一种测定黑刺菝葜或其制剂中皂苷元含量的方法

摘要

本发明公开了一种测定黑刺菝葜或其制剂中皂苷元含量的方法。该方法是先在黑刺菝葜或其制剂中加入酸水溶液或酶分解皂苷后，再用与水不相混溶的二氯乙烷或氯仿、乙酸乙酯等可溶性有机溶剂从中提取出皂苷元，然后在高氯酸作用下，在冰醋酸中使之与香草醛显色反应，以拉肖皂苷元为对照品，用比色法在波长450nm处测定其含量。本发明的方法能检测黑刺菝葜或其制剂中皂苷元的含量，反应特异性强，复现性好，方法稳定可靠。

说明书

技术领域

本发明涉及一种测定黑刺菝葜或其制剂中皂苷元含量的方法，具体地说涉及一种以香草醛为显色剂，用比色法间接测定黑刺菝葜或其制剂中皂苷元含量的方法。

背景技术

黑刺菝葜(Smilax scobinicaulis C.H.Wright)又名短梗菝葜，是菝葜科菝葜属植物，生于低山灌丛或山谷河岸，主产于陕西、甘肃各省，广泛分布于北方地区，资源十分丰富。其根茎在我国北方代替威灵仙入药，商品上称为“铁丝威灵仙”、“金刚刺”、“金刚藤”等。煎汤或浸酒内服；研粉、磨汁调敷或煎水洗外用；具除风湿、活血解毒、镇惊息风和抗癌等功效，临床上用于治疗风湿性腰腿病、小儿惊风肠炎、瘰疬，疮疖、癌肿等病症。

黑刺菝葜或其制剂中主要活性成分为以拉肖皂苷元(Laxogenin)为非糖部分的多种甾体皂苷，目前还没有关于黑刺菝葜或其制剂中皂苷元含量测定方法的文献报道，这对以皂苷元为主要药效成分的黑刺菝葜药材及其制剂的质量控制、资源评价和有效成分的提取分离带来很大的困扰，不利于中药材的现代化利用，因此，测定黑刺菝葜药材及其制剂中皂苷元含量具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是建立一种测定黑刺菝葜或其制剂中皂苷元含量的方法，也就是提供一种以香草醛为显色剂，用比色法间接测定黑刺菝葜或其制剂中皂苷元含量的方法。

本发明的原理是先提取出皂苷元，在高氯酸作用下，在冰醋酸中使之与香草醛显色反应，以拉肖皂苷元为对照品，用比色法测定。该方法稳定，复现性好，测定结果准确可靠，从而实现了本发明的目的。

本发明测定黑刺菝葜或其制剂中皂苷元含量的方法，是将黑刺菝葜或其制剂中的皂苷元提取出来，然后以香草醛为显色剂，用比色法测定其含量，其特征在于先在黑刺菝葜或其制剂中加入酸水溶液或酶分解皂苷后，再用与水不相混溶的二氯乙烷或氯仿、乙酸乙酯等可溶性有机溶剂从中提取出皂苷元，得供试液。

黑刺菝葜或其制剂中皂苷元以香草醛为显色剂的反应，最好采用香草醛-冰醋酸-高氯酸溶液体系，该体系最好是：准确称取香草醛0.2g于棕色瓶中，加冰醋酸4.0mL，冷藏，加入高氯酸16.0mL，摇匀。

本发明测定黑刺菝葜或其制剂中皂苷元含量的具体方法是，以拉肖皂苷元为对照品，最大吸收波长450nm，比色法测定皂苷元含量；其主要包括如下步骤：精密吸取供试液于比色管中，水浴加热挥干溶剂，加入与供试液等体积的香草醛-冰醋酸-高氯酸溶液，60℃水浴加热15min，取出后马上用冰水浴冷却10min，再准确加入冰醋酸5.0mL摇匀；用紫外分光光度计在450nm处测定其吸收光度值；以测得的吸收光度值Y通过线性回归方程得试液中皂苷元的含量X。

本发明测定黑刺菝葜或其制剂中皂苷元含量的方法，反应特异性强，复现性好，方法稳定可靠。

附图说明

图1：拉肖皂苷元与香草醛化合物的吸收光谱

图2：显色剂反应后的稳定性

图3：拉肖皂苷元标准曲线

具体实施方式

以下实施是对本发明的进一步说明，不是对本发明的限制。

以下实施所采用的试剂均为分析纯，仪器为752型紫外可见分光光度计，香草醛-冰醋酸-高氯酸溶液：准确称取香草醛0.2g于棕色瓶中，加冰醋酸4.0mL，配制5％香草醛冰乙酸溶液(g/mL)，冷藏；加入高氯酸16.0mL，摇匀。空白对照条件：加入香草醛-冰醋酸-高氯酸溶液1mL于比色管中，60℃水浴加热15min，取出后马上用冰水浴冷却10min，再准确加入冰醋酸5.0mL稀释，摇匀。

实施例1：最大吸收波长测定

精密吸取拉肖皂苷元溶液1mL于比色管中，水浴加热挥干溶剂，加入香草醛-冰醋酸-高氯酸溶液1mL，60℃水浴加热15min，取出后马上用冰水浴冷却10min，再准确加入冰醋酸5.0mL稀释，摇匀，用紫外可见分光光度计在400～650nm范围内扫描，发现对照品溶液与样品溶液均在450nm处有最大吸收峰且较为稳定，空白溶液在此只有微弱吸收，吸收曲线见附图1。

实施例2：显色反应温度确定

精密吸取拉肖皂苷元溶液1mL于比色管中，水浴加热挥干溶剂，加入香草醛-冰醋酸-高氯酸溶液1mL，不同温度水浴下加热15min，取出后马上用冰水浴冷却10min，再准确加入冰醋酸5.0mL稀释，摇匀，用紫外可见分光光度计在400～650nm范围内扫描，扫描结果见表1。由表1可知，水浴温度在40～60℃时，λmax变化不大；当温度大于70℃时，λmax变化较大；当温度60℃时，吸光度值(A)最大，且λmax变化幅度最小，因此显色反应温度设定为60℃。

表1 水浴温度对λ_max及A影响

  水浴温度(℃)  最大吸收波长(λ_max/nm)  吸光度值(A)  40  449  0.277  50  448  0.293  60  450  0.307  70  455  0.265  80  430  0.261

实施例3 稳定性试验

精确吸取对照品溶液0.5mL于比色管中(同时做一空白对照)，水浴加热挥干溶剂，加入香草醛-冰醋酸-高氯酸溶液1.0mL，60℃水浴下加热15min，取出后马上用冰水浴冷却10min，再准确加入冰醋酸5.0mL稀释，摇匀，用紫外可见分光光度计在450nm测定吸收光度值A，分别于0～100min内测定A，结果见图2。

图2表明：显色体系在0～30min内吸光度值A不稳定；在30～70min内吸光度值比较稳定；超过70min后A明显下降。因此，在显色后30～70min内测定的数据是可靠的。

实施例4 拉肖皂苷元标准曲线制备

标准溶液配制：精密称取拉肖皂苷元对照品约5mg，用氯仿溶解定容至25mL，制成每1mL含0.2mg的标准溶液。

分别精确吸取标准溶液0.1、0.3、0.5、0.7、0.9、1.1、1.3、1.5mL于比色管中(同时做一空白对照)，水浴加热挥干溶剂，加入香草醛-冰醋酸-高氯酸溶液1.0mL，60℃水浴下加热15min，取出后马上用冰水浴冷却10min，再准确加入冰醋酸5.0mL稀释，摇匀，用紫外可见分光光度计在450nm测定吸收光度值Y，以拉肖皂苷元的质量为横坐标(mg)，吸收光度值为纵坐标绘制标准曲线，得回归方程为：y＝0.6146x-0.0225及相关系数R²＝0.995。

实施例5 供试样品中皂苷元含量测定

取黑刺菝葜干燥根粗粉15g，加入50mL 10％硫酸溶液，50mL氯仿回流提取三次，提取温度70℃，每次2小时，分别合并三次氯仿提取液，减压回收溶剂并定容至25mL，得供试液。

精确吸取供试液1mL于比色管中，水浴加热挥干溶剂(同时做一个空白)，加入香草醛-冰醋酸-高氯酸溶液1.0mL，60℃水浴下加热15min，取出后马上用冰水浴冷却10min，再准确加入冰醋酸5.0mL稀释，摇匀，用紫外可见分光光度计在450nm测定吸收光度值。每组样品重复三次，取其平均值。以测定的吸收光度值Y(A)通过线性回归方程，算得测定液中皂苷元的含量x为0.892mg。

根据下述式(1)计算黑刺菝葜干燥根中皂苷元质量分数为0.149％。

$X=\frac{x}{m\times \frac{V_0}{V}\times 1000}\times 100$式(1)

式(1)中：

X为试样中拉肖皂苷元物质的含量，单位为g/100g；

x为从标准曲线上算得的测定液中拉肖皂苷元的含量，单位为mg；

m为试样的质量，单位为g；

V为供试液定容的体积，单位为mL；

V₀为取测定液的体积，单位为mL；

计算结果保留三位有效数字。

实施例6 回收率试验

精确量取6份黑刺菝葜干燥根的样品已处理溶液，每份1mL，加入一定量的拉肖皂苷元对照品溶液，按最佳显色条件进行反应，测定A结果见表2.

表2 回收率试验结果

样品平均回收率达到97.32％，RSD＝1.46％，表明拉肖皂苷元在测定过程中基本没有损失，该方法可靠。