创伤弧菌全菌免疫刺激复合物疫苗的制备工艺及其在水生动物的应用

摘要

本发明涉及一种创伤弧菌全菌免疫刺激复合物疫苗的制备工艺及其在水生动物的应用，它包括如下步骤：(1)将创伤弧菌进行预扩增与扩大培养，(2)对培养后的发酵菌液中的创伤弧菌进行灭活，(3)对灭活的菌液进行无活菌检验(4)离心收集灭活的创伤弧菌，(5)然后对收集的灭活创伤弧菌进行超声波破碎，(6)免疫刺激复合物组分的配制，(7)超声波处理制备免疫刺激复合物。本发明选用的创伤弧菌毒力较强(LD

说明书

技术领域

本发明涉及一种致病菌灭活疫苗的制备及其应用。

背景技术

创伤弧菌(vibrio vulnificus)是一种低度嗜盐性弧菌，属于人鱼共患病病原，能导致人与鳗鲡产生败血症和严重伤口感染。大致可分为生物I、生物II、生物III三个型，其中生物I型主要危害了人的健康，可导致人感染后致死率高达60％以上；而生物II型则为鳗鲡的主要细菌性传染病病源之一，上个世纪70-80年代，曾让日本、欧美等鳗鲡产业遭受巨大的经济损失；近五年来，我国沿海地区养殖鳗鲡因创伤弧菌而引起发病也十分严重，临床上呈现急性和迁延性两种过程，养殖场鳗鲡创伤弧菌病可反复发作，造成严重经济损失。传统通常采用抗生素和消毒剂等化学药物防治创伤弧菌病，易造成了环境污染、药物残留和抗药性等问题，影响水产品出口，甚至威胁消费者的健康。

目前，国内外研究创伤弧菌主要侧重流行病学和致病机理等，而比较少关注水产疫苗的研制与开发。有关发酵工艺研究主要集中在大肠杆菌等工业微生物，弧菌发酵工艺方面至今未见报道；有关水产动物病原ISCOMs的研究报道也仅见本实验室的嗜水气单胞菌ISCOMs研究，而创伤弧菌ISCOM疫苗的制备工艺研究在国内尚未见报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种能优化创伤弧菌疫苗的发酵培养、提高发酵液中疫苗活菌生物含量、且疫苗的应用效果较好的创伤弧菌全菌免疫刺激复合物疫苗的制备工艺及其水生动物的应用。

本发明的目的通过如下步骤的技术方案实现：它包括如下步骤：(1)将创伤弧菌进行预扩增与扩大培养，(2)对培养后的发酵菌液中的创伤弧菌进行灭活，(3)对灭活的菌液进行无活菌检验(4)离心收集灭活的创伤弧菌，(5)然后对收集的灭活创伤弧菌进行超声波破碎，(6)免疫刺激复合物组分的配制，(7)超声波处理制备免疫刺激复合物。

本发明选用的创伤弧菌毒力较强(LD₅₀约为200cfu/g)、且培养条件和优化的培养基能使发酵液的活菌生物含量实现翻番，培养出的创伤弧菌生物量高达50mg/ml以上；为创伤弧菌疫苗的产业化发酵生产提供了强有力的技术支持。

具体实施方式：

本发明的具体工艺步骤如下：

(1)将创伤弧菌进行预扩增与扩大培养

选择公认TSB培养基和改良的TSB培养基；将经常规检测合格的创伤弧菌毒株接种到含有TSB的细菌培养物的50mlTSB的250ml三角瓶中，在25-31℃恒温、100-200转/分钟的条件下振荡培养14-18小时，将该培养液作为种子液；以0.5-10％预扩增的培养物接种于发酵罐内的新鲜高压灭菌的改良TSB培养液中大规模培养36-60小时；所述的改良的TSB培养液的成分为：葡萄糖0.18％-0.22％(W/V为水的体积重量百分比，以下同。)、胰蛋白胨1.2％，1.8％(W/V)、大豆胨0.2％-0.6％(W/V)、玉米浆0.2％-0.6％(V/V)、磷酸氢二钾0.15％-0.25％(W/V)、氯化钠1.0％-2.0％(W/V)、磷酸铁0.0005％-0.002％(W/V)和酵母膏0.05％-0.2％(W/V)；发酵培养条件参数为：接种量为0.5-10％、温度25-31℃、转速100-200转/分钟；空气流量为35-15L/min；pH值6.5-7.5；发酵20-28小时后按间隔3-10分钟、自动工作15-20秒补浓缩料共500ml，所述的浓缩料的重量份数比为葡萄糖1份和大豆胨3份，收集后即为发酵菌液。

(2)对培养后的发酵菌液中的创伤弧菌进行灭活将菌液收集于灭菌罐中，添加终浓度为0.1-0.5％(V/V体积百分比)的福尔马林，室温罐内翻滚震荡3-5小时后，置于3-5℃冰箱中过夜或经过48小时，可彻底灭活。为了确保彻底灭活需对灭菌后灭菌罐中的菌液(即灭活菌液)进行无菌检验，无菌检验的方法是：充分摇匀灭菌后的灭活菌液，灭菌枪头吸取0.2-1.0ml的灭活菌液，超净工作台上铺平板，放置26-30℃恒温培养箱培养48小时，灭菌完全的培养物应当没有菌落出现，试验设空白平板对照。

(3)离心收集灭活的创伤弧菌：在8000-12000转/分钟的转速下，离心20-30分钟，收集、浓缩细菌；发酵培养细菌的生物量(湿重)应为25-50g.l^-1；所述的离心收集的细菌用灭菌生理盐水重悬，每升菌苗的离心后定容至生物量125-175g.l^-1。

上述经过大量培养、灭活及离心浓缩、收集的灭活细菌即为菌苗的半成品。

(4)对收集的灭活创伤弧菌进行超声波破碎，菌体粗蛋白的制备(细菌裂解，蛋白释放)：

采用市售的JY98-3D超声波破碎仪，超声波的超声探头(又称为变幅杆)的直径为20mm，超声功率设为800瓦；将超声波破碎仪用70％酒精进行洁净消毒；将灭活的200-400ml的浓缩菌液放入专用超声杯中，待浓缩菌液预冻或预溶至留有少量冰晶时进行低温超声破碎；破碎的作用程序为：间隔时间10秒，工作时问5秒，如此循环反复作用总时间为6分钟/轮。共作用3轮，全程时问为18分钟，实际作用时间为6分钟。指针显示的输出起始功率在720瓦左右，最后阶段的功率可接近设置值800瓦。本发明中还可以采用其它细菌破碎仪，只要能达到对灭活后的细菌进行破碎的目的即可。

第一次超声波裂解后的用灭菌磷酸盐缓冲液(PBS)调整细菌蛋白浓度至8-12mg.ml^-1。

(5)免疫刺激复合物(ISCOMs)组分的配制

在超声裂解的菌体粗蛋白中、每100ml菌液中添加0.05-0.2克的0.05-0.2％(W/V)的皂苷(QuilA)(出处ACCURATE CHEMICAL&SCIENTIFIC CORPORATION)和每ml菌液中各添加100-150μg.ml^-1的卵磷脂和胆固醇(终浓度)。由于卵磷脂和胆固醇都是不易溶于水的有机物，配制卵磷脂和胆固醇时先将两种物质溶解于氯仿中配成100-150mg.ml^-1储存液，现配现用或-20℃冻存备用。

(6)超声波处理制备免疫刺激复合物

菌体粗蛋白按上述配苗比例添加皂苷、卵磷脂和胆固醇构成免疫刺激复合物的基质后，待预冻或预溶至留有少量冰晶时，置于超声波破碎仪内进行低温超声破碎、控制超声破碎仓内温度不高于35℃。程序设置为：间隔时间10秒，超声作用5秒，全程时间为18分钟。温度不高于60℃。在洁净条件下，将超声处理的免疫刺激复合物收集于500ml灭菌疫苗专用塑料瓶内混匀后，测定免疫刺激复合物蛋白浓度，用灭菌PBS调整免疫刺激复合物的蛋白浓度至8-12mg.ml^-1。二次超声处理后得到制品即为创伤弧菌免疫刺激复合物疫苗；将制得的免疫刺激复合物疫苗在-20℃冻存备用。

(7)分装：将创伤弧菌ISCOM疫苗分装于100ml经150-170℃干热处理1.5-2.5小时的疫苗专用玻璃瓶，加盖、贴标签，-20℃冻存。

(8)成品检验：将分装后的成品进行性状检验和纯粹检验；冻存前制品为棕黄色均匀浓稠液体，有轻微硫臭味；冻结状态为棕黄色冰块；所述的性状检验为：制品用0.01M PBS 1：100稀释，差速离心去除细胞碎片，再超速离心浓缩ISCOMs，饱和磷钨酸负染后置透射电镜下观察，可观察到直径为35nm-40nm笼格状结构；所述的纯粹检验为抽检2/10已分装的疫苗，无菌条件下用移液器吸取混匀的ISCOMs0.1-0.5ml，均匀涂平板，26-30℃恒温箱培养48小时观察应无细菌生长。

为了保证所获得的培养物中无污染物的存在，在上述步骤(1)之后步骤(2)之前进行培养物的污染菌落检测；具体方法如下：每一批预扩增和扩大培养时均设同批次培养基空白对照，将培养基空白对照污染者废弃。从每一批次生产的细菌中随机抽样(2/10)划板培养，鉴定菌落形态、色泽，观察有无杂菌生长；进行血清凝集试验评估细菌的抗原性，不合格产品高压灭活后废弃。

为了确保在步骤(2)到步骤(4)的过程中没有发生污染情况，在步骤(4)之后和步骤(5)之前最好进行污染菌落检验以及抗原性检验，污染菌落检验方法与上述的无菌检验方法相同，抗原性检测方法为浓缩后的菌苗以灭菌生理盐水(或PBS)作10-20倍稀释后，菌体凝集试验评估其抗原性。

在步骤(5)之后步骤(6)之前，还可以对经过破碎工序的菌液进行蛋白检测，该检测方法属于已有公知的方法，检测方法为：以新鲜配置的牛血清白蛋白(BSA)作曲线，Bradford法测定一次破碎后的蛋白浓度。

在步骤(7)之后，还可以经过透射电镜下的观测与鉴定的步骤，该步骤的具体过程如下：典型ISCOMs的结构为直径35nm-40nm的颗粒状，中间为疏水区，有6个对称的点状物比较均匀地分布在其周围，构成免疫刺激复合物(ISCOM)结构的典型基质。创伤弧菌全菌ISCOMs制品因成分复杂未做进一步的超速离心处理，饱和磷钨酸负染后置透射电镜下观察，不易观察到典型的ISCOMs结构。样品经100倍稀释，8000-12000转/分钟离心30分钟，去除细胞碎片，34000-36000转/分钟离心浓缩处理后，可在电镜下观察到直径为35nm-40nm的笼格状结构。

将经过本发明方法制得的创伤弧菌ISCOM疫苗经过安全性检测和效力检验的结果如下。

所述的安全性检验分为如下步骤：

(a)实验鱼及其饲养条件

选择健康活跃、无病症、无体外寄生虫感染的鳗鲡，置50×30×40cm³玻璃水族箱注水至箱深的1/2处，每个水族箱放养鳗鲡10-25尾，置于室内，控温空调控制室温24℃±1℃。水源为暴气自来水，每日换水1/3。普通小型充气机连续充气直到试验结束；鳗鲡在试验前暂养7天以上，检验无寄生虫感染，试验期间停止投食。

(b)对鳗鱼的安全性试验

浸浴：以灭菌自来水将创伤弧菌ISCOM疫苗稀释为200μg.ml^-1，浸浴欧洲鳗鲡10-25尾，24小时后换水；同样体积灭菌自来水浸浴同批鳗鲡10-25尾为对照；实验组与对照组均设重复平行组，连续观察7-14天，鳗鲡无病理反应，可判定批次疫苗是安全可靠的。

注射：灭菌PBS(0.01mol)将创伤弧菌ISCOM疫苗稀释为2000μg.ml^-1，一次性注射器以0.1ml/尾的剂量注射鳗鲡10-25尾，对照鳗鲡10-25尾注射等剂量灭菌PBS；实验组与对照组均设重复平行组，连续观察7-14天，鳗鲡无病理反应，可判定批次疫苗是安全可靠的。

灌胃：灭菌PBS(0.01mol)将创伤弧菌ISCOM疫苗稀释为4000μg.ml^-1，一次性注射器(配硅胶管)以0.2ml/尾的剂量灌胃鳗鲡10-25尾，对照鳗鲡10-25尾灌胃等剂量灭菌PBS；实验组与对照组均设重复平行组，连续观察7-14天，鳗鲡无病理反应，可判定批次疫苗是安全可靠的。

所述的效力检验步骤如下：

(a)试验鱼标准及饲养条件

规格：5-50g/尾(便于采血)。试验鱼免疫前血清抗体检验：随机选择3尾以上鳗鲡采集血清，血清凝集或ELISA法评估免疫前的血清抗体效价。本底抗体滴度凝集价大于2²(显著凝集)、ELISA抗体效价大于1:200不宜作为试验用鱼。试验鱼的健康标准及饲养条件同安全性检验(a)。

(b)注射免疫、采血及攻毒

以灭菌生理盐水将创伤弧菌ISCOM疫苗调整为350-450μg.ml^-1浓度的悬液。鳗鲡经鱼安定麻醉后，每尾腹腔注射上述免疫悬液0.1ml，每组10-25尾，对照组鳗鲡腹腔注射等剂量的灭菌生理盐水；实验组与对照组均设重复平行组。攻毒：于免疫后的第25-40天，用新鲜制备的创伤弧菌菌株的菌液(2×10⁴-5×10⁵cfu)腹腔注射攻毒，7-14天内观察并统计死亡情况。

实验室疫苗注射免疫后攻毒试验试验结果(见表1)，免疫组的免疫保护力为100％和对照组的存活率为0％。

表1 对照和免疫欧洲鳗对FJ03-X2菌株攻击的成活率比较

(c)口服免疫、采血及攻毒

创伤弧菌ISCOM疫苗，在鳗场对鳗鲡进行口服免疫试验。按每吨鱼体重每天拌料50ml疫苗，连续口服7天，间隔一周后再服7天；以不添加疫苗的常规饲料投喂鳗鲡为对照组。攻毒：于第2次免疫后的第25-60天进行攻毒试验，试验分2组，免疫组与对照组，每组10-25尾；免疫组与对照组均设重复平行组。用新鲜制备的创伤弧菌菌株的菌液(2×10⁴-5×10⁵cfu)腹腔注射攻毒，7-14天内观察并统计死亡情况。

田间疫苗口服免疫后攻毒试验免疫组的免疫保护力为100％，对照组的存活率为23.1％；试验结果见表2

表2 对照和免疫日本鳗对FJ03-X2菌株攻击的成活率比较

结果显示：创伤弧菌ISCOM疫苗安全、有效、实用。