扩张青霉转糖基β－半乳糖苷酶基因及其应用

摘要

本发明公开了扩张青霉(Penicillium expansum)F3 CGMCC No.2352转糖基β－半乳糖苷酶基因，所述基因由总RNA借助RT－PCR扩增获得。该基因核苷酸序列全长3036碱基，编码1011个氨基酸。该基因在毕氏酵母中获得了高效分泌表达，发酵液产酶量为963mg/L。其重组酶特征为：酶为二亚基蛋白，聚合体分子量为240±10kD，单亚基分子量为120±5kD；酶对乳糖的K

说明书

发明领域

本发明涉及一种转糖基β-半乳糖苷酶基因，尤其涉及一种来源于扩张青霉的转糖基β-半乳糖苷酶基因及其应用。

技术背景

β-半乳糖苷酶(β-galactosidase，EC.3.2.1.23)，又称乳糖酶，广泛存在于动物、植物和微生物中，能水解多糖或寡糖中的β-半乳糖苷键，也能催化转糖基反应。其水解活性可用于水解牛乳、乳清粉和其他乳制品中的乳糖，生成半乳糖和葡萄糖，解决乳糖不耐症患者的乳品消费问题等；还可用于水解硝基苯-β-D-半乳糖苷或5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷，生成显色物质，作为分子生物学筛选重组克隆的一种工具。近年来，随着糖生物学的发展，β-半乳糖苷酶逐渐成为糖类合成的重要工具之一，其转糖基活性被应用于合成功能性低聚半乳糖和具有生物活性的半乳糖苷化合物，如合成烷基糖苷类表面活性剂和糖基化的抗生素等。

β-半乳糖苷酶所催化的转糖基反应处于水解与合成的动态平衡状态，转糖基新生成的低聚糖及糖苷产物也可以作为底物被酶重新水解，导致转糖基产物的产量不高。为从根本上解决这一问题，研究人员对β-半乳糖苷酶进行分子改造，在酶催化中心用非亲核体氨基酸残基取代亲核体催化氨基酸残基，产生了一种命名为糖苷合成酶(Glycosynthases)的新型活性酶，只催化合成反应，彻底解决了产物被水解的问题，从根本上提高了糖苷酶的转糖基效率，产物产量可高达100％。目前，国际上β-半乳糖苷合成酶的来源还只局限于大肠杆菌，该酶特异合成β-1，6键，而真菌来源的β-半乳糖苷合成酶未见报道。因此，寻找并获得不同来源尤其是真菌来源的转糖基β-半乳糖苷酶基因，对于今后在此基础上进行分子改造获得新的半乳糖苷合成酶具有非常重要的理论意义。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供一种来源于扩张青霉的转糖基β-半乳糖苷酶基因及其应用。

一种转糖基β-半乳糖苷酶基因，它来源于扩张青霉(Penicillium expansum)F3CGMCCNo.2352，具有如SEQ ID No.1所示核苷酸序列，全长3036碱基。

一种由上述转糖基β-半乳糖苷酶基因编码的转糖基β-半乳糖苷酶，它具有如SEQ IDNo.2所示氨基酸序列，全长1011个氨基酸。

一种插入了包含上述SEQ ID No.1所示核苷酸序列的载体。

所述核苷酸序列插入pPIC9K表达载体。

一种插入了包含上述SEQ ID No.1所示核苷酸序列或含有SEQ ID No.1序列载体的重组细胞。

所述的重组细胞为毕氏酵母。

所述转糖基β-半乳糖苷酶在制药、食品领域方面的应用。

上述转糖基β-半乳糖苷酶基因在基因表达方面的应用，通过将转糖基β-半乳糖苷酶基因克隆到pPIC9K表达载体上，转化毕氏酵母GS115(Pichia pastoris GS115)，甲醇诱导高效表达重组β-半乳糖苷酶。

上述转糖基β-半乳糖苷酶基因在毕氏酵母中表达的重组酶为二亚基蛋白，聚合体分子量为240±10kDa，单亚基分子量为120±5kDa；酶对邻硝基苯-β-D-半乳糖苷(o-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside，ONPG)的适宜反应的温度为50℃～55℃，适宜反应的pH为3.0～8.0；以pH7.0的磷酸氢二钾-磷酸二氢钾缓冲液配制的酶溶液在温度50℃条件下，能稳定保存至少55个小时，在25℃能稳定保存至少3个月；于4℃保存时，在pH2.4～9.0范围内至少稳定保存24小时；Hg²⁺、Ag⁺强烈抑制酶的活性，K⁺、Na⁺、NH⁴⁺、Ni²⁺、Ca²⁺、Mg²⁺、Mn²⁺激活酶的活性；酶对乳糖的K_m值为1.18mmol/L，酶对邻硝基苯-β-D-半乳糖苷的K_m值为4.25mmol/L，酶对对硝基苯-β-D-半乳糖苷(p-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside，PNPG)的K_m值为0.38mmol/L。

上述转糖基β-半乳糖苷酶基因在毕氏酵母中表达的重组酶在以乳糖为底物的反应体系中具有转糖基活性，反应中有低聚半乳糖生成。

上述重组酶对ONPG的最适反应温度为50℃；对ONPG的最适反应pH为3.6～4.0。

以上操作步骤、实验条件及试剂如无特别说明，均采用本领域常规操作和常用试剂。

本发明有益效果如下：

将上述转糖基β-半乳糖苷酶基因克隆到pPIC9K表达载体上，转化毕氏酵母GS115，甲醇诱导表达，发酵液产酶量高达963mg/L，接近工业规模的克每升水平。该基因克隆到pPIC9K表达载体上还可用于基因改造，即对酶基因进行定点突变，在酶催化中心用非亲核体氨基酸取代亲核体氨基酸，以获得新的β-半乳糖苷合成酶，从根本上提高该酶的转糖基效率。本发明填补了国内真菌转糖基β-半乳糖苷酶基因研究空白，为β-半乳糖苷合成酶的获得提供新的基因来源，并通过高效重组表达为工业生产提供大量的β-半乳糖苷酶。

附图说明

图1是本发明所述的扩张青霉F3重组β-半乳糖苷酶的SDS-PAGE电泳图；1、扩张青霉F3重组β-半乳糖苷酶，2、蛋白分子量标准。

图2是本发明所述扩张青霉F3重组β-半乳糖苷酶以乳糖为底物生成低聚半乳糖的TLC检测图；其中，1、Oligomate 55低聚糖标准品，2、重组β-半乳糖苷酶以乳糖为底物的反应产物，A为葡萄糖、B为半乳糖、C为低聚半乳糖、D为乳糖。

具体实施方式

下面结合附图和实施实例对本发明做进一步说明，但不限于此。实施例中未明确限定的均可按本领域现有技术。

实施例1：扩张青霉(Penicillium expansum)F3总RNA的提取

将扩张青霉F3 CGMCC No.2352接种于50mL产酶发酵培养液中，28℃摇床培养32小时，用超纯水洗涤菌体两次，滤纸过滤收集菌体，液氮研磨破碎细胞壁。取50mg菌粉，加入1mLTrizol试剂，混匀，于15℃～30℃保温5分钟，然后加入200μL氯仿，震荡15秒后于15℃～30℃保温2～3分钟，12000转/分离心5分钟，将上清液转入新管中，再加入0.5mL异丙醇，混匀，于15℃～30℃保温10分钟，沉淀RNA，12000转/分离心10分钟，去除上清，用75％乙醇洗涤RNA沉淀2次，真空干燥5～10分钟，重新溶于50μL无RNA酶的灭菌超纯水。

上述产酶发酵培养液成分：葡萄糖10g/L，蛋白胨10g/L，酵母粉10g/L，氯化钠3g/L，pH自然，115℃灭菌30分钟。

实施例2：扩张青霉F3 β-半乳糖苷酶基因高保守区cDNA序列的PCR扩增

从GenBank中检索到不同菌株β-半乳糖苷酶基因的cDNA序列，设计一对兼并PCR引物(DF-F3和DR-F3)：

oligo-dT：5’-TTTTTTTTTTTTTTTTTT-3’

DF-F3：5’-AACGARGGTGGWCTGTACGC-3’

DR-F3：5’-GGARGTAGGWCCKATGTTG-3’

以提取的扩张青霉菌总RNA为模板，采用上述oligo-dT引物进行反转录合成cDNA第一条链，其反应总体积为20μL，先混合dNTP 2.5mmol/L、引物1μmol/L、模板RNA 3μg与无RNA酶的超纯水共12μL，65℃预变性5分钟，置于冰上；然后加入5×cDNA合成缓冲液、DTT 0.1mmol/L、RNA酶抑制剂40U/μL、反转录酶15U共8μL，混匀，50℃延伸30分钟，85℃终止反应5分钟。以上述反应合成的cDNA第一条链为模板，用DF-F3和DR-F3引物进行PCR扩增，其总体积为50μL，即超纯水35μL，10×PCR buffer 5μL、dNTP2.4mmol/L、引物各1μmol/L、MgCl₂1.5mmol/L、模板cDNA100ng、TaKaRa Taq酶2.5U共15μL。PCR扩增条件：95℃预变性5分钟，反应30个循环(95℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸1分钟)，30个循环结束后72℃延伸10分钟。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，紫外分析仪检测，然后回收，测序大小为284bp。所得产物即为扩张青霉F3β-半乳糖苷酶基因高保守区cDNA片段，测得序列如SEQ ID No.3。

详列如下：

tgaaggtctg aggtccgatg ttgttgacgt attttccgta ctggtacccg ttgacgaaca  60

gctgcacacg gtaagcgtcc ggaggggcag tgctgttgcc aaagttaaag tacagcggga  120

tgtcgtagcc tgatagaaga tcaaggtcaa agctggcact gtagaagcga atgccgggct  180

tggtgagacc ggtgaatgga ctgctggaat cccaattctt ggtggatggc ttgggctggt  240

ggaaaccttg acgttcggcg tacagaccac cctcgttaat ctct                   300。

实施例3：扩张青霉F3β-半乳糖苷酶基因cDNA 3’端序列的扩增

根据SEQ ID No.3的序列，设计两条嵌套PCR正义引物(GSP F和GSP F₁)，3’RACE法合成β-半乳糖苷酶基因cDNA的3’端片段。引物序列如下：

3’AP：5’-GGCCACGCGTCGACTAGTACTTTTTTTTTTTTTTTTT-3’

第一轮PCR引物

GSP F：5’-CACCAGCCCAAGCCATCCACCAAG-3’

3’AUAP：5’-GGCCACGCGTCGACTAGTAC-3’

第二轮PCR引物

GSP F₁：5’-TCCAGCAGTCCATTCACCGGTCTCACCAAGCCC-3’

3’AUAP：5’-GGCCACGCGTCGACTAGTAC-3’

以提取的扩张青霉菌总RNA为模板，采用上述3’AP引物进行反转录合成cDNA第一条链。以cDNA第一条链为模板，用GSP F和3’AUAP引物进行第一轮PCR扩增，再以上述PCR产物为模板，用GSP F₁和3’AUAP引物进行第二轮PCR扩增。PCR扩增条件和PCR产物回收方法同实施例2。PCR产物测序大小为708bp。所得产物即为扩张青霉F3β-半乳糖苷酶基因cDNA3’端序列，测得序列如SEQ ID No.4。

详列如下：

tccagcagtc cattcaccgg tctcaccaag cccggcattc gcttctacag tgccagcttt  60

gaccttgatc ttccatcagg gtacgacatc ccgctgtact ttaactttgg caacagcact  120

gcccctccgg acgcttaccg tgtgcagctg ttcgtcaacg ggtaccagta cggaaaatac  180

gtcaacaacg tcggacccca gacgagcttc cctgttcccg agggtattct gaactaccat  240

ggtaccaact ggattgcgtt gagtttgtgg gctcaacagg aaagcggtgc caagttgaat  300

agctttgagc tgatcaacac cactcccgtg cttacatcct tggacaaggt caagtctgtt  360

gaccagccaa agtacaagtc tcgaaagggg gcgtactaga acggttgctt ccatgatgta  420

atgatgcaat gcttgaagga tcgctaggaa tagacaagag gcatgaggta aatatgaaaa  480

ggcattgaca agcgctcatc tttattgctc gttgagaggc cgatattcaa gaatttacac  540

cttcatatgt tggacactgt ggcgcagcta ttctcttgca aaattgactc ttgtacgtcg  600

atggaggctt atatatcaag ttacacaagt agaatcattc aacagtcact tgtggaccta  660

ctcaatatca ccaggcgtga aatcatcaaa tcaaaaaaaa aaaaaaaa               720。

实施例4：扩张青霉F3β-半乳糖苷酶基因cDNA5′端序列的扩增

根据SEQ ID No.3的序列，设计三条嵌套PCR反义引物(5’GSP R₁、5’GSPR₂和5′GSPR₃)，5’RACE法合成β-半乳糖苷酶基因cDNA的5’端片段。引物序列如下：

5’GSP R₁：5’-CGACGTAGAAAGACACGCAGTTGAATCCCAATG-3’

第一轮PCR引物

5’AP：5’-GGCCACGCGTCGACTAGTACCCCCCCCCCCCCCCCC-3’

5’GSPR₂：5’-TAGCAAGTAGATTCCAGCCTCTTTTGCCGC-3’

第二轮PCR引物

5’AUAP：5’-GGCCACGCGTCGACTAGTAC-3’

5’GSPR₃：5’-ATCCAGGGAAACCACCGCCGGAAACTTCGG-3’

以提取的扩张青霉菌总RNA为模板，采用上述5’GSP R₁引物进行反转录合成cDNA第一条链。将上述反转录产物，于37℃以RNase H作用1小时，采用PCR产物回收试剂盒回收。末端脱氧核糖核酸转移酶(TaKaRa)在回收产物5’端加上ployG寡核苷酸序列，反应条件是：37℃保温30分钟，加等体积酚/氯仿(24∶1)，混匀，12000转/分离心20分钟，取上清，加2倍体积的无水乙醇和1/10体积的醋酸钠(3mol/L)沉淀DNA，离心收集沉淀，加适量体积的无RNA酶的灭菌超纯水溶解。以上述加ployG的cDNA第一条链为模板，用5’AP和5’GSPR₂引物进行第一轮PCR扩增，再以该PCR产物为模板，用5’AUAP和5’GSPR₃引物进行第二轮PCR扩增。PCR扩增条件和PCR产物回收方法同实施例2。PCR产物测序大小为2833bp。所得产物即为扩张青霉F3β-半乳糖苷酶基因cDNA5’端序列，测得序列如SEQ IDNo.5。

详列如下：

attggccacg cgatcgacta gtaccccccc ccccccccga aaagccgaag gaataaaaga 60

aaaaggttgc ttcctcaatt cggcttcttc acgacagcgc gccgtggaaa ttattcgcca 120

tgaagctcct gtcttcgttg gccctggctg ccttggcggc acaggtctca ggtgctgcta 180

tcagccacaa gcttgacggc ttcactcttc gcgagcatgc tgatgcttca aagcgggagt 240

tgcttcaaaa atatgtgact tgggacaagc actcaatttt catcaatggt gagcgattga 300

tgatgttcag tggtgaagtt cacccctacc ggttgcccgt tgcctcattg tacatcgatg 360

tctttgagaa aatcaaggca ttgggattca actgcgtgtc tttctacgtc gactgggcct  420

tgttggaagg caagcccggc cactacacag ctgagggcat ctttgacttg cagccctttt  480

ttgatgcggc aaaagaggct ggaatctact tgctagcccg tcccggtcct tacatcaacg  540

ccgaagtttc cggcggtggt ttccctggat ggctgcaaag ggtaaatggc acactgcgaa  600

caagcattgg agactacctc aaatcgacag acaactacgc ctcgcacatc gcgaagacca  660

ttgcaaaggc gcagatcacc aacggtggac cgatcattct gtaccagccc gaaaatgagt  720

actctggagc ttgctgtggc tatgaagatt tccccgacgg ctcttacatg caatacatcg  780

aagatcatgc tcgtgatgca ggaatcgtgg ttcccttcat cagcaatgat gcctatgctg  840

gcggtcacaa cgcacccggt accggtaagg gtgcagtcga catctatggc catgatggct  900

accctcttgg attcgactgt gccaatcctt ctgtttggcc ggatggcaat ctgcccacca  960

attaccacac cttgcacgaa gaacaaagcc ctaccacgcc cttctctgtc gttgagttcc  1020

aaggtggagc tttcgacccc tggggtgggg taggcttcgc aaagtgcgca catttgctga  1080

atcacgagtt cgagagagtg ttctacaaga acgactttag ctttggcgtc acattcttca  1140

acttgtacat gatcttcggc ggtacgaatt ggggtaatct gggtcaccct ggtggttaca  1200

catcgtacga ctatggctct gccatatctg aatcgcgtaa cgtcaccaga gagaagtatt  1260

ccgagcttaa actactgggc aacttcgcca aggtttcccc tggctatgtt gtggccaacc  1320

ctggaaattt gactacttcg aaatacacca agactgcgga cctgactgtg actcctctgc  1380

tcggagaaag cagttctgcc ggctcgttct tcgtcatccg tcattccaac tacaacagcc  1440

aagcctcggt gaagtatcaa ctcactcttc caacgagcgc gggtgagctc actattcccc  1500

aactcggtgg tgaactcaca ttgagtggcc gggactcaaa gattcatgtg accgactatg  1560

atgtggctgg tagcaacatt ctctactcta ctgccgaggt gttcacatgg aagaagttcg  1620

ataatggaaa ggtcctcatt ctgtatggtg gacctggcga gcatcatgag tttgctgtca  1680

ccggtgcctc tgccagctct gtcattgagg gatcctcctc gggcatcacg tcaaagaaga  1740

ttggcgatgc ccttgtcgtc gcttgggatg tttcgagtaa gcgccgaatt attaagatcg  1800

gagacctgaa agtcttcctt ctcgaccgta actctgccta caactactgg gtgcctcacc  1860

tgccaaccaa gggcaaggca cctggctacg tcagcaagaa ggcaatcgat tcttcaatca  1920

ttgtgaaggc cggctatctg gttcgcagtg cattcctgag tggaaaggat ttgcacattc  1980

aggcggactt caacgccacc actcccattg agatcattgg cgccccatcc tctgccaaaa  2040

atcttgtcat caacggcaag aagacaaaga ctaacgtcga cgacaatggc atttggtcgg  2100

ccagtgtgtc ctactccaca cctgagatcc atcttcccag cctgaaggat ctgaagtggc  2160

aatccatcga tactcttcct gaagtcaaga actcgtacga tgactctgcg tggacgtctg  2220

ctgaccagcc tcacaccctc aacaccgccc acgagcttca gaccccaact actctcttct  2280

cgtccgacta tggataccac acaggtactc tcctctaccg cggtcacttc gttgccaatg  2340

gcaaagaatc catattcttc attcagactc agggtggttc cgcttatggc cactctgtct  2400

gggtcaatga gacatacgtt ggctcctggg agggaagtgg ttctaacgac aattacaacg  2460

ctacgtatac gctcccctcc ctggccacag gcaaaaagta cgcgatcacg gtggtcattg  2520

acaacatggg tctggacgtg aactgggtca tcggtcaaga gggcatgaag aaccctcgtg  2580

gtatcatccg ctacaacctg gctggacacg acgccagcgc catctcttgg aagctgaccg  2640

gcaaccttgg aggtgaggac taccgcgaca cagtccgcgg acctctcaat gagggaggtc  2700

tttacgccga acgtcaaggt ttccaccagc ccaagccatc caccaagaat tgggattcca  2760

gcagtccatt caccggtctc accaagcccg gcattcgctt ctacagtgcc agctttgacc  2820

ttgatcttcc atc                                                     2880。

将上述三个序列拼接，获得3464bp的cDNA全序列，该序列含一个3036bp的ORF，编码1011个氨基酸，其中上述ORF前117bp编码的39个氨基酸为信号肽序列，后2919bp(含终止密码子)编码的972个氨基酸为成熟酶。

该3036bp的ORF即为扩张青霉(Penicillium expansum)F3 CGMCC No.2352的β-半乳糖苷酶基因编码区cDNA序列，其核苷酸序列及编码的氨基酸序列分别为SEQ ID No.1和SEQ ID No.2。

实施例5：成熟扩张青霉F3β-半乳糖苷酶基因编码区cDNA序列的扩增

设计引物F-F3和R-F3，分别引入能插入pPIC9K质粒(Invitrogen，该质粒载体具有α-factor信号肽序列，可分泌表达蛋白，便于重组蛋白的纯化)的EcoR|、Not|酶切位点(下划线所示)，序列如下：

F-F3：5’-CATGAATTCGGAGTTGCTTCAAAAATATGTGACTTGGG-3’

R-F3：5’-GCATGCGGCCGCGTACGCCCCCTTTCGAGAC-3’

以提取的扩张青霉菌总RNA为模板，采用上述R-F3引物进行反转录合成cDNA第一条链。以cDNA第一条链为模板，用F-F3和R-F3引物进行PCR扩增。PCR扩增条件和PCR产物回收方法同实施例2。PCR产物经回收后连接到pMD18-T质粒载体上(TA克隆)，转化大肠杆菌Top10感受态细胞，涂布氨苄青霉素平板，用菌落PCR方法筛选获得重组菌，然后测序，将测得的序列进行分析，显示由2919bp组成，与实施例4结果一致。

实施例6：扩张青霉F3β-半乳糖苷酶基因在毕氏酵母中的表达

将实施例5筛选到的重组菌接种于30mL LB氨苄(100μg/mL)培养液中，37℃摇床培养，提取重组质粒，加EcoR|、Not|(TaKaRa)于37℃酶切5小时，进行凝胶回收目的片段，采用同样酶切方法处理pPIC9K质粒载体。将制备好的酶基因片段与pPIC9K载体按一定比例混合，采用连接试剂盒(TaKaRa DNA Ligation Kit Ver.2.0)于16℃连接24小时。然后采用CaCl₂转化法转化宿主菌大肠杆菌Top10，转化菌液涂布氨苄青霉素平板，37℃过夜培养。提取阳性菌落质粒，Stu|酶将重组质粒及pPIC9K空质粒线性化，采用电激转化法转化毕氏酵母GS115，转化液涂布MD筛选平板，30℃培养3～4天，挑选生长良好的酵母菌落，采用菌落PCR法验证阳性转化子。将重组质粒阳性转化子及pPIC9K空质粒转化子的单菌落接种于BMGY培养基中，30℃培养至OD₆₀₀达到2～6，3000转/分离心5分钟收集细胞，弃去上清，用BMMY培养液重悬细胞，25℃甲醇诱导表达，每24小时加一次100％甲醇至终浓度0.5％(v/v)以保持诱导。测定发酵上清液中β-半乳糖苷酶水解活性和转糖基活性，将完全符合要求的重组菌作为菌种保存。

上述LB培养液成分：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 7g/L，pH 7.0～7.5，121℃灭菌20分钟；

上述MD培养基成分：无氨基酸酵母氮源(YNB)13.4g/L，生物素4×10^-4g/L，蛋白胨20g/L，琼脂粉15g/L，pH自然，115℃灭菌30分钟；

上述BMGY培养液成分：酵母粉10g/L，蛋白胨20g/L，YNB 13.4g/L，pH6.0磷酸缓冲液100mmol/L，生物素4×10^-4g/L，甘油1％(v/v)，pH自然，115℃灭菌30分钟；

上述BMMY培养液成分：酵母粉10g/L，蛋白胨20g/L，YNB 13.4g/L，pH6.0磷酸缓冲液100mmol/L，生物素4×10^-4g/L，甲醇0.5％(v/v)，pH自然，115℃灭菌30分钟。

上述β-半乳糖苷酶水解活性测定：

取50μL上清液，加2mmol/L的ONPG溶液450μL，40℃反应10分钟，加1mL0.5mol/L的Na₂CO₃溶液终止反应，12,000转/分离心2分钟，上清液测OD₄₀₀。酶的活力单位规定：以1分钟水解ONPG释放1μmol邻硝基苯酚的酶量为一个酶活力单位(U)。

上述β-半乳糖苷酶转糖基活性测定方法：

取50μL上清液，加入250μL pH5.4醋酸钠缓冲液配制的30％(w/v)乳糖溶液，于50℃反应4小时，12,000转/分离心5分钟，上清液即含反应产物-低聚半乳糖。

将反应产物进行薄层层析(Thin-Layer Chromatography，TLC)分析，确定转糖基活性。TLC薄板(Silica gel60，No.553，Merck)点样后，在展层剂(正丁醇∶乙醇∶水＝5∶3∶2，v/v/v)中层析，雾喷显色剂(20％硫酸溶液+0.5％的3，5-二羟基甲苯)，于120℃烘烤10分钟，糖斑点显色，如果乳糖斑点附近除单糖斑点外生成了新的寡糖斑点，则β-半乳糖苷酶有转糖基活性。

实施例7：扩张青霉F3β-半乳糖苷酶基因在毕氏酵母中的表达和纯化

将实施例6所保存的毕氏酵母GS115重组菌接种于200mL BMGY培养液，30℃培养24小时，转接于2L BMMY培养液培养液，25℃培养，每24小时加入甲醇至终浓度0.5％(v/v)，再继续培养105小时，于3000转/分离心5分钟，获得发酵上清液，即粗酶液。用孔径为0.22μm的滤膜过滤粗酶液，然后用截流分子量为30kDa的膜反复超滤5次，即获得到了电泳纯重组β-半乳糖苷酶。

实施例8：扩张青霉F3重组β-半乳糖苷酶的基本酶学性质

(1)酶的分子量

酶蛋白分子量的测定采用聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE)。根据样品和标准蛋白的PAGE图，测定样品和标准蛋白的相对迁移值Rf，用标准蛋白的Rf值对分子量的对数作标准曲线。再根据纯酶样品的Rf值，就可求得其分子量。SDS-PAGE采用垂直板式不连续系统电泳方式，电泳分离胶浓度为7％，浓缩胶4％；Native gradient PAGE(非解离梯度聚丙稀酰胺凝胶电泳)采用5～10％线形梯度垂直板状聚丙烯酰胺凝胶，4℃电泳。

Native gradient PAGE显示酶蛋白的分子量约为240±10kDa，SDS-PAGE显示酶蛋白单亚基分子量约为120±5kDa(如附图1)，表明该酶为一个二亚基蛋白。

(2)酶的动力学参数

酶的动力学参数的测定采用双倒数法。

将2μL酶(0.8U/mL)与18μL不同浓度(浓度范围0.28～1.95mol/L)的乳糖溶液混合，于50℃反应30分钟，用葡萄糖试剂盒(上海丰汇医学科技有限公司)测定水解的葡萄糖含量，计算水解速率，用双倒数作图法测得酶对乳糖的K_m值为1.18mmol/L。

将50μL酶与450μL不同浓度的ONPG和PNPG(浓度范围0.25～3.0mmol/L)混合，于50℃反应3分钟，加1mL 0.5mol/L的Na₂CO₃溶液终止反应，测定OD₄₀₀，计算水解速率，用双倒数作图法测得酶对ONPG和PNPG的K_m值分别为4.25mmol/L和0.38mmol/L。

(3)温度和pH对酶活性的影响

在适当的温度范围(20℃～80℃)内，每5℃为一个梯度测定酶在该温度下的相对酶活。结果表明：酶适宜反应的温度为50℃～55℃，最适反应温度为50℃。将酶在上述温度梯度下保温2小时后测定相对酶活。结果表明：酶在50℃以下比较稳定，60℃以上失活较快，65℃失去所有的酶活。

用不同pH的缓冲液配制酶反应体系，测定相对酶活，结果表明：酶适宜反应的pH范围比较广，为pH3.0～8.0，最适反应pH为3.6～4.0；酶在不同pH的缓冲液中4℃保存24小时，测定相对酶活，结果表明：酶在pH 2.4～9.0范围内稳定。

将pH7.0磷酸钾缓冲液配制的酶溶液置室温保存，测定酶在室温(25℃)的稳定性，结果表明：酶在25℃能稳定保存至少3个月。

上述酶活测定方法为：50μL酶与450μL2mmol/L的ONPG溶液混合，于40℃反应10分钟，加1mL0.5mol/L的Na₂CO₃溶液终止反应，测定OD₄₀₀。

上述不同pH缓冲液分别为：邻苯二甲酸-盐酸缓冲液pH2.2～3.8；醋酸-醋酸钠缓冲液pH3.6～5.6；磷酸氢二钾-磷酸二氢钾缓冲液pH5.5～8.5；甘氨酸-氢氧化钠缓冲液pH8.7～10.6；碳酸氢钠-氢氧化钠缓冲液pH10.0～11.0。

(4)部分金属离子和化合物对酶活性的影响

以ONPG为底物，在酶活测定反应体系中分别加入终浓度为1mmol/L的各种化学试剂测定相对酶活。结果显示：Hg²⁺、Ag⁺强烈抑制酶的活性；K⁺、Na⁺、NH⁴⁺、Ni²⁺、Ca²⁺、Mg²⁺、Mn²⁺激活酶的活性。

实施例9：扩张青霉F3重组酶以乳糖为底物的转糖基反应

将20μL pH5.4醋酸钠缓冲液配制的30％(w/v)乳糖溶液与5μL酶于50℃反应4小时，100℃煮沸5分钟灭活酶液，然后进行薄层层析(Thin-Layer Chromatography，TLC)分析。TLC薄板(Silica gel 60，No.553，Merck)点样后，在展层剂(正丁醇∶乙醇∶水＝5∶3∶2，v/v/v)中层析，雾喷显色剂(20％硫酸溶液+0.5％的3，5-二羟基甲苯)，于120℃烘烤10分钟，糖斑点显色。通过高效液相色谱分析(High Performance Liquid Chromatography，HPLC)和薄层扫描分析，测定低聚半乳糖产量约为27.6％。图2显示了低聚半乳糖产物的TLC分析结果。

上述HPLC分析所用设备及条件：岛津(SHIMADZU)高效液相色谱仪；岛津RID-10A视差检测器；BIO-RAD Aminex HPX-42C柱(300mm×7.8mm)；流动相为超纯水，流速为0.4mL/min，柱温70℃；结果分析软件为Class-VP6.0。样品用0.22μm滤膜过滤后，稀释成2％(w/v)的糖溶液，进样分析。

上述薄层扫描分析所用设备及条件：岛津(SHIMADZU)CS-9301双波长飞点薄层扫描仪，检测波长为550nm。

序列表

SEQ ID No.1

<110>山东大学

<120>扩张青霉转糖基β-半乳糖苷酶基因及其应用

<160>5

<210>1

<211>3036

<212>DNA

<213>扩张青霉(Penicillium expansum)

<222>(1)…(3036)

<400>1

atgaagctcc tgtcttcgtt ggccctggct gccttggcgg cacaggtctc aggtgctgct    60

atcagccaca agcttgacgg cttcactctt cgcgagcatg ctgatgcttc aaagcgggag    120

ttgcttcaaa aatatgtgac ttgggacaag cactcaattt tcatcaatgg tgagcgattg    180

atgatgttca gtggtgaagt tcacccctac cggttgcccg ttgcctcatt gtacatcgat    240

gtctttgaga aaatcaaggc attgggattc aactgcgtgt ctttctacgt cgactgggcc    300

ttgttggaag gcaagcccgg ccactacaca gctgagggca tctttgactt gcagcccttt    360

tttgatgcgg caaaagaggc tggaatctac ttgctagccc gtcccggtcc ttacatcaac    420

gccgaagttt ccggcggtgg tttccctgga tggctgcaaa gggtaaatgg cacactgcga    480

acaagcattg gagactacct caaatcgaca gacaactacg cctcgcacat cgcgaagacc    540

attgcaaagg cgcagatcac caacggtgga ccgatcattc tgtaccagcc cgaaaatgag    600

tactctggag cttgctgtgg ctatgaagat ttccccgacg gctcttacat gcaatacatc    660

gaagatcatg ctcgtgatgc aggaatcgtg gttcccttca tcagcaatga tgcctatgct    720

ggcggtcaca acgcacccgg taccggtaag ggtgcagtcg acatctatgg ccatgatggc    780

taccctcttg gattcgactg tgccaatcct tctgtttggc cggatggcaa tctgcccacc    840

aattaccaca ccttgcacga agaacaaagc cctaccacgc ccttctctgt cgttgagttc    900

caaggtggag ctttcgaccc ctggggtggg gtaggcttcg caaagtgcgc acatttgctg    960

aatcacgagt tcgagagagt gttctacaag aacgacttta gctttggcgt cacattcttc    1020

aacttgtaca tgatcttcgg cggtacgaat tggggtaatc tgggtcaccc tggtggttac    1080

acatcgtacg actatggctc tgccatatct gaatcgcgta acgtcaccag agagaagtat    1140

tccgagctta aactactggg caacttcgcc aaggtttccc ctggctatgt tgtggccaac    1200

cctggaaatt tgactacttc gaaatacacc aagactgcgg acctgactgt gactcctctg    1260

ctcggagaaa gcagttctgc cggctcgttc ttcgtcatcc gtcattccaa ctacaacagc    1320

caagcctcgg tgaagtatca actcactctt ccaacgagcg cgggtgagct cactattccc    1380

caactcggtg gtgaactcac attgagtggc cgggactcaa agattcatgt gaccgactat    1440

gatgtggctg gtagcaacat tctctactct actgccgagg tgttcacatg gaagaagttc    1500

gataatggaa aggtcctcat tctgtatggt ggacctggcg agcatcatga gtttgctgtc    1560

accggtgcct ctgccagctc tgtcattgag ggatcctcct cgggcatcac gtcaaagaag    1620

attggcgatg cccttgtcgt cgcttgggat gtttcgagta agcgccgaat tattaagatc    1680

ggagacctga aagtcttcct tctcgaccgt aactctgcct acaactactg ggtgcctcac    1740

ctgccaacca agggcaaggc acctggctac gtcagcaaga aggcaatcga ttcttcaatc    1800

attgtgaagg ccggctatct ggttcgcagt gcattcctga gtggaaagga tttgcacatt    1860

caggcggact tcaacgccac cactcccatt gagatcattg gcgccccatc ctctgccaaa    1920

aatcttgtca tcaacggcaa gaagacaaag actaacgtcg acgacaatgg catttggtcg    1980

gccagtgtgt cctactccac acctgagatc catcttccca gcctgaagga tctgaagtgg    2040

caatccatcg atactcttcc tgaagtcaag aactcgtacg atgactctgc gtggacgtct    2100

gctgaccagc ctcacaccct caacaccgcc cacgagcttc agaccccaac tactctcttc    2160

tcgtccgact atggatacca cacaggtact ctcctctacc gcggtcactt cgttgccaat    2220

ggcaaagaat ccatattctt cattcagact cagggtggtt ccgcttatgg ccactctgtc    2280

tgggtcaatg agacatacgt tggctcctgg gagggaagtg gttctaacga caattacaac    2340

gctacgtata cgctcccctc cctggccaca ggcaaaaagt acgcgatcac ggtggtcatt    2400

gacaacatgg gtctggacgt gaactgggtc atcggtcaag agggcatgaa gaaccctcgt    2460

ggtatcatcc gctacaacct ggctggacac gacgccagcg ccatctcttg gaagctgacc    2520

ggcaaccttg gaggtgagga ctaccgcgac acagtccgcg gacctctcaa tgagggaggt    2580

ctttacgccg aacgtcaagg tttccaccag cccaagccat ccaccaagaa ttgggattcc    2640

agcagtccat tcaccggtct caccaagccc ggcattcgct tctacagtgc cagctttgac    2700

cttgatcttc catcaggcta cgacatcccg ctgtacttta actttggcaa cagcactgcc    2760

cctccggacg cttaccgtgt gcagctgttc gtcaacgggt accagtacgg aaaatacgtc    2820

aacaacgtcg gaccccagac gagcttccct gttcccgagg gtattctgaa ctaccatggt    2880

accaactgga ttgcgttgag tttgtgggct caacaggaaa gcggtgccaa gttgaatagc    2940

tttgagctga tcaacaccac tcccgtgctt acatccttgg acaaggtcaa gtctgttgac    3000

cagccaaagt acaagtctcg aaagggggcg tactag                              3036

SEQ ID No.2

<211>2

<211>1011

<212>PRT

<400>2

Met Lys Leu Leu Ser Ser Leu Ala Leu Ala Ala Leu Ala Ala Gln Val Ser Gly Ala Ala

                5                   10                  15                  20

Ile Ser His Lys Leu Asp Gly Phe Thr Leu Arg Glu His Ala Asp Ala Ser Lys Arg Glu

                25                  30                  35                  40

Leu Leu Gln Lys Tyr Val Thr Trp Asp Lys His Ser Ile Phe Ile Asn Gly Glu Arg Leu

                45                  50                  55                  60

Met Met Phe Ser Gly Glu Val His Pro Tyr Arg Leu Pro Val Ala Ser Leu Tyr Ile Asp

                65                  70                  75                  80

Vla Phe Glu Lys Ile Lys Ala Leu Gly Phe Asn Cys Val Ser Phe Tyr Val Asp Trp Ala

                85                  90                  95                  100

Leu Leu Glu Gly Lys Pro Gly His Tyr Thr Ala Glu Gly Ile Phe Asp Leu Gln Pro Phe

                105                 110                 115                 120

Phe Asp Ala Ala Lys Gly Ala Gly Ile Tyr Leu Leu Ala Arg Pro Gly Pro Tyr Ile Asn

                125                 130                 135                 140

Ala Glu Val Ser Gly Gly Gly Phe Pro Gly Trp Leu Gln Arg Val Asn Gly Thr Leu Arg

                145                 150                 155                 160

Thr Ser Ile Gly Asp Tyr Leu Lys Ser Thr Asp Asn Tyr Ala Ser His Ile Ala Lys Thr

                165                 170                 175                 180

Ile Ala Lys Ala Gln Ile Thr Asn Gly Gly Pro Ile Ile Leu Tyr Gln Pro Glu Asn Glu

                185                 190                 195                 200

Tyr Ser Gly Ala Cys Cys Gly Tyr Glu Asp Phe Pro Asp Gly Ser Tyr Met Gln Tyr Ile

                205                 210                 215                 220

Glu Asp His Ala Arg Asp Ala Gly Ile Val Val Pro Phe Ile Ser Asn Asp Ala Tyr Ala

                225                 230                 235                 240

Gly Gly His Asn Ala Pro Gly Thr Gly Lys Gly Ala Val Asp Ile Tyr Gly His Asp Gly

                245                 250                 255                 260

Tyr Pro Leu Gly Phe Asp Cys Ala Asn Pro Ser Val Trp Pro Asp Gly Asn Leu Pro Thr

                265                 270                 275                 280

Asn Tyr His Thr Leu His Glu Glu Gln Ser Pro Thr Thr Pro Phe Ser Val Val Glu Phe

                285                 290                 295                 300

Gln Gly Gly Ala Phe Asp Pro Trp Gly Gly Val Gly Phe Ala Lys Cys Ala His Leu Leu

                305                 310                 315                 320

Asn His Glu Phe Glu Arg Val Phe Tyr Lys Asn Asp Phe Ser Phe Gly Val Thr Phe Phe

                325                 330                 335                 340

Asn Leu Tyr Met Ile Phe Gly Gly Thr Asn Trp Gly Asn Leu Gly His Pro Gly Gly Tyr

                345                 350                 355                 360

Thr Ser Tyr Asp Tyr Gly Ser Ala Ile Ser Glu Ser Arg Asn Val Thr Arg Glu Lys Tyr

                365                 370                 375                 380

Ser Glu Leu Lys Leu Leu Gly Asn Phe Ala Lys Val Ser Pro Gly Tyr Val Val Ala Asn

                385                 390                 395                 400

Pro Gly Asn Leu Thr Thr Ser Lys Tyr Thr Lys Thr Ala Asp Leu Thr Val Thr Pro Leu

                405                 410                 415                 420

Leu Gly Glu Ser Ser Ser Ala Gly Ser Phe Phe Val Ile Arg His Ser Asn Tyr Asn Ser

                425                 430                 435                 440

Gln Ala Ser Val Lys Tyr Gln Leu Thr Leu Pro Thr Ser Ala Gly Glu Leu Thr Ile Pro

                445                 450                 455                 460

Gln Leu Gly Gly Glu Leu Thr Leu Ser Gly Arg Asp Ser Lys Ile His Val Thr Asp Tyr

                465                 470                 475                 480

Asp Val Ala Gly Ser Asn Ile Leu Tyr Ser Thr Ala Glu Val Phe Thr Trp Lys Lys Phe

                485                 490                 495                 500

Asp Asn Gly Lys Val Leu Ile Leu Tyr Gly Gly Pro Gly Glu His His Glu Phe Ala Val

                505                 510                 515                 520

Thr Gly Ala Ser Ala Ser Ser Val Ile Glu Gly Ser Ser Ser Gly Ile Thr Ser Lys Lys

                525                 530                 535v540

Ile Gly Asp Ala Leu Val Val Ala Trp Asp Val Ser Ser Lys Arg Arg Ile Ile Lys Ile

                545                 550                 555                 560

Gly Asp Leu Lys Val Phe Leu Leu Asp Arg Asn Ser Ala Tyr Asn Tyr Trp Val Pro His

                565                 570                 575                 580

Leu Pro Thr Lys Gly Lys Ala Pro Gly Tyr Val Ser Lys Lys Ala Ile Asp Ser Ser Ile

                585                 590                 595                 600

Ile Val Lys Ala Gly Tyr Leu Val Arg Ser Ala Phe Leu Ser Gly Lys Asp Leu His Ile

                605                 610                 615                 620

Gln Ala Asp Phe Asn Ala Thr Thr Pro Ile Glu Ile Ile Gly Ala Pro Ser Ser Ala Lys

                625                 630                 635                 640

Asn Leu Val Ile Asn Gly Lys Lys Thr Lys Thr Asn Val Asp Asp Asn Gly Ile Trp Ser

                645                 650                 655                 660

Ala Ser Val Ser Tyr Ser Thr Pro Glu Ile His Leu Pro Ser Leu Lys Asp Leu Lys Trp

                665                 670                 675                 680

Gln Ser Ile Asp Thr Leu Pro Glu Val Lys Asn Ser Tyr Asp Asp Ser Ala Trp Thr Ser

                685                 690                 695                 700

Ala Asp Gln Pro His Thr Leu Asn Thr Ala His Glu Leu Gln Thr Pro Thr Thr Leu Phe

                705                 710                 715                 720

Ser Ser Asp Tyr Gly Tyr His Thr Gly Thr Leu Leu Tyr Arg Gly His Phe Val Ala Asn

                725                 730                 735                 740

Gly Lys Glu Ser Ile Phe Phe Ile Gln Thr Gln Gly Gly Ser Ala Tyr Gly His Ser Val

                745                 750                 755                 760

Trp Val Asn Glu Thr Tyr Val Gly Ser Trp Glu Gly Ser Gly Ser Asn Asp Asn Tyr Asn

                765                 770                 775                 780

Ala Thr Tyr Thr Leu Pro Ser Leu Ala Thr Gly Lys Lys Tyr Ala Ile Thr Val Val Ile

                785                 790                 795                 800

Asp Asn Met Gly Leu Asp Val Asn Trp Val Ile Gly Gln Glu Gly Met Lys Asn Pro Arg

                805                 810                 815                 820

Gly Ile Ile Arg Tyr Asn Leu Ala Gly His Asp Ala Ser Ala Ile Ser Trp Lys Leu Thr

                825                 830                 835                 840

Gly Asn Leu Gly Gly Glu Asp Tyr Arg Asp Thr Val Arg Gly Pro Leu Asn Glu Gly Gly

                845                 850                 855                 860

Leu Tyr Ala Glu Arg Gln Gly Phe His Gln Pro Lys Pro Ser Thr Lys Asn Trp Asp Ser

                865                 870                 875                 880

Ser Ser Pro Phe Thr Gly Leu Thr Lys Pro Gly Ile Arg Phe Tyr Ser Ala Ser Phe Asp

                885                 890                 895                 900

Leu Asp Leu Pro Ser Gly Tyr Asp Ile Pro Leu Tyr Phe Asn Phe Gly Asn Ser Thr Ala

                905                 910                 915                 920

Pro Pro Asp Ala Tyr Arg Val Gln Leu Phe Val Asn Gly Tyr Gln Tyr Gly Lys Tyr Val

                925                 930                 935                 940

Asn Asn Val Gly Pro Gln Thr Ser Phe Pro Val Pro Glu Gly Ile Leu Asn Tyr His Gly

                945                 950                 955                 960

Thr Asn Trp Ile Ala Leu Ser Leu Trp Ala Gln Gln Glu Ser Gly Ala Lys Leu Asn Ser

                965                 970                 975                 980

Phe Glu Leu Ile Asn Thr Thr Pro Val Leu Thr Ser Leu Asp Lys Val Lys Ser Val Asp

                985                 990                                    1000

Gln Pro Lys Tyr Lys Ser Arg Lys Gly Ala Tyr

                1005               1010

SEQ ID No.3

<210>3

<211>284

<212>DNA

<222>(1)…(284)

<400>3

tgaaggtctg aggtccgatg ttgttgacgt attttccgta ctggtacccg ttgacgaaca    60

gctgcacacg gtaagcgtcc ggaggggcag tgctgttgcc aaagttaaag tacagcggga    120

tgtcgtagcc tgatagaaga tcaaggtcaa agctggcact gtagaagcga atgccgggct    180

tggtgagacc ggtgaatgga ctgctggaat cccaattctt ggtggatggc ttgggctggt    240

ggaaaccttg acgttcggcg tacagaccac cctcgttaat ctct                     300

SEQ ID No.4

<210>4

<211>708

<212>DNA

<222>(1)…(708)

<400>4

tccagcagtc cattcaccgg tctcaccaag cccggcattc gcttctacag tgccagcttt    60

gaccttgatc ttccatcagg gtacgacatc ccgctgtact ttaactttgg caacagcact    120

gcccctccgg acgcttaccg tgtgcagctg ttcgtcaacg ggtaccagta cggaaaatac    180

gtcaacaacg tcggacccca gacgagcttc cctgttcccg agggtattct gaactaccat    240

ggtaccaact ggattgcgtt gagtttgtgg gctcaacagg aaagcggtgc caagttgaat    300

agctttgagc tgatcaacac cactcccgtg cttacatcct tggacaaggt caagtctgtt    360

gaccagccaa agtacaagtc tcgaaagggg gcgtactaga acggttgctt ccatgatgta    420

atgatgcaat gcttgaagga tcgctaggaa tagacaagag gcatgaggta aatatgaaaa    480

ggcattgaca agcgctcatc tttattgctc gttgagaggc cgatattcaa gaatttacac    540

cttcatatgt tggacactgt ggcgcagcta ttctcttgca aaattgactc ttgtacgtcg    600

atggaggctt atatatcaag ttacacaagt agaatcattc aacagtcact tgtggaccta    660

ctcaatatca ccaggcgtga aatcatcaaa tcaaaaaaaa aaaaaaaa                 720

SEQ ID No.5

<210>5

<211>2833

<212>DNA

<222>(1)…(2833)

<400>5

attggccacg cgatcgacta gtaccccccc ccccccccga aaagccgaag gaataaaaga    60

aaaaggttgc ttcctcaatt cggcttcttc acgacagcgc gccgtggaaa ttattcgcca    120

tgaagctcct gtcttcgttg gccctggctg ccttggcggc acaggtctca ggtgctgcta    180

tcagccacaa gcttgacggc ttcactcttc gcgagcatgc tgatgcttca aagcgggagt    240

tgcttcaaaa atatgtgact tgggacaagc actcaatttt catcaatggt gagcgattga    300

tgatgttcag tggtgaagtt cacccctacc ggttgcccgt tgcctcattg tacatcgatg    360

tctttgagaa aatcaaggca ttgggattca actgcgtgtc tttctacgtc gactgggcct    420

tgttggaagg caagcccggc cactacacag ctgagggcat ctttgacttg cagccctttt    480

ttgatgcggc aaaagaggct ggaatctact tgctagcccg tcccggtcct tacatcaacg    540

ccgaagtttc cggcggtggt ttccctggat ggctgcaaag ggtaaatggc acactgcgaa    600

caagcattgg agactacctc aaatcgacag acaactacgc ctcgcacatc gcgaagacca    660

ttgcaaaggc gcagatcacc aacggtggac cgatcattct gtaccagccc gaaaatgagt    720

actctggagc ttgctgtggc tatgaagatt tccccgacgg ctcttacatg caatacatcg    780

aagatcatgc tcgtgatgca ggaatcgtgg ttcccttcat cagcaatgat gcctatgctg    840

gcggtcacaa cgcacccggt accggtaagg gtgcagtcga catctatggc catgatggct    900

accctcttgg attcgactgt gccaatcctt ctgtttggcc ggatggcaat ctgcccacca    960

attaccacac cttgcacgaa gaacaaagcc ctaccacgcc cttctctgtc gttgagttcc    1020

aaggtggagc tttcgacccc tggggtgggg taggcttcgc aaagtgcgca catttgctga    1080

atcacgagtt cgagagagtg ttctacaaga acgactttag ctttggcgtc acattcttca    1140

acttgtacat gatcttcggc ggtacgaatt ggggtaatct gggtcaccct ggtggttaca    1200

catcgtacga ctatggctct gccatatctg aatcgcgtaa cgtcaccaga gagaagtatt    1260

ccgagcttaa actactgggc aacttcgcca aggtttcccc tggctatgtt gtggccaacc    1320

ctggaaattt gactacttcg aaatacacca agactgcgga cctgactgtg actcctctgc    1380

tcggagaaag cagttctgcc ggctcgttct tcgtcatccg tcattccaac tacaacagcc    1440

aagcctcggt gaagtatcaa ctcactcttc caacgagcgc gggtgagctc actattcccc    1500

aactcggtgg tgaactcaca ttgagtggcc gggactcaaa gattcatgtg accgactatg    1560

atgtggctgg tagcaacatt ctctactcta ctgccgaggt gttcacatgg aagaagttcg    1620

ataatggaaa ggtcctcatt ctgtatggtg gacctggcga gcatcatgag tttgctgtca    1680

ccggtgcctc tgccagctct gtcattgagg gatcctcctc gggcatcacg tcaaagaaga    1740

ttggcgatgc ccttgtcgtc gcttgggatg tttcgagtaa gcgccgaatt attaagatcg    1800

gagacctgaa agtcttcctt ctcgaccgta actctgccta caactactgg gtgcctcacc    1860

tgccaaccaa gggcaaggca cctggctacg tcagcaagaa ggcaatcgat tcttcaatca    1920

ttgtgaaggc cggctatctg gttcgcagtg cattcctgag tggaaaggat ttgcacattc    1980

aggcggactt caacgccacc actcccattg agatcattgg cgccccatcc tctgccaaaa    2040

atcttgtcat caacggcaag aagacaaaga ctaacgtcga cgacaatggc atttggtcgg    2100

ccagtgtgtc ctactccaca cctgagatcc atcttcccag cctgaaggat ctgaagtggc    2160

aatccatcga tactcttcct gaagtcaaga actcgtacga tgactctgcg tggacgtctg    2220

ctgaccagcc tcacaccctc aacaccgccc acgagcttca gaccccaact actctcttct    2280

cgtccgacta tggataccac acaggtactc tcctctaccg cggtcacttc gttgccaatg    2340

gcaaagaatc catattcttc attcagactc agggtggttc cgcttatggc cactctgtct    2400

gggtcaatga gacatacgtt ggctcctggg agggaagtgg ttctaacgac aattacaacg    2460

ctacgtatac gctcccctcc ctggccacag gcaaaaagta cgcgatcacg gtggtcattg    2520

acaacatggg tctggacgtg aactgggtca tcggtcaaga gggcatgaag aaccctcgtg    2580

gtatcatccg ctacaacctg gctggacacg acgccagcgc catctcttgg aagctgaccg    2640

gcaaccttgg aggtgaggac taccgcgaca cagtccgcgg acctctcaat gagggaggtc    2700

tttacgccga acgtcaaggt ttccaccagc ccaagccatc caccaagaat tgggattcca    2760

gcagtccatt caccggtctc accaagcccg gcattcgctt ctacagtgcc agctttgacc    2820

ttgatcttcc atc                                                       2880