硫基-硝基吡啶基改性的抗体溶液用含硫醇茅屋霉素 衍生物(1.3molar eq/二硫基吡啶基)处理，硫基-硝基吡啶由改性抗体中的 释放在325nm用分光光度滴定法测量，在约16个小时内完成。纯化抗 体-茅屋霉素衍生物结合物通过Sephadexg-25或Sephacryl S300柱的凝胶 过滤除去未反应药物和其它低分子物质。每个抗体分子结合的茅屋霉素 衍生物的数量可通过测量在230nm和275nm的吸光率比率确定，通过 此方法，平均1-10个茅屋霉素衍生物分子/抗体分子可经二硫化物连接。

可以用先前由Liu等，93 Proc.Natl.Acad.Sci 8618-8623(1996)描述 的方法测量基于结合亲合力对抗原表达细胞的结合效果。茅屋霉素衍生 物和其抗体结合物对细胞系的细胞毒性可通过如Goldmacher等，135 J. Immunol.3648-3651(1985)中所述的细胞繁殖曲线的反外推法测量。这 些化合物对粘附细胞系的细胞毒性可通过如Goldmacher等，102 J.Cell Biol.1312-1319(1986)中所述的clonogenic试验测定。

本发明的代表性结合物是茅屋霉素衍生物与抗体、抗体片段、表皮 生长因子(EGF)、促黑素(MSH)、促甲状腺素(TSH)、雌激素、雌激素类 似物、雄激素、雄激素类似物的结合物。

衍生物和细胞结合药物的各种结合物制备方法的代表性实例描述 如下。

二硫化物连接物:例如单克隆抗体MY9是鼠科IgG₁抗体，它特异地结 合CD33抗原{J.D.Griffin等8 Leukemia Res.，521(1984)}，如果目标细 胞表达CD33作为急性骨髓性白血病(ALM)疾病时可以使用。同样，单 克隆抗体抗-B4是鼠科IgG₁，它结合于B细胞的CD19抗原{Nadler等， 131 J.Immunol.244-250(1983)}，如果目标细胞是B细胞或表达此抗原 的疾病细胞时，例如在非霍奇金淋巴瘤或慢性成淋巴细胞白血病中，可 以使用。

此外，结合骨髓细胞的GM-CSF可用作细胞结合药物用于急性骨髓 性白血病的疾病细胞。结合于活化T-细胞的IL-2可用于预防移植排异， 用于治疗和预防移植物抗宿主病，用于治疗急性T细胞白血病。结合于 黑素细胞的MSH用于治疗黑素瘤。

抗体或其它细胞结合药物用如上所述的N-琥珀酰亚氨基-3-吡啶基 二硫基丙酸盐改性{J.Carlsson，H.Drevin & R.Axen，Biochem.J.， 173:723(1978)}以每个抗体分子平均引入4个吡啶基二硫基基团，改性 的分子与含硫醇衍生物反应以产生二硫化物连接的结合物。

或者，结合物可采用和/或适用在WO2004/103272中公开的方法制 备，所述专利中的教导列为本文参考文献。

硫醚连接物:本发明的含硫醇衍生物可如上所述(U.S.Pat No.5,208,020) 经硫醚链连接于抗体和其它细胞结合药物。抗体或其它细胞结合药物可 用商业获得的化合物，例如N-琥珀酰亚氨基4-(马来亚酰氨基甲基)环己 烷羧酸酯(SMCC)、N-琥珀酰亚氨基-4-(N-马来亚酰氨基甲基)-环己烷-1- 羧基-(6-酰氨基-己酸酯)(它是SMCC的“长链”类似物)(LC-SMCC)改性。 这些交联剂形成由马来亚酰氨基部分衍生的不可断裂连接物。

包含卤代乙酰基部分的交联剂包括N-琥珀酰亚氨基-4-(碘乙酰基)- 氨基苯甲酸酯(SIAB)、N-琥珀酰亚氨基碘乙酸酯(SIA)、N-琥珀酰亚氨基 溴乙酸酯(SBA)和N-琥珀酰亚氨基3-(溴乙酰氨基)丙酸酯(SBPA)。这些 交联剂形成由卤代乙酰基部分衍生的不可断裂连接物。

酸不稳定连接物:本发明的含氨基衍生物可如上所述{W.A.Blattler等， Biochemistry 24，1517-1524(1985)；U.S4,542,225，4,569,789，4,618,492， 4,764,368}经酸不稳定连接物连接于抗体和其它细胞结合药物。

同样，含hydrazido基团的本发明衍生物可经酸不稳定腙连接物连 接于抗体和其它细胞结合药物的碳水化合物部分{腙连接物的实例参见 B.C.Laguzza等，J.Med.Chem.，32，548-555(1989)；R.S.greenfield等， Cancer Res.，50，6600-6607(1990)}。

光不稳定连接物:本发明的含胺基团衍生物可经如上所述{P.Senter等， Photochemistry and Photobiology，42，231-237(1985)；U.S.Pat.No. 4,625,014}的光不稳定连接物连接于抗体和其它细胞结合药物。

肽酶不稳定连接物:本发明的含胺基团衍生物还可经肽间隔基连接于细 胞结合药物。如上所示，在药物和大分子蛋白质载体之间的短肽间隔基 在血清中是稳定的，但容易被细胞内肽酶水解{A.Trouet等，Proc.Natl. Acad.Sci.，79，626-629(1982)}。含氨基衍生物可用缩合剂，例如1-乙基 -3-(3-二甲基氨基-丙基)碳化二亚胺-HCl(EDC-HCl)与肽缩合得到肽衍生 物，它可连接于细胞结合药物。

酯酶不稳定连接物:带有羟基的本发明的衍生物可用琥珀酸酐琥珀酰基 化，随后连接于细胞结合药物以产生结合物，它可通过细胞内酯酶断裂 以释放游离药物{例如参见E.Aboud-Pirak等，Biochem Pharmacol.，38， 641-648(1989)}。

通过上述方法制备的结合物可用标准色谱技术，例如尺寸排除、吸 附色谱法，包括，但不限于，离子交换、疏水相互作用色谱法、亲合力 色谱法、基于陶瓷羟磷灰石或Porapak的色谱法或通过HPLC纯化。也 可采用通过透析或过滤纯化。

单克隆抗体或细胞结合药物和本发明的衍生物的结合物优选是经 如上所述的二硫化物键连接的物质。该细胞结合药物通过已知方法制 备，例如用琥珀酰亚氨基吡啶基-二硫基丙酸盐(SPDP)改性单克隆抗体 {Carlsson等，173 Biochem.J.723-737(1978)}。生成的硫代吡啶基随后 通过用含硫醇的衍生物替代以产生二硫化物连接的结合物。含有1-10 个经二硫化物桥连接的衍生物的结合物容易用此方法制备。通过此方法 的结合过程在US5,585,499中充分描述，其列为本文参考文献。

根据本发明的优选方面，细胞结合药物是抗体，尤其是单克隆抗体。

根据本发明的另一优选方面，细胞结合药物是抗原特异的抗体片 段，例如FV、Fab、Fab’或F(ab’)₂。

根据其它目的，本发明还涉及药物组合物，其含有如上定义的本发 明的结合物分子或式(I)化合物与可药用的载体。

根据其它目的，本发明还涉及杀死或抑制细胞，优选选择的细胞群 落生长的方法，其包括使目标细胞或含有目标细胞的组织与有效量的本 发明的药物组合物接触。

选择的细胞群落是癌和/或繁殖细胞。

根据其它目的，本发明还涉及治疗，优选选择性治疗癌症的方法， 其包括向需要的患者给药有效量的本发明的药物组合物。

根据本发明，“选择性治疗癌症”是指杀死癌和/或繁殖细胞，基本上 不杀死正常和/或非繁殖细胞。

根据其它目的，本发明还涉及如上定义的本发明的结合物分子或式 (I)化合物用于制备治疗癌症的药物的用途。

用于抑制选择的细胞群落生长的方法可体外、体内或生物体外(ex vivo)实行。

体外使用的实例包括处理细胞培养物以杀死除不表达目标抗原所 需变体外的所有细胞或以杀死表达不需要抗原的变体。

非临床体外使用的条件容易地由熟练技术人员确定。

生物体外使用的实例包括在移植入同一患者前处理自体同源骨髓 以杀死疾病的或恶性的细胞:在移植之前处理骨髓以杀死胜任的T细胞， 防止移植物抗宿主病(GVHD)。

临床生物体外处理以在癌症治疗的自体同源移植前或治疗自体免 疫疾病中由骨髓除去肿瘤细胞或淋巴细胞，或在移植前为预防GVHD由 异源骨髓或组织中除去T细胞和其它淋巴细胞可如下进行。由患者或其 它个体收集骨髓，随后在含有加入本发明的细胞毒素药物，浓度范围为 约10μM-1pM的血清的培养基中在约37℃培养约30分钟至约48小时。 浓度的确切时间和培养时间(＝剂量)由本领域技术人员容易地确定。在培 养后，骨髓细胞用含有血清的培养基洗涤，根据已知方法通过静脉内输 液返回患者。在患者接受其它治疗，例如在抽取骨髓和重新输液处理的 细胞的时间内单独的化学疗法或全身放射治疗过程中处理的骨髓细胞 用标准医学设备贮存在液氮中冷冻。

对于临床体内用途，本发明的细胞结合药物将作为测试为无菌和测 试内毒素含量的溶液供给。合适的结合物给药制度如下，结合物作为体 内块造影剂团每周给药持续6周，所给的块剂量为可加入的人体血清白 蛋白正常盐的50-400mL(例如0.5-1mL人血清白蛋白浓缩溶液， 100mg/mL)。剂量将为每周体重的约50μg-10mg/kg，i.v.(每次注射 10μg-100mg/kg)。在治疗后6周，患者可接受第二次治疗过程，具体临 床制度与给药途径、赋形剂、稀释剂、剂量、时间等有关，可由熟练技 术人员根据临床状况确定。

可根据杀死选择的细胞群落体内或生物体外方法治疗的医学症状 的实例包括所有类型的恶性肿瘤，包括例如肺、乳腺、结肠、前列腺、 肾、胰腺、卵巢和淋巴器官癌；黑素瘤；自体免疫疾病，例如系统性狼 疮、风湿性关节炎和多发性硬化；移植排异，例如肾移植排异、肝移植 排异、肺移植排异、心脏移植排异和骨髓移植排异；移植物抗宿主病； 病毒感染，例如CMV感染、HIV感染、AIDS等；细菌感染；和寄生虫 感染，例如贾第鞭毛虫病、阿米巴病、血吸虫病和其它由本领域技术人 员确定的疾病。

那些需要本文描述的疾病和症状治疗的患者的确定在本领域技术 人员的能力和知识内是已知的。本领域兽医或临床医生可通过采用临床 测试、身体检查、医学/家庭历史或生物学和诊断试验容易地确定需要该 治疗的患者。

治疗有效量可容易地通过主治诊断医生作为本领域技术人员通过 使用常规技术和通过观察类似环境下得到的结果确定。在确定治疗有效 量时，主治诊断医生考虑许多因素，包括，但不限于，患者种类、体重、 年龄和一般健康；所包含的特殊疾病；患病程度或疾病的严重程度；个 体患者的响应；给药的具体化合物；给药模式；给药制剂的生物利用率 特性；所选择的剂量制度；伴随药物治疗的使用；和其它相关环境。

需要获得所需生物学效果的式(I)化合物或结合物的数量将根据许 多因素变化，包括所采用的化合物的化学特性(例如疏水性)、化合物效 力、疾病类型、患者所属的种类、患者疾病状态、给药途径、通过选择 的途径化合物的生物利用率，所有因素指示给药的所需剂量、传送和疗 法。

“制药的”或“可药用的”是指分子实体和组合物在根据需要向动物或 人给药时不产生不利、过敏或其它不幸的反应。

用于本文的“可药用的赋形剂”包括任何载体、稀释剂、辅料或赋形 剂，例如防腐或抗氧化剂、填料、崩解剂、润湿剂、乳化剂、悬浮剂、 溶剂、分散介质、涂层、抗菌和抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂等。药物 活性物质的这些介质和试剂的使用是本领域中已知的，除了与活性成分 不相容的任何常规介质或试剂外，被预期在治疗组合物中的用途。附助 活性成分也可加入组合物中作为合适的治疗组合。

在发明内容中，用于本文的术语“治疗”或“处理”是指逆转、减缓、 抑制该术语适用的疾病或状况或一种或多种该疾病或状况的症状的进 程或预防。

根据本发明，术语“患者”或“需要治疗的患者”是指被本文提及的病 理学症状侵袭或很可能被侵袭的动物或人，患者优选是人。

在一般情况下，本发明的化合物可以用于肠胃外给药的含有0.1-10 ％w/v化合物的含水生理学缓冲溶液提供，典型剂量范围为每天 1μg/kg-0.1g/kg体重，优选剂量范围是每天0.01mg/kg-10mg/kg体重或在 儿童中的相当剂量。所给药的优选药物剂量同样取决于变量，诸如疾病 或症状的类型和进展程度、特定患者的整体健康状态、所选择的化合物 的相对生物学效力、化合物的制剂、给药途径(静脉内、肌内等)、经选 择的输送途径的化合物药物动力学性质，和给药的速率(团或连续输液) 和时间表(在一定时间周期内重复的次数)。

本发明的化合物还能够以单位剂量形式给药，其中“单位剂量”是指 能够向患者给药的单一剂量，它可容易地操作和包装，保持为物理和化 学稳定的单位剂量，其含有活性化合物本身，或作为本文如下描述的可 药用的组合物。同样，典型的总日剂量范围为0.01-100mg/kg体重，作 为一般指导，用于人体的单位剂量为每天1mg-3000mg。优选单位剂量 范围为1-500mg，一天给药1-6次，更优选10mg-500mg，每天一次。本 文提供的化合物可通过与一种或多种可药用的赋形剂混合配制成药物 组合物。该单位剂量组合物可制备用于口服给药，尤其是以片剂、简单 胶囊或软凝胶胶囊形式；或鼻内给药，尤其是以粉末、鼻滴剂或气溶胶 形式；或皮肤给药，例如局部软膏、乳液、洗液、凝胶或喷雾剂，或经 皮下斑点。

组合物可方便地以单位剂量形式给药，可通过制药领域已知的任何 方法制备，例如Remington:The Science and Practice of Pharmacy，20^thed；gennaro，A.R.，Ed.；Lippincott Williams & Wilkins:Philadelphia，PA， 2000中所述。

优选的制剂包括药物组合物，其中本发明的化合物配制成用于口服 或肠胃外给药。

用于口服给药，片剂、丸剂、粉剂、胶囊、锭剂等，可含有一种或 多种任一如下成分或类似性质的化合物:粘合剂，例如微晶纤维素或黄 蓍胶；稀释剂，例如淀粉或乳糖；崩解剂，例如淀粉和纤维素衍生物； 润滑剂，例如硬脂酸镁；滑动剂，例如胶体二氧化硅；增甜剂，例如蔗 糖或糖精；或调味剂，例如薄荷油或甲基水杨酸酯。胶囊可以是硬胶囊 或软胶囊形式，它们通常由凝胶珠任选与增塑剂混合制备，以及淀粉胶 囊。此外，剂量单位形式可含有各种改进剂量单位物理形式的其它材料， 例如糖、虫漆或肠溶剂的涂层。其它口服剂量形式糖浆或酏剂可含有增 甜剂、防腐剂、染料、着色剂和香料。此外，活性化合物可加入快速溶 解、改性释放或延迟释放制剂和配方中，其中该延迟释放配方优选是双 峰的。优选的片剂含有任何组合的乳糖、玉米淀粉、硅酸镁、交联羧甲 基纤维素钠、聚维酮、硬脂酸镁或滑石。

用于肠胃外给药的液体制剂包括无菌含水或非水溶液、悬浮液或乳 液。液体组合物还可包括粘合剂、缓冲剂、防腐剂、螯合剂、增甜剂、 香料和着色剂等。非水溶剂包括酒精、丙二醇、聚乙二醇、植物油，例 如橄榄油、和有机酯，例如乙基油酸酯。含水载体包括酒精和水的混合 物、缓冲介质和盐水。尤其是生物相容的、生物可降解的交酯聚合物、 交酯/乙交酯共聚物或聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物可以是有用的赋形剂以 控制活性化合物的释放。静脉内赋形剂可包括液体和营养补充物、电解 质补充物，例如基于Ringer’s葡萄糖的物质等。其它用于这些活性化合 物的潜在有用的肠胃外输送体系包括乙烯-乙烯基乙酸酯共聚物微粒、渗 透泵、可植入输液体系和脂质体。

给药的其它方式包括用于吸入的配方，其包括用于干粉、气溶胶或 液滴的手段。它们可以是含有例如聚氧乙烯-9-月桂基醚、甘胆酸酯和脱 氧胆酸酯的含水溶液，或用于鼻滴液形式给药的油质溶液或作为鼻内适 用的凝胶。用于颊给药的制剂包括，例如糖锭或锭剂，还可包括香料基 质，例如蔗糖或阿拉伯树胶，和其它赋形剂，例如甘胆酸酯。适用于直 肠给药的配方优选作为单位剂量栓剂存在，其含有固体基质载体，例如 可可脂，或包括水杨酸酯。用于皮肤局部适用的配方采取软膏、乳液、 洗液、浆、凝胶、喷雾剂、气溶胶或油形式。可使用的载体包括凡士林 油、羊毛脂、聚乙二醇、醇或其组合。适用于经皮给药的配方可作为离 散斑片存在，可以是溶解和/或分散在聚合物或粘合剂中的亲脂性乳液或 缓冲的含水溶液。

附图

附图1a表示huB4-SPDB-实施例16化合物对抗原阴性BJAB细胞和 抗原阴性MOLT-4细胞的体外效力。

附图1b表示huB4-SMCC-实施例16化合物对抗原阴性BJAB细胞 和抗原阴性MOLT-4细胞的体外效力。

附图1c表示实施例16的游离化合物对BJAB和MOLT-4细胞的体 外效力。

附图2a表示huB4-SPDB-实施例17化合物对抗原阴性BJAB细胞和 抗原阴性MOLT-4细胞的体外效力。

附图2b表示huB4-SMCC-实施例17化合物对抗原阴性BJAB细胞 和抗原阴性MOLT-4细胞的体外效力。

附图2c表示实施例17的游离化合物对BJAB和MOLT-4细胞的体 外效力。

附图3a表示huMy9-6-SPDB-实施例16化合物对抗原阳性HL60/GC 细胞和抗原阴性Ramos细胞的体外效力。

附图3b表示实施例16的游离化合物对HL60/GC细胞和Ramos细 胞的体外效力。

发明进一步通过如下实施例的描述说明，但不受其限制。

实验部分

方法A1:高压液相色谱-质谱(LCMS)

使用Micromass MassLynx软件，分析在带有THERMOHypersilgold C18 3μm柱(50 x 3mm)的Agilent 1100系列HPLC中进行，采用(A)乙腈 和(B)水/0.1％甲酸的混合物以0.8mL/分钟的流量进行梯度洗脱(梯度:5％ A:95％B上升至95％A:5％ B，超过5分钟，95％ A:5％B 0.5分钟， 95％ A:5％B下降至5％ A:95％B超过1分钟，5％ A:95％B 0.5分钟)； 带有Electrospray(正和负离子化)的Waters-Micromass Platform I、 Platform II或ZQ分光光度仪；串联Diode Array(190-490nm)；辅助检测 器Sedere(France)model SEDEX 65 Evaporative Light Scattering(ELS)检测 器。

方法A2:高压液相色谱-质谱(LCMS)

使用Micromass MassLynx软件，分析在带有WATERS XBridge C18 3，5μm柱(100 x 3mm)的Waters AllianceHPLC中进行，采用(A)甲醇和(B) 水/0.1％甲酸的混合物以1.1mL/分钟的流量进行梯度洗脱(梯度:5％ A: 95％ B上升至95％ A:5％ B，超过10分钟，95％ A:5％ B下降至5％ A: 95％ B超过1分钟，5％ A:95％ B 2分钟)；带有Electrospray(正和负离 子化)的Waters-Micromass Platform II分光光度仪；串联Diode Array(190-500nm)；辅助检测器Sedere(France)Model SEDEX 85 Evaporative Light Scattering(ELS)检测器。

方法A3:高压液相色谱-质谱(LCMS)

使用Micromass MassLynx软件，分析在带有XBridge C18 2.5μm柱 (50 x 3mm)的Agilent 1100系列HPLC中进行，采用(A)乙腈和(B)水/0.1％ 甲酸的混合物以1.1mL/分钟的流量进行梯度洗脱(梯度:5％ A:95％ B 上升至100％ A，超过5分钟，100％ A 0.5分钟，100％ A下降至5％ A: 95％ B超过1分钟，5％ A:95％ B 0.5分钟)；带有Electrospray的 Waters-Micromass ZQ分光光度仪；串联Diode Array(210-254nm)。

方法B:高压液相色谱(HPLC)纯化

HPLC纯化用Macherey Nagel Nucleodur C18gravity 5μM柱 (21 x 100mm，目录编号762101)进行，用(A)乙腈和(B)水的混合物以 15mL/分钟流量(方法B1)或20mL/分钟(方法B2)洗脱(梯度:5％ A:95％ B 5分钟，5％ A:95％ B上升至100％ A超过20分钟，100％ A8分钟，100％ A至5％ A:95％ B超过1分钟，5％ A:95％ B 11分钟)。

方法C:电子电离(EI)质谱

EI质谱用Finnigan SSQ 7000质谱仪(E1型:70eV，离子源温度＝150 ℃，直接输入)进行。

方法D:化学电离(CI)质谱

CI质谱用Finnigan SSQ 7000质谱仪(氨)记录。

方法E:¹H核磁共振(NMR)光谱

1HNMR光谱用Bruker Avance Drx-500、Bruker Avance Drx-400或 Bruker Avance DRX-300记录。

方法F:高压液相色谱(HPLC)纯化

HPLC纯化用Macherey Nagel VP 250/40mm NUCLEODURgRAVITY 100-10 C18(目录编号762250)进行，以70mL/分钟的流量用(A)乙腈和(B) 水/HCOONH₄ 0，01m/NH4OH pH9-10的混合物洗脱(梯度:10％ A:90％ B 3 分钟，10％ A:90％ B上升至95％ A:5％ B超过37分钟，95％ A:5％ B 8分 钟，95％ A:5％B 至10％ A:90％B 超过1分钟，10％ A:90％B 1分钟)。

方法G1:高压液相色谱-质谱(LCMS)

使用Micromass MassLynx软件，分析在带有Acquity UPLC BEH C18 1，7μm柱(2.1 x 100mm)Acquity UPLC进行，以1.1mL/分钟的流量用(A) 乙腈和(B)水/0.1％甲酸的混合物进行梯度洗脱(梯度:5％ A:95％ B上升 至95％ A:5％ B超过4.7分钟，95％ A:5％ B下降至5％ A:95％ B超过 0.5分钟，5％ A:95％ B 0.8分钟)；带有Electrospray的Quattro Premier 分光仪；串联Diode Array(210-400nm)。

方法G2:高压液相色谱-质谱(LCMS)

使用Micromass MassLynx软件，分析在带有Acquity UPLC BEH C18 1，7μm柱(2.1 x 100mm)的Acquity UPLC进行，以0.6mL/分钟的流量用(A) 乙腈和(B)水/0.1％甲酸的混合物进行梯度洗脱(梯度:5％ A:95％ B上升 至95％ A:5％ B超过10分钟，95％ A:5％ B下降至5％ A:95％ B超过1 分钟，5％ A:95％ B 2分钟)；带有Electrospray的Quattro Premier分光仪； 串联Diode Array(210-400nm)。

方法H:高压液相色谱(HPLC)纯化方法

HPLC纯化用带有Kromasil 16μm C18柱(250 x 21.2mm，PN A0490- 250 x 212，Lot.No.DT0259，SN 9772196)的VarianHPLC进行，以20mL/ 分钟的流量用(A)水和(B)乙腈的混合物洗脱。收集时间为80秒。化合物 的质谱用Bruker Esquire 3000装置获得，NMR谱用400MHz操作的 Bruker Avance分光仪记录。

洗脱柱的梯度:

1.8，8’-[5-(N-4-甲基二硫基-4，4-二甲基丁酰基)氨基-1，3-苯二基二(亚甲氧 基)]-二[7-甲氧基-2-亚甲基-1，2，3，11a-四氢-5H-吡咯并[2，1-c][1，4]苯并二 氮杂-5-酮]纯化

55％ A:45％ B 8分钟，55％ A:45％ B至50％ A:50％ B超过14分 钟，50％ A:50％ B至10％ A:90％ B超过4分钟，10％ A:90％ B 5分钟， 10％ A:90％ B至55％ A:45％ B超过1分钟，55％ A:45％ B 3分钟。

2.8，8’-[5-(N-4-巯基-4，4-二甲基丁酰基)氨基-1，3-苯二基二(亚甲氧基)]-二 [7-甲氧基-2-亚甲基-1，2，3，11a-四氢-5H-吡咯并[2，1-c][1，4]苯并二氮杂 -5-酮]纯化

60％ A:40％ B 4分钟，60％ A:40％ B至55％ A:45％ B超过5分 钟，55％ A:45％ B 4分钟，55％ A:45％ B至50％ A:50％ B超过13分 钟，50％ A:50％ B至10％ A:90％ B超过10秒，10％ A:90％ B 5分钟， 10％ A:90％ B至60％ A:40％ B超过10秒，60％ A:40％ B for 3分钟。

3.8，8’-[5-(N-甲基-N-(2-甲基二硫基-212-二甲基乙基)氨基-1，3-苯二基(亚 甲氧基)]-二[7-甲氧基-2-亚甲基-1，2，3，11a-四氢-5H-吡咯并[2，1-c][1，4]苯 并二氮杂-5-酮]纯化

60％ A:40％ B 8分钟，60％ A:40％ B至45％ A:55％ B超过16分 钟，45％ A:55％ B至10％ A:90％ B超过2分钟，10％ A:90％ B 5分钟， 10％ A:90％ B至60％ A:40％ B超过1分钟，60％ A:40％ B 3分钟。

4.8，8’-[5-(N-甲基-N-(2-巯基-2，2-二甲基乙基)氨基-1，3-苯二基(亚甲氧 基)]-二[7-甲氧基-2-亚甲基-1，2，3，11a-四氢-5H-吡咯并[2，1-c][1，4]苯并二 氮杂-5-酮]纯化

65％ A:35％ B至60％ A:40％ B超过8分钟，60％ A:40％ B至50％ A:50％ B超过19分钟，50％ A:50％ B至10％ A:90％ B超过10秒，10％ A:90％ B 5分钟，10％ A:90％ B至65％ A:35％ B超过10秒，65％ A: 35％ B 3分钟。

实施例1:8，8’-[1，3-苯二基二(亚甲氧基)]-二[(S)-2-亚乙-(E)-基-7-甲氧基 -1，2，3，11a-四氢-5H-吡咯并[2，1-c][1，4]苯并二氮杂-5-酮]

将碳酸钾(22.8mg)、α，α’-二溴-m-二甲苯(7.3mg)和碘化钾(9.1mg)加 入pre-茅屋霉素(15mg)在二甲基甲酰胺(0.5mL)中的搅拌溶液中。反应物 在30℃搅拌20小时，过滤出固体，用二甲基甲酰胺(0.2mL)洗涤两次， 随后丢弃。向混合的二甲基甲酰胺溶液中加入水(0.4mL)，得到的溶液注 射进行方法B1的HPLC纯化。合并合适的馏分，在Jouan Model RC10.10 装置中通过离心蒸发浓缩得到8，8’-[1，3-苯二基二(亚甲氧基)]-二[(S)-2- 亚乙-(E)-基-7-甲氧基-1，2，3，11a-四氢-5H-吡咯并[2，1-c][1，4]苯并二氮杂 -5-酮]白色粉末(3.33mg):

LC/MS(方法A1，Platform II):ES:m/z＝647MH⁺

                           保留时间＝3.53分钟

¹H N.M.R.(500MHz，CDCl₃-d1，δ ppm):1，75(d，J＝7，0Hz，6H)；2，96(m， 4H)；3，89(m，2H)；3，96(s，6H)；4，27(s b，4H)；5，17(d，J＝12，5Hz，2H)； 5，23(d，J＝12，5Hz，2H)；5，60(m，2H)；6，85(s，2H)；7，36-7，43(m，3H)；7， 51(s b，1H)；7，53(s，2H)；7，63(d，J＝4，5Hz，2H)。

实施例2:8，8’-[5-甲氧基-1，3-苯二基二(亚甲氧基)]-二[(S)-2-亚乙-(E)-基 -7-甲氧基-1，2，3，11a-四氢-5H-吡咯并[2，1-c][1，4]苯并二氮杂-5-酮]

根据制备8，8’-[1，3-苯二基二(亚甲氧基)]-二[(S)-2-亚乙-(E)-基-7-甲 氧基-1，2，3，11a-四氢-5H-吡咯并[2，1-c][1，4]苯并二氮杂-5-酮](实施例1) 的方法，以1，3-二-溴甲基-5-甲氧基-苯为原料可制备8，8’-[5-甲氧基-1，3- 苯二基二(亚甲氧基)]-二[(S)-2-亚乙-(E)-基-7-甲氧基-1，2，3，11a-四氢-5H- 吡咯并[2，1-c][1，4]苯并二氮杂-5-酮]:

LC/MS(方法A1，Platform II):ES:m/z＝677MH⁺

                           保留时间＝4.17分钟

¹H N.M.R.(300MHz，CDCl₃-d1，δ ppm):1，75(d，J＝7，0Hz，6H)；2，96(m， 4H)；3，81(s，3H)；3，89(m，2H)；3，96(s，6H)；4，26(s b，4H)；5，14(d， J＝12，5Hz，2H)；5，21(d，J＝12，5Hz，2H)；5，60(m，2H)；6，82(s，2H)；6，95(s b， 2H)；7，07(s b，1H)；7，53(s，2H)；7，63(d，J＝4，5Hz，2H)。

1，3-二-溴甲基-5-甲氧基-苯可如下制备:

在氩气中，将四溴化碳(663mg)加入1-溴甲基-3-羟基甲基-5-甲氧基- 苯(420mg)在无水二氯甲烷(10mL)中的搅拌溶液中，在0℃冷却得到的溶 液，滴加三苯基膦(500mg)在无水二氯甲烷(10mL)中的溶液。反应混合 物在室温下搅拌20小时，随后真空浓缩至残余物。残余物用硅胶色谱 法(Merck SuperVario Flash 30g柱，Si60 15-40μm，用二氯甲烷/庚烷 40:60洗脱)纯化得到1，3-二-溴甲基-5-甲氧基-苯(170mg):

El(方法C):m/z＝292m⁺

          m/z＝213[M-Br]⁺

          m/z＝134[213-Br]⁺

¹H N.M.R.(400MHz，DMSO-d₆，δppm):3，77(s，3H)；4，65(s，4H)；6，98(s b， 2H)；7，10(s b，1H)。

1-溴甲基-3-羟基甲基-5-甲氧基-苯可如下制备:

在氩气中，将四溴化碳(3.47g)加入1，3-二羟基甲基-5-甲氧基-苯 (800mg)在无水二氯甲烷(16mL)中的搅拌溶液中，在0℃冷却得到的溶 液，滴加三苯基膦(2.68g)在无水二氯甲烷(16mL)中的溶液。反应混合物 在室温下搅拌20小时，随后真空浓缩至残余物。残余物用硅胶色谱法 (Merck SuperVarioFlash 90g柱，Si60 15-40μm，用甲醇/二氯甲烷4:96洗 脱)纯化得到1-溴甲基-3-羟基甲基-5-甲氧基-苯(420mg):

EI(方法C):m/z＝230m⁺

          m/z＝151[M-Br]⁺

¹H N.M.R.(400MHz，DMSO-d₆，δppm):3，75(s，3H)；4，46(d b，J＝5，5Hz， 2H)；4，65(s，2H)；5，22(t b，J＝5，5Hz，1H)；6，83(s b，1H)；6.88(s b，1H)； 6，97(s b，1H)。

实施例3:8，8’-[1，5-戊二基二(氧基)]-二[(S)-2-亚乙-(E)-基-7-甲氧基 -1，2，3，11a-四氢-5H-吡咯并[2，1-c][1，4]苯并二氮杂-5-酮]

将碳酸钾(22.8mg)和1，5-二碘代戊烷(8.2μL)加入pre-茅屋霉素 (15mg)在二甲基甲酰胺(0.5mL)中的搅拌溶液中，反应物在室温下搅拌 20小时，加入附加部分的碳酸钾(8mg)。反应物再在室温下搅拌20小时。

过滤出固体，二甲基甲酰胺溶液根据方法B2注射进行HPLC纯化， 合并合适馏分，用Jouan Model RC10.10.装置离心蒸发浓缩得到 8，8’-[1，5-戊二基二(氧基)]-二[(S)-2-亚乙-(E)-基-7-甲氧基-1，2，3，11a-四氢 -5H-吡咯并[2，1-c][1，4]苯并二氮杂-5-酮]白色粉末(4mg):

LC/MS(方法A2):ES:m/z＝613MH⁺

              保留时间＝9.04分钟

¹H N.M.R.(500MHz，CDCl₃-d1，δppm):1，66(m部分掩蔽，2H)；1，75(d b， J＝7，0Hz，6H)；1，96(m，4H)；2，97(d b，J＝7，0Hz，4H)；3.89(m，2H)；3，94(s， 6H)；4，06(m，2H)；4，13(m，2H)；4，26(s b，4H)；5，60(m，2H)；6，80(s，2H)； 7，50(s，2H)；7，66(d，J＝4，5Hz，2H)。

实施例4:8，8’-[1，4-丁二基二(氧基)]-二[(S)-2-亚乙-(E)-基-7-甲氧基 -1，2，3，11a-四氢-5H-吡咯并[2，1-c][1，4]苯并二氮杂-5-酮]

根据制备8，8’-[1，5-戊二基二(氧基)]-二[(S)-2-亚乙-(E)-基-7-甲氧基 -1，2，3，11a-四氢-5H-吡咯并[2，1-c][1，4]苯并二氮杂-5-酮](实施例3)的方 法，以1，4-二碘代丁烷为原料，可制备8，8’-[1，4-丁二基二(氧基)]-二[(S)-2- 亚乙-(E)-基-7-甲氧基-1，2，3，11a-四氢-5H-吡咯并[2，1-c][1，4]苯并二氮杂 -5-酮]:

LC/MS(方法A1，Platform II):ES:m/z＝599MH⁺

                           m/z＝318，5(M+H+K)²⁺/2

                           保留时间＝3.23分钟

¹H N.M.R.(500MHz，CDCl₃-d1，δppm):1，75(d b，J＝7，0Hz，6H)；2，10(m， 4H)；2，98(d b，J＝7，0Hz，4H)；3，90(m，2H)；3，93(s，6H)；4，11(m，2H)； 4，20(m，2H)；4，27(s b，4H)；5，60(m，2H)；6，82(s，2H)；7，50(s，2H)；7，66(d， J＝4，5Hz，2H)。

实施例5:8，8’-[3-甲基-1，5-戊二基二(氧基)]-二[(S)-2-亚乙-(E)-基-7-甲氧 基-1，2，3，11a-四氢-5H-吡咯并[2，1-c][1，4]苯并二氮杂-5-酮]

根据制备8，8’-[1，3-苯二基二(亚甲氧基)]-二[(S)～2-亚乙-(E)-基-7-甲 氧基-1，2，3，11a-四氢-5H-吡咯并[2，1-c][1，4]苯并二氮杂-5-酮](实施例1) 的方法，以1，5-二溴-3-甲基戊烷为原料，可制备8，8’-[3-甲基-1，5-戊二基 二(氧基)]-二[(S)-2-亚乙-(E)-基-7-甲氧基-1，2，3，11a-四氢-5H-吡咯并[2，1 -c][1，4]苯并二氮杂-5-酮]:

LC/MS(方法A1，Platform II):ES:m/z＝627MH⁺

                           保留时间＝3.92分钟

实施例6:8，8’-[2，6-吡啶二基二(氧基)]-二[(S)-2-亚乙-(E)-基-7-甲氧基 -1，2，3，11a-四氢-5H-吡咯并[2，1-c][1，4]苯并二氮杂-5-酮]

根据制备8，8’-[1，3-苯二基二(亚甲氧基)]-二[(S)～2-亚乙-(E)-基-7-甲 氧基-1，2，3，11a-四氢-5H-吡咯并[2，1-c][1，4]苯并二氮杂-5-酮](实施例1) 的方法，以2，6-二-溴甲基-吡啶为原料可制备8，8’-[2，6-吡啶二基二(氧 基)]-二[(S)-2-亚乙-(E)-基-7-甲氧基-1，2，3，11a-四氢-5H-吡咯并[2，1-c][1，4] 苯并二氮杂-5-酮]:

LC/MS(方法A1，ZQ):ES:m/z＝648MH⁺

                  保留时间＝3.21分钟

¹H N.M.R.(400MHz，CDCl₃-d1，δppm):1，75(d b，J＝6，5Hz，6H)； 2，94-2，99(m，4H)；3，90(m，2H)；3，99(s，6H)；4，27(s b，4H)；5，32(s，4H)； 5，60(m，2H)；6，86(s，2H)；7，48(d，J＝8，0Hz，2H)；7，56(s，2H)；7，64(d， J＝4，5Hz，2H)；7，74(t，J＝8，0Hz，1H)。

实施例7:8，8’-[4-(3-叔丁氧基羰基氨基丙氧基)-2，6-吡啶二基二(亚甲氧 基)]-二[(S)-2-亚乙-(E)-基-7-甲氧基-1，2，3，11a-四氢-5H-吡咯并[2，1-c][1，4] 苯并二氮杂-5-酮]可如下制备:

向pre-茅屋霉素(30mg)在二甲基甲酰胺(0.5mL)中的搅拌溶液中加 入碳酸钾(45.7mg)、4-(3-叔丁氧基羰基氨基丙氧基)-2，6-二(甲苯磺酰氧基 甲基)-吡啶(41mg)在二甲基甲酰胺(0.5mL)中的溶液和碘化钾(18.3mg)。 反应物在30℃搅拌20小时，过滤出固体，用二甲基甲酰胺(0.2mL)洗涤。 向合并的二甲基甲酰胺溶液中加入水(0.5mL)，加入甲酸直至沉淀完全消 失。得到的溶液根据方法B1注射进行HPLC纯化，合并合适的馏分， 用Jouanmodel RC10.10.装置通过离心蒸发浓缩得到8，8’-[4-(3-叔丁氧基 羰基氨基丙氧基)-2，6-吡啶二基二(亚甲氧基)]-二[(S)-2-亚乙-(E)-基-7-甲 氧基-1，2，3，11a-四氢-5H-吡咯并[2，1-c][1，4]苯并二氮杂-5-酮](8.3mg)。 LC/MS(方法A1，Platform I):ES:m/z＝857MH⁺+2H₂O

                        m/z＝839MH⁺+H₂O

                        m/z＝821MH⁺

                        m/z＝721[M-C₅O₂H₈]+H⁺

                        保留时间＝3.67分钟

¹H N.M.R.(500MHz，CD3CO2D-d4，δ ppm):1，41(s，9H)；1，71(d，J＝6，5Hz， 6H)；2，08(m，2H)；2，95(m，4H)；3，34(m，2H)；3，90(s，6H)；4，06(m，2H)； 4，18(m，2H)；4，24-4，36(m，4H)；4，43(t，J＝6，0Hz，2H)；5，50(s b，4H)； 5，61(m，2H)；6，80-7，70(m very b，2H)；6，95(s b，2H)；7，48-7，58(m，4H)。

4-(3-叔丁氧基羰基氨基丙氧基)-2，6-二(甲苯磺酰氧基甲基)-吡啶可 如下制备:

向4-(3-叔丁氧基羰基氨基丙氧基)-2，6-二(羟基甲基)-吡啶(76mg)在 二氯甲烷(0.7mL)中的预冷却(0℃)溶液中加入氢氧化钾(30mg)在水 (0.3mL)中的溶液。加入甲苯磺酰氯(93.7mg)，得到的多相混合物剧烈振 荡1小时，随后用二氯甲烷和水洗涤入分液漏斗中。分层，水层用二氯 甲烷提取三次，合并的有机溶液用硫酸镁干燥，真空浓缩至残余物。残 余物用硅胶色谱法(Interchrom Puriflash 10g柱，SiOH 15-35μm)纯化，用 庚烷(A)和乙酸乙酯(B)的混合物梯度洗脱(梯度:90％ A:10％B上升至 50％A:50％B)得到4-(3-叔丁氧基羰基氨基丙氧基)-2，6-二(甲苯磺酰氧 基甲基)-吡啶(56mg):

LC/MS(方法A1，Platform I):ES:m/z＝621 MH⁺

                          保留时间＝4.90分钟

4-(3-叔丁氧基羰基氨基丙氧基)-2，6-二(羟基甲基)-吡啶可如下制备:

向4-(3-叔丁氧基羰基氨基丙氧基)-吡啶-2，6-二羧酸二乙基酯(150mg) 在无水乙醇(5mL)中的溶液中加入硼氢化钠(43mg)和氯化钙(128mg)。在 搅拌4小时后，氢气逸出停止，反应用水停止。减压蒸发溶剂，残余物 用二氯甲烷和水洗涤入分液漏斗中。分层，水层用二氯甲烷提取三次， 合并的有机溶液用硫酸镁干燥，真空浓缩得到4-(3-叔丁氧基羰基氨基丙 氧基)-2，6-二(羟基甲基)-吡啶(80mg):

LC/MS(方法A1，ZQ):ESm/z＝313MH⁺

                  保留时间＝1.90分钟

¹H N.M.R.(400MHz，DMSO-d₆，δ ppm):1，37(s，9H)；1，84(m，2H)；3，08(q， J＝6，5Hz，2H)；4，05(t，J＝6，5Hz1 2H)；4，45(d，J＝6，0Hz，4H)；5，32(t， J＝6，0Hz，2H)；6，84(s，2H)；6，90(t b，J＝6，5Hz，1H)。

4-(3-叔丁氧基羰基氨基丙氧基)-吡啶-2，6-二羧酸二乙基酯可如下制 备:

将白屈氨酸二乙基酯(Scrimin，P.；Tecilla，P.；Tonellato，U.； Vendrame，T.J.Org.Chem.1989，54，5988)(150mg)溶解无水二甲基甲酰 胺(2mL)中，加入3-(叔丁氧基羰基-氨基)-丙基溴(164mg)和碳酸钾 (130mg)。得到的混合物在70℃搅拌15小时，用饱和氯化铵水溶液停止 反应，随后用乙酸乙酯洗涤入分液漏斗中。分层，水层用乙酸乙酯提取 3次，合并的有机溶液用硫酸镁干燥，真空浓缩至残余物。残余物用硅 胶色谱法(Merck SuperVarioFlash 30g柱，Si60 15-40μm)纯化，用庚烷(A) 和乙酸乙酯(B)的混合物梯度洗脱(梯度:60％ A:40％ B上升至50％ A: 50％ B)，得到4-(3-叔丁氧基羰基氨基丙氧基)-吡啶-2，6-二羧酸二乙基酯 (150mg):

C1(方法D):m/z＝397MH⁺

¹H N.M.R.(400MHz，DMSO-d₆，δ ppm):1，34(t，J＝7，0Hz，6H)；1，36(s，9H)； 1，86(m，2H)；3，10(q，J＝6，5Hz，2H)；4，21(t，J＝6，5Hz，2H)；4，37(q，J＝7，0Hz， 4H)；6，89(m b，1H)；7，71(s，2H)。

实施例8:8，8’-[5-(3-氨基丙氧基)-1，3-苯二基二(亚甲氧基)]-二[(S)-2-亚乙 -(E)-基-7-甲氧基-1，2，3，11a-四氢-5H-吡咯并[2，1-c][1，4]苯并二氮杂-5- 酮]可如下制备:

向pre-茅屋霉素(21mg)在二甲基甲酰胺(0.7mL)中的搅拌溶液中加 入碳酸钾(32mg)、1-(3-烯丙基氧基羰基氨基-丙氧基)-3，5-二-(溴甲基)-苯 (16.2mg)和碘化钾(12.8mg)。反应物在30℃搅拌20小时，过滤出固体， 用二甲基甲酰胺(0.2mL)洗涤两次，随后丢弃。向合并的二甲基甲酰胺溶 液中加入水(0.5mL)，过滤出生成的沉淀，用水洗涤，用Jouan Model RC10.10离心蒸发干燥。

向溶解在二甲基甲酰胺(0.8mL)中的粗化合物(27mg)中加入四(三苯 基膦)钯(2mg)、三苯基膦(0.9mg)和吡咯烷(5.6μL)，在30℃搅拌15小时 后，加入四(三苯基膦)钯(2mg)、三苯基膦(1mg)和吡咯烷(2.8μL)，反应 混合物在室温下再搅拌15小时。向二甲基甲酰胺溶液中加入水(0.4mL)， 加入甲酸直至沉淀完全消失。得到的溶液根据方法B1注射进行HPLC 纯化，收集合适的馏分，用Jouan Model RC10.10.装置离心蒸发浓缩得 到8，8’-[5-(3-氨基丙氧基)-1，3-苯二基二(亚甲氧基)]-二[(S)-2-亚乙-(E)-基 -7-甲氧基-1，2，3，11a-四氢-5H-吡咯并[2，1-c][1，4]苯并二氮杂-5- 酮](0.2mg)。

LC/MS(方法A1，Platform II)ES:m/z＝800MH⁺

                             保留时间＝2.84分钟

1-(3-烯丙基氧基羰基氨基-丙氧基)-3，5-二-(溴甲基)-苯可如下制备:

向1-(3-烯丙基氧基羰基氨基-丙氧基)-3，5-二-(羟基甲基)-苯(70mg) 在二氯甲烷(3mL)中的悬浮液中加入四溴化碳(248mg)和三苯基膦 (199mg)在二氯甲烷(2mL)中的溶液。回流3小时后，反应混合物用硅胶 色谱法(Merck Super VarioFlash 25g柱，Si60 15-40μm)纯化，用二氯甲烷 洗脱，得到1-(3-烯丙基氧基羰基氨基-丙氧基)-3，5-二-(溴甲基)-苯 (52mg):

LC/MS(方法A1，Platform II):ESm/z＝420 MH⁺

                           保留时间＝450分钟

¹H N.M.R.(400MHz，DMSO-d₆，δppm):1，85(m，2H)；3，15(q，J＝6，5Hz， 2H)；3，99(t，J＝6，5Hz，2H)；4，46(d b，J＝5，5Hz，2H)；4，65(s，4H)；5，16(d b， J＝11，0Hz，1H)；5，26(d b，J＝17，5Hz，1H)；5，90(m，1H)；6，96(d，J＝1，5Hz， 2H)；7，09(t，J＝1，5Hz，1H)；7，29(t b，J＝6，5Hz，1H)。

1-(3-烯丙基氧基羰基氨基-丙氧基)-3，5-二-(羟基甲基)-苯可如下制 备:

将5-(3-邻苯二甲酰亚氨基-丙氧基)-1，3-(羟基甲基)-苯(1.45g)溶解在 二氯甲烷和乙醇的混合物(25mL，25:75)中。加入肼水合物(0.62mL)，反 应混合物回流1小时，真空除去溶剂，残余物溶解在二氯甲烷中。过滤 出不溶解残余物，用硅胶色谱法(Merck Super VarioPrep 70g柱，Si60 15-40μm)纯化，用甲醇/二氯甲烷，20:80，随后用氢氧化铵/甲醇/二氯甲 烷，0.5:25:75洗脱，得到适用于进一步转化的1-(3-氨基-丙氧基)-3，5-二 -(羟基甲基)-苯(1g)。

将1-(3-氨基-丙氧基)-3，5-二-(羟基甲基)-苯(100mg)样品溶解在甲醇 (5mL)中，向冷却的溶液(0℃)加入碳酸钠(120mg)在水(5mL)中的溶液和 烯丙基氯甲酸酯(42μL)。在0℃搅拌30分钟后，反应混合物在室温下再 搅拌15小时。真空除去溶剂，残余物用乙酸乙酯和水洗涤入分液漏斗 中，分层，水层用乙酸乙酯提取两次，真空浓缩得到5-(3-烯丙基氧基羰 基氨基-丙氧基)-2，6-二-(羟基甲基)苯(75mg):

E1(方法C):m/z＝295m⁺

          m/z＝142(M-C₈H₉O₃)+

          m/z＝41 C₃H₅⁺

¹H N.M.R.(300MHz，DMSO-d₆，δppm):1，85(m，2H)；3，14(q，J＝6，5Hz， 2H)；3，96(t，J＝6，5Hz，2H)；4，41-4，48(m，6H)；5，11(t部分掩蔽，J＝5，5Hz， 2H)；5，16(qd，J＝1，5 et 10，5Hz，1H)；5，26(qd，J＝1，5 et 17，0Hz，1H)； 5，90(m，1H)；6，72(s b，2H)；6，83(s b，1H)；7，26(t b，J＝6，5Hz，1H)。

5-(3-邻苯二甲酰亚氨基-丙氧基)-1，3-(羟基甲基)-苯可如下制备:

将3，5-二-羟基甲基苯酚(Felder，D.；Gutierrez Nava，m.；del Pilar Carreon，M.；Eckert，J.F.；Luccisano，M.；Schall，C；Masson，P.；Gallani，J. L；Heinrich，B.；Guillon，D.；Nierengarten，J.F.Helv.Chimica Acta 2002， 85，288)(2.35g)、N-(3-溴丙基)-邻苯二甲酰亚胺(4.49g)和碳酸钾(10.53g) 在乙腈(25mL)中混合，回流12小时。将反应混合物冷却到室温，减压 除去溶剂，残余物重新溶解在二氯甲烷中，过滤出不溶解残余物。滤液 用水洗涤，用硫酸镁干燥，真空浓缩得到残余物。残余物用硅胶色谱法 (Merck Super VarioPrep 90g柱，Si60 15-40μm)纯化，用甲醇/二氯甲烷4:96 洗脱，得到5-(3-邻苯二甲酰亚氨基-丙氧基)-1，3-(羟基甲基)-苯(1，45g): LC/MS(方法A1，Platform II):ESm/z＝342MH⁺

                         m/z＝324(MH⁺-H₂O)

                         保留时间＝2.90分钟

¹H N.M.R.(300MHz，DMSO-d₆，δppm):2，05(m，2H)；3，76(t，J＝6，5Hz，2H)； 3，99(t，J＝6，5Hz，2H)；4，40(d，J＝5，5Hz，4H)；5，09(t，J＝5，5Hz，2H)；6，59(s b， 2H)；6，82(s b，1H)；7，80-7，90(m，4H)。

实施例9:8，8’-[5-(N-甲基-3-叔丁氧基羰基氨基丙基)-1，3-苯二基二(亚甲 氧基)]-二[(S)-2-亚乙-(E)-基-7-甲氧基-1，2，3，11a-四氢-5H-吡咯并 [2，1-c][1，4]苯并二氮杂-5-酮]可如下制备:

向5-(N-甲基-3-叔丁氧基羰基氨基丙基)-1，3-二-(羟基甲基)-苯(50mg) 和三乙胺(113μL)在二氯甲烷(2mL)中的冷却(0℃)溶液中加入甲磺酰氯 (26μL)。30分钟后，反应混合物用水洗涤两次，得到的二氯甲烷溶液用 硫酸镁干燥，真空浓缩得到粘稠油(50.3mg)。

将pre-茅屋霉素(15mg)在二甲基甲酰胺(0.5mL)中的溶液加入粗化 合物(13mg)、碳酸钾(23mg)和碘化钾(9mg)，反应混合物在30℃搅拌20 小时。加入另外的粗化合物样品(6mg)，反应混合物在30℃再搅拌20小 时。过滤出固体，用二甲基甲酰胺(0.2mL)洗涤，随后丢弃。向合并的二 甲基甲酰胺溶液中加入水(0.4mL)、一滴甲酸和另外的水(1.5mL)。

过滤得到的悬浮液(2mL)样品，得到的固体真空干燥得到8，8’-[5-(N- 甲基-3-叔丁氧基羰基氨基丙基)-1，3-苯二基二(亚甲氧基)]-二[(S)-2-亚乙 -(E)-基-7-甲氧基-1，2，3，11a-四氢-5H-吡咯并[2，1-c][1，4]苯并二氮杂-5- 酮](3.1mg):

LC/MS(方法A1，Platform II):ES:m/z＝818MH⁺

                           保留时间＝4.11分钟

5-(N-甲基-3-叔丁氧基羰基氨基丙基)-1，3-二-(羟基甲基)-苯可如下 制备:

向5-(N-甲基-3-叔丁氧基羰基氨基丙基)-1，3-二羧酸二乙基酯(100mg) 在四氢呋喃(2mL)中的冷却溶液(-5℃)中缓慢加入氢化锂铝在乙醚中的 1M溶液(0.55mL)。在加完后，加入硫酸钠十水合物直到气体逸出停止。 过滤出固体，用乙酸乙酯洗涤两次，合适的有机溶液真空浓缩得到5-(N- 甲基-3-叔丁氧基羰基氨基丙基)-1，3-二-(羟基甲基)-苯(66.8mg)粘稠油: C1(方法D):m/z＝327mNH₄⁺

       m/z＝310MH⁺

       m/z＝271(MNH₄⁺-C₄H₈)

¹H N.M.R.(300MHz，DMSO-d₆，δppm):1，37(s b，9H)；1，75(m，2H)； 2，45-2，54(m掩蔽，2H)；2，77(s，3H)；3，18(t，J＝7，0Hz，2H)；4，45(d， J＝5，5Hz，4H)；5，08(t，J＝5，5Hz，2H)；7，00(s b，2H)；7，08(s b，1H)。

5-(N-甲基-3-叔丁氧基羰基氨基丙基)-苯-1，3-二羧酸二基酸酯可如 下制备:

向5-(N-甲基-3-叔丁氧基羰基氨基丙炔-1-基)-苯-1，3-二羧酸二乙基 酯(890mg)在甲醇(10mL)中的溶液中加入钯10％/碳(89mg)，溶液在氢气 气氛(1bar)下在室温下搅拌18小时。过滤出固体，真空除去溶剂得到 5-(N-甲基-3-叔丁氧基羰基氨基丙基)-苯-1，3-二羧酸二乙基酯(767mg)黄 色油:

EI(方法C):m/z＝365M⁺

          m/z＝309(M-C₄H₈)⁺

          m/z＝265(m/z＝309-CO₂)⁺

          m/z＝57 C₄H₉⁺

          m/z＝44 C₂H₆N⁺

¹H N.M.R.(400MHz，DMSO-d₆，δppm):1，32(s b，9H)；1，79(m，2H)；2，70(t， J＝7，0Hz，2H)；2，76(s，3H)；3，16(m，2H)；3，87(s，6H)；8，06(d，J＝2，0Hz， 2H)；8，32(t，J＝2，0Hz，1H)。

5-(N-甲基-3-叔丁氧基羰基氨基丙炔-1-基)-苯-1，3-二羧酸二乙基酯 可如下制备:

将5-三氟甲基磺酰氧基-间苯二酸二甲基酯(Bodwell，g.J.；Fleming， J.J.；Mannion，M.R.；Miller，D.O.J.Org.Chem.2000，65(17)，5360)(1g) 溶解在2mL乙腈中，加入N-甲基-N-叔丁氧基羰基-丙炔胺(Bradbury，B. J.；Baumgold，J.；Jacobsen，K.A.J.Med.Chem.1990，33(2)，741) (643mg)、双(三苯基膦)氯化钯(205mg)、碘化铜(56mg)和三乙胺(591mg)。 得到的混合物在室温下搅拌15小时，减压蒸发除去溶剂，残余物随后 用乙酸乙酯和水洗涤入分液漏斗。分层，水层用乙酸乙酯提取。合并的 有机溶液用饱和氯化钠水溶液洗涤，用硫酸镁干燥，真空浓缩得到残余 物。残余物用硅胶色谱法(Biotage FLASH 40+M 100g柱，SiOH 32-63μm， 用乙酸乙酯/庚烷，20:80洗脱)得到5-(N-甲基-3-叔丁氧基羰基氨基丙炔 -1-基)-苯-1，3-二羧酸二乙基酯(896mg):

¹H N.M.R.(300MHz，DMSO-d₆，δppm):1，43(s，9H)；2，90(s，3H)；3，90(s， 6H)；4，30(s，2H)；8，16(d，J＝1，5Hz，2H)；8，42(t，J＝1，5Hz，1H)。

实施例10:8，8’-{5-[3-(4-甲基-4-甲基二硫基-戊酰基氨基)-丙氧基]-1，3-苯 二基二(亚甲氧基)}-二[(S)-2-亚乙-(E)-基-7-甲氧基-1，2，3，11a-四氢-5H-吡 咯并[2，1-c][1，4]苯并二氮杂-5-酮]可如下制备:

向1-[3-(4-甲基-4-甲基二硫基-戊酰基氨基)-丙氧基]-3，5-二-(羟基甲 基)-苯(45mg)和三乙胺(49[mu]L)在二氯甲烷(1.5mL)中的冷却(0℃)溶液 中加入甲磺酰氯(19μL)。30分钟后，反应混合物用水洗涤两次，得到的 二氯甲烷溶液用硫酸镁干燥，真空浓缩得到粘稠油(39mg)。

向pre-茅屋霉素(26mg)在二甲基甲酰胺(0.9mL)中的溶液中加入碳 酸钾(40mg)、碘化钾(16mg)和粗化合物样品(31mg)，反应混合物在30℃ 搅拌20小时。加入另外的粗化合物样品(6mg)，反应混合物在30℃再搅 拌20小时。过滤出固体，用二甲基甲酰胺(0.3mL)洗涤，随后丢弃。将 水(1.6mL)加入合并的二甲基甲酰胺溶液中，过滤得到的固体，用水洗涤， 真空干燥得到残余物。残余物用硅胶色谱法(Interchrom Puriflash 2g柱， SiOH 15-35μm，用二氯甲烷/甲醇洗脱，95:5)，随后再次用硅胶色谱法 (Chromabond OH 2g柱，45μm洗脱)得到8，8’-{5-[3-(4-甲基-4-甲基二硫基 -戊酰基氨基)-丙氧基]-1，3-苯二基二(亚甲氧基)}-二[(S)-2-亚乙-(E)-基-7- 甲氧基-1，2，3，11a-四氢-5H-吡咯并[2，1-c][1，4]苯并二氮杂-5- 酮](0.2mg):

LC/MS(方法A1，Platform I):ES:m/z＝896MH⁺

                          保留时间＝4.09分钟

¹H N.M.R.(500MHz，CDCl₃-d1，δppm):1，29(s，6H)；1，75(d，J＝6，5Hz，6H)； 1，92-2，03(m，4H)；2，28(m，2H)；2，39(s，3H)；2，97(m，4H)；3，45(q， J＝6，0Hz，2H)；3，89(q，J＝5，5Hz，2H)；3，96(s，6H)；4，04(t，J＝5，0Hz，2H)； 4，27(s b，4H)；5，14(d，J＝12，5Hz，2H)；5，20(d，J＝12，5Hz，2H)；5，60(m， 2H)；5，84(t b，J＝6，0Hz，1H)；6，83(s，2H)；6，94(s，2H)；7，09(s，1H)；7，53(s， 2H)；7，64(d，J＝5，0Hz，2H)。

1-[3-(4-甲基-4-甲基二硫基-戊酰基氨基)-丙氧基]-3，5-二-(羟基甲基)- 苯

向1-(3-氨基-丙氧基)-3，5-二-(羟基甲基)-苯(50mg)在二甲基甲酰胺 (1mL)中的溶液中加入4-甲基-4-甲基二硫基-戊酸(44mg)，N，N’-二异丙基 碳化二亚胺(35mL)和1-羟基苯并三唑水合物(5.8mg)。在室温下15小时 后，将水加入反应混合物中，水溶液用乙酸乙酯提取两次。合并的有机 溶液用饱和氯化钠水溶液洗涤，用硫酸镁干燥，真空浓缩得到残余物。 残余物用硅胶色谱法(Interchrom Puriflash 5g柱，SiOH 15-35μm)纯化，用 甲醇/二氯甲烷，5:95洗脱，得到1-[3-(4-甲基-4-甲基二硫基-戊酰基氨 基)-丙氧基]-3，5-二-(羟基甲基)-苯(48mg):

LC/MS(方法A1，ZQ):ESm/z＝388MH⁺

                  保留时间＝3.03分钟

¹H N.M.R.(300MHz，DMSO-d₆，δppm):1，24(s，6H)；1，76-1，87(m，4H)； 2，16(m，2H)；2，40(s，3H)；3，19(q，J＝6，5Hz，2H)；3，95(t，J＝6，5Hz，2H)； 4，44(d b，J＝5，5Hz，4H)；5，12(d，J＝5，5Hz，2H)；6，73(s b，2H)；6，83(s b， 1H)；7，92(t b，J＝5，5Hz，1H)。

实施例11:原料产物和/或中间体的制备

向4-苄氧基-5-甲氧基-2-硝基苯甲酸(4.8g，16mmol)在无水二氯甲烷 (80mL)和THF(5mL)中的溶液中在室温下加入草酰氯(2.8mL，32mmol)和 DMF(30μL，0.38mmol)。在加入DMF后形成大量气泡，混合物搅拌过夜， 随后通过真空旋转蒸发除去溶剂。残余物通过加入无水二氯甲烷共同蒸 发一次以下，得到乙酰氯黄色固体。

向4-亚甲基-L-脯氨酸甲酯，化合物A(3.95g，15.5mmol)在无水 THF(80mL)中的溶液中在0℃加入三乙胺(6.7mL，48mmol)，2分钟后， 在10分钟内经导管在相同温度快速加入在无水THF(80mL)中的上述乙 酰氯。得到的黄色混浊溶液在0-5℃搅拌30分钟，随后在室温下搅拌4 小时。反应溶液用乙酸乙酯和水稀释，水层用乙酸乙酯提取两次，合并 的有机层用2％盐酸溶液和盐水洗涤，用无水硫酸镁干燥。过滤并除去 溶剂，残余物用快速色谱法(己烷/AcOEt，1:1，1:1.5)纯化得到(2S)-4-(亚 甲基)-1-[5-甲氧基-2-硝基-4-(苯基甲氧基)-苯甲酰基]-2-吡咯烷羧酸甲基 酯黄色固体(5.6g，y＝85％)。¹H NMR(400Hz，CDCl₃):化合物显示一对明显 的旋转异构体(rotomers)。δ 7.76(s，0.7H)，7.73(s，0.3H)，7.43-7.29(m，5H)， 6.83(s，0.7H)，6.80(s，0.3H)，5.17(s，1.4H)，5.16(s，0.6H)，5.10-4.89(m， 2.7H)，4.57(d，J＝16Hz，0.3H)，4.19-4.12(m，0.7H)，3.95-3.77(m，6.3H)， 3.57(s，1H)，3.06-2.96(m，1H)，2.73-2.62(m，1H)；¹³C NMR(400Hz，CDCl₃): 171.8，171.7，166.5，166.2，154.9，154.4，148.25，148.18，141.7，141.3， 137.19，137.13，135.3，135.2，128.7，128.43，128.41，127.5，127.3，109.5， 109.1，109.0，108.9，71.3，60.6，58.1，56.7，56.5，52.39，52.37，52.0，50.2， 37.1，35.5；

MS(ESI):m/z449.3(M+Na)⁺。

在-78℃30分钟内经注射泵向酯(3.15g，7.39mmol)在无水二氯甲烷 (9mL)和甲苯(27mL)中的溶液中滴加dibal-H(15mL，1.0m甲苯溶液)，混 合物在-78℃持续搅拌2小时，TLC(己烷/AcOEt，1:1.5)显示所述原料消 耗。反应在-78℃用甲醇(0.3mL，7.4mmol)停止，加入5％盐酸(20mL)，随 后加入AcOEt(50mL)。移去干冰/丙酮浴，混合物温热到0℃，搅拌15 分钟。水层用AcOEt提取两次，合并的有机层用冷5％盐酸和盐水洗涤， 用无水硫酸钠干燥。通过C盐过滤，除去溶剂，残余物用快速色谱法(己 烷/AcOEt，1:1，1:1.5，1:2，1:3，1:5，100％AcOEt)纯化得到(2S)-4-(亚甲 基)-1-[5-甲氧基-2-硝基-4-(苯基甲氧基)苯甲酰基]-2-吡咯烷甲醛蓬松黄 色固体(2.69g，y＝92％)。¹H NMR(400Hz，CDCl₃):化合物显示一对明显的 旋转异构体。δ 9.75(s，0.7H)，9.32(s，0.3H)，7.76(s，0.7H)，7.69(s，0.3H)， 7.45-7.31(m，5H)，6.85(s，0.7H)，6.80(s，0.3H)，5.19-4.82(m，4.7H)，4.56(d， J＝16Hz，0.3H)，4.14-3.79(m，5H)，2.99-2.68(m，2H)；¹³C NMR(400Hz， CDCl3):198.3，197.1，167.1，155.0，154.6，148.4，141.3，140.4，137.2， 135.2，128.7，128.5，128.4，127.5，126.9，126.6，109.8，109.4，109.3，109.2， 109.1.71.3，66.6，64.3，56.7，56.6，52.2，50.6，33.2，31.9；MS(ESI):m/z 419.2(M+Na)⁺。

方法1:向(2S)-4-(亚甲基)-1-[5-甲氧基-2-硝基-4-(苯基甲氧基)苯甲 酰基]-2-吡咯烷甲醛(1.0当量)在THF/H₂O(v/v，1.7:1，0.03m)中的溶液中 在室温下在2分钟内分批加入次硫酸钠(5-8当量)，混合物再搅拌6-20 小时，用TLC(己烷/AcOEt 1:2和CH₂Cl₂/MeOH 5:1)监测。在醛几乎消 耗后，反应用甲醇停止(与所使用THF大致相同的体积)。通过真空旋转 蒸发(温度<40℃)除去溶剂，残余物固体放置在高真空中使其完全干燥。 将固体悬浮在无水甲醇(0.03m)中，在室温下滴加AcCl(8-10当量)。在搅 拌15分钟后，过滤混浊的溶液，固体用无水甲醇洗涤。透明黄色滤液 在室温下搅拌1-2小时，用饱和碳酸氢钠骤冷。在经旋转蒸发除去大多 数甲醇后，残余物用二氯甲烷和水稀释。水层用AcOEt提取，合并的有 机层用无水硫酸钠干燥并过滤，除去溶剂，残余物用快速色谱法(己烷 /AcOEt，1:3，1:5)纯化得到(11aS)-7-甲氧基-2-亚甲基-8-(苯基甲氧 基)-1，2，3，11a-四氢-5H-吡咯并[2，1-c][1，4]苯并二氮杂-5-酮，70-85％收 率。NMR光谱与文献报导的一致。MS(ESI):m/z 371.2(M+Na)⁺。MS(ESI， 用CH₃OH):m/z 403.3(M+CH₃OH+Na)⁺。MS(ESI，用H₂O):m/z 389.2(M +H₂O+Na)⁺。

方法2:向(2S)-4-(亚甲基)-1-[5-甲氧基-2-硝基-4-(苯基甲氧基)苯甲 酰基]-2-吡咯烷甲醛(1.0当量)在THF/H₂O(v/v，3.2:1，0.03m)中的溶液中 在室温下在2分钟内分批加入次硫酸钠(6-8当量)，随后加入硫酸氢钠 (0.5-1.0当量)。混合物再搅拌12-20小时，用TLC(己烷/AcOEt 1:2和 CH₂Cl₂/MeOH 5:1)监测。在中间体[MS(ESI):459.0(M-H)^-]几乎消耗后， 反应用饱和碳酸氢钠骤冷至PH5-6。通过真空旋转蒸发(温度<40℃)除去 溶剂，残余物固体放置在高真空中使其完全干燥。将固体悬浮在无水甲 醇(0.03m)中，在室温下滴加AcCl(8-10当量)。在搅拌15分钟后，过滤 混浊的溶液，固体用无水甲醇洗涤。透明黄色滤液在室温下搅拌1-2小 时，用饱和碳酸氢钠骤冷。在经旋转蒸发除去大多数甲醇后，残余物用 二氯甲烷和水稀释。水层用AcOEt提取，合并的有机层用无水硫酸钠干 燥并过滤，除去溶剂，残余物用快速色谱法(己烷/Ac OEt，1:3，1:5)纯化 得到(11aS)-7-甲氧基-2-亚甲基-8-(苯基甲氧基)-1，2，3，11a-四氢-5H-吡咯 并[2，1-c][1，4]苯并二氮杂-5-酮，65-80％收率。

在室温下向原料(98mg，0.28mmol)在无水二氯甲烷(2mL)中的溶液 中加入新鲜混合的甲磺酸(2mL)在无水二氯甲烷(4mL)中的溶液。混合物 在室温下搅拌1.5小时，倾倒在冰(～30g)上，用饱和NaHCO3停止，用 二氯甲烷稀释。水层用二氯甲烷提取，合并的有机层用无水硫酸钠干燥， 过滤和除去溶剂。残余物用快速色谱法(CH₂Cl₂/MeOH，15:1)纯化得到产 物黄色固体(29mg)。上述水层在室温下搅拌过夜，用依次二氯甲烷和 AcOEt提取，合并的二氯甲烷和AcOEt用无水硫酸钠干燥，过滤和除去 溶剂得到(11 aS)-8-羟基-7-甲氧基-2-亚甲基-1，2，3，11a-四氢-5H-吡咯并 [2，1-c][1，4]苯并二氮杂-5-酮(25mg)。总收率是74％。¹H NMR(400Hz， CDCl₃):δ 7.65(d，J＝4.8Hz，1H)，7.48(s，1H)16.87(s，1H)，6.35(bs，1H)， 5.17(t，J＝1.6Hz，1H)，5.14(7，J＝1.6Hz，1H)，4.26(s，2H)，3.93(s，3H)， 3.87-3.83(m，1H)，3.12-3.05(m，1H)，2.91(d，J＝16Hz，1H)；MS(ESI):m/z 281.0(M+Na)⁺。MS(ESI，用水):m/z258.9(M+H)⁺，m/z 299.1(M+H₂O+ Na)⁺。

实施例12:8，8’-[5-乙酰基硫基甲基-1，3-苯二基二(亚甲氧基)]-二[(S)-2- 亚甲基-7-甲氧基-1，2，3，11a-四氢-5H-吡咯并[2，1-c][1，4]苯并二氮杂-5- 酮]

在0℃向三苯基膦(577mg，2.2mmol)在无水THF(5mL)中的溶液中滴 加偶氮二羧酸二乙酯(2.2m甲苯溶液，791μL，1.7mmol)，在0℃搅拌50 分钟后，滴加1，3，5-三(羟基甲基)苯(269mg，1.6mmol，使用前通过将三 甲基1，3，5-苯三羧酸与在THF中的氢化锂铝反应，用无水苯共同蒸发， 高真空干燥几小时制备)和硫代乙酸(108μL，1.45mmol)在无水THF(4mL) 中的溶液。1小时后，移去冰水浴，反应物在室温下搅拌15小时。通过 旋转蒸发真空除去溶剂，残余物用快速色谱法纯化得到5-乙酰基硫基甲 基-1，3-二(羟基甲基)-苯无水固体(110mg)。

¹H NMR(400Hz，CDCl₃):δ 7.13-6.99(m，3H)14.45(apt，J＝20.4Hz，4H)， 3.98(apt，J＝20.4Hz，4H)，3.73(bs，2H)，2.24(apt，J＝20.4Hz，3H)； MS(ESI):m/z 249.0(M+Na)⁺。

在0℃向三苯基膦(28mg，0.1mmol)在无水THF(0.3mL)中的溶液中 滴加偶氮二羧酸二异丙基酯(19μL，0.09mmol)，在0℃搅拌35分钟后， 加入(11aS)-8-羟基-7-甲氧基-2-亚甲基-1，2，3，11a-四氢-5H-吡咯并 [2，1-c][1，4]苯并二氮杂-5-酮，化合物5，(18mg，0.07mmol，在使用前用 无水苯共同蒸发，高真空干燥几小时)在无水THF(0.2mL)中的溶液。混 合物持续搅拌10分钟，随后加入在无水THF(0.2mL)中的5-乙酰基硫基 甲基-1，3-二(羟基甲基)-苯，化合物6，(6.6mg，0.03mmol，在使用前用无水 苯共同蒸发，高真空干燥几小时)。反应混合物在0℃搅拌35分钟，移 去冰水浴，溶液在室温下搅拌21小时。通过旋转蒸发真空除去溶剂， 残余物用快速色谱法纯化以得到粗产物，它进一步用制备HPLC(C18柱， CH₃CN/H₂O)纯化得到0.7mg8，8’-[5-乙酰基硫基甲基-1，3-苯二基二(亚甲 氧基)]-二[(S)-2-亚甲基-7-甲氧基-1，2，3，11a-四氢-5H-吡咯并[2，1-c][1，4]苯 并二氮杂-5-酮]，化合物7。MS(ESI，用H₂O):m/z 765.3(M+2H₂O+ Na)⁺，747.3(M+H₂O+Na)⁺，729.2(M+Na)⁺，707.3(M+H)⁺，663.2(M -Ac)^-。

实施例13 二-{2-[(S)-2-亚甲基-7-甲氧基-5-氧代-1，2，3，11a-四氢-5H-吡 咯并[2，1-c][1，4]苯并二氮杂-8-基氧基]-乙基}-氨基甲酸叔丁基酯

方案1

化合物1.在-20℃将亚硫酰氯(5.6mL，76.3mmol)滴加到无水甲醇 (76mL)中，随后加入反-4-羟基-L-脯氨酸(5.0g，38.1mmol)。使得到的混合物 温热到室温，搅拌20小时。减压除去溶剂，残余物进一步在高真空下干 燥得到反-4-羟基-L-脯氨酸甲酯1白色固体:¹HNMR(300MHz，DMSO-d₆)δ 2.18-2.23(m，2H)，3.06(m，1H)13.32-3.36(m，2H)，3.76(s，3H)，4.42(br.s， 1H)，4.48(dd，J＝5.4，8.1Hz，1H)，5.56(br.s，1H)；EIMSm/z 146([M]⁺+1)。

化合物2.在0℃氩气下向反-4-羟基-L-脯氨酸甲酯1(4.48g，30.9mmol) 和碳酸氢钠(1.56g，18.5mmol)在无水DMF(42mL)中的溶液中加入(BOC)₂O 在DMF(20mL)中的溶液。在室温下搅拌过夜后，通过在0℃加入100mL 水停止反应，用EtOAc(4 x 80mL)提取。合并的有机层用盐水(100mL)洗涤， 干燥(硫酸镁)，过滤和旋转蒸发浓缩。残余物用快速色谱法(硅胶，1:1 己 烷/EtOAc)纯化得到N-BOC保护的4-羟基-L-脯氨酸甲酯2无色油: ¹HNMR(300MHz，CDCl₃，旋转异构体)δ 1.38和1.43(2 x s，9H)，2.04 -2.07(m，1H)，2.23-2.27(m，2H)，3.54-3.63(m，2H)，3.70(s，3H)，4.34-4.38(m， 1H)，4.46(br.s，1H)。

化合物3.(Francomanfre，Jean-Marc Kern，and Jean-Francois Biellmann J.Org.Chem.1992，57，2060-2065)。N-BOC保护的4-羟基-L-脯氨酸甲酯 化合物2(3.24g，13.2mmol)溶解在CH₂Cl₂(132mL)中，冷却到0℃。加入吡 啶和Dess-Martin periodinane，持续搅拌直至TLC显示没有SM遗留。反 应混合物用CH₂Cl₂稀释，用10％含水Na₂S₂O₃(3 x 50mL)、1N含水 HCl(50mL)、饱和含水NaHCO₃(50mL)和盐水(50mL)洗涤，用硫酸镁干燥， 过滤和浓缩。残余物用快速色谱法(硅胶，7:3己烷/EtOAc)纯化，得到 N-BOC保护的4-氧代-L-脯氨酸甲酯3浅黄色油:¹HNMR(300MHz，CDCl₃， 旋转异构体)δ1.44(s，9H)，2.53-2.57(m，1H)，2.85-2.96(m，1H)，3.72和 3.74(2 x s，3H)，3.85-3.87(m，2H)，4.67-4.77(m，1H)。

化合物4.(Kuei-Ying Lin，Markmatteucci US 5414077)在0℃将叔 丁醇钾(2.51g，22.3mmol)在无水THF(40mL)中的溶液加入甲基三苯基溴 化鏻(7.99g，22.3mmol)在THF(40mL)中的悬浮液中。得到的黄色内鎓盐 悬浮液在0℃搅拌2小时，随后加入N-BOC保护的4-氧代-L-脯氨酸甲 酯3(2.72g，11.2mmol)在THF(32mL)中的溶液。在室温搅拌1小时后，反 应混合物用EtOAc(100mL)稀释，用水(80mL)、盐水(80mL)洗涤，干燥(硫 酸镁)，浓缩。残余物用快速色谱法(硅胶，9:1 己烷/EtOAc)得到N-BOC 保护的4-亚甲基-L-脯氨酸甲基酯，化合物4，无色油:¹HNMR(300MHz， CDCl₃，旋转异构体)δ1.40和1.45(2 x s，9H)，2.58-2.62(m，1H)，2.88 -2.98(m，1H)，3.69和3.70(2 x s，3H)，4.03-4.06(m，2H)，4.36-4.49(m，1H)， 4.97-4.99(m，2H)；EIMSm/z 264([M]⁺+Na)。

化合物5.将N-BOC保护的4-亚甲基-L-脯氨酸甲基酯，化合物 4，(0.8g，3.31mmol)溶解在CH2Cl2(6.5mL)中，冷却到0℃。滴加三氟乙酸 (6.5mL)在CH₂Cl₂(6.5mL)中的溶液，得到的混合物在室温搅拌1.5小时。 在用旋转蒸发器除去挥发性溶剂后，棕色残余物溶解在10mL水中，用 Et2O(3 x 5mL)洗涤。浓缩水溶液，它进一步高真空干燥得到4-亚甲基-L- 脯氨酸甲基酯5TFA盐:¹HNMR(300MHz，CDCl₃，旋转异构体)δ 2.83 -2.87(m，1H)，3.05-3.11(m，1H)，3.80和3.81(2 x s，3H)，4.00-4.10(m，2H)， 4.55(dd，J＝5.7，5.7Hz，1H)，5.17-5.21(m，2H)；¹³CNMR(534.0，49.1，53.8， 59.3，111.7，137.6，169.8；EIMSm/z 142([M]⁺+1)。

化合物6.(Kamal，A.；et alJ.med.Chem.2002，45，4679-4688)将二 乙醇胺(3.57g，34mmol)溶解在甲醇(20mL)中，在室温用Et3N(4.7mL， 34mmol)和三氟乙酸乙酯(4.90g，34mmol)处理20小时，随后加入另外 1mL CF₃COOEt。再经20小时后，高真空除去挥发性溶剂得到N-三氟乙 酰基-二乙醇胺6浅黄色油，使用时无需进一步纯化。

化合物7.在0℃将偶氮二羧酸二乙酯(7.66g，44mmol)滴加入香草酸 甲酯(7.30g，40.1mmol)和三苯基膦(15.67g，59.7mmol)在无水THF(57mL) 中的搅拌溶液中，得到的混合物在此温度下搅拌1小时，随后加入N- 三氟乙酰基-二乙醇胺6(7.30g，40.1mmol)在无水THF(20mL)中的溶液。 在室温搅拌过夜后，反应用水(100mL)停止，用Et₂O(3 x 80mL)提取，合 并的Et₂O层用盐水(100mL)洗涤，干燥(硫酸镁)和浓缩。残余物用快速 色谱法(硅胶，8:2 to 7:3 己烷/EtOAc)纯化得到N-三氟乙酰基-N，N-二 [2-(4-甲氧基羰基-2-甲氧基-苯氧基)乙基]胺，化合物7，白色固体: ¹HNMR(300MHz，CDCl₃)δ3.81(s，3H)，3.84(s，3H)，3.87(s，3H)，3.88(s， 3H)，4.04-4.08(m，4H)，4.28-4.32(m，4H)，6.84和6.85(2 x d，J＝6.3Hz， 2H)，7.50和7.51(2 x d，J＝1.5Hz，2H)，7.61(dd，J＝1.5，6.3Hz，2H)。

化合物8.在0℃将固体Cu(NO₃)₂.xH₂O(2.33g，12.41mmol)加入N- 三氟乙酰基-N，N-二[2-(4-甲氧基羰基-2-甲氧基-苯氧基)乙基]胺7(2.62g， 4.96mmol)在乙酐(50mL)中的搅拌溶液中。反应混合物在0℃搅拌1小时， 在室温搅拌2小时，随后倾倒入200mL冰水中。再持续搅拌1小时。得 到的黄色沉淀通过过滤收集，用快速色谱法(硅胶，6:4己烷/EtOAc)纯化 得到N-三氟乙酰基-N，N-二[2-(4-甲氧基羰基-2-甲氧基-5-硝基-苯氧基)乙 基]胺，化合物8浅黄色固体:¹HNMR(300MHz，CDCl₃)δ3.86(s，3H)， 3.88(s，3H)，3.886(s，3H)，3.890(s，3H)，4.04-4.09(m，4H)，4.30-4.35(m， 4H)，6.98和6.99(2 x s，2H)，7.37和7.40(2 x s，2H)。

化合物9.N-三氟乙酰基-N，N-二[2-(4-甲氧基羰基-2-甲氧基-5-硝基- 苯氧基)乙基]胺8(2.58g，4.16mmol)在THF-MeOH(1:2，48mL)中的溶液 在室温用10％含水K₂CO₃(16mL)处理12小时。在用旋转蒸发器除去挥 发物质后，残余物用100mL水稀释，用EtOAc(3 x 100mL)提取。合并的 EtOAc层用盐水(100mL)洗涤，干燥(硫酸镁)，浓缩得到N，N-二[2-(4-甲 氧基羰基-2-甲氧基-5-硝基-苯氧基)乙基]胺，化合物9黄色固体，它无需 进一步纯化而使用:¹HNMR(300MHz，CDCl₃)δ3.17(t，J＝3.9Hz，4H)， 3.89(s，6H)，3.93(s，6H)，4.19(t，J＝3.9Hz，4H)，7.05(s，2H)，7.47(s，2H)。

化合物10.将N，N-二[2-(4-甲氧基羰基-2-甲氧基-5-硝基-苯氧基)乙 基]胺9(粗，4.16mmol)和NaHCO₃(210mg，2.50mmol)悬浮在THF中，在0 ℃用(BOC)₂O(999mg，4.58mmol)处理，在室温持续搅拌3小时。在除去 THF后，残余物在水和EtOAc(100/100mL)之间分配，水层进一步用 EtOAc(2 x 50mL)提取。合并的层用盐水(80mL)洗涤，干燥(硫酸镁)，浓 缩。残余物用快速色谱法(硅胶，6:4 己烷/EtOAc)纯化得到N-叔丁氧基羰 基-N，N-二[2-(4-甲氧基羰基-2-甲氧基-5-硝基-苯氧基)乙基]胺，化合物 10浅黄色固体:¹HNMR(300MHz，CDCl₃)δ1.44(s，9H)，3.77(m，4H)，3.83， 3.86和3.87(3 x s，12H)，4.20和4.26(2 x t，J＝3.9Hz，4H)，6.97和6.99(2 x s， 2H)，7.36和7.40(2 x s，2H)；EIMS m/z 646([M]⁺+Na)。

化合物11.将N-叔丁氧基羰基-N，N-二[2-(4-甲氧基羰基-2-甲氧基-5- 硝基-苯氧基)乙基]胺，化合物10(2.11g，3.39mmol)悬浮在 THF-MeOH-H₂O(3:1:1，65mL)中，在室温用1m含水LiOH(14mL)处理3 小时。在除去挥发性溶剂后，残余物用水(25mL)稀释。得到的水溶液用浓 HCl酸化至pH约1。过滤收集沉淀的N-叔丁氧基羰基-N，N-二[2-(4-羧基-2- 甲氧基-5-硝基-苯氧基)乙基]胺，化合物11，用水洗涤，在高真空下进一步 干燥:¹HNMR(300MHz，CDCl₃，旋转异构体)δ1.39(s，9H)，3.70(m，4H)，3.88 和3.89(2 x s，6H)，4.29(m，4H)，7.29和7.31(2 x s，2H)，7.63(s，2H)，13.60(br. s，2H)；¹³CNMR δ27.8，46.2和46.6，56.3和56.4，67.2，79.2，107.9和108.0， 111.3，141.4和141.5，149.1，151.7，154.5，165.9；HRMSm/z C₂₅H₂₉N₃O₁₄Na 计算值618.1547，实验值618.1552([M]⁺+Na)。

化合物12.将催化量的DMF(2滴)加入N-叔丁氧基羰基-N，N-二 [2-(4-羧基-2-甲氧基-5-硝基-苯氧基)乙基]胺11(194mg，0.33mmol)和草酰 氯(72.7L，0.81mmol)在无水THF(6.5mL)中的溶液中，得到的混合物在 室温搅拌过夜。用旋转蒸发器除去过量THF和草酰氯，乙酰氯重新悬浮 在新鲜THF(4mL)中，在0℃和氩气气氛中，滴加到4-亚甲基-L-脯氨酸 甲基酯5(206.7mg，0.81mmol)、Et₃N(0.19mL，1.39mmol)和H₂O(0.4mL) 在THF(1mL)中的溶液中。反应混合物温热到室温，持续搅拌2小时。 在除去THF后，残余物在水和EtOAc(10/10mL)间分配，水层进一步用 EtOAc(2 x 8mL)提取。合并的有机层用盐水(10mL)洗涤，干燥(硫酸镁) 和浓缩。残余物用快速色谱法(硅胶，2:8 己烷/EtOAc)纯化得到二{2-[5- 甲氧基-2-硝基-4-[(S)-4-亚甲基-2-甲氧基羰基-1-吡咯烷基羰基]-苯氧基]- 乙基}-氨基甲酸叔丁基酯12浅黄色油(旋转异构体):¹HNMR(300MHz， CDCl₃，旋转异构体)δ1.46(s，9H)，2.68-2.75(m，2H)，2.99-3.10(m，2H)， 3.60-4.28(m，24H)，4.56-5.12(m，6H)，6.78-6.83(m，2H)，7.63-7.71(m， 2H)；EIMSm/z 864([M]⁺+Na)。

化合物13.在-78℃和氩气气氛中，向二{2-[5-甲氧基-2-硝基 -4-[(S)-4-亚甲基-2-甲氧基羰基-1-吡咯烷基羰基]苯氧基]-乙基}-氨基甲 酸叔丁基酯12(100mg，0.12mmol)在无水甲苯(2.4mL)中的剧烈搅拌的溶 液中滴加DIBAL-H(480μL 1M甲苯溶液)。在混合物再搅拌45分钟后， 通过加入5滴甲醇，随后加入5％HCl(4mL)分解过量试剂。得到的混合 物温热到0℃，分层，水层进一步用CH₂Cl₂(3 x 3mL)提取。合并的有机 层用盐水洗涤，干燥(硫酸镁)和浓缩。残余物用快速色谱法(硅胶，95:5 CHCl₃/MeOH)纯化得到二{2-[5-甲氧基-2-硝基-4-[(S)-4-亚甲基-2-甲酰基 -1-吡咯烷基羰基]苯氧基]-乙基}-氨基甲酸叔丁基酯13浅黄色油(84mg， 91％)。

化合物14.在室温下将二{2-[5-甲氧基-2-硝基-4-[(S)-4-亚甲基-2- 甲酰基-1-吡咯烷基羰基]苯氧基]-乙基}-氨基甲酸叔丁基酯13(180mg， 0.23mmol)、Na₂S₂O₄(1.84mmol，8当量)、3.5mL THF和2.2mLH₂O搅拌 20小时。高真空除去溶剂，残余物重新悬浮在MeOH(30mL)中，滴加 AcCl直到pH约2。得到的混合物在室温搅拌1小时，反应物通过除去 大多数MeOH，随后用EtOAc(25mL)稀释处理。EtOAc溶液用饱和含水 NaHCO₃、盐水洗涤，干燥(硫酸镁)和浓缩。残余物用快速色谱法(硅胶， 97:3 CHCl₃/MeOH)纯化得到二-{2-[(S)-2-亚甲基-7-甲氧基-5-氧代-1，2， 3，11a-四氢-5H-吡咯并[2，1-c][1，4]苯并二氮杂-8-基]-乙基}-氨基甲酸 叔丁基酯14白色固体(86mg，50％)。

实施例14:(11aS)-7-(5-溴戊氧基)-2-亚甲基-1，2，3，11a-四氢-5H-吡咯并 [2，1-c][1，4]苯并二氮杂-5-酮

方案2

化合物15.向香草酸甲酯(9.109g，50mmol)在丙酮(200mL)中的溶 液中加入K₂CO₃(27.64g，200mmol)和1，5-二溴戊烷(20.4mL，150mmol)， 将得到的混合物回流加热。6小时后，TLC显示没有原料残留。将混合 物冷却到室温，过滤除去固体。滤液浓缩，用快速色谱法纯化(硅胶，8:2 己烷/EtOAc)得到4-(5-溴戊氧基)-3-甲氧基-苯甲酸甲基酯15白色固体 (13.65g，82％):¹HNMR(300MHz，CDCl₃)δ 1.60-1.66(m，2H)，1.85-1.97(m， 4H)，3.42(t，J＝5.0Hz，2H)，3.87(s，3H)，3.89(s，3H)，4.06(t，J＝5.0Hz，2H)， 6.85(d，J＝6.3Hz，1H)，7.52(d，J＝1.5Hz，1H)，7.63(dd，J＝6.3，1.5Hz，1H)； EIMSm/z 353和355([M]⁺+Na)。

化合物16.在0℃将固体Cu(NO₃)₂.xH₂O(3.64g，19.42mmol)加入 4-(5-溴戊氧基)-3-甲氧基-苯甲酸甲基酯15(5.36g，16.18mmol)在乙酐 (81mL)中的搅拌溶液中。反应混合物在0℃搅拌1小时，在室温搅拌 2小时，随后倾倒入200mL冰水中。过滤收集生成的黄色沉淀，用水 洗涤。在高真空下进一步干燥得到4-(5-溴戊氧基)-5-甲氧基-2-硝基-苯甲 酸甲基酯化合物16浅黄色固体(5.98g)，它直接用于下一步骤: ¹HNMR(300MHz，CDCl₃)δ1.59-1.70(m，2H)，1.85-1.98(m，4H)13.43(t， J＝5.1Hz，2H)，3.89(s，3H)，3.94(s，3H)，4.08(t，J＝4.8Hz，2H)，7.05(s，1H)， 7.42(s，1H)。EIMSm/z398和400([M]⁺+Na)。

化合物17.将4-(5-溴戊氧基)-5-甲氧基-2-硝基-苯甲酸甲基酯 16(5.98g，15.9mmol)悬浮在THF-MeOH-H₂O(3:1:1，157mL)中，在室温用 1M含水LiOH(31mL)处理5小时。在除去挥发溶剂后，残余物用水(70mL) 稀释。得到的含水溶液用浓盐酸酸化至pH～2，过滤收集沉淀的4-(5- 溴戊氧基)-5-甲氧基-2-硝基-苯甲酸17，用水洗涤，在高真空下进一步干 燥(5.47g):¹HNMR(300MHz，CDCl₃)δ1.64-1.68(m，2H)，1.87-1.98(m，4H)， 3.43(t，J＝4.8Hz，2H)，4.08(s，3H)，4.10(t，J＝5.1Hz，2H)，7.21(s，1H)，7.35(s， 1H)，13.60(br.s，1H)；EIMSm/z384和386([M]⁺+Na)。

化合物18.将催化量的DMF(2滴)加入4-(5-溴戊氧基)-5-甲氧基-2- 硝基-苯甲酸17(270mg，0.74mmol)和草酰氯(80μL，0.89mmol)在无水 THF(7.5mL)中的溶液中，得到的混合物在室温搅拌过夜。用旋转蒸发器 除去过量THF和草酰氯，乙酰氯重新悬浮在新鲜THF(6mL)中，在0℃ 氩气气氛下，滴加到4-亚甲基-L-脯氨酸甲基酯5(228mg，0.89mmol)、 Et₃N(0.32mL，2.31mmol)和H₂O(0.15mL)在THF(1.5mL)中的溶液中。使 反应混合物温热到室温，持续搅拌4小时，在除去THF后，残余物在水 和EtOAc(20/20mL)之间分配。水层进一步用EtOAc(3 x 10mL)提取，合 并的有机层用盐水(20mL)洗涤，干燥(硫酸镁)和浓缩。残余物用快速色 谱法(硅胶，6:4己烷/EtOAc)纯化得到1-[4-(5-溴戊氧基)-5-甲氧基-2-硝基 -苯甲酰基]-4-亚甲基-L-脯氨酸甲基酯18浅黄色油(旋转异构体): ¹HNMR(300MHz，CDCl₃，旋转异构体)δ1.62-1.68(m，2H)，1.86-1.98(m， 4H)，2.64-2.75(m，1H)，2.99-3.08(m，1H)，3.43(t，J＝5.1Hz，2H)，3.59 -3.96(m，7H)，4.05-4.21(m，3H)，4.57-4.61和4.90-5.12(m，3H)，6.80和 6.83(2s，1H)，7.64和7.67(2s，1H)；EIMSm/z507和509([M]⁺+Na)。

化合物19.向1-[4-(5-溴戊氧基)-5-甲氧基-2-硝基-苯甲酰基]-4-亚 甲基-L-脯氨酸甲基酯18(61mg，0.12mmol)在无水甲苯-CH₂Cl₂(3:1， 2.5mL)中的剧烈搅拌溶液中在-78℃氩气气氛下滴加DIBAL-H(188μL 1M甲苯溶液)。在混合物再搅拌45分钟后，通过加入5滴甲醇，随后 加入5％HCl(2mL)分解过量试剂。得到的混合物温热到0℃，分层，水 层进一步用CH₂Cl₂(3 x 3mL)提取。合并的有机层用盐水洗涤，干燥(硫 酸镁)和浓缩。残余物用快速色谱法(硅胶，1:1 己烷/EtOAc)纯化得到 (S)-1-[4-(5-溴戊氧基)-5-甲氧基-2-硝基-苯甲酰基]-4-亚甲基-2-吡咯烷甲 醛19浅黄色油(44mg，80％)。

化合物20.在室温将(S)-1-[4-(5-溴戊氧基)-5-甲氧基-2-硝基-苯甲 酰基]-4-亚甲基-2-吡咯烷甲醛19(43.7mg，0.096mmol)、Na₂S₂O₄(0.58mmol，6equiv)、1.5mL THF和0.9mLH₂O的混合物搅拌18小时。 高真空除去溶剂，残余物重新悬浮在MeOH(6mL)中，滴加AcCl直到pH ～2。得到的混合物在室温搅拌1小时，反应物通过除去大多数MeOH， 随后用稀释EtOAc(20mL)处理。EtOAc溶液用饱和含水NaHCO₃、盐水 洗涤，干燥(硫酸镁)和浓缩。残余物用快速色谱法(硅胶，98:2 CHCl₃/MeOH)纯化得到(11aS)-7-(5-溴戊氧基)-2-亚甲基-1，2，3，11a-四氢 -5H-吡咯并[2，1-c][1，4]苯并二氮杂-5-酮20浅黄色油(31mg，74％): ¹HNMR(300MHz，CDCl₃)δ1.58-1.66(m，2H)，1.84-1.99(m，4H)，2.91 -2.95(m，1H)，3.08-3.14(m，1H)，3.42(t，J＝5.1Hz，2H)，3.93(s，3H)，3.87 -4.27(m，5H)，5.15(br s，1H)，5.18(br s，1H)，6.84(s，1H)，7.49(s，1H)，7.71(d， J＝4.0Hz，1H)；EIMSm/z429和431([M]⁺+Na)。

化合物20可随后与如实施例11中制备的PBD部分偶合形成本发 明的化合物。

实施例15:8，8’-[3-(2-乙酰基硫基甲基)-1，5-戊二基二(氧基)]-二[(S)-2-亚 甲基-7-甲氧基-1，2，3，11a-四氢-5H-吡咯并[2，1-c][1，4]苯并二氮杂-5- 酮]

在0℃向三苯基膦(1.77g，6.8mmol)在无水THF(15mL)中的溶液中滴 加偶氮二羧酸二乙酯(2.2M甲苯溶液，2.4mL，5.4mmol)，在0℃搅拌55 分钟后，滴加3-(2-羟基乙基)戊烷-1，5-二醇(740mg，5mmol)和硫代乙酸 (335μL，4.5mmol)在无水THF(7mL)中的溶液。1小时后移去冰水浴，反 应物在室温下搅拌16小时，通过真空旋转蒸发除去溶剂。残余物用快 速色谱法(CHCl₃/MeOH，20:1，15:1，10:1，4:1)纯化得到3-(2-乙酰基硫基 乙基)戊烷-1，5-二醇白色固体(350mg)，回收原料三醇(406mg)。¹H NMR(400Hz，CDCl₃):δ 3.65-3.63(m，4H)，3.45(bs，2H)，2.84-2.80(m，2H)， 2.28(s，3H)，1.73-1.67(m，1H)，1.55-1.49(m，6H)。MS(ESI):m/z229.0(M+ Na)⁺。

在0℃，向三苯基膦(53mg，0.2mmol)在无水THF(0.4mL)中的溶液中 滴加偶氮二羧酸二异丙基酯(36μL，0.17mmol)。在0℃搅拌25分钟后， 加入(11aS)-8-羟基-7-甲氧基-2-亚甲基-1，2，3，11a-四氢-5H-吡咯并 [2，1-c][1，4]苯并二氮杂-5-酮，PBD单体，(38mg，0.14mmol，使用前用 无水苯共蒸发，在高真空下干燥几小时)在无水THF(0.2mL)中的溶液。 混合物持续搅拌10分钟，随后加入在无水THF(0.2mL)中的硫代乙酸酯 化合物(12mg，0.058mmol，使用前用无水苯共蒸发，在高真空下干燥几 小时)溶液。反应混合物在0℃搅拌35分钟，移去冰水浴，溶液在室温 下搅拌12小时。通过真空旋转蒸发除去溶剂，残余物用快速色谱法 (CHCl₃/MeOH，100:1，50:1，25:1，20:1)纯化得到8，8’-[3-(2-乙酰基硫基甲 基)-1，5-戊二基二(氧基)]-二[(S)-2-亚甲基-7-甲氧基-1，2，3，11a-四氢-5H- 吡咯并[2，1-c][1，4]苯并二氮杂-5-酮](19mg，y＝47％)。¹H NMR(400Hz， CDCl₃):δ7.66(d，J＝4.4Hz，2H)，7.46(s，2H)，6.78(s，2H)，5.17(s，2H)，5.14(s， 2H)，4.26(s，4H)，4.17-4.09(m，4H)，3.88(s，6H)，3.87-3.83(m，2H)， 3.13-3.06(m，2H)，2.94-2.90(m，4H)，2.29(s，3H)11.95(bs，3H)，1.68(bs， 4H)。MS(ESI，用水):m/z 745.3(M+2H2O+Na)⁺，727.3(M+H2O+Na)⁺， 709.2(M+Na)⁺。

实施例16:8，8’-[5-(N-4-巯基-4，4-二甲基丁酰基)氨基-1，3-苯二基二(亚甲 氧基)]-二[7-甲氧基-2-亚甲基-1，2，3，11a-四氢-5H-吡咯并[2，1-c][1，4]苯并 二氮杂-5-酮]可如下制备:

向三(2-羧基乙基)膦盐酸盐(TCEP，52mg，0.18mmol)在水(0.3mL)中 的悬浮液中滴加饱和碳酸氢钠(～0.6mL)以调节pH至6～7，随后向其中加 入磷酸盐缓冲液(pH7.0，10mM，Na₂HPO₄/H₃PO₄，0.5mL)。将如此得到的 TCEP溶液加入8，8’-[5-(N-4-甲基二硫基-4，4-二甲基丁酰基)-氨基-1，3-苯 二基二(亚甲氧基)]-二[7-甲氧基-2-亚甲基-1，2，3，11a-四氢-5H-吡咯并 [2，1-c][1，4]苯并二氮杂-5-酮](29mg，0.036mmol)在甲醇(2.2mL)中的混 合物中，在室温下搅拌3小时。反应用磷酸盐缓冲液(pH6.5)停止，用二 氯甲烷提取。合并的有机层用盐水洗涤，用无水硫酸钠干燥，过滤和减 压除去溶剂得到白色固体。将固体溶解在二氯甲烷/MeOH(2:1)中，再次 蒸发。加入二氯甲烷并蒸发，残余物高真空干燥，用逆相C18柱 {CH₃CN/H₂O，在装柱前将固体溶解在CH₃CN/H₂O(3:1，2mL)中，搅拌30 分钟}纯化得到8，8’-[5-(N-4-巯基-4，4-二甲基丁酰基)氨基-1，3-苯二基二 (亚甲氧基)]-二[7-甲氧基-2-亚甲基-1，2，3，11a-四氢-5H-吡咯并[2，1-c][1，4] 苯并二氮杂-5-酮](11mg)白色固体(方法H)。

MS(ESI):m/z＝786.3MNa⁺

        m/z＝804.2MNa⁺+H₂O。

8，8’-[5-(N-4-甲基二硫基-4，4-二甲基丁酰基)氨基-1，3-苯二基二(亚甲 氧基)]-二[7-甲氧基-2-亚甲基-1，2，3，11a-四氢-5H-吡咯并[2，1-c][1，4]苯并 二氮杂-5-酮]可如下制备:

向5-(N-4-甲基二硫基-4，4-二甲基丁酰基)-氨基-1，3-二-(甲磺酰氧基 甲基)-苯(89mg，0.18mmol)溶解在无水DMF(2mL)中的溶液中在室温下 加入8-羟基-7-甲氧基-2-亚甲基-1，2，3，11a-四氢-5H-吡咯并[2，1-c][1，4]苯 并二氮杂-5-酮(93mg，0.36mmol)、碳酸钾粉末(100mg，0.72mmol)、碘 化钾粉末(15mg，0.09mmol)和四丁基碘化铵(13mg，0.036mmol)。在混合 物搅拌1小时后，加入第二部分的8-羟基-7-甲氧基-2-亚甲基-1，2，3，11a- 四氢-5H-吡咯并[2，1-c][1，4]苯并二氮杂-5-酮(22mg，0.085mmol)。在室 温下溶液持续搅拌3小时，反应用水停止，用二氯甲烷稀释。分离有机 层，水层用二氯甲烷提取。合并的有机层用盐水洗涤，用无水硫酸钠干 燥。过滤和减压蒸发滤液，随后高真空蒸发以除去残留DMF。残余物随 后用逆相C18柱(CH₃CN/H₂O)纯化得到8，8’-[5-(N-4-甲基二硫基-4，4-二 甲基丁酰基)氨基-1，3-苯二基二(亚甲氧基)]-二[7-甲氧基-2-亚甲基-1，2，3， 11a-四氢-5H-吡咯并[2，1-c][1，4]苯并二氮杂-5-酮](29mg)白色固体(方 法H)。

MS(ESI):m/z＝832.2MNa⁺

        m/z＝850.2MNa⁺+H₂O

¹H NMR(400Hz，CDCl₃-d1 δ ppm):7.67(bs，2H)，7.58-7.26(m，5H)，6.82(s， 2H)，5.21-5.14(m，8H)，4.30(s，4H)14.02-3.88(m，9H)，3.16-3.10(m，2H)， 2.97-2.93(m，2H)，2.45-2.40(m，5H)，2.09-2.03(m，2H)，1.34(s，6H)。 5-(N-4-甲基二硫基-4，4-二甲基丁酰基)氨基-1，3-二-(甲磺酰氧基甲基)-苯 可如下制备:

在-2℃，在10分钟，向5-(N-4-甲基二硫基-4，4-二甲基丁酰基)-氨基 -1，3-二-(羟基甲基)-苯(329mg，1.0mmol)在无水二氯甲烷(7mL)中的悬浮 液中滴加三乙胺(348μL，2.5mmol)，随后滴加甲磺酰氯(193μL， 2.5mmol)。溶液在0℃再搅拌10分钟，用冰水混合物骤冷，混合物用冷 二氯甲烷提取，合并的二氯甲烷层用冷水洗涤，用无水硫酸钠干燥。过 滤，滤液通过真空旋转蒸发，残余物用短硅胶柱(二氯甲烷/己烷/乙酸乙 酯，1:2:4)快速纯化得到5-(N-4-甲基二硫基-4，4-二甲基丁酰基)氨基-1，3- 二-(甲磺酰氧基甲基)-苯无色油(410mg)。

MS(ESI):m/z＝508.0MNa⁺

    m/z＝483.9M-H

    m/z＝519.9M-H+2H₂O

5-(N-4-甲基二硫基-4，4-二甲基丁酰基)-氨基-1，3-二-(羟基甲基)-苯可 如下制备:

向5-硝基-m-二甲苯-α，α’-二醇(890mg，5.4mmol)在甲醇(50mL)中的 溶液中加入Pd/C(10％，287mg)。输入氢气，混合物在压力(H₂，5-8psi)下 在室温下氢化5小时。溶液通过C盐过滤，滤液通过真空旋转蒸发过程 蒸发得到5-氨基-m-二甲苯-α，α’-二醇，将其溶解在THF(10mL) /DMF(15ml)中。在室温下加入溶解在THF(5ml)中的4-甲基二硫基-4，4- 二甲基丁酸(1.05g，5.4mmol)，随后加入1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳 化二亚胺盐酸盐(2.1g，10.8mmol)和4-二甲基氨基吡啶(66mg， 0.54mmol)。得到的混合物在室温下搅拌过夜，用10％氯化铵停止，用 乙酸乙酯提取，洗涤和干燥。经过滤，真空旋转蒸发除去溶剂，残余物 用快速色谱法(CH₂Cl₂/MeOH，15:1，10:1，7:1)纯化得到5-(N-4-甲基二硫 基-4，4-二甲基丁酰基)-氨基-1，3-二-(羟基甲基)-苯白色固体(729mg)。

MS(ESI):m/z＝352.1MNa⁺

¹H NMR(400Hz，CDCl₃-d1，δ ppm):7.47(s，2H)，7.10(s，1H)，4.58(s，4H)， 2.52-2.47(m，2H)，2.42(s，3H)，2.02-1.98(m，2H)，1.34(s，6H)。

实施例17:8，8’-[5-(N-甲基-N-(2-巯基-2，2-二甲基乙基)氨基-1，3-苯二基 (亚甲氧基)]-二[7-甲氧基-2-亚甲基-1，2，3，11a-四氢-5H-吡咯并[2，1-c][1，4] 苯并二氮杂-5-酮]可如下制备:

向三(2-羧基乙基)膦盐酸盐(TCEP，64mg，0.22mmol)在水(0.05mL)中 的悬浮液中滴加饱和碳酸氢钠(～0.7mL)以调节pH至6～7，随后向其中加 入磷酸盐缓冲液(pH7.0，10mM，Na₂HPO₄/H₃PO₄，0.8mL)。将如此得到的 TCEP溶液加入8，8’-[5-(N-甲基-N-(2-甲基二硫基-2，2-二甲基乙基)氨基 -1，3-苯二基(亚甲氧基))-二[7-甲氧基-2-亚甲基-1，2，3，11a-四氢-5H-吡咯并 [2，1-c][1，4]苯并二氮杂-5-酮](35mg，0.045mmol)在甲醇(5mL)中的混 合物中，在室温下搅拌4.5小时。反应用磷酸盐缓冲液(pH6.5)停止，用 二氯甲烷提取。合并的有机层用盐水洗涤，用无水硫酸钠干燥，过滤和 减压除去溶剂得到白色固体。将固体溶解在二氯甲烷/MeOH(2:1)中，再 次蒸发。加入二氯甲烷并蒸发，残余物高真空干燥，用逆相C18柱 {CH₃CN/H₂O，在装柱前将固体溶解在CH₃CN/H₂O(3:1，2mL)中，搅拌30 分钟}纯化得到8，8’-[5-(N-甲基-N-(2-巯基-2，2-二甲基乙基)氨基-1，3-苯二 基(亚甲氧基)]-二[7-甲氧基-2-亚甲基-1，2，3，11a-四氢-5H-吡咯并 [2，1-c][1，4]苯并二氮杂-5-酮](10.5mg，y＝32％)白色固体(方法H)。

MS(ESI):m/z＝758.2MNa⁺

        m/z＝776.2MNa⁺+H₂O

        m/z＝794.3MNa⁺+2H₂O

8，8’-[5-(N-甲基-N-(2-甲基二硫基-2，2-二甲基乙基)氨基-1，3-苯二基 (亚甲氧基)]-二[7-甲氧基-2-亚甲基-1，2，3，11a-四氢-5H-吡咯并[2，1-c][1，4] 苯并二氮杂-5-酮]可如下制备:

向5-(N-甲基-N-(2-甲基二硫基-2，2-二甲基乙基)氨基-1，3-二-(甲磺酰 氧基甲基)-苯(105mg，0.23mmol)溶解在无水DMF(2.5mL)中的溶液中在 室温下加入8-羟基-7-甲氧基-2-亚甲基-1，2，3，11a-四氢-5H-吡咯并 [2，1-c][1，4]苯并二氮杂-5-酮(119mg，0.46mmol)、碳酸钾粉末(127mg， 0.92mmol)、碘化钾粉末(20mg，0.12mmol)和四丁基碘化铵(17mg， 0.046mmol)。在混合物搅拌1.5小时后，加入第二部分的8-羟基-7-甲氧 基-2-亚甲基-1，2，3，11a-四氢-5H-吡咯并[2，1-c][1，4]苯并二氮杂-5-酮 (23mg，0.089mmol)。在室温下溶液持续搅拌4.5小时，反应用水停止， 用二氯甲烷稀释。分离有机层，水层用二氯甲烷提取。合并的有机层用 盐水洗涤，用无水硫酸钠干燥。过滤溶液和减压蒸发滤液，随后高真空 蒸发以除去残留DMF。残余物重新悬浮CH₃CN/H₂O(10:1)中，并过滤。 蒸发滤液，粗产物用逆相C18柱(CH₃CN/H₂O)纯化得到8，8’-[5-(N-甲基 -N-(2-甲基二硫基-2，2-二甲基乙基)氨基-1，3-苯二基(亚甲氧基))-二[7-甲 氧基-2-亚甲基-1，2，3，11a-四氢-5H-吡咯并[2，1-c][1，4]苯并二氮杂-5-酮] (39mg)白色固体(方法H)。

MS(ESI):m/z＝804.2MNa⁺

        m/z＝822.2MNa⁺+H₂O

        m/z＝840.2MNa⁺+2H₂O

¹H NMR(400Hz，CDCl₃-d1，δ ppm):7.64(bs，2H)，7.50(s，2H)，6.83-6.76(m， 5H)，5.18-5.10(m，8H)，4.27(s，4H)，3.95(s，6H)，3.90-3.84(m，3H)，3.51(s， 2H)，3.13-3.07(m，2H)，3.01(s，3H)，2.94-2.90(m，2H)12.41(s，3H)，1.30(s， 6H)。

5-(N-甲基-N-(2-甲基二硫基-2，2-二甲基乙基)氨基-1，3-二-(甲磺酰氧 基甲基)-苯可如下制备:

在-2℃，在10分钟，向5-(N-甲基-N-(2-甲基二硫基-2，2-二甲基乙基) 氨基-1，3-二-(羟基甲基)-苯(135mg，0.45mmol)在无水二氯甲烷(3mL)中的 溶液中滴加三乙胺(153μL，1.1mmol)，随后滴加甲磺酰氯(87μL， 1.1mmol)。溶液在0℃再搅拌30分钟，用冰/水骤冷，混合物用冷二氯 甲烷提取，合并的二氯甲烷层用冷水洗涤，用无水硫酸钠干燥。过滤， 滤液通过真空旋转蒸发，残余物制备TLC板(己烷/乙酸乙酯，1:1.5)纯化 得到5-(N-甲基-N-(2-甲基二硫基-2，2-二甲基乙基)氨基-1，3-二-(甲磺酰氧 基甲基)-苯无色油(105mg)。

MS(ESI):m/z＝480.0MNa⁺

5-(N-甲基-N-(2-甲基二硫基-2，2-二甲基乙基)氨基-1，3-二-(羟基甲 基)-苯可如下制备:

向5-(N-(2-甲基二硫基-2，2-二甲基乙基)氨基-1，3-二-(羟基甲基)-苯 (226mg，0.78mmol)在DMF(4mL)中的溶液中加入碘甲烷(149μL， 2.4mmol)，随后加入碳酸钾粉末。在室温下搅拌4天后，混合物用饱和 氯化铵骤冷，用二氯甲烷稀释。分离有机层，水层用二氯甲烷提取。合 并的有机层用盐水洗涤，用无水硫酸钠干燥。残余物用快速色谱法纯化 (己烷/乙酸乙酯，1:2)得到5-(N-甲基-N-(2-甲基二硫基-2，2-二甲基乙基) 氨基-1，3-二-(羟基甲基)-苯无色泡沫(152mg)。

MS(ESI):m/z＝324.1MNa⁺

¹H NMR(400Hz，CDCl₃-d1，δ ppm):6.70(s，2H)，6.66(s，1H)，4.06(s，4H)， 3.54(s，2H)，3.04(s，3H)，2.46(s，3H)，1.37(s，6H)。

5-(N-(2-甲基二硫基-2，2-二甲基乙基)氨基-1，3-二-(羟基甲基)-苯可如下制 备:

向5-氨基-1，3-二-羟基甲基-苯(765mg，5mmol)在无水乙醇(25mL)中 的溶液中加入2-(甲基二硫基)-异丁醛(751mg，5mmol)。在室温下搅拌4 小时后，将溶液用冰/水浴冷却到0℃，加入硼氢化钠(220mg，5.8mmol)。 混合物在0℃持续搅拌1小时，随后用冷5％盐酸停止，用二氯甲烷稀释。 加入饱和碳酸氢钠，使溶液微碱性。分离有机层，水层用二氯甲烷提取， 合并的有机层用盐水洗涤，用无水硫酸钠干燥。过滤溶液，滤液减压蒸 发。残余物用快速色谱法(CH₂Cl₂/MeOH，15:1，10:1)纯化得到5-(N-(2-甲 基二硫基-2，2-二甲基乙基)氨基-1，3-二-(羟基甲基)-苯无色油(832mg)。

MS(ESI):m/z＝310.0MNa⁺

实施例18:

8，8’-[(4-(2-(4-巯基-4-甲基)-戊酰氨基-乙氧基)-吡啶-2，6-二甲基)-二 氧基]-二[(S)-2-亚乙-(E)-基-7-二甲氧基-1，2，3，11a-四氢-吡咯并[2，1-c][1，4] 苯并二氮杂-5-酮]可如下制备:

向8，8’-[(4-(2-(4-甲基-4-甲基二硫基)-戊酰氨基-乙氧基)-吡啶-2，6-二 甲基)-二氧基]-二[(S)-2-亚乙-(E)-基-7-二甲氧基-1，2，3，11a-四氢-吡咯并 [2，1-c][1，4]苯并二氮杂-5-酮](60mg)在甲醇(1.6mL)中的溶液中加入 DMF(0.2mL)和三(2-羧基乙基)膦盐酸盐(48mg)在水0.2mL中的溶液。反 应混合物在室温下搅拌18小时，真空除去溶剂得到残余物，其用硅胶 色谱法(Merck SuperVario Flash 10g柱，Si60 15-40)纯化，用甲醇(A)/ 二氯甲烷/乙腈 9:1(B)梯度洗脱，(梯度:100％ B下降至10％ A:90％ B) 得到8，8’-[(4-(2-(4-巯基-4-甲基)-戊酰氨基-乙氧基)-吡啶-2，6-二甲基)-二 氧基]-二[(S)-2-亚乙-(E)-基-7-二甲氧基-1，2，3，11a-四氢-吡咯并 [2，1-c][1，4]苯并二氮杂-5-酮](17mg):

LC/MS(方法A1，ZQ):ES:m/z＝855MH⁺+H₂O

                     m/z＝837MH⁺

                  保留时间＝3.70分钟

8，8’-[(4-(2-(4-甲基-4-甲基二硫基)-戊酰氨基-乙氧基)-吡啶-2，6-二甲 基)-二氧基]-二[(S)-2-亚乙-(E)-基-7-二甲氧基-1，2，3，11a-四氢-吡咯并 [2，1-c][1，4]苯并二氮杂-5-酮]可如下制备:

向4-(2-(4-甲基-4-甲基二硫基)-戊酰氨基-乙氧基)-2，6-二-(羟基甲 基)-吡啶(360mg)和三乙胺(810μL)在二氯甲烷(4mL)中的冷却(0℃)溶液 中加入甲磺酰氯(298μL)在二氯甲烷(4mL)中的溶液。2小时后，加入水， 分层，水层用二氯甲烷提取两次。合并有机溶液用硫酸钠干燥，真空浓 缩得到残余物。残余物用硅胶色谱法(Interchrom Puriflash 20g柱，SiOH 15-35)纯化，使用甲醇(A)/二氯甲烷(B)的混合物进行梯度洗脱，(梯度: 100％ B下降至3％ A:97％ B)得到280mg甲磺酸酯化合物。

向pre-茅屋霉素(120mg)在二甲基甲酰胺(4mL)中的溶液中加入碳酸 钾(244mg)、碘化钾(147mg)和甲磺酸酯化合物(137mg)样品。反应混合物 在30℃搅拌20小时，加入水(20mL)，过滤出生成的固体，用水洗涤， 真空干燥得到残余物。残余物用硅胶色谱法(Interchrom Puriflash 20g柱， SiOH 15-35)纯化，使用甲醇(A)/二氯甲烷(B)的混合物进行梯度洗 脱，(梯度:100％ B下降至6％ A:94％ B)得到粗化合物，它溶解在水/乙 腈1:1中，随后真空浓缩得到8，8’-[(4-(2-(4-甲基-4-甲基二硫基)-戊酰氨 基-乙氧基)-吡啶-2，6-二甲基)-二氧基]-二[(S)-2-亚乙-(E)-基-7-二甲氧基 -1，2，3，11a-四氢-吡咯并[2，1-c][1，4]苯并二氮杂-5-酮](120mg):

LC/MS(方法A1，ZQ):ES:m/z＝919MH⁺+2H₂O

                     m/z＝901MH⁺+H₂O

                     m/z＝883MH⁺

                  保留时间＝3.82分钟

¹H N.M.R.(500MHz，CDCl₃-d1，δ ppm):δ＝1，28(s，6H)；1，75(d，J＝6，5Hz， 6H)；1，94(m，2H)；2，29(m，2H)；2，39(s，3H)；2，97(m，4H)；3，50-4，20(m， 6H)；4，00(s，6H)；4，27(s，4H)；5，27(m，4H)；5，61(m，2H)；5，87(t b， J＝5，5Hz，1H)；6，83(s，2H)；6，97(s，2H)；7，55(s，2H)；7，64(d，J＝4，5Hz， 2H)。

4-(2-(4-甲基-4-甲基二硫基)-戊酰氨基-乙氧基)-2，6-二-(羟基甲基)-吡 啶可如下制备:

向4-(2-叔丁氧基羰基氨基-乙氧基)-2，6-二-(羟基甲基)-吡啶(656mg) 在二噁烷(3.5mL)中的溶液中加入盐酸4N二噁烷(5.5mL)溶液。在室温下 4小时后，反应混合物真空浓缩得到残余物(603mg)。

向上述残余物(150mg)在二甲基甲酰胺(3.5mL)中的溶液中加入三乙 胺(267μL)、4-甲基-4-甲基二硫基-戊酸(149mg)、N，N’-二异丙基碳化二亚 胺(119μL)和1-羟基苯并三唑水合物(49mg)。在室温下15小时后，向反 应混合物中加入水，水溶液用乙酸乙酯提取三次。合并的有机溶液用饱 和氯化钠水溶液洗涤，用硫酸镁干燥，真空浓缩得到残余物。残余物用 硅胶色谱法(Interchrom Puriflash 20g柱，SiOH 15-35μm)纯化，使用甲醇 (A)/二氯甲烷(B)的混合物进行梯度洗脱，(梯度:100％ B下降至10％ A: 90％ B)得到4-(2-(4-甲基-4-甲基二硫基)-戊酰氨基-乙氧基)-2，6-二-(羟基 甲基)-吡啶(81mg):

LC/MS(方法A3):ESm/z＝375MH⁺

                m/z＝156C₇H₁₀NO₃⁺

              保留时间＝2.2分钟

¹H N.M.R.(400MHz，DMSO-d₆，δ ppm):δ＝1，22(s，6H)；1，79(m，2H)； 2，19(m，2H)；2，39(s，3H)；3，43(q，J＝5，5Hz，2H)；4，06(t，J＝5，5Hz，2H)； 4，45(d b，J＝6，0Hz，4H)；5，33(d，J＝6，0Hz，2H)；6，84(s，2H)；8，13(t b， J＝5，5Hz，1H)。

4-(2-叔丁氧基羰基氨基-乙氧基)-2，6-二-(羟基甲基)-吡啶

根据制备4-(3-叔丁氧基羰基氨基-丙氧基)-2，6-二-(羟基甲基)吡啶 的方法，用4-(2-叔丁氧基羰基氨基-乙氧基)-吡啶-2，6-二羧酸二乙酯为原 料，可制备4-(2-叔丁氧基羰基氨基-乙氧基)-2，6-二-(羟基甲基)-吡啶。

LC/MS(方法A3):ES m/z＝299MH⁺

                 m/z＝156C₇H₁₀NO₃⁺

              保留时间＝1.7分钟

¹H N.M.R.(300MHz，DMSO-d₆，δ ppm):δ＝1，39(s，9H)；3，32(m部分掩蔽， 2H)；4，03(t，J＝6，0Hz，2H)；4，46(d，J＝6，0Hz，4H)；5，30(t，J＝6，0Hz，2H)； 6，83(s，2H)；7，00(t b，J＝6，0Hz，1H)。

4-(2-叔丁氧基羰基氨基-乙氧基)-吡啶-2，6-二羧酸二乙酯

根据4-(2-叔丁氧基羰基氨基-丙氧基)-吡啶-2，6-二羧酸二乙酯的制 备方法，以2-叔丁氧基羰基氨基-乙基溴为原料，可制备4-(2-叔丁氧基 羰基氨基-乙氧基)-吡啶-2，6-二羧酸二乙酯。

LC/MS(方法A3):ES m/z＝383MH⁺

                 m/z＝240C₁₁H₁₄NO₅⁺

              保留时间＝3.6分钟

¹H N.M.R.(300MHz，DMSO-d₆，δ ppm):δ＝1，23(t，J＝7，0Hz，6H)；1，37(s， 9H)；3，33(m部分掩蔽，2H)；4，22(t，J＝5，5Hz，2H)；4，38(q，J＝7，0Hz，4H)； 7，01(t b，J＝5，5Hz，1H)；7，71(s，2H)。

实施例19:

8，8’-[(1-(2-(4-甲基-4-甲基二硫基)-戊酰氨基-乙氧基)-苯-3，5-二甲基)-二 氧基]-二[(S)-2-亚乙-(E)-基-7-二甲氧基-1，2，3，11a-四氢-吡咯并[2，1-c][1，4] 苯并二氮杂-5-酮]

根据8，8’-[(4-(2-(4-甲基-4-甲基二硫基)-戊酰氨基-乙氧基)-吡啶-2，6- 二甲基)-二氧基]-二[(S)-2-亚乙-(E)-基-7-二甲氧基-1，2，3，11a-四氢-吡咯并 [2，1-c][1，4]苯并二氮杂-5-酮]的制备方法，用1-(2-(4-甲基-4-甲基二硫 基)-戊酰氨基-乙氧基)-3，5-二-(羟基甲基)-苯为原料，可制备 8，8’-[(1-(2-(4-甲基-4-甲基二硫基)-戊酰氨基-乙氧基)-苯-3，5-二甲基)-二 氧基]-二[(S)-2-亚乙-(E)-基-7-二甲氧基-1，2，3，11a-四氢-吡咯并[2，1-c][1，4] 苯并二氮杂-5-酮]:

LC/MS(方法A1，Platform I):ES:m/z＝882MH⁺

                          保留时间＝4.13分钟

¹H N.M.R.(500MHz，CDCl₃-d1，δ ppm):1，30(s，6H)；1，75(d，J＝6，5Hz， 6H)；1，96(m，2H)；2，31(m，2H)；2，40(s，3H)；2，97(m，4H)；3，66(m，2H)； 3，89(m，2H)；3，97(s，6H)；4，04(t，J＝5，5Hz，2H)；4，27(s b，4H)；5，14(d， J＝12，5Hz，2H)；5，19(d，J＝12，5Hz，2H)；5，61(m，2H)；5，93(t，J＝6，0Hz，1H)； 6，82(s，2H)；6，94(s b，2H)；7，09(s b，1H)；7，53(s，2H)；7，64(d，J＝4，5Hz， 2H)。

1-(2-(4-甲基-4-甲基二硫基)-戊酰氨基-乙氧基)-3，5-二-(羟基甲基)-苯

根据4-(2-(4-甲基-4-甲基二硫基)-戊酰氨基-乙氧基)-2，6-二-(羟基甲 基)-吡啶的制备方法，用1-(2-叔丁氧基羰基氨基-乙氧基)-3，5-二-(羟基甲 基)-苯可制备1-(2-(4-甲基-4-甲基二硫基)-戊酰氨基-乙氧基)-3，5-二-(羟 基甲基)-苯:

¹H N.M.R.(400MHz，CDCl₃-d1，δppm):δ＝1，22(s，6H)；1，80(m，2H)； 2，20(m，2H)；2，39(s，3H)；3，40(q，J＝6，0Hz，2H)；3，95(t，J＝6，0Hz，2H)； 4，44(d，J＝6，0Hz，4H)；5，11(t b，J＝6，0Hz，2H)；6，73(s b，2H)；6，84(s b，1H)； 8，09(t b，1H)。

1-(2-叔丁氧基羰基氨基-乙氧基)-3，5-二-(羟基甲基)-苯

根据5-(3-邻苯二甲酰亚氨基-丙氧基)-1，3-二-(羟基甲基)-苯的制备 方法，用2-叔丁氧基羰基氨基-乙基溴可制备1-(2-叔丁氧基羰基氨基- 乙氧基)-3，5-二-(羟基甲基)-苯:

LC/MS(方法A3):ES m/z＝298MH⁺

                 m/z＝242(M+2H-tBu)⁺

                 m/z＝224(m/z＝242-H₂O)⁺

                 m/z＝206(m/z＝224-H₂O)⁺

                 m/z＝162(m/z＝206-CO₂)⁺

              保留时间＝2.7分钟

¹H N.M.R.(500MHz，DMSO-d₆，δ ppm):δ＝1，39(s，9H)；3，28(q，J＝6，0Hz， 2H)；3，91(t，J＝6，0Hz，2H)；4，44(d，J＝6，0Hz，4H)；5，14(t，J＝6，0Hz，2H)； 6，72([epsilon]b，2H)；6，83(s b，1H)；7，01(t b，J＝7，0Hz，1H)。

实施例20:

8，8’-[(4-(3-(4-甲基-4-甲基二硫基)-戊酰氨基-丙氧基)-吡啶-2，6-二甲 基)-二氧基]-二[(S)-2-亚乙-(E)-基-7-二甲氧基-1，2，3，11a-四氢-吡咯并 [2，1-c][1，4]苯并二氮杂-5-酮]可如下制备:

向4-(3-(4-甲基-4-甲基二硫基)-戊酰氨基-丙氧基)-2，6-二-(羟基甲 基)-吡啶(55mg)和三乙胺(99μL)在二氯甲烷(2mL)中的冷却(0℃)溶液中 加入甲磺酰氯(36μL)。30分钟后，加入水，分层，水层用二氯甲烷提取 两次。合并有机溶液用硫酸镁干燥，真空浓缩得到残余物(95mg)。

向pre-茅屋霉素(50mg)在二甲基甲酰胺(0.75mL)中的溶液中加入碳 酸钾(114mg)、上述残余物(55mg)在二甲基甲酰胺(1mL)中的溶液和碘化 钾(46mg)。反应物在30℃搅拌20小时，过滤出固体，用二甲基甲酰胺 洗涤。在合并的二甲基甲酰胺溶液中加入水，加入甲酸直到沉淀完全消 失。得到的溶液根据方法B注射进行HPLC纯化。合并合适的馏分，用 Jouan Model RC10.10.装置离心蒸发浓缩得到8，8’-[(4-(3-(4-甲基-4-甲基 二硫基)-戊酰氨基-丙氧基)-吡啶-2，6-二甲基)-二氧基]-二[(S)-2-亚乙-(E)- 基-7-二甲氧基-1，2，3，11a-四氢-吡咯并[2，1-c][1，4]苯并二氮杂-5- 酮](13.5mg)。

LC/MS(方法A3):ES m/z＝897MH⁺

                 m/z＝664(M-C₁₀H₂₀NOS₂+2H)⁺

                 m/z＝234C₁₀H₂₀NOS₂⁺

              保留时间＝3.7分钟

¹H N.M.R.(500MHz，CD₃COOD-d₄，δ ppm):δ＝1，25(s，6H)；1，60-2，20(m 部分掩蔽，10H)；2，35(m，5H)；2，80-4，44(m，14H)；3，91(s，6H)；5，40(s， 4H)；5，62(m，2H)；6，83-7，95(m，8H)。

4-(3-(4-甲基-4-甲基二硫基)-戊酰氨基-丙氧基)-2，6-二-(羟基甲基)-吡 啶

根据4-(2-(4-甲基-4-甲基二硫基)-戊酰氨基-乙氧基)-2，6-二-(羟基甲 基)-吡啶的制备方法，用4-(3-叔丁氧基羰基氨基-丙氧基)-2，6-二-(羟基甲 基)-吡啶可制备4-(3-(4-甲基-4-甲基二硫基)-戊酰氨基-丙氧基)-2，6-二 -(羟基甲基)-吡啶:

LC/MS(方法A3):ESm/z＝389MH⁺

                m/z＝234(M-C₇H₈NO₃)⁺

                m/z＝156C₇H₁₀NO₃⁺

     保留时间＝2.3分钟

由实施例20化合物衍生的硫醇(SH)衍生物与下式化合物保护平衡:

实施例21:

8，8’-[(4-(4-(4-甲基-4-甲基二硫基)-戊酰氨基-丁氧基)-吡啶-2，6-二甲基)- 二氧基]-二[(S)-2-亚乙-(E)-基-7-二甲氧基-1，2，3，11a-四氢-吡咯并 [2，1-c][1，4]苯并二氮杂-5-酮]

根据8，8’-[(4-(3-(4-甲基-4-甲基二硫基)-戊酰氨基-丙氧基)-吡啶-2，6- 二甲基)-二氧基]-二[(S)-2-亚乙-(E)-基-7-二甲氧基-1，2，3，11a-四氢-吡咯 并[2，1-c][1，4]苯并二氮杂-5-酮]的制备方法，用4-(4-(4-甲基-4-甲基二 硫基)-戊酰氨基-丁氧基)-2，6-二-(羟基甲基)-吡啶可制备8，8’-[(4-(4-(4-甲 基-4-甲基二硫基)-戊酰氨基-丁氧基)-吡啶-2，6-二甲基)-二氧基]-二[(S)-2- 亚乙-(E)-基-7-二甲氧基-1，2，3，11a-四氢-吡咯并[2，1-c][1，4]苯并二氮杂 -5-酮]:

LC/MS(方法A1，Platform II):ES:m/z＝947MH⁺+2H₂O

                              m/z＝929MH⁺+H₂O

                              m/z＝911MH⁺

            保留时间＝3.74分钟

¹H N.M.R.(500MHz，CD₃COOD-d₄，δ ppm):δ＝1，26(s，6H)；1，59-1，76(m， 8H)；1，81-1，94(m，4H)；2，35(m，5H)；2，80-4，40(m，14H)；3，92(s，6H)； 5，39(m，4H)；5，50(m，2H)；6，72-7，95(m，8H)。

4-(4-(4-甲基-4-甲基二硫基)-戊酰氨基-丁氧基)-2，6-二-(羟基甲基)-吡 啶

根据4-(2-(4-甲基-4-甲基二硫基)-戊酰氨基-乙氧基)-2，6-二-(羟基甲 基)-吡啶的制备方法，用4-(4-叔丁氧基羰基氨基-丁氧基)-2，6-二-(羟基甲 基)-吡啶可制备4-(4-(4-甲基-4-甲基二硫基)-戊酰氨基-丁氧基)-2，6-二 -(羟基甲基)-吡啶:

LC/MS(方法A3):ES m/z＝403MH⁺

                 m/z＝248(M-C₇H₈NO₃)⁺

                 m/z＝156C₇H₁₀NO₃⁺

              保留时间＝2.3分钟

4-(4-叔丁氧基羰基氨基-丁氧基)-2，6-二-(羟基甲基)-吡啶

根据4-(3-叔丁氧基羰基氨基-丙氧基)-2，6-二-(羟基甲基)吡啶的制备 方法，用4-(4-叔丁氧基羰基氨基-丁氧基)-吡啶-2，6-二羧酸二乙酯可制备 4-(4-叔丁氧基羰基氨基-丁氧基)-2，6-二-(羟基甲基)-吡啶:

LC/MS(方法A3):ES m/z＝411MH⁺

                 m/z＝355(M+2H-tBu)⁺

         m/z＝240C₁₁H₁₄NO₅⁺

       保留时间＝3.9分钟

4-(4-叔丁氧基羰基氨基-丁氧基)-吡啶-2，6-二羧酸二乙酯

根据4-(3-叔丁氧基羰基氨基-丙氧基)-吡啶-2，6-二羧酸二乙酯的制 备方法，用甲磺酸4-叔丁氧基羰基氨基-丁基酯(Cazenave Gassiot，A.； Charton，J.；Girault-Mizzi，S.；Gilleron，P.；Debreu-Fontaine，M-A.； Sergheraert，C；Melnyk，P.Bioorg.Med.Chem.Lett.2005，15(21)，4828)可 制备4-(4-叔丁氧基羰基氨基-丁氧基)-吡啶-2，6-二羧酸二乙酯:

LC/MS(方法A3):ESm/z＝327MH⁺

                m/z＝271(M+2H-tBu)⁺

                m/z＝156C₇H₁₀NO₃⁺

              保留时间＝2.0分钟

实施例22:

8，8’-[(4-(3-[4-(4-甲基-4-甲基二硫基-戊酰基)-哌嗪-1-基]-丙基)-吡啶 -2，6-二甲基)-二氧基]-二[(S)-2-亚乙-(E)-基-7-二甲氧基-1，2，3，11a-四氢-吡 咯并[2，1-c][1，4]苯并二氮杂-5-酮]

根据8，8’-[(4-(3-(4-甲基-4-甲基二硫基)-戊酰氨基-丙氧基)-吡啶-2，6- 二甲基)-二氧基]-二[(S)-2-亚乙-(E)-基-7-二甲氧基-1，2，3，11a-四氢-吡咯 并[2，1-c][1，4]苯并二氮杂-5-酮]的制备方法，用4-(3-[4-(4-甲基-4-甲基 二硫基-戊酰基)-哌嗪-1-基]-丙基)-2，6-二-(羟基甲基)-吡啶可制备 8，8’-[(4-(3-[4-(4-甲基-4-甲基二硫基-戊酰基)-哌嗪-1-基]-丙基)-吡啶-2，6- 二甲基)-二氧基]-二[(S)-2-亚乙-(E)-基-7-二甲氧基-1，2，3，11a-四氢-吡咯并 [2，1-c][1，4]苯并二氮杂-5-酮]:

LC/MS(方法A1，Platform II):ES:m/z＝950MH⁺

                           保留时间＝3.32分钟

¹H N.M.R.(500MHz，CDCl₃，δ ppm):δ＝1，32(s，6H)；1，76(d，J＝6，5Hz，6H)； 1，80(m，2H)；1，94(m，2H)；2，27-2，46(m，11H)；2，67(m，2H)；2，97(m，4H)； 3，40-3，70(m，4H)；3，90(m，2H)；4，00(s，6H)；4，27(s b，4H)；5，29(s b，4H)； 5，60(q b，J＝6，5Hz，2H)；6，86(s，2H)；7，30(s，2H)；7，56(s，2H)；7，65(d， J＝4，5Hz，2H)。

4-(3-[4-(4-甲基-4-甲基二硫基-戊酰基)-哌嗪-1-基]-丙基)-2，6-二-(羟 基甲基)-吡啶可如下制备:

向4-(3-(4-叔丁氧基羰基-哌嗪-1-基)-丙基)-2，6-二-(羟基甲基)-吡啶 (610mg)在二噁烷(10mL)中的溶液中加入盐酸4N二噁烷(2.5mL)溶液。在 室温下4小时后，反应混合物真空浓缩得到残余物(650mg)。

向上述残余物(160mg)样品在二甲基甲酰胺(2.5mL)中的溶液中加入 N，N-二异丙基乙胺(181μL)、4-甲基-4-甲基二硫基-戊酸(158mg)、N，N’- 二异丙基碳化二亚胺(88μL)和1-羟基苯并三唑水合物(15mg)。在室温下 15小时后，过滤出固体，二甲基甲酰胺溶液根据方法F进行注射HPLC。 合并合适的馏分，冻干浓缩得到4-(3-[4-(4-甲基-4-甲基二硫基-戊酰基)- 哌嗪-1-基]-丙基)-2，6-二-(羟基甲基)-吡啶(105mg):

LC/MS(方法A3):ESm/z＝442MH⁺

           m/z＝266(M+2H-C₇H₁₃OS₂)⁺

          保留时间＝2.3分钟

¹H N.M.R.(400MHz，DMSO-d₆，δ ppm):δ＝1，27(s，6H)；1，70-1，83(m，4H)； 2，25-2，39(m，8H)；2，40(s，3H)；2，63(m，2H)；3，43(m，4H)；4，49(s，4H)； 5，28(m b，2H)；7，18(s，2H)。

4-(3-(4-叔丁氧基羰基-哌嗪-1-基)-丙基)-2，6-二-(羟基甲基)-吡啶

根据4-(3-叔丁氧基羰基氨基-丙氧基)-2，6-二-(羟基甲基)吡啶的制备 方法，用4-[3-(4-叔丁氧基羰基-哌嗪-1-基)-丙基]-吡啶-2，6-二羧酸二乙酯 可制备4-(3-(4-叔丁氧基羰基-哌嗪-1-基)-丙基)-2，6-二-(羟基甲基)-吡啶:

LC/MS(方法A3):ES m/z＝366MH⁺

                 m/z＝310(M+2H-tBu)⁺

                 m/z＝266(M+2H-CO₂tBu)⁺

              保留时间＝0.5分钟

¹H N.M.R.(400MHz，DMSO-d₆，δ ppm):δ＝1，39(s，9H)；1，73(m，2H)； 2，29(m，6H)；2，61(m，2H)；3，30(m部分掩蔽，4H)；4，49(d，J＝6，0Hz，4H)； 5，30(t b，J＝6，0Hz，2H)；7，18(s，2H)。

4-[3-(4-叔丁氧基羰基-哌嗪-1-基)-丙基]-吡啶-2，6-二羧酸二乙酯

根据5-(3-叔丁氧基羰基-N-甲基-氨基-丙基)-苯-1，3-二羧酸二乙酯的 制备方法，用4-[3-(4-叔丁氧基羰基-哌嗪-1-基)-丙-1-炔基]-吡啶-2，6-二羧 酸二乙酯可制备4-[3-(4-叔丁氧基羰基-哌嗪-1-基)-丙基]-吡啶-2，6-二羧 酸二乙酯:

LC/MS(方法A3):ES m/z＝450MH⁺

                 m/z＝394(M+2H-tBu)⁺

                 m/z＝350(M+2H-CO₂tBu)⁺

              保留时间＝2.4分钟

¹H N.M.R.(400MHz，DMSO-d₆，δ ppm):δ＝1，35(t，J＝7，0Hz，6H)；1，39(s， 9H)；1，79(m，2H)；2，27(m，6H)；2，80(m，2H)；3，29(m，4H)；4，39(q， J＝7，0Hz，4H)；8，12(s，2H)。

4-[3-(4-叔丁氧基羰基-哌嗪-1-基)-丙-1-炔基]-吡啶-2，6-二羧酸二乙 酯

根据5-(3-叔丁氧基羰基-N-甲基-氨基-丙炔-1-基)-苯-1，3-二羧酸二乙 酯的制备方法，用4-三氟甲基磺酰氧基-吡啶-2，6-二羧酸二乙酯和叔丁基 -4-炔丙基-哌嗪-1-羧酸酯(Zheng，H.；Weiner，L.M.；Bar-Am，O.；Epsztejn， S.；Cabantchik，Z.I.；Warshawsky，A.；Youdim，M.B.H.；和Fridkin，M. Bioorg.Med.Chem.2005，3，773)可制备4-[3-(4-叔丁氧基羰基-哌嗪-1- 基)-丙-1-炔基]-吡啶-2，6-二羧酸二乙酯。

E1(方法C)m/z＝445M⁺

         m/z＝388(M-C₄H₉)⁺

         m/z＝344(m/z＝388-CO₂)⁺

         m/z＝57C₄H₉⁺

¹H N.M.R.(400MHz，CDCl₃-d1，δppm):δ＝1，46(t，J＝7，0Hz，6H)；1，48(s， 9H)；2，60(m b，4H)；3，52(m b，4H)；3，62(s b，2H)；4，49(q，J＝7，0Hz，4H)； 8，23(s，2H)。

4-三氟甲基磺酰氧基-吡啶-2，6-二羧酸二乙酯可如下制备:

向白屈氨酸二乙酯(Chaubet，F.；Nguyen van duong，M.；Gref，A.； Courtieu，J.；Crumbliss，A.L.；Gaudemer，A.Tetrahedron Lett.1990，31(40)， 5729-5732)(3.5g)在吡啶(35mL)中的冷却(0℃)溶液中滴加三氟甲基磺酰 氯(2.6mL)。反应物随后在室温下搅拌3小时，加入水和乙酸乙酯。分层， 水层用乙酸乙酯提取两次。合并的有机溶液用硫酸镁干燥，真空浓缩成 残余物。残余物用硅胶色谱法(Merck SuperVarioPrep 90g柱，Si60 15-40μm)纯化，用二氯甲烷洗脱，得到4-三氟甲基磺酰氧基-吡啶-2，6- 二羧酸二乙酯(4.2g)。

LC/MS(方法A1，Platform I):ESm/z＝372MH⁺

                          保留时间＝4.38分钟

实施例23:

8，8’-[(1-(3-[4-(4-甲基-4-甲基二硫基-戊酰基)-哌嗪-1-基]-丙基)-苯-3，5-二 甲基)-二氧基]-二[(S)-2-亚乙-(E)-基-7-二甲氧基-1，2，3，11a-四氢-吡咯并 [2，1-c][1，4]苯并二氮杂-5-酮]

根据8，8’-[(4-(3-(4-甲基-4-甲基二硫基)-戊酰氨基-丙氧基)-吡啶-2，6- 二甲基)-二氧基]-二[(S)-2-亚乙-(E)-基-7-二甲氧基-1，2，3，11a-四氢-吡咯并 [2，1-c][1，4]苯并二氮杂-5-酮]的制备方法，用1-(3-[4-(4-甲基-4-甲基二 硫基-戊酰基)-哌嗪-1-基]-丙基)-3，5-二-(羟基甲基)-苯可以使用 8，8’-[(1-(3-[4-(4-甲基-4-甲基二硫基-戊酰基)-哌嗪-1-基]-丙基)-苯-3，5-二 甲基)-二氧基]-二[(S)-2-亚乙-(E)-基-7-二甲氧基-1，2，3，11a-四氢-吡咯并 [2，1-c][1，4]苯并二氮杂-5-酮]:

LC/MS(方法A3):ES m/z＝949MH⁺

                 m/z＝475，3(M+2H)²⁺/2

              保留时间＝3.3分钟

1-(3-[4-(4-甲基-4-甲基二硫基-戊酰基)-哌嗪-1-基]-丙基)-3，5-二-(羟基甲 基)-苯

根据4-(3-[4-(4-甲基-4-甲基二硫基-戊酰基)-哌嗪-1-基]-丙基)-2，6-二 -(羟基甲基)-吡啶的制备方法，以1-(3-(4-叔丁氧基羰基-哌嗪-1-基)-丙 基)-3，5-二-(羟基甲基)-苯为原料，可制备1-(3-[4-(4-甲基-4-甲基二硫基- 戊酰基)-哌嗪-1-基]-丙基)-3，5-二-(羟基甲基)-苯:

LC/MS(方法A3):ES m/z＝441MH⁺

              保留时间＝2.4分钟

¹H N.M.R.(400MHz DMSO-d₆，δppm):δ＝1，26(s，6H)；1，71(m，2H)； 1，79(m，2H)；2，22-2，40(m，8H)；2，39(s，3H)；2，58(m，2H)；3，44(m，4H)； 4，45(d，J＝6，0Hz，4H)；5，09(t，J＝6，0Hz，2H)；7，00(s b，2H)；7，08(s b，1H)。

1-(3-(4-叔丁氧基羰基-哌嗪-1-基)-丙基)-3，5-二-(羟基甲基)-苯

根据5-(3-叔丁氧基羰基-N-甲基-氨基-丙基)-1，3-二-(羟基甲基)-苯的 制备方法，以5-[3-(4-叔丁氧基羰基-哌嗪-1-基)-丙基]-邻苯二甲酸二甲基 酯为原料可制备1-(3-(4-叔丁氧基羰基-哌嗪-1-基)-丙基)-3，5-二-(羟基甲 基)-苯:

LC/MS(方法A3):ES m/z＝365MH⁺

                 m/z＝309(M+2H-tBu)⁺

              保留时间＝2.0分钟

¹H N.M.R.(300MHz，DMSO-d₆，δ ppm):δ＝1，39(s，9H)；1，71(m，2H)； 2，28(m，6H)；2，57(m，2H)；3，29(m部分掩蔽，4H)；4，44(d，J＝6，0Hz，4H)； 5，08(t，J＝6，0Hz，2H)；7，00(s b，2H)；7，08(s b，1H)。

5-[3-(4-叔丁氧基羰基-哌嗪-1-基)-丙基]-邻苯二甲酸二甲基酯

根据5-(3-叔丁氧基羰基-N-甲基-氨基-丙基)-苯-1，3-二羧酸二乙基酯 的制备方法，以5-[3-(4-叔丁氧基羰基-哌嗪-1-基)-丙-1-炔基]-邻苯二甲酸 二甲基酯为原料可制备5-[3-(4-叔丁氧基羰基-哌嗪-1-基)-丙基]-邻苯二 甲酸二甲基酯:

LC/MS(方法A3):ES m/z＝421MH⁺

                 m/z＝365(M+2H-tBu)⁺

                 m/z＝321(M+2H-CO₂tBu)⁺

              保留时间＝2.7分钟

¹H N.M.R.(400MHz，DMSO-d₆，δppm):δ＝1，39(s，9H)；1，74(m，2H)； 2，28(m，6H)；2，75(m，2H)；3，30(m部分掩蔽，4H)；3，89(s，6H)；8，08(d， J＝2，0Hz，2H)；8，32(t，J＝2，0Hz，1H)。

5-[3-(4-叔丁氧基羰基-哌嗪-1-基)-丙-1-炔基]-邻苯二甲酸二甲基酯

根据5-(3-叔丁氧基羰基-N-甲基-氨基-丙-1-炔基)-苯-1，3-二羧酸二乙 酯的制备方法，用叔丁基-4-炔丙基-哌嗪-1-羧酸酯为原料，可制备 5-[3-(4-叔丁氧基羰基-哌嗪-1-基)-丙-1-炔基]-邻苯二甲酸二甲基酯:

LC/MS(方法A3):ESm/z＝417MH⁺

                m/z＝361(M+2H-tBu)⁺

                m/z＝317(M+2H-CO₂tBu)⁺

              保留时间＝3.1分钟

¹H N.M.R.(400MHz，DMSO-d₆，δppm):δ＝1，40(s，9H)；2，50(m掩蔽，4H)； 3，35(m，4H)；3，61(s，2H)；3，90(s，6H)；8，14(s b，2H)；8，40(s b，1H)。

实施例24:

8，8’-[(4-(2-{2-[2-(4-甲基-4-甲基二硫基-戊酰基氨基)-乙氧基]-乙氧 基}-乙氧基)-吡啶-2，6-二甲基)-二氧基]-二[(S)-2-亚乙-(E)-基-7-二甲氧基 -1，2，3，11a-四氢-吡咯并[2，1-c][1，4]苯并二氮杂-5-酮]

根据8，8’-[(4-(3-(4-甲基-4-甲基二硫基)-戊酰氨基-丙氧基)-吡啶-2，6- 二甲基)-二氧基]-二[(S)-2-亚乙-(E)-基-7-二甲氧基-1，2，3，11a-四氢-吡咯 并[2，1-c][1，4]苯并二氮杂-5-酮]的制备方法，用4-(2-{2-[2-(4-甲基-4- 甲基二硫基-戊酰基氨基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-2，6-二-(羟基甲基)- 吡啶可制备8，8’-[(4-(2-{2-[2-(4-甲基-4-甲基二硫基-戊酰基氨基)-乙氧 基]-乙氧基}-乙氧基)-吡啶-2，6-二甲基)-二氧基]-二[(S)-2-亚乙-(E)-基-7- 二甲氧基-1，2，3，11a-四氢-吡咯并[2，1-c][1，4]苯并二氮杂-5-酮]:

LC/MS(方法A3):ES m/z＝971MH⁺

                 m/z＝486，3(M+2H)²⁺/2

              保留时间＝3.60分钟

¹H N.M.R.(500MHz，CDCl₃-d1，δppm):δ＝1，28(s，6H)；1，76(d，J＝6，5Hz， 6H)；1，94(m，2H)；2，26(m，2H)；2，40(s，3H)；2，98(m，4H)；3，36-3，95(m， 12H)；4，00(s，6H)；4，18(m，2H)；4，28(s b，4H)；5，27(m，4H)；5，61(m， 2H)；5，97(m b，1H)；6，84(s，2H)；7，01(s b，2H)；7，56(s，2H)；7，64(d， J＝4，5Hz，2H)。

4-(2-{2-[2-(4-甲基-4-甲基二硫基-戊酰基氨基)-乙氧基]-乙氧基}-乙 氧基)-2，6-二-(羟基甲基)-吡啶

根据4-(3-[4-(4-甲基-4-甲基二硫基-戊酰基)-哌嗪-1-基]-丙基)-2，6-二 -(羟基甲基)-吡啶的制备方法，用4-(2-{2-[2-叔丁氧基羰基氨基-乙氧基]- 乙氧基}-乙氧基)-2，6-二-(羟基甲基)-吡啶为原料，制备4-(2-{2-[2-(4-甲基 -4-甲基二硫基-戊酰基氨基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-2，6-二-(羟基甲 基)-吡啶:

LC/MS(方法A3):ESm/z＝463MH⁺

              保留时间＝2.3分钟

¹H N.M.R.(400MHz，DMSO-d₆，δ ppm):δ＝1，22(s，6H)；1，79(m，2H)； 2，15(m，2H)；2，39(s，3H)；3，18(q，J＝6，0Hz，2H)；3，40(t，J＝6，0Hz，2H)； 3，52(m，2H)；3，60(m，2H)；3，76(m，2H)；4，18(m，2H)；4，45(s，4H)； 5，32(m b，2H)；6，85(s，2H)；7，90(t b，J＝6，0Hz，1H)。

4-(2-{2-[2-叔丁氧基羰基氨基-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-2，6-二-(羟 基甲基)-吡啶

根据4-(3-叔丁氧基羰基氨基-丙氧基-)-2，6-二-(羟基甲基)吡啶，用 4-(2-{2-[2-叔丁氧基羰基氨基-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-吡啶-2，6-二羧 酸二乙酯为原料，可制备4-(2-{2-[2-叔丁氧基羰基氨基-乙氧基]-乙氧基}- 乙氧基)-2，6-二-(羟基甲基)-吡啶:

LC/MS(方法A3):ESm/z＝387MH⁺

                m/z＝331(M+2H-tBu)⁺

             保留时间＝2.0分钟

¹H N.M.R.(400MHz，DMSO-d₆，δppm):δ＝1，37(s，9H)；3，07(q，J＝6，0Hz， 2H)；3，39(t，J＝6，0Hz，2H)；3，51(m，2H)；3，59(m，2H)；3，73(m，2H)； 4，18(m，2H)；4，45(d，J＝6，0Hz，4H)；5，31(t，J＝6，0Hz，2H)；6，73(t b， J＝6，0Hz，1H)；6，85(s，2H)。

4-(2-{2-[2-叔丁氧基羰基氨基-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-吡啶-2，6-二 羧酸二乙酯可如下制备:

向4-(2-{2-[2-叠氮基-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-吡啶-2，6-二羧酸二 乙酯(Roy，B.C.；Santos，M.；Mallik，S.；D.Campiglia，A.D.J.Org.Chem. 2003，68(10)，3999)(900mg)在乙酸乙酯(18mL)中的溶液加入二叔丁基焦 碳酸酯(545mg)和10％钯/碳(73mg)。溶液在室温下在氢气气氛(2bar)下 搅拌18小时，过滤出固体，真空除去溶剂得到残余物。残余物用硅胶 色谱法(Analogix Super Flash SiO₂ SF25-34g)纯化，用二氯甲烷(A)和甲醇 (B)的混合物梯度洗脱(梯度:100％ A下降至97.5％ A:2.5％ B)得到 4-(2-{2-[2-叔丁氧基羰基氨基-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-吡啶-2，6-二羧酸 二乙酯(760mg):

LC/MS(方法A3):ESm/z＝471MH⁺

                m/z＝415(M+2H-tBu)⁺

                m/z＝371(M+2H-CO₂tBu)⁺

              保留时间＝3.6分钟

¹H N.M.R.(300MHz1 DMSO-d₆，δppm):δ＝1，32(t，J＝7，0Hz，6H)；1，36(s， 9H)；3，04(q，J＝6，0Hz，2H)；3，38(t，J＝6，0Hz，2H)；3，51(m，2H)；3，59(m， 2H)；3，79(m，2H)；4，25(m掩蔽，2H)；4，29(q，J＝7，0Hz，4H)；6，70(t b， J＝6，0Hz，1H)；7，73(s，2H)。

实施例25:

8，8’-[(1-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(4-甲基-4-甲基二硫基-戊酰基氨基)-乙氧 基]-乙氧基}-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-苯-3，5-二甲基)-二氧基]- 二[(S)-2-亚乙-(E)-基-7-二甲氧基-1，2，3，11a-四氢-吡咯并[2，1-c][1，4]苯并 二氮杂-5-酮]

根据8，8’-[(4-(3-(4-甲基-4-甲基二硫基)-戊酰氨基-丙氧基-)-吡啶 -2，6-二甲基)-二氧基]-二[(S)-2-亚乙-(E)-基-7-二甲氧基-1，2，3，11a-四氢- 吡咯并[2，1-c][1，4]苯并二氮杂-5-酮]的制备方法，用 1-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(4-甲基-4-甲基二硫基-戊酰基氨基)-乙氧基]-乙氧基}- 乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-3，5-二-(羟基甲基)-苯，可制备 8，8’-[(1-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(4-甲基-4-甲基二硫基-戊酰基氨基)-乙氧基]-乙 氧基}-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-苯-3，5-二甲基)-二氧基]-二 [(S)-2-亚乙-(E)-基-7-二甲氧基-1，2，3，11a-四氢-吡咯并[2，1-c][1，4]苯并二 氮杂-5-酮]:

LC/MS(方法A1，Platform II):ES:m/z＝1102MH+

                          保留时间＝4.49分钟

¹H N.M.R.(500MHz，CDCl₃-d1，δppm):δ＝1，30(s，6H)；1，75(d，J＝6，5Hz， 6H)；1，95(m，2H)；2，28(m，2H)；2，41(s，3H)；2，97(m，4H)；3，33-3，96(m， 24H)；3，96(s，6H)；4，12(m，2H)；4，27(s b，4H)；5，07-5，24(m，4H)；5，60(m， 2H)；6，21(m b，1H)；6，81(s，2H)；6，96(s，2H)；7，07(s，1H)；7，51(s，2H)； 7，65(d，J＝4，5Hz，2H)。

1-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(4-甲基-4-甲基二硫基-戊酰基氨基)-乙氧基]-乙 氧基}-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-3，5-二-(羟基甲基)-苯

根据1-(3-(4-甲基-4-甲基二硫基)-戊酰氨基-丙氧基-)-3，5-二-(羟基甲 基)-苯的制备方法，用1-(2-{2-[2-(2-{2-[2-氨基-乙氧基]-乙氧基}-乙氧 基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-3，5-二-(羟基甲基)-苯为原料，可制备 1-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(4-甲基-4-甲基二硫基-戊酰基氨基)-乙氧基]-乙氧 基}-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-3，5-二-(羟基甲基)-苯:

LC/MS(方法G1):ESm/z＝594MH+

              保留时间＝1.9分钟。

1-(2-{2-[2-(2-{2-[2-氨基-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-乙氧基]-乙氧 基}-乙氧基)-3，5-二-(羟基甲基)-苯可如下制备:

向1-(2-{2-[2-(2-{2-[2-叠氮基-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-乙氧基]-乙 氧基}-乙氧基)-3，5-二-(羟基甲基)-苯(540mg)在THF(5.5mL)中的溶液中 加入三苯基膦(320mg)和水(22)，溶液在室温下搅拌18小时，真空除 去溶剂成残余物。残余物用硅胶色谱法(Merck SuperVarioFlash 30g柱， Si6015-40)纯化，用二氯甲烷/甲醇 95:5，随后用二氯甲烷/甲醇/ NH₄OH 75:25:2.5洗脱，得到1-(2-{2-[2-(2-{2-[2-氨基-乙氧基]-乙氧基}- 乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-3，5-二-(羟基甲基)-苯(430mg):

LC/MS(方法A3):ES:m/z＝418MH⁺

              保留时间＝1.3and1.7分钟

1-(2-{2-[2-(2-{2-[2-叠氮基-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-乙氧基]-乙氧 基}-乙氧基)-3，5-二-(羟基甲基)-苯可如下制备:

向2-[2-(2-{2-[2-(2-叠氮基-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-乙氧 基]-乙醇(1.6g)和三乙胺(1.45mL)在二氯甲烷(40mL)中的冷却(0℃)溶液 中加入甲磺酰氯(617)，1小时后，加入水。分层，有机层用硫酸镁干 燥，真空浓缩得到残余物(1.83g)。将残余物样品(1.4g)、3，5-二羟基甲基 苯酚(510mg)和碳酸钾(686mg)在二甲基甲酰胺(8mL)中混合，加热到70 ℃15小时。将反应混合物冷却到室温，加入水，水溶液用乙酸乙酯提取 三次。合并的有机溶液用饱和氯化钠水溶液洗涤，用硫酸镁干燥，真空 浓缩成残余物。残余物用硅胶色谱法(Merck SuperVarioPrep 70g柱， Si60 15-40)，用甲醇(A)/二氯甲烷(B)的混合物洗脱，(梯度:2％A: 98％ B至10％ A:90％ B)得到1-(2-{2-[2-(2-{2-[2-叠氮基-乙氧基]-乙氧基}- 乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-3，5-二-(羟基甲基)-苯(540mg): C1(方法D):m/z＝461MNH₄⁺

2-[2-(2-{2-[2-(2-叠氮基-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-乙氧基]- 乙醇可如下制备:

向2-[2-(2-{2-[2-(2-甲苯磺酰氧基-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧 基)-乙氧基]-乙醇(Loiseau，F.A.；Hii，K.K.；Hill，A.M.J.Org.Chem.2004， 69，639)(4.5g)在二氯甲烷(30mL)中的溶液中加入叠氮化钠(0.89g)。溶液 在70℃搅拌18小时，随后真空除去溶剂得到残余物。加入二氯甲烷， 过滤出生成的沉淀。将有机层真空浓缩得到2-[2-(2-{2-[2-(2-叠氮基-乙氧 基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-乙氧基]-乙醇(3.1g):

Cl(方法D):m/z＝325MNH₄⁺

实施例26:

8，8’-[(1-(2-{2-[2-(4-甲基-4-甲基二硫基-戊酰基氨基)-乙氧基]-乙氧基}-乙 氧基)-苯-3，5-二甲基)-二氧基]-二[(S)-2-亚乙-(E)-基-7-二甲氧基 -1，2，3，11a-四氢-吡咯并[2，1-c][1，4]苯并二氮杂-5-酮]

根据8，8’-[(4-(3-(4-甲基-4-甲基二硫基)-戊酰氨基-丙氧基-)-吡啶 -2，6-二甲基)-二氧基]-二[(S)-2-亚乙-(E)-基-7-二甲氧基-1，2，3，11a-四氢-吡 咯并[2，1-c][1，4]苯并二氮杂-5-酮]，用1-(2-{2-[2-(4-甲基-4-甲基二硫 基-戊酰基氨基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-3，5-二-(羟基甲基)-苯，可制备 8，8’-[(1-(2-{2-[2-(4-甲基-4-甲基二硫基-戊酰基氨基)-乙氧基]-乙氧基}-乙 氧基)-苯-3，5-二甲基)-二氧基]-二[(S)-2-亚乙-(E)-基-7-二甲氧基 -1，2，3，11a-四氢-吡咯并[2，1-c][1，4]苯并二氮杂-5-酮]:

LC/MS(方法A1，Platform II):ES:m/z＝970MH⁺

                     保留时间＝3.89分钟

¹H N.M.R.(500MHz，CDCl₃-d1，δppm):δ＝1，27(s，6H)；1，75(d，J＝6，5Hz， 6H)；1，94(m，2H)；2，26(m，2H)；2，40(s，3H)；2，98(m，4H)；3，35-3，92(m， 12H)；3，96(s，6H)；4，15(m，2H)；4，28(s b，4H)；5，10-5，23(m，4H)；5，60(q b，J＝6，5Hz，2H)；6，05(t b，J＝6，0Hz，1H)；6，81(s，2H)；6，98(s，2H)；7，09(s， 1H)；7，53(s，2H)；7，64(d，J＝4，5Hz，2H)。

1-(2-{2-[2-(4-甲基-4-甲基二硫基-戊酰基氨基)-乙氧基]-乙氧基}-乙 氧基)-3，5-二-(羟基甲基)-苯

根据1-(3-(4-甲基-4-甲基二硫基)-戊酰氨基-丙氧基-)-3，5-二-(羟基甲 基)-苯的制备方法，用1-(2-{2-[2-氨基-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-3，5-二 -(羟基甲基)-苯为原料，可制备1-(2-{2-[2-(4-甲基-4-甲基二硫基-戊酰基 氨基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-3，5-二-(羟基甲基)-苯:

LC/MS(方法A3):ES:m/z＝462MH⁺

                 m/z＝444(M+H-H₂O)⁺

              保留时间＝3.0分钟

1-(2-{2-[2-氨基-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-3，5-二-(羟基甲基)-苯

根据1-(2-{2-[2-(2-{2-[2-氨基-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-乙氧基]-乙 氧基}-乙氧基)-3，5-二-(羟基甲基)-苯的制备方法，用1-(2-{2-[2-叠氮基- 乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-3，5-二-(羟基甲基)-苯为原料，可制备 1-(2-{2-[2-氨基-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-3，5-二-(羟基甲基)-苯:

LC/MS(方法A3):ES:m/z＝286MH⁺

                 m/z＝268(M+H-H₂O)⁺

            保留时间＝0.8分钟

1-(2-{2-[2-叠氮基-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-3，5-二-(羟基甲基)-苯

根据1-(2-{2-[2-(2-{2-[2-叠氮基-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-乙氧基]- 乙氧基}-乙氧基)-3，5-二-(羟基甲基)-苯的制备方法，用2-[2-(2-叠氮基- 乙氧基)-乙氧基]-乙醇(Roy，B.C；Santos，M.；Mallik，S.；Campiglia，A.D. J.Org.Chem.2003，68(10)，3999)为原料，可制备1-(2-{2-[2-叠氮基-乙氧 基]-乙氧基}-乙氧基)-3，5-二-(羟基甲基)-苯:

Cl(方法D)m/z＝329MNH₄⁺。

实施例27:

8，8’-[(4-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(4-甲基-4-甲基二硫基-戊酰基氨基)-乙氧基]-乙 氧基}-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-吡啶-2，6-二甲基)-二氧基]-二 [(S)-2-亚乙-(E)-基-7-二甲氧基-1，2，3，11a-四氢-吡咯并[2，1-c][1，4]苯并二 氮杂-5-酮]

根据8，8’-[(4-(3-(4-甲基-4-甲基二硫基)-戊酰氨基-丙氧基-)-吡啶-2，6-二 甲基)-二氧基]-二[(S)-2-亚乙-(E)-基-7-二甲氧基-1，2，3，11a-四氢-吡咯并 [2，1-c][1，4]苯并二氮杂-5-酮]的制备方法，用4-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(4-甲基 -4-甲基二硫基-戊酰基氨基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙 氧基)-2，6-二-(羟基甲基)-吡啶，可制备8，8’-[(4-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(4-甲基-4- 甲基二硫基-戊酰基氨基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧 基)-吡啶-2，6-二甲基)-二氧基]-二[(S)-2-亚乙-(E)-基-7-二甲氧基-1，2，3，11a-四 氢-吡咯并[2，1-c][1，4]苯并二氮杂-5-酮]:

LC/MS(方法A3):ES:m/z＝1103MH⁺

                 m/z＝552(M+2H)²⁺/2

              保留时间＝3.7分钟

¹H N.M.R.(500MHz，CDCl₃-d1，δppm):δ＝1，29(s，6H)；1，75(d，J＝6，5Hz， 6H)；1，94(m，2H)；2，28(m，2H)；2，40(s，3H)；2，97(m，4H)；3，33-3，95(m， 24H)；3，99(s，6H)；4，18(m，2H)；4，28(s b，4H)；5，27(m，4H)；5，60(m， 2H)；6，19(m b，1H)；6，82(s，2H)；7，00(s b，2H)；7，55(s，2H)；7，64(d， J＝4，5Hz，2H)。

4-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(4-甲基-4-甲基二硫基-戊酰基氨基)-乙氧基]-乙 氧基}-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-2，6-二-(羟基甲基)-吡啶

根据4-(3-[4-(4-甲基-4-甲基二硫基-戊酰基)-哌嗪-1-基]-丙基)-2，6-二 -(羟基甲基)-吡啶的制备方法，用4-(2-{2-[2-(2-{2-[2-叔丁氧基羰基氨基- 乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-2，6-二-(羟基甲基)- 吡啶为原料，可制备4-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(4-甲基-4-甲基二硫基-戊酰基氨 基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-2，6-二-(羟基甲 基)-吡啶:

LC/MS(方法A3):ES:m/z＝596MH⁺

              保留时间＝2.4分钟

4-(2-{2-[2-(2-{2-[2-叔丁氧基羰基氨基-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-乙 氧基]-乙氧基}-乙氧基)-2，6-二-(羟基甲基)-吡啶

根据4-(3-叔丁氧基羰基氨基-丙氧基-)-2，6-二-(羟基甲基)吡啶的制 备方法，用4-{2-[2-(2-{2-[2-(2-叔丁氧基羰基氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙氧 基}-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-吡啶-2，6-二羧酸二乙酯为原料，可制备 4-(2-{2-[2-(2-{2-[2-叔丁氧基羰基氨基-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-乙氧 基]-乙氧基}-乙氧基)-2，6-二-(羟基甲基)-吡啶:

LC/MS(方法A3):ES:m/z＝519MH⁺

              保留时间＝2.2分钟

4-{2-[2-(2-{2-[2-(2-叔丁氧基羰基氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙 氧基)-乙氧基]-乙氧基}-吡啶-2，6-二羧酸二乙酯

根据4-(2-{2-[2-叔丁氧基羰基氨基-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-吡啶 -2，6-二羧酸二乙酯的制备方法，用4-{2-[2-(2-{2-[2-(2-叠氮基-乙氧基)- 乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-吡啶-2，6-二羧酸二乙酯为原 料，可制备4-{2-[2-(2-{2-[2-(2-叔丁氧基羰基氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙氧 基}-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-吡啶-2，6-二羧酸二乙酯:

LC/MS(方法A3):ES:m/z＝603MH⁺

                 m/z＝271(M+2H-CO₂tBu)⁺

              保留时间＝3.6分钟

4-{2-[2-(2-{2-[2-(2-叠氮基-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-乙氧 基]-乙氧基}-吡啶-2，6-二羧酸二乙酯可如下制备:

向白屈氨酸二乙基酯(1.03g)在二甲基甲酰胺(10mL)中的溶液中，加 入甲磺酸2-[2-(2-{2-[2-(2-叠氮基-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-乙 氧基]-乙酯(1.82g)和碳酸钾(893mg)。得到的混合物在70℃加热15小时， 随后冷却到室温。加入水，水溶液用乙酸乙酯提取3次。合并的有机溶 液用饱和氯化钠水溶液洗涤，用无水硫酸镁干燥，真空浓缩成残余物。 残余物用硅胶色谱法(Merck SuperVarioPrep 70g柱，Si60 15-40μm)纯化， 用甲醇(A)/二氯甲烷(B)的混合物洗脱(梯度:3％ A:97％ B至5％ A: 95％ B)，得到4-{2-[2-(2-{2-[2-(2-叠氮基-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧 基)-乙氧基]-乙氧基}-吡啶-2，6-二羧酸二乙酯(2.19g):

LC/MS(方法A3):ES:m/z＝529MH⁺

              保留时间＝3.4分钟

实施例28:

8，8’-[(1-(2-[甲基-(2-甲基-2-甲基二硫基-丙基)-氨基]-乙氧基)-苯-3，5- 二甲基)-二氧基]-二[(S)-2-亚乙-(E)-基-7-二甲氧基-1，2，3，11a-四氢-吡咯并 [2，1-c][1，4]苯并二氮杂-5-酮]

根据8，8’-[(4-(3-(4-甲基-4-甲基二硫基)-戊酰氨基-丙氧基-)-吡啶 -2，6-二甲基)-二氧基]-二[(S)-2-亚乙-(E)-基-7-二甲氧基-1，2，3，11a-四氢- 吡咯并[2，1-c][1，4]苯并二氮杂-5-酮]的制备方法，用1-(2-[甲基-(2-甲 基-2-甲基二硫基-丙基)-氨基]-乙氧基)-3，5-二-(羟基甲基)-苯，可制备 8，8’-[(1-(2-[甲基-(2-甲基-2-甲基二硫基-丙基)-氨基]-乙氧基)-苯-3，5-二甲 基)-二氧基]-二[(S)-2-亚乙-(E)-基-7-二甲氧基-1，2，3，11a-四氢-吡咯并[2，1 -c][1，4]苯并二氮杂-5-酮]:

LC/MS(方法A1，Platform I):ES:m/z＝872MH⁺+H2O

                             m/z＝854MH⁺

                          保留时间＝3.40分钟

¹H N.M.R.(500MHz，CDCl₃-d1，δppm):δ＝1，31(s，6H)；1，75(d，J＝6，5Hz， 6H)；2，39(s，3H)；2，45(s，3H)；2，62(s，2H)；2，92(t，J＝6，5Hz，2H)；2，97(m， 4H)；3，89(m，2H)；3，96(s，6H)；4，06(t，J＝6，5Hz，2H)；4，26(s b，4H)； 5，12(d，J＝12，5Hz，2H)；5，19(d，J＝12，5Hz，2H)；5，60(q b，J＝6，5Hz，2H)； 6，82(s，2H)；6，95(s b，2H)；7，06(s b，1H)；7，52(s，2H)；7，64(d，J＝4，5Hz， 2H)。

1-(2-[甲基-(2-甲基-2-甲基二硫基-丙基)-氨基]-乙氧基)-3，5-二-(羟基 甲基)-苯可如下制备:

向1-(2-(2-甲基-2-甲基二硫基-丙基)-氨基-乙氧基)-3，5-二-(羟基甲 基)-苯(280mg)在甲醛(228)中的冷却(5℃)悬浮液中加入甲酸(319μL)， 得到的混合物在100℃加热1小时15分钟，随后冷却到室温。加入水和 冰，随后加入氢氧化钠水溶液直到pH＝12。得到的水溶液用乙酸乙酯提 取3次，合并的有机溶液用硫酸镁干燥，真空浓缩成残余物。残余物经 硅胶色谱法(Merck SuperVarioFlash 25g柱，Si60 15-40)，用甲醇(A)/ 二氯甲烷(B)混合物洗脱，(梯度:2％ A:98％ B至5％ A:95％ B)得到 1-(2-[甲基-(2-甲基-2-甲基二硫基-丙基)-氨基]-乙氧基)-3，5-二-(羟基甲 基)-苯(210mg):

LC/MS(方法A3):ES:m/z＝346MH⁺

                 m/z＝212(M+2H-C₅H₁₁S₂)⁺

                     m/z＝135C₅H₁₁S₂⁺

                   保留时间＝2.1分钟

¹H N.M.R.(400MHz，DMSO-d₆，δppm):δ＝1，27(s，6H)；2，39(s，3H)；2，40(s， 3H)；2，60(s，2H)；2，85(t，J＝6，0Hz，2H)；4，02(t，J＝6，0Hz，2H)；4，44(d， J＝6，0Hz，4H)；5，10(t，J＝6，0Hz，2H)；6，72(s b，2H)；6，82(s b，1H)。

1-(2-(2-甲基-2-甲基二硫基-丙基)-氨基-乙氧基)-3，5-二-(羟基甲基)- 苯可如下制备:

向1-(2-氨基-乙氧基)-3，5-二-(羟基甲基)-苯盐酸盐(900mg)在四氢呋 喃(4.5mL)中的悬浮液中加入三乙胺(1.07mL)。在搅拌15分钟后，加入 2-(甲基二硫基)异丁醛(530)和异丙醇钛(1.42mg)，生成的混合物在室 温下搅拌2小时。加入乙醇(9mL)和氰基硼氢化钠(242mg)，新混合物在 室温下搅拌18小时。过滤出固体，滤液真空浓缩成残余物。残余物用 乙酸乙酯稀释，过滤出生成的固体。有机溶液随后用水和饱和氯化钠水 溶液洗涤，用硫酸镁干燥，真空浓缩成新残余物，它经硅胶色谱法(Merck SuperVarioFlash 30g柱，Si60 15-40μm)纯化，用甲醇(A)/二氯甲烷(B)混 合物洗脱，(梯度:4％ A:96％B至10％ A:90％B)得到1-(2-(2-甲基-2-甲基 二硫基-丙基)-氨基-乙氧基)-3，5-二-(羟基甲基)-苯(290mg):

¹H N.M.R.(400MHz，DMSO-d₆，δppm):δ＝1，27(s，6H)；1，82(m b，1H)； 2，39(s，3H)；2，67(s，2H)；2，91(t，J＝6，0Hz，2H)；4，00(t，J＝6，0Hz，2H)； 4，43(d，J＝6，0Hz，4H)；5，10(t，J＝6，0Hz，2H)；6，73(s b，2H)；6，83(s b，1H)。

实施例29:

8，8’-[(4-(3-[甲基-(4-甲基-4-甲基二硫基-戊酰基)-氨基]-丙基)-吡啶-2，6-二 甲基)-二氧基]-二[(S)-2-亚乙-(E)-基-7-二甲氧基-1，2，3，11a-四氢-吡咯并[2， 1-c][1，4]苯并二氮杂-5-酮]

根据8，8’-[(4-(3-(4-甲基-4-甲基二硫基)-戊酰氨基-丙氧基-)-吡啶 -2，6-二甲基)-二氧基]-二[(S)-2-亚乙-(E)-基-7-二甲氧基-1，2，3，11a-四氢- 吡咯并[2，1-c][1，4]苯并二氮杂-5-酮]的制备方法，用4-(3-[甲基-(4- 甲基-4-甲基二硫基-戊酰基)-氨基]-丙基)-2，6-二-(羟基甲基)-吡啶，可制备 8，8’-[(4-(3-[甲基-(4-甲基-4-甲基二硫基-戊酰基)-氨基]-丙基)-吡啶-2，6-二 甲基)-二氧基]-二[(S)-2-亚乙-(E)-基-7-二甲氧基-1，2，3，11a-四氢-吡咯并[2， 1-c][1，4]苯并二氮杂-5-酮]:

¹H N.M.R.(500MHz，CDCl₃-d1，δppm):δ＝1，32(s，6H)；1，75(d，J＝6，5Hz， 6H)；1，94(m，4H)；2，20-4，30(m，18H)；4，00(s，6H)；4，27(s b，4H)； 5，21-5，68(m，6H)；6，80-7，70(m，8H)。

4-(3-[甲基-(4-甲基-4-甲基二硫基-戊酰基)-氨基]-丙基)-2，6-二-(羟基 甲基)-吡啶

根据4-(2-(4-甲基-4-甲基二硫基)-戊酰氨基-乙氧基)-2，6-二-(羟基甲 基)-吡啶的制备方法，用4-(3-(叔丁氧基羰基-甲基-氨基)-丙基)-2，6-二 -(羟基甲基)-吡啶，可制备4-(3-[甲基-(4-甲基-4-甲基二硫基-戊酰基)-氨 基]-丙基)-2，6-二-(羟基甲基)-吡啶:

LC/MS(方法A3):ES:m/z＝387MH⁺

保留时间＝2.5分钟

4-(3-(叔丁氧基羰基-甲基-氨基)-丙基)-2，6-二-(羟基甲基)-吡啶

根据4-(3-叔丁氧基羰基氨基-丙氧基-)-2，6-二-(羟基甲基)吡啶的制 备方法，用4-(3-(叔丁氧基羰基-甲基-氨基)-丙基)-吡啶-2，6-二-二羧酸二 乙酯，可制备4-(3-(叔丁氧基羰基-甲基-氨基)-丙基)-2，6-二-(羟基甲基)- 吡啶:

C1(方法D)m/z＝311MH⁺

4-(3-(叔丁氧基羰基-甲基-氨基)-丙基)-吡啶-2，6-二-二羧酸二乙酯

根据5-(3-叔丁氧基羰基-N-甲基-氨基-丙基)-苯-1，3-二羧酸二乙酯的 制备方法，用4-[3-(叔丁氧基羰基-甲基-氨基)-丙-1-炔基]-吡啶-2，6-二羧 酸二乙酯，可制备4-(3-(叔丁氧基羰基-甲基-氨基)-丙基)-吡啶-2，6-二-二 羧酸二乙酯:

LC/MS(方法G2):ES:m/z＝395MH⁺

                 m/z＝339(M+2H-tBu)⁺

              保留时间＝7.5分钟

4-[3-(叔丁氧基羰基-甲基-氨基)-丙-1-炔基]-吡啶-2，6-二羧酸二乙酯

根据5-(3-叔丁氧基羰基-N-甲基-氨基-丙炔-1-基)-苯-1，3-二羧酸二乙 酯的制备方法，用叔丁氧基羰基-N-甲基-炔丙基胺，可制备4-[3-(叔丁氧 基羰基-甲基-氨基)-丙-1-炔基]-吡啶-2，6-二羧酸二乙酯。

C1(方法D)m/z＝391MH⁺。

实施例30:

8，8’-[(4-(3-[甲基-(2-甲基-2-甲基二硫基-丙基)-氨基]-丙基)-吡啶-2，6-二甲 基)-二氧基]-二[(S)-2-亚乙-(E)-基-7-二甲氧基-1，2，3，11a-四氢-吡咯并 [2，1-c][1，4]苯并二氮杂-5-酮]

根据8，8’-[(4-(3-(4-甲基-4-甲基二硫基)-戊酰氨基-丙氧基)-吡啶-2，6- 二甲基)-二氧基]-二[(S)-2-亚乙-(E)-基-7-二甲氧基-1，2，3，11a-四氢-吡咯并 [2，1-c][1，4]苯并二氮杂-5-酮]的制备方法，用4-{3-[甲基-(2-甲基-2-甲 基二硫基-丙基)-氨基]-丙基}-2，6-二-(羟基甲基)-吡啶，可制备 8，8’-[(4-(3-[甲基-(2-甲基-2-甲基二硫基-丙基)-氨基]-丙基)-吡啶-2，6-二甲 基)-二氧基]-二[(S)-2-亚乙-(E)-基-7-二甲氧基-1，2，3，11a-四氢-吡咯并 [2，1-c][1，4]苯并二氮杂-5-酮]:

¹H N.M.R.(500MHz，CDCl₃-d1，δppm):δ＝1，28(s，6H)；1，65(m部分掩蔽， 2H)；1，75(d，J＝6，5Hz，6H)；2，29(s，3H)；2，38(s，3H)；2，46(m，4H)； 2，65(m，2H)；2，97(m，4H)；3，89(m，2H)；4，00(s，6H)；4，27(s b，4H)； 5，29(s，4H)；5，60(q b，J＝6，5Hz，2H)；6，86(s，2H)；7，30(s，2H)；7，55(s， 2H)；7，64(d，J＝4，5Hz，2H)。

4-{3-[甲基-(2-甲基-2-甲基二硫基-丙基)-氨基]-丙基}-2，6-二-(羟基甲 基)-吡啶

P-34409-034-3

根据1-(2-(2-甲基-2-甲基二硫基-丙基)-氨基-乙氧基)-3，5-二-(羟基甲 基)-苯的制备方法，用4-{3-[甲基-氨基]-丙基}-2，6-二-(羟基甲基)-吡啶， 可制备4-{3-[甲基-(2-甲基-2-甲基二硫基-丙基)-氨基]-丙基}-2，6-二-(羟 基甲基)-吡啶:

LC/MS(方法A1，Platform II):ESm/z＝345MH⁺

                           保留时间＝1.15分钟

实施例31:

8，8’-[(1-(4-甲基-4-甲基二硫基)-戊酰氨基)-苯-3，5-二甲基]-二氧基]- 二[(S)-2-亚乙-(E)-基-7-二甲氧基-1，2，3，11a-四氢-吡咯并[2，1-c][1，4]苯并 二氮杂-5-酮]可如下制备:

根据8，8’-[(4-(2-(4-甲基-4-甲基二硫基)-戊酰氨基-乙氧基)-吡啶-2，6- 二甲基)-二氧基]-二[(S)-2-亚乙-(E)-基-7-二甲氧基-1，2，3，11a-四氢-吡咯并 [2，1-c][1，4]苯并二氮杂-5-酮]的制备方法，用(1-(4-甲基-4-甲基二硫 基)-戊酰氨基)-3，5-二-(羟基甲基)-苯为原料，可制备8，8’-[(1-(4-甲基-4- 甲基二硫基)-戊酰氨基)-苯-3，5-二甲基]-二氧基]-二[(S)-2-亚乙-(E)-基-7- 二甲氧基-1，2，3，11a-四氢-吡咯并[2，1-c][1，4]苯并二氮杂-5-酮]:

LC/MS(方法A1，PlatformI):ES:m/z＝838MH⁺

                          保留时间＝4.11分钟

¹H N.M.R.(500MHz，CDCl₃-d1，δppm):δ＝1，33(s，6H)；1，76(d，J＝6，5Hz， 6H)；2，03(m，2H)；2，43(s，3H)；2，46(m，2H)；2，97(m，4H)；3，89(m，2H)； 3，95(s，6H)；4，27(s b，4H)；5，14(d，J＝12，5Hz，2H)；5，19(d，J＝12，5Hz，2H)； 5，60(q，J＝6，5Hz，2H)；6，81(s，2H)；from7，20to7，60(m，6H)；7，64(d， J＝4，5Hz，2H)。

实施例19-31化合物的相应巯基衍生物可采用实施例18中描述的方 法制备。

实施例A:结合物制备的一般方法

选择结合于优先在人淋巴瘤细胞表面表达的CD19抗原的抗-B4抗 体用于结合茅屋霉素衍生物。

在第一步中，抗体与改性剂N-磺基琥珀酰亚氨基5-硝基-2-吡啶基 二硫代丁酸酯(SSNPB)反应以引入硝基吡啶基二硫基基团，在含有 0.05M磷酸钾、0.05M氯化钠和2mM乙二胺四乙酸(EDTA)的含水缓冲 液(pH6.5)中的浓度为8mg/mL的huC242抗体溶液(65.6mL)用8倍摩尔 过量的SSNPB在二甲基乙酰胺(DMA)中的溶液处理。反应混合物在室 温下搅拌90分钟，随后装在Sephadex G25凝胶过滤柱(50mm x 35.5mm， 柱)中，柱预先在含有0.05M磷酸钾、0.05M氯化钠和2mM EDTA的含 水缓冲液(pH7.5)中平衡。收集改性的含抗体馏分，汇集得到产物。改 性抗体的少量等分样品用二硫苏糖醇处理以断裂硝基吡啶基二硫化物， 释放的硝基吡啶-2-硫酮用分光光度法分析(对于化合物ε_323nm＝4，299M^-1cm^-1，ε_280nm＝565M^-1cm^-1，对抗体ε_280nm＝217，560M^-1cm^-1)。每个抗体分 子通常连接于平均4-6个硝基-吡啶基二硫化物分子。

将改性的抗体在上述缓冲液pH7.5中稀释至2.5mg/mL，用茅屋霉 素衍生物在DMA的溶液处理，使得在缓冲液中DMA的最终浓度为 20％。结合物混合物在室温下搅拌16小时，将反应混合物通过Sephacryl S300凝胶过滤柱(50mm x 42cm，柱)纯化，柱预先在磷酸盐缓冲盐水(PBS) 中平衡在pH6.5。汇集含有单体抗体-茅屋霉素衍生物结合物的馏分，在 PBS缓冲液中透析。最终的结合物通过分光光度法用消光系数分析，对 于每个茅屋霉素衍生物，单独测量消光系数。

本发明化合物的SPDB-PBD和SMCC-PBD结合物

huB4-SPDB-实施例16化合物

实施例A1:选择结合于优先在人淋巴瘤细胞表面表达的CD19抗原的 抗-B4抗体用于结合茅屋霉素衍生物。

抗体首先用4-(2-吡啶基二硫基)丁酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(SPDB)改 性以引入吡啶基二硫基基团。将在二甲基乙酰胺(DMA)(50μL)中的4.5 倍摩尔过量的SPDB(0.25μmol，81.1μg)加入在含有50mM磷酸钾、 50mM氯化钠和2mM乙二胺四乙酸(EDTA)的含水缓冲液(pH6.5) (0.95mL)中的huB4溶液(8mg，0.055μmol)中，最终蛋白质浓度为 8mg/mL，含有在缓冲液中的5％DMA。改性过程在室温下旋转90分钟， 用Sephadex G25凝胶过滤柱纯化，柱在含有50mM磷酸钾、50mM氯化 钠和2mM EDTA的含水缓冲液(pH7.5)中平衡。改性抗体的少量等分样 品用二硫苏糖醇(DTT)处理以断裂吡啶基二硫化物基团，改性抗体和释 放的吡啶硫醇用分光光度法分析(对于释放的吡啶硫醇ε_343nm＝8，080M^-1cm^-1，对改性吡啶二硫基ε_280nm＝5100M^-1cm^-1，对抗体ε_280nm＝222，960M^-1cm^-1)。每个抗体分子通常连接于平均3.36个吡啶基二硫化物分子。

将改性抗体(2.29mg，0.016μmol)在上述pH7.5缓冲液(732.8μL)和 DMA(91.6μL，10％ v/v)中稀释，随后用8，8’-[5-(N-4-巯基-4，4-二甲基丁酰 基)氨基-1，3-苯二基二(亚甲氧基)]-二[7-甲氧基-2-亚甲基-1，2，3，11a-四氢 -5H-吡咯并[2，1-c][1，4]苯并二氮杂-5-酮](实施例16化合物)(0.157μmol， 0.12mg)在DMA(91.6μl，10％v/v)中的溶液处理。最终蛋白质浓度为 2.5mg/mL，含有20％在缓冲液中的DMA。结合过程在室温下旋转过夜， 随后经沉降(13，200RPM 4分钟)澄清。上清液随后用在pH6.5的磷酸盐 水(PBS)缓冲液中平衡的Sephadex G25凝胶过滤柱纯化。纯化的结合物 用4次缓冲液交换透析入PBS pH6.5缓冲液中(约1:650稀释度)。结合 物通过0.22μm注射过滤器澄清，进行分光光度法分析(对于PBD ε_280nm＝7743M^-1cm^-1，ε_318nm＝9137M^-1cm^-1，对抗体ε_280nm＝222，960M^-1cm^-1)。每个抗体分子连接平均1.76PBD分子(实施例16化合物)。

huB4-SMCC-实施例16化合物

实施例A2:选择结合于优先在人淋巴瘤细胞表面表达的CD19抗原的 抗-B4抗体用于结合茅屋霉素衍生物。

在第一步中，抗体与改性剂琥珀酰亚氨基4-[马来酰亚氨基甲基]环 己烷-1-羧酸酯(SMCC)反应以引入马来酰亚胺基团。在含有0.05M磷酸 钾、0.05M氯化钠和2mM乙二胺四乙酸(EDTA)的含水缓冲液(pH6.7) 中的浓度为6mg/mL的huB4抗体溶液(1mL)用6.5倍摩尔过量的SMCC 在二甲基乙酰胺(DMA)中的溶液处理。反应混合物在室温下搅拌90分 钟，随后装在Sephadex G25凝胶过滤柱(NAP 10)中，柱预先在含有0.10M N-(2-羟基乙基)-哌嗪-N’-2-乙磺酸(HEPES)pH8.0的含水缓冲液中平衡。 收集改性的含抗体馏分，汇集得到产物。改性抗体的少量等分样品用□- 巯基乙醇处理10分钟，随后加入5，5’-二硫代二-2-硝基苯甲酸(DTNB) 以检测残余的硫醇(对于5-硫基-2-硝基苯甲酸(TNB)，ε_412nm＝14，150M^-1cm^-1，对抗体ε_280nm＝222，960M^-1cm^-1)。在抗体与马来酰亚胺的反应中消 耗的硫醇的数量(与没有抗体的对照组相比)等于连接于抗体的马来酰亚 胺摩尔量(减法Ellman’s试验)。每个抗体连接约3.2活性马来酰亚胺基 团。

将改性抗体(3mg，0.021μmol)在pH 8.0HEPES缓冲液中稀释至 3.0mg/mL，随后用实施例16的化合物在DMA中的溶液(5mM)处理，使 得在缓冲液中DMA的最终浓度为15％。每个连接物加入了3摩尔当量 的8，8’-[5-(N-4-巯基-4，4-二甲基丁酰基)氨基-1，3-苯二基二(亚甲氧基)]- 二[7-甲氧基-2-亚甲基-1，2，3，11a-四氢-5H-吡咯并[2，1-c][1，4]苯并二氮杂 -5-酮](实施例16化合物)(9.6eq./抗体，0.202μmol，149μg)。结合混合 物在室温下搅拌20小时，反应混合物通过G25柱(NAP5)纯化，柱预先 在0.05磷酸钾(KPi)、0.05M NaCl、0.002M EDTA缓冲液(pH6.7)中平衡。 汇集含有huB4-实施例16化合物结合物的馏分，用3次交换(24小时) 透析入Kpi缓冲液中。最终结合物(2.2mg，2.3mg/ml)用分光光度法用消 光系数分析，测定实施例16化合物(ε_318nm＝9，137M^-1cm^-1，ε_280nm＝7，734 M^-1cm^-1)和B4抗体(ε_280nm＝222，960M^-1cm^-1)。每个分子抗体连接平均 2.8PBD分子(实施例16化合物)。

huB4-SPDB-实施例17化合物

实施例A3:选择结合于优先在人淋巴瘤细胞表面表达的CD19抗原的 抗-B4抗体用于结合茅屋霉素衍生物。

抗体首先用4-(2-吡啶基二硫基)丁酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(SPDB)改 性以引入吡啶基二硫基基团。将在DMA(25μL)中的4.5倍摩尔过量的 SPDB(0.124μmol，40.6μg，)加入在含有50mM磷酸钾、50mM氯化钠和 2mM EDTA的含水缓冲液(pH6.5)(0.475mL)中的huB4溶液(4mg， 0.028μmol)中，最终蛋白质浓度为8mg/mL，含有在缓冲液中的5％DMA。 改性过程在室温下旋转90分钟，用Sephadex G25凝胶过滤柱纯化，柱 在含有50mM磷酸钾、50mM氯化钠和2mM EDTA的含水缓冲液(pH7.5) 中平衡。改性抗体的少量等分样品用DTT处理以断裂吡啶基二硫化物 基团，改性抗体和释放的吡啶硫醇用分光光度法分析(对于释放的吡啶硫 醇ε_343nm＝8，080M^-1cm^-1，对改性吡啶二硫基基团ε_280nm＝5100M^-1cm^-1， 对抗体ε_280nm＝222，960M^-1cm^-1)。每个抗体分子连接平均3.31个吡啶基 二硫化物分子。

将改性抗体(3.06mg，0.021μmol)在上述pH7.5缓冲液(0.976mL)和 DMA(122μL，10％ v/v)中稀释，随后用8，8’-[5-(N-甲基-N-(2-巯基-2，2-二 甲基乙基)氨基-1，3-苯二基(亚甲氧基))-二[7-甲氧基-2-亚甲基-1，2，3，11a- 四氢-5H-吡咯并[2，1-c][1，4]苯并二氮杂-5-酮](实施例17化合 物)(0.209μmol，0.154mg)在DMA(122μl，10％ v/v)中的溶液处理。最终蛋 白质浓度为2.5mg/mL，含有20％在缓冲液中的DMA。结合过程在室温 下旋转过夜，随后经沉降(13，200 RPM 4分钟)澄清。上清液随后用在pH 6.5的PBS缓冲液中平衡的Sephadex G25凝胶过滤柱纯化。纯化的结合 物用3次缓冲液交换透析入PBS pH6.5缓冲液中(约1:1200稀释度)。 结合物通过0.22μm注射过滤器澄清，进行分光光度法分析(对于PBD ε_280nm＝10736M^-1cm^-1，ε_318nm＝12053M^-1cm^-1，对抗体ε_280nm＝222，960M^-1cm^-1)。每个抗体分子连接平均3.05PBD分子(实施例17化合物)。

huB4-SMCC-实施例17化合物

实施例A4:选择结合于优先在人淋巴瘤细胞表面表达的CD19抗原的 抗-B4抗体用于结合茅屋霉素衍生物。

在第一步中，抗体与改性剂琥珀酰亚氨基4-[马来酰亚氨基甲基]环 己烷-1-羧酸酯(SMCC)反应以引入马来酰亚胺基团。在含有0.05M磷酸 钾、0.05M氯化钠和2mM乙二胺四乙酸(EDTA)的含水缓冲液(pH6.7) 中的浓度为6mg/mL的huB4抗体溶液(1mL)用7倍摩尔过量的SMCC 在二甲基乙酰胺(DMA)中的溶液处理。反应混合物在室温下搅拌90分 钟，随后装在Sephadex G25凝胶过滤柱(NAP10)中，柱预先在含有0.10M N-(2-羟基乙基)-哌嗪-N’-2-乙磺酸(HEPES)pH8.0的含水缓冲液中平衡。 收集改性的含抗体馏分，汇集得到产物。改性抗体的少量等分样品用β- 巯基乙醇处理10分钟，随后加入5，5’-二硫代二-2-硝基苯甲酸(DTNB) 以检测残余的硫醇(对于5-硫基-2-硝基苯甲酸(TNB)，ε_412nm＝14，150M^-1cm^-1，对抗体ε_280nm＝222，960M^-1cm^-1)。在抗体与马来酰亚胺的反应中消 耗的硫醇的数量(与没有抗体的对照组相比)等于连接于抗体的马来酰亚 胺摩尔量(减法Ellman’s试验)。每个抗体连接约3.7活性马来酰亚胺基 团。

将改性抗体(4.4mg，0.03μmol)在pH 8.0HEPES缓冲液中稀释至 8.7mg/mL，随后用实施例17的化合物在DMA中的溶液(5.4mM)处理， 使得在缓冲液中DMA的最终浓度为20％。每个连接物加入了2摩尔当 量的8，8’-[5-(N-甲基-N-(2-巯基-2，2-二甲基乙基)氨基-1，3-苯二基(亚甲氧 基))-二[7-甲氧基-2-亚甲基-1，2，3，11a-四氢-5H-吡咯并[2，1-c][1，4]苯并二 氮杂-5-酮](实施例17化合物)(7.4eq./抗体，0.222μmol，164μg)。结合 混合物在室温下搅拌20小时，反应混合物通过G25柱(NAP5)纯化，柱 预先在0.05磷酸钾(KPi)、0.05M NaCl、0.002M EDTA缓冲液(pH6.7) 中平衡。汇集含有huB4-实施例17化合物结合物的馏分，用3次交换(24 小时)透析入Kpi缓冲液中。最终结合物(2.25mg，2.25mg/ml)用分光光度 法用消光系数分析，测定实施例17化合物(ε_318nm＝12，053M^-1cm^-1， ε_280nm＝10，736M^-1cm^-1)和B4抗体(ε_280nm＝222，960M^-1cm^-1)。每个分子抗 体连接平均2.8PBD分子(实施例17化合物)。

huMy9-6-SPDB-实施例16化合物

实施例A5:抗体首先用4-(2-吡啶基二硫基)丁酸N-羟基琥珀酰亚胺酯 (SPDB)改性以引入吡啶基二硫基基团。将在DMA(50μL)中的4.5倍摩尔 过量的SPDB(0.246μmol，80.1μg，)加入在含有50mM磷酸钾、50mM氯 化钠和2mM EDTA的含水缓冲液(pH6.5)(0.950mL)中的huMy9-6溶液 (8mg，0.055μmol)中，最终蛋白质浓度为8mg/mL，含有在缓冲液中的 5％DMA。改性过程在室温下旋转90分钟，用Sephadex G25凝胶过滤 柱纯化，柱在含有50mM磷酸钾、50mM氯化钠和2mM EDTA的含水 缓冲液(pH8.5)中平衡。改性抗体的少量等分样品用DTT处理以断裂吡 啶基二硫化物基团，改性抗体和释放的吡啶硫醇用分光光度法分析(对于 释放的吡啶硫醇ε_343nm＝8，080M^-1cm^-1，对改性吡啶二硫基基团 ε_280nm＝5100M^-1cm^-1，对抗体ε_280nm＝206，460M^-1cm^-1)。每个抗体分子连 接平均3.32个吡啶基二硫化物分子。

将改性抗体(3.05mg，0.0208μmol)在上述pH8.5缓冲液(976μL)和 DMA(122μL，10％ v/v)中稀释，随后用8，8’-[5-(N-4-巯基-4，4-二甲基丁酰 基)氨基-1，3-苯二基二(亚甲氧基)]-二[7-甲氧基-2-亚甲基-1，2，3，11a-四氢 -5H-吡咯并[2，1-c][1，4]苯并二氮杂-5-酮](实施例16化合物)(0.207μmol， 0.158mg)在DMA(122μl，10％ v/v)中的溶液处理。最终蛋白质浓度为 2.5mg/mL，含有20％在缓冲液中的DMA。结合过程在室温下旋转过夜， 随后经沉降(13,200RPM 4分钟)澄清。上清液随后用在pH6.5的PBS缓 冲液中平衡的Sephadex G25凝胶过滤柱纯化。纯化的结合物用3次缓冲 液交换透析入PBS pH6.5缓冲液中(约1:600稀释度)。结合物通过0.22 μm注射过滤器澄清，进行分光光度法分析(对于PBD ε_280nm＝7743M^-1cm^-1，ε_318nm＝9137M^-1cm^-1，对抗体ε_280nm＝206，460M^-1cm^-1)。每个抗体 分子连接平均2.58PBD分子(实施例16化合物)。

实施例B:结合试验

抗-B4抗体和其茅屋霉素结合物在表达Ramos细胞的抗原上的相对 结合亲合力用基于荧光性的试验测定。抗体-茅屋霉素结合物和单纯的抗 体以10^-7M的浓度加入96孔圆底板中，用3倍的系列稀释液滴定从而 对每个浓度存在重复试验。Ramos细胞以每孔50000细胞加入每个含有 不同抗体或结合物浓度的孔和对照孔中，板在冰上培养3小时。在培养 时期后，洗涤板中的细胞，加入结合于人体IgG，如抗-B4的荧光素标 记的仲抗体，板在冰上培养1小时。在培养时期后，板再次洗涤，细胞 用1％甲醛/PBS溶液固定。板的每个孔中的荧光性用Becton Dickinson FACSCalibur荧光性分析器读出。数据作为在最高浓度抗体或结合物下 得到的最大荧光性的百分数画出曲线。

实施例C:茅屋霉素衍生物或茅屋霉素衍生物结合物的体外效力和特异 性。所使用的一般实验方法:

将茅屋霉素衍生物或茅屋霉素衍生物结合物样品加入96孔平底组 织培养板中，用1 x 10^-12M至3 x 10^-7M的系列稀释溶液滴定。抗原阳性 肿瘤细胞和抗原阴性肿瘤细胞加入孔中使得对于每个细胞系的每个药 物浓度存在三个重复样品，板在5％CO₂气氛中在37℃培养4天。

在培养时期结束时，向每个孔中加入20[mu]1四唑鎓试剂 WST-8(2-(2-甲氧基-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2，4-二硫代苯基)-2-四 唑鎓单钠盐)，板回收培养器中2小时。随后用Molecular Devices板阅 读器在450nm测量板每个孔中的吸光率。画出在每个茅屋霉素衍生物 或结合物浓度下细胞的存活比例的曲线。

 

化合物A549(IC₅₀)KB(IC₅₀)MCF7(IC₅₀)实施例57 x 10^-11M1 x 10^-11M1 x 10^-11M实施例1<10^-12M<10^-12M<10^-12M实施例2<10^-12M<10^-12M<10^-12M

测试本发明的化合物与结合物对MOLT-4和BJAB或HL60/GC和 Ramos细胞系的特异细胞毒性，结果在附图1a-c、2a-c和3a-b中说明。

附图1a表示huB4-SPDB-实施例16化合物对抗原阳性BJAB细胞 和抗原阴性MOLT-4细胞的体外效力。

附图1b表示huB4-SMCC-实施例16化合物对抗原阳性BJAB细胞 和抗原阴性MOLT-4细胞的体外效力。

附图1c表示实施例16游离化合物对BJAB和MOLT-4细胞的体外 效力。

附图2a表示huB4-SPDB-实施例17化合物对抗原阳性BJAB细胞 和抗原阴性MOLT-4细胞的体外效力。

附图2b表示huB4-SMCC-实施例17化合物对抗原阳性BJAB细胞 和抗原阴性MOLT-4细胞的体外效力。

附图2c表示实施例17游离化合物对BJAB和MOLT-4细胞的体外 效力。

附图3a表示huMy9-6-SPDB-实施例16化合物对抗原阳性HL60/GC 细胞和抗原阴性Ramos细胞的体外效力。

附图3b表示实施例16游离化合物对HL60/GC和Ramos细胞的体 外效力。

实施例D:茅屋霉素衍生物或茅屋霉素衍生物结合物的体内效力

试验可通过应用和/或适用在WO 2004/103272中描述的实验方法， 用huB4作为抗体和适用的抗原阳性细胞系，例如Ramos和Rajii Burkitt’s淋巴瘤细胞系进行。