一种钛及其合金心血管植入装置的表面定向固定CD34抗体或CD133抗体的方法

摘要

一种钛及钛合金心血管植入装置的表面定向固定CD34抗体或CD133抗体的方法，其主要步骤为：A.进行活化处理在表面形成羟基；B.在A步的活化表面吸附一层亲和素：C.再通过亲和素层吸附一层生物素化的蛋白A，D.在获得的蛋白A涂层的表面上，定向固定一层内皮祖细胞的细胞膜蛋白的特异性抗体——CD34抗体或CD133抗体。从而使钛及钛合金心血管植入装置植入人体后能捕获血液中内皮祖细胞，诱导植入装置表面的快速内皮化，从而使植入装置具有优良的抗凝血功能和抑制再狭窄发生的功能。

说明书

所属技术领域

本发明涉及钛及钛合金心血管植入装置的生物化改性方法。

背景技术

心血管系统疾病是危害人类健康的重要疾病之一，人工植入钛及钛合金心血管植入装置(血管支架或者心脏瓣膜)是治疗心血管疾病的有效方法。目前全世界每年有大约超过200万冠心病病人需要进行经皮穿刺冠状动脉成形术，其中70％需要植入血管支架。我国2006年接受血管支架植入治疗的患者也逾10万人次。我国心脏瓣膜病约占心脏病患者30％，每年也有十万以上危重病人必须施行人工心脏瓣膜置换术。

1987年Sigwar t首次采用钛及钛合金冠脉内支架(BMS)植入冠状动脉，但有20％～30％的病例会发生支架内再狭窄(ISR，即支架内由于平滑肌细胞过度增殖致使管腔再度狭窄)。目前在临床上主要应用通过使用药物涂层支架使再狭窄发生率降低到10％以下，药物涂层支架主要有两种：雷帕霉素涂层支架和多聚物为基础的紫杉醇涂层支架。虽然药物涂层支架能够降低再狭窄发生率，但由于涂层中的药物在抑制平滑肌细胞增殖的同时，也抑制了内皮细胞的增殖，使支架裸露，导致炎症、凝血甚至形成血栓。

目前我国每年由于瓣膜病变严重而需要实施人造心脏瓣膜替换手术的病人，大约20万例，这些病人多数为青壮年，如不能及时手术换瓣，将对社会造成不可估量的损失。目前常用的人工心脏瓣膜分为机械瓣膜和生物瓣膜两大类。前者采用钛及钛合金材料制成的，因其较好的耐久性而被大量应用，但使用机械瓣的患者术后须长期服用抗凝药物如华法令，防止血栓。生物瓣由于老化问题，可能需要在术后一定年后再次进行手术替换。如果能使机械瓣膜表面形成一层完整的内皮细胞层，将使凝血的可能性大大降低，即可以减少或不再服用抗凝药物，同时也几乎不需更换瓣膜，大大降低病人的治疗费用。

内皮祖细胞在受损心血管的内皮化中的起作用关键，循环血液内的内皮祖细胞能被趋化至心血管的损伤部位，其分化、增殖潜力可以使损伤内皮的结构功能快速修复。在心血管植入装置表面形成类似天然心血管内膜，即植入物表面内皮化被认为是最终解决植入后血栓形成问题和提高远期通畅率的根本途径，损伤内膜的快速内皮化是未来解决内膜增生和再狭窄的一个重要措施。

发明内容

本发明的目的就是提供一种钛及钛合金心血管植入装置的表面定向固定CD34抗体或CD133抗体的方法，该种方法能将CD34抗体或CD133抗体定向固定在钛及钛合金心血管植入装置的表面，使钛及钛合金心血管植入装置植入人体后能捕获血液中内皮祖细胞，诱导植入装置的快速内皮化，从而使植入装置具有优良的抗凝血功能和抑制再狭窄发生的功能。

为实现上述目的，本发明所采取的技术方案是，

一种钛及钛合金心血管植入装置的表面定向固定CD34抗体或CD133抗体的方法，其步骤如下：

A、活化处理

将钛及钛合金心血管植入装置在40-80℃的0.5-5mol/L NaOH溶液中浸泡1-24小时，取出后置于60-90℃去离子水中保温1-24小时，再在30-90℃的空气中干燥；

或者将钛及钛合金心血管植入装置在0.5-5mol/L的正磷酸溶液中浸泡1小时，清洗，干燥；

B、亲和素的固定：

将A步活化处理后的植入装置浸入亲和素浓度为0.1-5mg/ml的生理盐水或磷酸缓冲液中1-12小时，取出后用清洗，干燥；

或者将A步活化处理后的植入装置经去离子水、丙酮、甲苯依次漂洗后，置于含1％-10％ 3-氨丙基三氧乙基硅烷的甲苯中加热到60℃回流4小时，自然冷却至室温保存12h，取出后用甲苯、乙醇、去离子水依次清洗后真空干燥；再将其浸入含0.1-5mg/ml亲和素、并含有1-10mg/ml的1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳二亚胺、0.25mg/ml的N-羟基琥珀酰亚胺和0.1mg/ml的2-(N-吗啡啉)乙磺酸溶液中反应1-4h；清洗，干燥；

C、生物素化蛋白A的固定：

将B步处理后的植入装置，浸入0.1％-5％的白蛋白溶液中，室温孵育5-40分钟，再将其浸入含0.01-5mg/ml的生物素化蛋白A的生理盐水或磷酸缓冲液中1-12小时，取出后清洗，干燥；

D：抗体的定向固定：

将C步得到的吸附了生物素化蛋白A的植入装置浸入0.1％-5％的白蛋白溶液中5-40分钟，取出后浸入含0.01-1mg/ml的CD34抗体或CD133抗体的生理盐水或磷酸缓冲液中1-12小时，取出后清洗，干燥。

本发明制备过程中的化学反应过程、机理是：

通过A步条件下NaOH或正磷酸溶液的浸泡，使钛及钛合金心血管植入装置的表面形成多孔结构并带有大量的亲水的羟基。

再在B步中通过硅烷偶联剂——3-氨丙基三氧乙基硅烷中的乙氧基团与植入装置表面的羟基发生共价结合；在装置表面形成硅烷偶联剂单层；再在1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳二亚胺催化剂作用下，硅烷偶联剂单层的氨基与亲和素的羧基发生反应，而在表面上固定形成亲和素层。

在C步则先通过白蛋白与亲和素电荷吸附作用结合，再由生物素化蛋白A中的生物素基团(比白蛋白更易与亲和素结合)竞争替换下亲和素上吸附的白蛋白，形成亲和素与生物素化蛋白A的生物素基团特异结合。

D步中植入装置表面固定的生物素化蛋白A与浸泡溶液中的抗体CD34或CD133的非功能段即羧基端专一结合，从而抗体的功能域端远离固体表面向外排列，实现抗体的定向固定，用以捕获循环血液中的内皮祖细胞。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

通过表面活化得到的羟基及硅烷偶联剂的偶联共价结合亲和素在由亲和素与生物素化蛋白A特异结合，生物素化蛋白A与抗体的非功能端特异结合，而其功能域端远离固体表面向外排列，最终实现在植入装置定向构建出内皮祖细胞特异性识别表面，有效捕获血液中内皮祖细胞，诱导植入装置的快速内皮化。由于循环血液中的内皮祖细胞细胞膜表面高度表达CD34或CD133膜蛋白(属于抗原)，因此，本发明采用在装置材料表面功能端向外的定向固定CD34抗体或CD133抗体，最大限度保存了抗体的活性，提高了捕获血液中内皮祖细胞的效率，诱导植入装置表面的快速内皮化，从而使植入装置具有优良的抗凝血功能和抑制再狭窄发生的功能。

实验证明用本发明方法在表面定向固定CD34抗体或CD133抗体(也即用本发明方法改性)后的钛及钛合金心血管，能够有效捕获内皮祖细胞，诱导植入装置表面快速内皮化，具有有益的抗凝血功能。

所述A步用NaOH浸泡、保温及干燥后的植入装置，用紫外光照射1-30分钟后再进行B步的亲和素固定。紫外光照射能使活化处理的效果更好。

上述A步中的清洗为去离子水中超声清洗，干燥为氮气吹干，B、C、D步中的清洗为生理盐水或磷酸缓冲液漂洗，干燥为氮气吹干。这些清洗方式使得清洗更干净，氮气吹干则能更好的保持活性物质的活性。

附图说明

下面结合附图和实施例对本发明的方法作进一步详细的说明。

图1为本发明改性后的植入装置捕获内皮祖细胞实验的光学显微镜照片。

图2为未改性的植入装置捕获内皮祖细胞实验的光学显微镜照片。

图3为将本发明改性后的植入装置，植入成年狗的股动脉内2小时后，取出得到的扫描电子显微镜照片。

图4未改性的植入装置，植入成年狗的股动脉内2小时后，取出得到的扫描电子显微镜照片。

具体实施方式

实施例1

1、一种钛合金心血管植入装置的表面定向固定CD34抗体的方法，其步骤如下：

A、活化处理

将钛合金心血管植入装置在40℃的0.5mol/L NaOH溶液中浸泡1小时，取出后置于60℃去离子水中保温1小时，再在30℃的空气中干燥；用紫外光照射1分钟。

B、亲和素的固定：

将A步活化处理后的植入装置浸入亲和素浓度为0.1mg/ml的生理盐水中1小时，取出后用生理盐水漂洗，氮气吹干；

C、生物素化蛋白A的固定：

将B步处理后的植入装置，浸入0.1％的白蛋白溶液中，室温孵育5分钟，再将其浸入含0.01mg/ml的生物素化蛋白A的生理盐水中1小时，取出后生理盐水漂洗，氮气吹干；

D：抗体的定向固定：

将C步得到的吸附了生物素化蛋白A的植入装置浸入0.1％的白蛋白溶液中5分钟，取出后浸入含0.01mg/ml的CD34抗体的生理盐水中1小时，取出后生理盐水漂洗，氮气吹干。

实施例2

1、一种钛心血管植入装置的表面定向固定CD34抗体的方法，其步骤如下：

A、活化处理

将钛心血管植入装置在80℃的5mol/L NaOH溶液中浸泡24小时，取出后置于90℃去离子水中保温24h，再在90℃的空气中干燥后，用紫外光照射30分钟。

B、亲和素的固定：

将A步活化处理后的植入装置浸入亲和素浓度为5.0mg/ml的磷酸缓冲液中12小时，取出后用磷酸缓冲液漂洗，氮气吹干；

C、生物素化蛋白A的固定：

将B步处理后的植入装置，浸入5％的白蛋白溶液中，室温孵育40分钟，再将其浸入含5mg/ml的生物素化蛋白A的磷酸缓冲液中12小时，取出后磷酸缓冲液漂洗，氮气吹干；

D：抗体的定向固定：

将C步得到的吸附了生物素化蛋白A的植入装置浸入5％的白蛋白溶液中40分钟，取出后浸入含1mg/ml CD34抗体的生理盐水或磷酸缓冲液中12小时，取出后磷酸缓冲液漂洗，氮气吹干。

实施例3

1、一种钛合金心血管植入装置的表面定向固定CD133抗体的方法，其步骤如下：

A、活化处理

将钛合金心血管植入装置在70℃的3mol/L NaOH溶液中浸泡12小时，取出后置于70℃去离子水中保温20小时，再在80℃的空气中干燥后，用紫外光照射20分钟。

B、亲和素的固定：

将A步活化处理后的植入装置浸入亲和素浓度为1.0mg/ml的磷酸缓冲液中6小时，取出后用磷酸缓冲液漂洗，氮气吹干；

C、生物素化蛋白A的固定：

将B步处理后的植入装置，浸入1％的白蛋白溶液中，室温孵育40分钟，再将其浸入含0.1mg/ml的生物素化蛋白A的磷酸缓冲液中12小时，取出后磷酸缓冲液漂洗，氮气吹干；

D：抗体的定向固定：

将C步得到的吸附了生物素化蛋白A的植入装置浸入1％的白蛋白溶液中40分钟，取出后浸入含0.1mg/ml的CD133抗体的磷酸缓冲液中12小时，取出后磷酸缓冲液漂洗，氮气吹干。

实施例4

1、一种钛心血管植入装置的表面定向固定CD133抗体的方法，其步骤如下：

A、活化处理

将钛心血管植入装置在5mol/L的正磷酸溶液中浸泡3小时，去离子水中超声清洗，氮气吹干；

B、亲和素的固定：

将A步活化处理后的植入装置经去离子水、丙酮、甲苯依次漂洗后，置于含10％3-氨丙基三氧乙基硅烷的甲苯中加热到60℃回流4小时，自然冷却至室温保存12h，取出后用甲苯、乙醇、去离子水依次清洗后真空干燥；再将其浸入含5mg/ml亲和素、并含有10mg/ml的1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳二亚胺、0.25mg/ml的N-羟基琥珀酰亚胺和0.1mg/ml的2-(N-吗啡啉)乙磺酸溶液中反应4h；清洗，干燥；

C、生物素化蛋白A的固定：

将B步处理后的植入装置，浸入5％的白蛋白溶液中，室温孵育40分钟，再将其浸入含5mg/ml的生物素化蛋白A的磷酸缓冲液中12小时，取出后磷酸缓冲液漂洗，氮气吹干；

D：抗体的定向固定：

将C步得到的吸附了生物素化蛋白A的植入装置浸入5％的白蛋白溶液中40分钟，取出后浸入含1mg/ml的CD133抗体的磷酸缓冲液中12小时，取出后磷酸缓冲液漂洗，氮气吹干。

实施例5

1、一种钛合金心血管植入装置的表面定向CD133抗体的方法，其步骤如下：

将钛心血管植入装置在3mol/L的正磷酸溶液中浸泡2小时，去离子水中超声清洗，氮气吹干；

B、亲和素的固定：

将A步活化处理后的植入装置经去离子水、丙酮、甲苯依次漂洗后，置于含5％3-氨丙基三氧乙基硅烷的甲苯中加热到60℃回流4小时，自然冷却至室温保存12h，取出后用甲苯、乙醇、去离子水依次清洗后真空干燥；再将其浸入含0.5mg/ml亲和素、并含有6mg/ml的1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳二亚胺、0.25mg/ml的N-羟基琥珀酰亚胺和0.1mg/ml的2-(N-吗啡啉)乙磺酸溶液中反应2h；生理盐水漂洗，氮气吹干。

C、生物素化蛋白A的固定：

将B步处理后的植入装置，浸入1％的白蛋白溶液中，室温孵育20分钟，再将其浸入含0.1mg/ml的生物素化蛋白A的生理盐水中5小时，取出后生理盐水漂洗，氮气吹干；

D：抗体的定向固定：

将C步得到的吸附了生物素化蛋白A的植入装置浸入1％的白蛋白溶液中20分钟，取出后浸入含0.05mg/ml的CD133抗体的生理盐水中5小时，取出后生理盐水漂洗，氮气吹干。

实施例6

1、一种钛合金心血管植入装置的表面定向固定CD34抗体的方法，其步骤如下：

A、活化处理

将钛合金心血管植入装置在0.5mol/L的正磷酸溶液中浸泡0.5小时，去离子水中超声清洗，氮气吹干；

B、亲和素的固定：

将A步活化处理后的植入装置浸入亲和素浓度为1.0mg/ml的磷酸缓冲液中12小时，取出后用磷酸缓冲液漂洗，氮气吹干；

C、生物素化蛋白A的固定：

将B步处理后的植入装置，浸入0.1％的白蛋白溶液中，室温孵育5分钟，再将其浸入含0.01mg/ml的生物素化蛋白A的生理盐水中1小时，取出后清洗，干燥；

D：抗体的定向固定：

将C步得到的吸附了生物素化蛋白A的植入装置浸入0.1％的白蛋白溶液中20分钟，取出后浸入含0.01mg/ml的CD34抗体的生理盐水中1小时，取出后清洗，干燥。

实施例7

1、一种钛合金心血管植入装置的表面定向固定CD133抗体的方法，其步骤如下：

A、活化处理

将钛合金心血管植入装置在65℃的2.5mol/L NaOH溶液中浸泡12小时，取出后置于70℃去离子水中保温16小时，再在70℃的空气中干燥。

B、亲和素的固定：

将A步活化处理后的植入装置经去离子水、丙酮、甲苯依次漂洗后，置于含1％ 3-氨丙基三氧乙基硅烷的甲苯中加热到60℃回流4小时，自然冷却至室温保存12h，取出后用甲苯、乙醇、去离子水依次清洗后真空干燥；再将其浸入含0.1mg/ml亲和素、并含有1mg/ml的1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳二亚胺、0.25mg/ml的N-羟基琥珀酰亚胺和0.1mg/ml的2-(N-吗啡啉)乙磺酸溶液中反应1h；清洗，干燥；

C、生物素化蛋白A的固定：

将B步处理后的植入装置，浸入1％的白蛋白溶液中，室温孵育40分钟，再将其浸入含0.1mg/ml的生物素化蛋白A的磷酸缓冲液中12小时，取出后磷酸缓冲液漂洗，氮气吹干；

D：抗体的定向固定：

将C步得到的吸附了生物素化蛋白A的植入装置浸入1％的白蛋白溶液中40分钟，取出后浸入含0.1mg/ml的CD133抗体的磷酸缓冲液中12小时，取出后磷酸缓冲液漂洗，氮气吹干。

以下实验结果，证明本发明方法改性后的心血管植入装置能捕获血液中内皮祖细胞，诱导植入装置的快速内皮化：

实验一 体外流动腔模拟血流条件下血管植入装置表面对内皮祖细胞的捕获能力。

将本发明方法改性后的心血管植入装置与未改性的植入装置分别放在平板流动腔中，50ml的内皮祖细胞悬液(密度1×10⁶/ml)灌注入流动腔系统，调节流动腔内的液体流速，使剪切力大小约为1.0Pa，类似小动脉的剪切力。平板流动腔在在CO₂孵箱(37C，5％CO₂)孵育24h。然后取出，在PBS中轻轻洗涤。观察不同材料表面粘附的细胞数量。图1为本发明改性后的植入装置捕获内皮祖细胞实验的光学显微镜照片，图2为未改性的植入装置捕获内皮祖细胞实验的光学显微镜照片。图1、图2显示本发明改性后的植入装置涂层捕获动态循环液体中的内皮祖细胞的数量大大增加。

实验二 体内捕获内皮祖细胞，诱导材料表面内皮化实验。

将本发明方法改性后的心血管植入装置与未改性的植入装置分别植入成年狗的股动脉内，在2小时后取出进行扫描电子显微镜观察。图3、图4分别为改性后和未改性的植入装置的扫描电子显微镜照片。图3显示植入2小时后，改性后的植入装置表面几乎被卵圆形或扁平的细胞所覆盖，多数细胞开始在材料表面铺展。图4显示植入2小时后，未改性的植入装置表面沉积较多的血小板和纤维蛋白。可见，本发明方法改性后的心血管植入装置能够有效捕获内皮祖细胞，诱导材料表面快速内皮化，具有有益的抗凝血功能。