一种提高微生物油脂发酵生产效率的方法

摘要

本发明涉及微生物油脂的生产，具体地说是一种提高微生物油脂发酵生产效率的方法，将产油酵母菌种子液接种于发酵液中，在发酵期间添加醇类化合物，醇类化合物于发酵液中的浓度为0.01－5.0mM，其添加时间为发酵液接种后的0－40h，待发酵液中总还原糖浓度降至1g/L以下时停止培养，离心收集菌体，经有机溶剂抽提获得微生物油脂；与不加入醇类化合物的对照组比较，菌体生物量、油脂含量和脂肪得率系数增率分别达0.6％－5.7％、0.2％－7.4％和1.4％－13.2％，发酵时间缩短2.8％－27.1％。其切实有效，简单易行，是一种缩短发酵周期，增强微生物对底物利用能力，提高微生物油脂生产效率的新方法。

说明书

技术领域

本发明涉及微生物油脂的生产，具体地说是一种提高微生物油脂发酵生产效率的方法，是在发酵期间添加醇类化合物于发酵培养基中，通风培养至发酵液中总还原糖浓度降至1g/L以下时停止，离心收集菌体，经有机溶剂抽提获得更高产量的微生物油脂。本发明技术简单有效，可增强微生物将碳水化合物转化为油脂的能力，并且可以缩短发酵周期，显著提高微生物油脂的生产效率。

背景技术

微生物油脂是指某些微生物包括酵母菌、霉菌、藻类等在一定条件下将碳水化合物、碳氢化合物等转化为菌体内的脂肪酸甘油酯，其脂肪酸组成与常规植物油脂相似，主要是C₁₆和C₁₈系脂肪酸，如棕榈酸、硬脂酸、油酸和亚麻酸等。

目前用于油脂生产的原料主要以油料植物和油料作物为主，但因其占用耕地，生产受到季节和自然条件的制约，不利于油脂原料稳定和连续供应。而利用微生物发酵法获取微生物油脂是一条发展潜力巨大的获取新油源的好途径。微生物油脂不但可以缓解我国油脂资源紧缺的局面，而且能够合理利用废弃的生物质资源，降低油脂生产成本，提高产品附加值，实现连续大规模生产，有利于环境保护。微生物油脂用途广泛，通过与醇进行酯交换反应，生产可降解的润滑油、溶剂油、油漆和油墨溶剂、表面活性剂、粘接剂等产品。因此，微生物油脂研究具有广阔的发展空间。

提高微生物油脂发酵生产效率的技术途径很多，其中缩短发酵时间和提高脂肪得率系数(脂肪得率系数是指每100克底物经发酵转化所获得的脂肪质量)是最重要的途径。其中脂肪得率系数又与生物量产量和菌体油脂含量相关联。本发明通过在发酵过程中添加微量醇类化合物，提高了微生物油脂发酵的技术经济性。

发明内容

色醇、对羟基苯乙醇、苯基乙醇、法尼醇和香叶醇是真核生物进行细胞间互相联系的信号分子，信号分子的释放与接受促使微生物群体同步、协调地应对环境变换。细胞间的信号传递几乎影响着每一个反应，它确保某一特定类型的全部细胞接收并转化信号；凭借这一方式，相同类型的细胞对同一信号作出同步反应，其功能是协调各细胞间代谢产物的流动。本发明正是将这一理论应用于微生物发酵。在发酵期间添加醇类化合物，如色醇、对羟基苯乙醇、苯基乙醇、法尼醇和香叶醇这些信号分子来参与细胞间的信号转导，调控微生物的代谢机制和产油机制，增强微生物的产脂能力，从而提高微生物油脂的生产效率。

本发明的目的在于提供一种缩短发酵周期、增强微生物对底物利用能力、提高微生物油脂发酵生产效率的方法。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种提高微生物油脂发酵生产效率的方法，将产油酵母菌种子液接种于发酵液中，于30℃通风培养，在发酵期间添加醇类化合物，其在发酵液中的浓度为0.01-5.0mM，其添加时间为发酵液接种后0-40h，待发酵液中总还原糖浓度降至1g/L以下时停止培养，离心收集菌体，经有机溶剂抽提获得微生物油脂。

所述醇类化合物包括色醇(CAS：526-55-6)、对羟基苯乙醇(CAS：501-94-0)、苯基乙醇(CAS：60-12-8)、法尼醇(CAS：4602-84-0)和/或香叶醇(CAS：106-24-1)。

所述产油酵母菌常为斯达氏油脂酵母Lipomyces starkeyi或红冬孢酵母Rhodosporidium toruloides。

本发明具有如下优点：

1.本发明利用微生物代谢调控规律，在发酵期间加入少量醇类化合物来调控产油酵母的代谢机制，从而明显增强菌体对底物的利用能力和油脂积累的能力，缩短发酵时间，获得更高的油脂产量，达到提高油脂生产效率的目的，取得更显著的综合效益，提高了微生物油脂发酵的技术经济性。

2.本发明切实有效，简单易行，为微生物油脂生产效率的提高提供了一种新的方法。其在发酵培养基中添加醇类化合物，与不加入醇类化合物的对照组比较，菌体生物量增率达0.6％-5.7％，菌体油脂含量增率达0.2％-7.4％，油脂产量增率达0.7％-13.5％，脂肪得率系数增率达1.4％-13.2％，发酵时间缩短2.8％-27.1％。

具体实施方式

本发明所添加的醇类化合物包括色醇(CAS：526-55-6)、对羟基苯乙醇(CAS：501-94-0)、苯基乙醇(CAS：60-12-8)、法尼醇(CAS：4602-84-0)和/或香叶醇(CAS：106-24-1)。将醇类化合物分别溶解于二甲基亚砜(DMSO)中，配制成溶液。

本发明使用的YEPD种子液配方为(g/L)：葡萄糖20，酵母粉10，蛋白胨10，pH 5-6。发酵培养基配方为(g/L)：葡萄糖70，酵母粉5.0，磷酸二氢钾1.0，七水硫酸镁0.5，pH 5-6。

本发明使用的产油微生物菌株包括红冬孢酵母Rhodosporidiumtoruloides或斯达氏油脂酵母Lipomyces starkeyi，将生长于YEPD培养基中的产油酵母种子液(含10⁶～10⁸个细胞/mL)按10％的接种量接入到灭菌后的发酵培养基中，于30℃通风培养，在发酵期间添加醇类化合物，待发酵液中总还原糖浓度降至1g/L以下时停止培养，经离心、洗涤，收集菌体沉淀，在105℃干燥至恒重，即得干菌体，经有机溶剂抽提获得微生物油脂。与不加入醇类化合物的对照组比较，利用该技术可使油脂发酵过程菌体生物量增率达0.6％-5.7％，油脂含量增率达0.2％-7.4％，油脂产量增率达0.7％-13.5％，脂肪得率系数增率达1.4％-13.2％，发酵时间缩短2.8％-27.1％。

本发明使用酸热-有机溶剂法提取微生物油脂。按每克干菌体加入6mL的4mol/L盐酸，于78℃水浴热处理60分钟，冷却后加入与HCl等体积甲醇，充分振荡，再加入等体积氯仿，充分振荡，静置收集氯仿层。甲醇层加入二倍体积氯仿，充分振荡，静置收集氯仿层。合并氯仿浸提液，加入等体积的0.1％NaCl溶液，充分振荡，静置收集氯仿层，用无水Na₂SO₄干燥、过滤，旋转蒸发除去氯仿，再于105℃烘干至恒重，即得到微生物油脂。

下面是提高微生物油脂生产效率的具体实施例。通过实施例可进一步了解不同醇类化合物对微生物产脂能力的影响。

对比例1：

将斯达氏油脂酵母Lipomyces starkeyi AS 2.1560种子液接种于发酵液中，加入250μL DMSO，30℃通风培养144h，此时发酵液中葡萄糖浓度降至1g/L以下。于6000 rpm离心10分钟收集菌体。得到干菌体17.5g/L，菌体油脂含量57.8％，脂肪得率系数14.4。

实施例1

将斯达氏油脂酵母Lipomyces starkeyi AS 2.1560种子液接种于发酵液中，在30℃通风培养12h后加入对羟基苯乙醇至终浓度为100μM，培养至110h，于6000rpm离心10分钟收集菌体。得到干菌体17.8g/L，菌体油脂含量58.7％，脂肪得率系数14.9。与对比例1比较，发酵时间缩短34h，干菌体、油脂含量和脂肪得率系数增率分别为1.7％、1.6％和3.5％。

实施例2

将斯达氏油脂酵母Lipomyces starkeyi AS 2.1560种子液接种于发酵液中，在30℃通风培养12h后加入色醇至终浓度为100μM，培养至115h，于6000rpm离心10分钟收集菌体。得到干菌体18.0g/L，菌体油脂含量60.5％，脂肪得率系数15.6。与对比例1比较，发酵时间缩短29h，干菌体、油脂含量和脂肪得率系数增率分别为2.9％、4.7％和8.3％。

实施例3

将斯达氏油脂酵母Lipomyces starkeyi AS 2.1560种子液接种于发酵液中，在30℃通风培养36h后加入色醇至终浓度为100μM，培养至111h，于6000rpm离心10分钟收集菌体。得到干菌体18.3g/L，菌体油脂含量62.0％，脂肪得率系数16.3。与对比例1比较，发酵时间缩短33h，干菌体、油脂含量和脂肪得率系数增率分别为4.6％、7.3％和13.2％。

实施例4

将斯达氏油脂酵母Lipomyces starkeyi AS 2.1560种子液接种于发酵液中，在30℃通风培养36h后加入对羟基苯乙醇至终浓度为100μM，培养至107h，于6000rpm离心10分钟收集菌体。得到干菌体18.1g/L，菌体油脂含量58.6％，脂肪得率系数15.2。与对比例1比较，发酵时间缩短37h，干菌体、油脂含量和脂肪得率系数增率分别为3.4％、1.4％和5.6％。

实施例5

将斯达氏油脂酵母Lipomyces starkeyi AS 2.1560种子液接种于发酵液中，在30℃通风培养36h后加入苯基乙醇至终浓度为100μM，培养至112h，于6000rpm离心10分钟收集菌体。得到干菌体17.9g/L，菌体油脂含量59.1％，脂肪得率系数15.1。与对比例1比较，发酵时间缩短32h，干菌体、油脂含量和脂肪得率系数增率分别为2.3％、2.2％和4.9％。

实施例6

将斯达氏油脂酵母Lipomyces starkeyi AS 2.1560种子液接种于发酵液中，在30℃通风培养36h后加入法尼醇至终浓度为100μM，培养至109h，于6000rpm离心10分钟收集菌体。得到干菌体17.9g/L，菌体油脂含量59.7％，脂肪得率系数15.3。与对比例1比较，发酵时间缩短35h，干菌体、油脂含量和脂肪得率系数增率分别为2.3％、3.3％和6.3％。

实施例7

将斯达氏油脂酵母Lipomyces starkeyi AS 2.1560种子液接种于发酵液中，在30℃通风培养36h后加入香叶醇至终浓度为100μM，培养至110h，于6000rpm离心10分钟收集菌体。得到干菌体17.9g/L，菌体油脂含量62.0％，脂肪得率系数15.9。与对比例1比较，发酵时间缩短34h，干菌体、油脂含量和脂肪得率系数增率分别为2.3％、7.3％和10.4％。

实施例8

将斯达氏油脂酵母Lipomyces starkeyi AS 2.1560种子液接种于发酵液中，在30℃通风培养0h时加入色醇至终浓度为10μM，培养至136h，于6000rpm离心10分钟收集菌体。得到干菌体17.7g/L，菌体油脂含量58.0％，脂肪得率系数14.7。与对比例1比较，发酵时间缩短8h，干菌体、油脂含量和脂肪得率系数增率分别为1.1％、0.3％和2.1％。

实施例9

将斯达氏油脂酵母Lipomyces starkeyi AS 2.1560种子液接种于发酵液中，在30℃通风培养38h后加入色醇至终浓度为5.0mM，培养至140h，于6000rpm离心10分钟收集菌体。得到干菌体17.6g/L，菌体油脂含量57.9％，脂肪得率系数14.6。与对比例1比较，发酵时间缩短4h，干菌体、油脂含量和脂肪得率系数增率分别为0.6％、0.2％和1.4％。

实施例10

将斯达氏油脂酵母Lipomyces starkeyi AS 2.1560种子液接种于发酵液中，在30℃通风培养38h后加入色醇至终浓度为50μM和对羟基苯乙醇至终浓度为50μM，培养至105h，于6000rpm离心10分钟收集菌体。得到干菌体17.9g/L，菌体油脂含量59.2％，脂肪得率系数15.1。与对比例1比较，发酵时间缩短39h，干菌体、油脂含量和脂肪得率系数增率分别为2.3％、2.4％和4.9％。

对比例2：

将红冬孢酵母Rhodosporidium toruloides AS 2.1389种子液接种于发酵液中，加入250μL DMSO，30℃通风培养5d，发酵液中葡萄糖浓度降至1g/L以下。于6000rpm离心10分钟收集菌体。得到干菌体17.6g/L，菌体油脂含量57.9％，脂肪得率系数14.6。

实施例11

将红冬孢酵母Rhodosporidium toruloides AS 2.1389种子液接种于发酵液中，在30℃通风培养24h后加入色醇至终浓度为100μM，培养5d，于6000rpm离心10分钟收集菌体。得到干菌体18.6g/L，菌体油脂含量62.2％，脂肪得率系数16.5。与对比例2比较，干菌体、油脂含量和脂肪得率系数增率分别为5.7％、7.4％和13.0％。

实施例12

将红冬孢酵母Rhodosporidium toruloides AS 2.1389种子液接种于发酵液中，在30℃通风培养24h后加入对羟基苯乙醇至终浓度为100μM，培养5d，于6000rpm离心10分钟收集菌体。得到干菌体18.5g/L，菌体油脂含量61.1％，脂肪得率系数16.1。与对比例2比较，干菌体、油脂含量和脂肪得率系数增率分别为5.1％、5.5％和10.3％。

实施例13

将红冬孢酵母Rhodosporidium toruloides AS 2.1389种子液接种于发酵液中，在30℃通风培养24h后加入苯基乙醇至终浓度为100μM，培养5d，于6000rpm离心10分钟收集菌体。得到干菌体18.1g/L，菌体油脂含量60.3％，脂肪得率系数15.6。与对比例2比较，干菌体、油脂含量和脂肪得率系数增率分别为2.8％、4.1％和6.8％。