中药金钱草抗结石分级提取物的制备方法及其应用

摘要

本发明属于医药技术领域，特别是用于预防和治疗尿结石的中药金钱草抗结石分级提取物的制备方法。金钱草用乙醇，加热回流提取，回收乙醇，浓缩，得总提取物，水浴浓缩得醇浸膏，再依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、水分步萃取，回收溶剂，浓缩，分别得金钱草的分级提取物石油醚部分、乙酸乙酯部分、正丁醇部分、水层部分。药理试验表明，本发明的金钱草醇提物和分级提取物能明显降低大鼠尿液草酸和尿钙含量，明显降低肾组织损伤和抑制结石沉积，是预防和治疗尿结石的活性成分，可直接、复合制成各种方便使用的药物制剂或作为食品添加剂用于尿结石的防治。

说明书

技术领域

本发明属于医药技术领域，特别是用于预防和治疗尿结石的中药金钱草抗结石分级提取物的制备方法及其应用。

背景技术

尿结石(尿石症)为泌尿系统常见病，多发病。尿石症的发病率受遗传，营养，环境等多种因素影响。由于各民族生活习惯和饮食结构和遗传基因的不同，我国尿石症的发病率存在民族差异、年龄差异、性别差异。近几十年来，随着我国社会经济状况的改变，尿石症患者的构成发生了明显变化，尿石症分布的地区差异、年龄差异、性别差异明显缩小，发病率有逐年增加的趋势，目前我国尿石症的发病年龄高峰为21～50岁。尿结石可造成肾脏局部炎性浸润，并蔓延至周围组织，长期的结石压迫可引起梗阻，导致肾盂肾炎、肾积水、恶性病变、肾功能衰竭等一系列病理改变，严重影响国民健康和生活质量。

金钱草为报春花科植物过路黄(Lysimachia Christinae Hance)的干燥全草，又名大金钱草、对座草、路边黄、遍地黄等。主要分布于长江流域，北至陕西，南到贵州、四川、云南等省，其中以四川为主产地。金钱草味苦，酸，微寒，归肝，胆，肾，膀胱经。功能清热解毒，利尿排石，活血散淤。用于肝、胆结石，胆囊炎，黄疸性肝炎，泌尿系结石，水肿，跌打损伤，毒蛇咬伤，毒蕈及药物中毒；外用治化脓性炎症，烧烫伤。药理研究证明金钱草能显著促进大鼠胆汁分泌，明显降低致石豚鼠胆汁中游离胆红素和钙离子的含量，显著提高总胆汁酸的含量，抑制胆红素结石的形成[中药药理与临床.2004；20(2)：21-22]。金钱草是治疗尿结石的传统药物，疗效经多年的临床应用得到良好的验证。金钱草的治疗尿结石作用主要有三个方面：1、使碱性尿液酸性化，并起到溶石的作用；2、松弛、扩张膀胱、输尿管平滑肌，利于结石排出；3、显著利尿效应，增加肾盂、输尿管内压，起到推石下移的作用[中西医结合临床[J].2004；4(3)：44]。

目前金钱草作为中药治疗结石的金石之药，在抗结石复方中广泛应用，但迄今为止，其抗结石作用的物质基础-有效成分尚不明确。有研究认为槲皮素和山柰素是金钱草的主要药理活性成分[江苏药学与临床研究.2005；13(1)：31-33]，另外所含的黄酮类化合物具有酚羟基可能是抗氧化作用的主要活性基团[中成药，2005，27(2)：239-241]。

发明内容

本发明的目的是将金钱草分级提取，得到醇提物(JA)及四个分级产物，即石油醚部分(JB)、乙酸乙酯部分(JC)、正丁醇部分(JD)、水层部分(JE)，通过药理试验来证明中药金钱草提取物JA、JB、JC、JD、JE是抗结石的活性成分，明显降低大鼠尿液草酸和尿钙含量，明显降低肾组织损伤和结石沉积程度，明显抑制草酸钙晶体形成过程，延长结晶成核、形成、聚集的时间，延长三水草酸钙结晶向一水草酸钙结晶转化的时间，抑制结晶的数量，降低结晶的大小及密度，从而抑制草酸钙晶体形成，保护肾组织。中药金钱草提取物JA、JB、JC、JD、JE作为预防和治疗尿结石的活性成分，使直接、复合制成各种方便使用的药物制剂或作为食品添加剂用于尿结石的防治。

本发明采用金钱草药材为报春花科植物过路黄(Lysimachia christinaeHance)的干燥全草。金钱草药材用30～90％乙醇，80℃～100℃加热回流提取2～3次，每次0.5～2小时，过滤，合并两次滤液，回收乙醇，水浴浓缩得总提取物醇浸膏(JA)，再依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、水、分步萃取3～4次，合并同类萃取液，回收溶剂，浓缩，分别得金钱草的分级提取物，即：石油醚部分(JB)、乙酸乙酯部分(JC)、正丁醇部分(JD)、水层部分(JE)。金钱草分级提取流程图，见说明书附图图1。

本发明通过药理试验证明了金钱草抗结石分级提取物的抗结石作用，是预防和治疗尿结石的活性成分。本发明金钱草分级提取物作为预防和治疗尿结石的活性成分，经直接、复合制成各种方便使用的药物制剂或作为食品添加剂，用于尿结石的防治。

本发明药效实验结果如下：

1、体内大鼠草酸钙结石模型试验：

金钱草抗结石分级提取物JA、JC、JD、JE可增加肾结石大鼠尿量，其中JA对尿量的增加较显著；降低尿钙、尿草酸的含量，其中JC、JE对尿液钙含量的降低有显著的统计学意义，JA、JE对尿液草酸含量的降低有显著的统计学意义；降低肾组织病变程度，减少肾组织草酸钙晶体量；降低肾组织骨桥蛋白表达量，从而抑制草酸钙结晶的肾组织的沉积。

2.体外草酸钙结晶动力学试验：

金钱草提取物可延长结晶诱导时间，在浓度24μg/ml时尤其明显，其中JB、JD、JE在24μg/ml浓度与对照条件比较有显著差异，提示金钱草提取物均可抑制草酸钙结晶的形成；金钱草提取物JA、JB、JC、JD在高浓度24μg/ml时可明显降低吸收峰值，表明可抑制草酸钙结晶的生成量；金钱草提取物JA、JB、JC、JD、JE可延长草酸钙结晶的达峰时间，抑制草酸钙结晶的形成，各组在浓度0.24～24μg/ml对Tmax的延长均在2倍以上；金钱草提取物均可抑制草酸钙结晶的成核速率，且JA、JB、JC、JD对成核速率的抑制在浓度0.24～24μg/ml呈剂量相关性，浓度越大，抑制越强，而JE无剂量相关性；金钱草提取物均可抑制草酸钙结晶的聚集速率，但各组分对聚集速率的抑制无剂量相关性。

3.体外草酸钙结晶形态学研究

金钱草各提取物能影响草酸钙结晶的形态、大小，延长三水草酸钙结晶向一水草酸钙结晶转化的时间，抑制结晶的数量，从而降低结晶的大小及密度，强度依次为JB≥JC＞JA≥JD＞JE＞。

综上所述，本发明的金钱草醇提物和分级提取物能明显降低大鼠尿液草酸和尿钙含量，明显降低肾组织损伤和结石沉积程度，明显抑制草酸钙晶体形成过程，延长结晶成核、形成、聚集的时间，延长三水草酸钙结晶向一水草酸钙结晶转化的时间，抑制结晶的数量，降低结晶的大小及密度，从而抑制草酸钙晶体形成，保护肾组织。金钱草醇提物和分级提取物是预防和治疗尿结石的活性成分，可直接、复合制成各种方便使用的药物制剂或作为食品添加剂用于尿结石的防治，特别是能制成颗粒剂、口服液、散剂、片剂、胶囊、丸剂等；作为食品添加剂可制成果汁或果肉型饮料、糖果、糕点等。

附图说明

图1为金钱草分级提取流程图。

具体实施方式

实施例1

本发明中的金钱草抗结石分级提取物使用的金钱草药材为报春花科植物过路黄(Lysimachia christinae Hance)的干燥全草。具体制备方法如下：

一.金钱草醇提物的获得

金钱草药材5kg，加30～90％乙醇(溶剂比1∶8～10)浸泡过夜，加热80～100℃回流2小时，过滤。滤渣再用乙醇，回流提取2小时，过滤。合并两次滤液，回收乙醇，水浴浓缩得醇浸膏(JA)。

二.不同极性溶剂萃取

金钱草醇提物适量，用水溶解后得混悬物1000ml左右，置于2L分液漏斗中，依次加入石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、水分步萃取3～4次，合并同类萃取液，回收溶剂，水浴浓缩，分别得金钱草的分级提取物：石油醚部分(JB)、乙酸乙酯部分(JC)、正丁醇部分(JD)、水层部分(JE)。浓缩的浸膏，称重，计算得率。

三.金钱草分级提取流程图，见说明书附图1。

四.药理试验

下面的药理试验将进一步具体说明金钱草分级提取物的抗结石作用。

1.金钱草分级提取物抑制大鼠尿结石的作用

1.1实验方法：大鼠80只，雄性，随机分为8组，每组10只。除对照组小鼠每日饮用正常水外，其它各组均饮用成石水(1％的乙二醇+1％氯化铵)，连续饮用1周，同时各组按下述剂量给药：①对照组，ig.等体积水(1ml/100g)；②模型组，ig.等体积水；③排石颗粒组，ig.6g/kg；④总浸膏组(JA)，ig.500mg/kg；⑤石油醚部分(JB)，ig.200mg/kg，⑥乙酸乙酯部分(JC)，ig.200mg/kg；⑦正丁醇部分(JD)，ig.200mg/kg；⑧水层部分(JE)，ig.200mg/kg。每天给药1次，连续1周。给药前后各称体重1次，比较实验前后大鼠体重的变化。每天观察动物表观变化。于实验第7天给药后，用代谢笼收集各组大鼠12h尿液，并测定12h尿量、尿液pH值，尿液于-20℃保存，测定12h尿钙、尿草酸、尿镁含量。第8天处死大鼠后，立即解剖肾脏，观察肾外观，并称重，肾脏以10％中性福尔马林固定，常规石蜡切片，作HE染色，光学显微镜下观察肾组织形态及草酸钙结晶分布；骨桥蛋白免疫组化染色，光学显微镜下观察肾组织的骨桥蛋白表达量。

1.2实验结果

1.2.1对大鼠体重和肾脏重量、尿量、尿pH的影响

肾结石模型大鼠，体重增长明显抑制，肾脏指数增加，尿量明显减少，尿pH下降，而金钱草各提取物各组对肾结石大鼠的体重抑制、肾脏指数增加，尿pH的降低无明显的影响，而金钱草提取物JA、JC、JD、JE可增加肾结石大鼠尿量，其中金钱草提取物JA对尿量的增加有显著的统计学意义(P＜0.01)，提取物JB对尿量无明显的影响，结果见表1。

表1对大鼠尿量、尿pH的影响(n＝10，x±s)

与对照组比较：##P＜0.01；与模型组比较：***P＜0.001，***P＜0.01

1.2.2对大鼠尿液钙、草酸和尿镁含量的影响

肾结石模型大鼠的尿液钙、草酸明显增加，而尿镁无明显变化；金钱草提取物可降低尿钙、尿草酸的含量，其中金钱草提取物JC、JE对尿液钙含量的降低有显著的统计学意义，金钱草提取物JA、JE对尿液草酸含量的降低有显著的统计学意义，但各组尿镁均无明显的影响，结果见表2。

表2对大鼠尿液钙、镁和草酸含量(n＝10，x±s)

与对照组比较：##P＜0.01；与模型组比较：***P＜0.001，**P＜0.01

1.2.3大鼠肾组织形态和草酸钙结石观察

HE染色病理切片观察：草酸钙晶体在正常光镜下呈灰褐色，在相差和偏光下晶体有明亮的光泽。对照组动物肾脏正常，无结晶沉积；模型组动物肾脏病变程度较严重，小管上皮细胞明显肿胀、变性、坏死，管腔显著扩张；肾组织草酸钙结晶布满全肾，主要分布在肾皮质部、髓质部、肾乳头、肾盏、肾盂内，严重者多量大结石积集成堆，成堆且互相连接成片；与模型组比较，金钱草提取物各组肾组织病变程度较轻，草酸钙晶体明显少于模型组，尤其在肾髓质部分，其管腔扩张程度也明显比模型组轻，肾组织草酸钙结石评分结果见表3。

表3大鼠肾脏HE染色病理切片草酸钙结石评分(x±s)

与对照组比较：###P＜0.001；与模型组比较：***P＜0.001，**P＜0.01，*P＜0.05

1.2.4大鼠肾组织骨桥蛋白的表达(半定量计分)

与对照组比较，肾结石模型大鼠肾脏骨桥蛋白表达量显著增多；各给药组与模型组比较，骨桥蛋白表达量显著下降。提示金钱草提取物通过抑制草酸钙结晶，降低骨桥蛋白在肾结石的表达，抑制草酸钙结晶的肾组织的沉积，结果见表4。

表4对肾结石大鼠骨桥蛋白表达的影响(n＝10，x±s)

与对照组比较：###P＜0.001；与模型组比较：***P＜0.001，**P＜0.01，*P＜0.05

2.体外草酸钙结晶动力学试验

2.1实验方法：过饱和溶液草酸钙搅拌，析出晶体，通过分光光度计动态测定在620nm时的OD值，观察在过饱和溶液中草酸钙晶体的形成、成核和聚集过程。在比色皿中加入1.25mM的草酸钾溶液1ml，加0.5ml双蒸水(或待测定药物溶液)，同时马上加入钙混和液(新鲜配置含12.50mM的CaCl₂，12.50mM的醋酸钠，250.00mM的NaCl，调pH值到5.7)1ml，记录溶液在620nm处的OD值。实验在37℃的恒温条件下进行，加入钙溶液后，分光光度计每5s自动记录1次，记录20min，每个实验重复5遍。上述反应体系中钙离子终浓度为5.00mM，草酸根离子终浓度为0.50mM。测定参数包括最大吸收峰Amax-草酸钙结晶曲线的最大吸收峰值，最大吸收峰时间Tmax-草酸钙结晶曲线的最大吸收峰的达峰时间，诱导时间(TI)--即诱导形成可测定微粒形成所需的时间，成核速率(SN)--草酸钙结晶A₆₂₀曲线上升支的斜率(只受晶核的影响)和聚集速率(SA)--即草酸钙结晶A₆₂₀曲线下降支的斜率(主要受晶体聚合物的影响)。以及加入金钱草提取物后参数的变化。抑制率(负值表示结晶过程的促进作用)计算公式如下：

成核抑制率＝(1-SN_受试药/SN_对照)×100％

聚集抑制率＝(1-SA_受试药/SA_对照)×100％

2.2实验结果

诱导时间(TI)为体系形成可被仪器测定微粒形成所需的时间，反映了草酸钙结晶最初形成的时间。金钱草提取物均可延长TI，在浓度24μg/ml时尤其明显，其中JB、JD、JE在24μg/ml浓度与对照条件比较有显著差异，提示金钱草提取物均可抑制草酸钙结晶的形成，结果见表5。

草酸钙结晶的生成量越多，曲线的Amax越高，Amax反映了草酸钙结晶最大生成量。与对照条件比较，金钱草提取物各组对Amax均有不同程度的影响，其中JA、JB、JC、JD的影响较大，在高浓度24μg/ml时可明显降低Amax(P＜0.001)，而JE对Amax的影响无明显的剂量关系，提示金钱草提取物可抑制草酸钙结晶的生成量，结果见表5。

草酸钙结晶曲线的Tmax越小，草酸钙结晶曲线的达峰时间越短，Tmax反映了草酸钙结晶曲线峰值时间。与对照条件比较，金钱草提取物各组对Tmax均有不同程度的增加，提示金钱草提取物可延长草酸钙结晶的达峰时间，抑制草酸钙结晶的形成，各组在浓度0.24～24μg/ml对Tmax的延长均在2倍以上，结果见表5。

表5在各种条件下草酸钙结晶形成的参数值(1)(n＝5，x±s)

与对照组比较：*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001

表6在各种条件下草酸钙结晶形成的参数值(2)(n＝5，x±s)

成核速率(SN)为草酸钙结晶A₆₂₀曲线上升支的斜率，其只受晶核的影响，反映了草酸钙结晶的成核速率。金钱草提取物均可抑制草酸钙结晶的成核速率，且JA、JB、JC、JD对SN的抑制在浓度0.24～24μg/ml呈剂量相关性，浓度越大，抑制越强，而JE对SN的抑制无剂量相关性，结果见表6。

聚集速率(SA)为草酸钙结晶A₆₂₀曲线下降支的斜率，主要受晶体聚合物的影响，反映了草酸钙结晶的聚集速率。金钱草提取物均可抑制草酸钙结晶的聚集速率，但各组分对SA的抑制无剂量相关性，结果见表6。

3.体外草酸钙结晶形态学研究

3.1实验方法：采用草酸钙亚稳过饱和溶液体系，使用偏光相差显微摄像分析系统观察药物对草酸钙晶体形态的影响。在一只洁净的烧杯中加入5mM的CaCl₂溶液19ml，150mM的NaCl溶液120ml，然后一边磁力搅拌，加入0.5ml的双蒸水(或0.5ml溶媒对照)，缓慢滴加5mM的Na₂C₂O₄溶液19ml，滴加速度大约是1.0ml/min，使得[Ca²⁺]＝[C₂O₄^2-]＝0.6mM，得到草酸钙亚稳过饱和溶液。观察药物影响时用受试药物0.5ml代替0.5ml的双蒸水，同法操作。受试药物浓度分别为2.00、0.40、0.08mg/ml，终浓度分别为6.31、1.26、0.25μg/ml。

在烧杯底部放入3片经过亲水性处理的玻璃片，将各烧杯用封口膜密封，于31±1℃培养箱中放置，分别于第1d、3d、6d各取出一片玻璃片，干燥，相差显微镜下(400×，ph2)观察得到的晶体：晶体类型、密度、周长及长短轴的变化。每张玻璃片随机拍摄4个不同的视野，用图像分析软件进行分析计算得出分散单颗晶体的参数：周长、长轴、短轴。

3.2实验结果

从实验观察到草酸钙晶体有三种形态，结晶初始为长棒状(可能为三水草酸钙结晶)，逐渐形成四角锥形(可能为二水草酸钙结晶)和拉长的六边形晶体(可能为一水草酸钙结晶)。文献报道三水和二水草酸钙结晶极不稳定，定向转化为稳定的一水草酸钙结晶，然后聚集成较大结晶，本实验过程中观察到最多的晶形为长棒状和六边形晶体。按长棒状晶体多少，依次为JB≥JC＞JA≥JD＞JE＞H₂O；按六边形晶体多少，依次为H₂O＞JE＞JA≥JD＞JC≥JB，实验结果显示金钱草各提取物能延长三水草酸钙结晶向一水草酸钙结晶转化的时间，抑制结晶的数量，从而降低结晶的大小及密度，上述显微镜下观察结果与晶体的参数分析结果相一致，结果见表7。

表7相差显微镜下晶体类型、密度

用图像分析软件进行分析计算得出分散单颗晶体的参数：周长、长轴、短轴。因第1天、第3天结晶颗粒多而密度较大，参数测定困难，这里只列出第6天六边形晶体，长棒状晶体计算结果。数据显示金钱草提取物JA，JD可使六边形晶体周长、长轴、短轴等参数降低，具有统计学意义。对照组第6天棒状晶体生成极少，无法计算数值，而JA、JD、JE也有棒状晶体生成，但由于边缘不够

清晰所以无法计算数值。结果显示在该实验体系中金钱草提取物对草酸钙结晶的形态、大小有明显影响，其中JB、JC生成的六边形晶体最少，其次是JA、JD，而JE又次之，提示金钱草各提取物能延长三水草酸钙结晶向一水草酸钙结晶转化。

药理试验表明，本发明的金钱草醇提物和分级提取物能明显降低大鼠尿液草酸和尿钙含量，明显降低肾组织损伤和结石沉积程度，明显抑制草酸钙晶体形成过程，延长结晶成核、形成、聚集的时间，延长三水草酸钙结晶向一水草酸钙结晶转化的时间，抑制结晶的数量，降低结晶的大小及密度，从而抑制草酸钙晶体形成，保护肾组织。金钱草醇提物和分级提取物是预防和治疗尿结石的活性成分，可直接、复合制成各种方便使用的药物制剂或作为食品添加剂用于尿结石的防治。

五.金钱草分级提取物在抗泌尿系结石中的应用

本发明将通过下列实施例说明。以下配方实施例中的单位均为重量百分比(W/％)。

实施例2

金钱草排石颗粒

金钱草分级提取物浸膏    15～30

乳糖                    30

糊精                    30

                        制成1000克

实施例3

金钱草排石口服液I

金钱草分级提取物浸膏    5～25

聚山梨酯80              10

90％乙醇                60ml

单糖浆                  200ml

蒸馏水加至              1000ml

实施例4

金钱草排石口服液II

金钱草分级提取物浸膏    5～25

聚山梨酯80              10

90％乙醇                60ml

蒸馏水加至              1000ml

实施例5

金钱草排石散

金钱草分级提取物浸膏    12～15

金钱草药材细粉          50～300

蔗糖                    适量

                        制成1000克

实施例6

金钱草排石片

金钱草分级提取物浸膏    25～30

枸橼酸钠                1～2

淀粉                    20～30

糊精                    15～20

                        制成1000片

实施例7

金钱草排石胶囊

金钱草分级提取物浸膏    5～25

羧甲基纤维素钠          20～30

糊精                    15～30

                        制成1000粒

实施例8

金钱草排石丸

金钱草分级提取物浸膏    5～25

枸橼酸钠                1～2

羧甲基纤维素钠          20～30

蔗糖                    15～30

蜂蜜                    适量

                        制成1000丸

实施例9

金钱草青梅(果汁)清排饮料

金钱草分级提取物浸膏    5～10

青梅粉或果汁            2～3(20～30ml)

枸橼酸钠                1～2

聚山梨酯80              10ml

90％乙醇                60ml

12蒸馏水加至            1000ml

根据上述实施例，金钱草分级提取物浸膏可以指JB、JC、JD、JE的单一使用，也可指它们间两两加合或多组分组合使用。因此，本发明可有许多改良和变更，除上述涉及例之外，在所附权力要求范围内，本发明也可以用其它方法实施。