大鼠肝硬化骨质疏松动物模型构建方法

摘要

大鼠肝硬化骨质疏松动物模型构建方法，将玉米粉、鼠饲料粉及鸡蛋黄粉混合得A，然后将胆固醇倒入融化的猪油中混合得B，将B加入A中搅拌均匀得到C，用水溶解脱氧胆酸钠，然后加入C的混合物中，再加水将混合物调和成粘稠状，将粘稠状混合物烘烤自然冷却得造模复合物饲料；取SPF级雄性SD大鼠26只，随机分为A、B两组，A组，肝硬化骨质疏松模型组，本组大鼠饲以造模复合物饲料，第1周饮用5％乙醇水溶液；第2周饮用8％乙醇水溶液；40％四氯化碳的香油溶液按1.3ml/kg给予皮下注射，每隔5天注射1次，造模时间40天得到大鼠肝硬化骨质疏松动物模型，B组，正常对照组，本组大鼠采用常规饲料及水喂养，生理盐水按1.3ml/kg给予皮下注射，每隔5天注射1次，时间40天。

说明书

技术领域

本发明属于将肝硬化动物模型与骨质疏松症动物模型相结合的技术领域，具体涉及到一种大鼠肝硬化骨质疏松动物模型构建方法。

背景技术

越来越多的研究提示，肝硬化(liver cirrhosis)是并发骨质疏松症(osteoporosis，OP)的高危因素之一。主要有如下几方面原因：(1)肝脏在骨骼新陈代谢中起着十分重要的作用，骨的基本结构钙质需要维生素D的协助才能从肠道吸收，但维生素D必须先在肝脏和肾脏中经过羟化才具有活性进而发挥生理作用。肝硬化后维生素D的羟化(即“活化”)功能明显下降，从而使得钙质吸收、血钙稳定和骨钙沉积均受到显著影响。最为重要的是成骨细胞功能障碍，骨形成减少。(2)肝硬化导致门静脉压力升高，胃肠道瘀血，粘膜水肿，影响钙的吸收。血液中的钙质减少后，为了维持血钙浓度，破骨细胞活性增强。此时机体将从骨骼中动员钙质释放入血，从而造成骨吸收增加。(3)除了骨钙吸收减少外，肝硬化患者消化功能减退，将导致蛋白质、微量元素、维生素K等摄入的不足。前二者缺乏将影响骨有机质的形成；维生素K缺乏可使骨钙素合成受阻，骨钙素是促进骨矿化的重要活性物质，骨钙素缺乏必将导致骨矿化障碍。(4)有资料显示乙型肝炎肝硬化患者的骨密度(bonemineral density，BMD)与同龄正常人群相比明显降低，继发性骨量减少及骨质疏松的发生率高达58％。另有报道，肝硬化失代偿期患者骨量减少及骨质疏松的发生率高达83％，其中继发性骨质疏松的发生率高达40.4％。流行病学调查表明，我国是肝炎(尤其是乙型肝炎)肝硬化的高危人群国家，有将近3000万乙肝患者，超过1亿的乙肝携带者，他们的肝功能在反复损害、修复的过程中，很容易出现肝硬化。此类肝性骨病必将进一步影响患者的生存及生活质量，尤其是易罹患多部位(腰椎、髋部及腕关节等)的骨质疏松脆性骨折，其危害已日益受到重视。

然而，目前制约肝硬化继发性骨质疏松症(LC-OP)的病因、相互作用机制、临床防治与基础研究以及新药研发的一个“瓶颈”问题是缺乏适宜的实验动物模型作为研究载体。目前国外虽有建立大鼠肝硬化骨质疏松动物模型的一些方法，但主要是单一采用四氯化碳来诱导造模，存在建模周期长、给药周期及干预模式不统一、缺乏一致公认的实验动物纳入标准及模型评价标准等问题。而国内目前主要采用的仍是小鼠动物模型，实验动物的耐受性差，意外死亡率高，模型时限较短。

发明内容

本发明的目的在于克服上述现有技术的缺点，提供了一种造模周期短、见效快、成本低、使用方便、模型性能稳定、适应性广的大鼠肝硬化骨质疏松动物模型构建方法。

为达到上述目的，本发明采用技术方案是：

1)造模复合物饲料的制备

首先将玉米粉、常规鼠饲料粉及鸡蛋黄粉混合均匀得到A，然后将胆固醇倒入加热融化的新炼猪油中混合得到B，将B加入A中搅拌均匀得到C，用热水溶解脱氧胆酸钠，然后加入C的混合物中搅拌均匀，再加水将混合物调和成粘稠状，将粘稠状混合物平铺于烤盘中，80℃烘烤36小时，自然冷却后，切割成形，常温保存备用，其中按质量比含40％～45％常规鼠饲料粉、37％～42％玉米粉、10％新炼猪油、5％鸡蛋黄粉、2％脱氧胆酸钠和1％胆固醇。

2)其次，取SPF级雄性SD大鼠26只，体重140～160g，随机分为A、B两组进行试验，A组，肝硬化骨质疏松模型组，简称模型组：本组16只大鼠均饲以造模复合物饲料，第1周饮用5％乙醇水溶液；第2周开始饮用8％乙醇水溶液；40％四氯化碳的香油溶液按1.3ml/kg给予皮下注射，每隔5天注射1次，造模时间40天得到大鼠肝硬化骨质疏松动物模型，B组，正常对照组，简称对照组：本组10只大鼠采用常规饲料及水喂养，生理盐水按1.3ml/kg给予皮下注射，每隔5天注射1次，时间40天。

本发明的SPF级雄性SD(Sprague Dawley)大鼠由第四军医大学动物实验中心提供，合格证号；医动证字SCXK(军)2002-005。

附图说明

图1是造模40天后A组(模型组)与B组(对照组)大鼠肝脏大体比较观察；

图2是造模40天后A组(模型组)与B组(对照组)大鼠肝组织病理学观察，其中a₁是A组(模型组)肝实质内大量纤维组织增生，形成假小叶，肝实质变性(VG染色×50)，a₂是A组(模型组)肝细胞广泛表达III型胶原(免疫组化×100)，b₁是B组(对照组)正常肝小叶结构(HE染色×100)，b₂是B组(对照组)正常肝小叶内部分肝细胞内表达III型胶原(免疫组化×100)；

图3是造模40天后A组(模型组)与B组(对照组)大鼠腰椎及股骨干骨密度(BMD)结果观察；

图4是造模40天后A组(模型组)与B组(对照组)大鼠胫骨近段松质骨Micro-CT三维重构及比较观察。

具体实施方式

下面结合附图对本发明作进一步详细说明。

本发明的构建方法如下：

1)首先将玉米粉、常规鼠饲料粉及鸡蛋黄粉混合均匀得到A，然后将胆固醇倒入加热融化的新炼猪油中混合得到B，将B加入A中搅拌均匀得到C，用热水溶解脱氧胆酸钠，然后加入C的混合物中搅拌均匀，再加水将混合物调和成粘稠状，将粘稠状混合物平铺于烤盘中，80℃烘烤36小时，自然冷却后，切割成形得到造模复合物饲料，常温保存，其中按质量比含40％～45％常规鼠饲料粉、37％～42％玉米粉、10％新炼猪油、5％鸡蛋黄粉、2％脱氧胆酸钠和1％胆固醇。

2)其次，取SPF级雄性SD大鼠26只，体重140～160g，随机分为A、B两组进行试验，A组，肝硬化骨质疏松模型组，简称模型组：本组16只大鼠均饲以造模复合物饲料，第1周饮用5％乙醇水溶液；第2周开始饮用8％乙醇水溶液；40％四氯化碳的香油溶液按1.3ml/kg给予皮下注射，每隔5天注射1次，造模时间40天得到大鼠肝硬化骨质疏松动物模型，B组，正常对照组，简称对照组：本组10只大鼠采用常规饲料及水喂养，生理盐水按1.3ml/kg给予皮下注射，每隔5天注射1次，时间40天。

模型建立的评价方法与结果

(一)评价指标：

1.肝组织学观察及血清丙氨酸氨基转移酶(Alamine aminotransferase，ALT)及天冬氨酸氨基转移酶(Aspartate aminotransferase，AST)检测：

造模40天，两组大鼠(即构建的A组模型组和B组对照组)禁食12小时，而后在12％水合氯醛腹腔麻醉条件下，剖腹探查(在体)及离体观察两组大鼠肝脏，腹主动脉取血分离血清，测定血清AST、ALT。麻醉条件下完整切取肝脏，10％甲醛磷酸缓冲液固定，石蜡包埋、4μm连续切片，制备肝组织学切片，用于HE和VG染色以及III型胶原免疫组化染色观察，采用Leica显微镜及其全自动图像分析系统(德国Leica公司)观察肝硬化(包括肝细胞变性与胶原纤维增生程度等)病变程度。

2.骨密度(bone mineral density，BMD)检测：

于适应性饲养的第3天(即造模前)及造模40天后，两组大鼠在麻醉条件下应用双能X射线吸收法(dual-energy X-ray absorptiometry，DEXA)骨密度测量仪(DPX-IQ，美国GE-Lunar公司)检测大鼠腰椎(L4～6)及左侧股骨干骨密度(BMD)，运用小动物软件进行分析。测量精度(变异系数)CV＜1％。

3.Micro-CT检测：

造模40天后两组大鼠取材，每组10只，均取右侧的胫骨近端，将标本放入Micro-CT(eXplore Locus SP，美国GE公司)样品杯中，采用相同协议条件(largetube_14μm_155min_ss.protocol)进行扫描并对每个标本感兴趣区(ROI)进行三维重建。每个标本ROI统一设定为胫骨近端骺线下2mm～4mm的松质骨节段，以Threshold＝1000作为松质骨阈值。测定ROI区域内的骨密度(BMD，mg/cm³)、组织骨密度(TMD，mg/cm³)、骨体积比(BV/TV，％)、骨表面积体积比(BS/TV，1/mm)、骨小梁厚度(Tb.Th.，mm)、骨小梁数量(Tb.N.，1/mm)及骨小梁间距(Tb.Sp.，mm)等骨小梁立体测量学指标。

4.骨生物力学特性测量：

两组大鼠处死后取腰椎(L5)及右侧股骨，置于SANS CMT-4204微机控制电子万能试验机(深圳新三思材料检测有限公司，No.10603027)支架上，分别进行压缩试验及三点弯曲试验，测定各组最大载荷(N)。20KN传感器相对误差≤±0.22％，位移相对误差≤±0.20％，速度相对误差≤±0.18％，加载速度为1mm/min，跨距为15mm。

5.统计学分析：

利用SPSS 10.0统计软件进行独立样本t检验分析，所有数据均以M±SD表示。

(二)结果：

1.两组大鼠体重、血清AST、ALT测结果及肝组织大体观察：

造模过程中，A组(模型组)与B组(对照组)大鼠分别采用造模复合物饲料与鼠普通饲料喂养，所用实验动物均存活。造模第40天时，A组(模型组)与B组(对照组)相比，体重明显减轻(P＜0.01)；血清ALT、AST值则显著增高(P＜0.01，P＜0.05)(表1)。A组(模型组)肝组织失去正常的光洁及润泽，肝脏肿胀，质韧，硬变，表观呈广泛细沙粒结节样变(图1)。

表1两组大鼠体重及血清酶测定结果(M±SD)

与B组相比较，^*P＜0.01，^&P＜0.05

2.肝组织病理学观察结果：

A组(模型组)肝实质内出现大量纤维纵隔，增生的纤维纵隔向肝实质内延伸，包绕并分割肝小叶，相互交错的纤维纵隔形成完全或不完全的肝假小叶，交汇处增生纤维呈粗大结节状。肝细胞排列紊乱并呈明显的气球样变性，可见点灶状及碎片状肝细胞坏死，肝细胞内广泛表达III型胶原蛋白(图2a₁～a₂)。B组(正常对照组)大鼠肝小叶为正常结构，肝组织内无纤维组织增生及纵隔形成。肝细胞形态及排列无异常，无气球样变性、坏死或纤维脂肪化改变，III型胶原蛋白表达程度低，仅限于部分肝细胞内(图2b₁～b₂)。

3.骨密度(BMD)检测结果：

造模前两组大鼠的体重、腰椎(L4～6)骨密度及左股骨干骨密度值无显著性差别(P＞0.05)。造模40天后A组(模型组)与B组(对照组)间比较发现，无论是大鼠体重，还是腰椎骨密度或股骨干骨密度均存在显著差异(P＜0.01)；A组大鼠的体重、腰椎骨密度以及左股骨干骨密度值均明显低于同期B组(对照组)水平。表明A组(模型组)造模40天后在体骨密度测量已出现明显的骨质疏松变化。结果见图3和表2。

表2两组大鼠体重、腰椎骨密度及左股骨干骨密度测量结果(M±SD，g/cm²)

与B组相比较，^*P＜0.01

4.Micro-CT检测结果比较：

离体测量发现，A组(模型组)与B组(对照组)相比，大鼠胫骨近端骨密度(BMD)显著降低(P＜0.01)。体视学参数分析进一步表明，A组(模型组)大鼠的骨体积比(BV/TV)、骨小梁厚度(Tb.Th.)及骨小梁数量(Tb.N.)均明显低于同期B组(对照组)值(P＜0.01)；而A组(模型组)大鼠骨表面积体积比(BS/TV)以及骨小梁间距(Tb.Sp.)则较同期B组(对照组)明显增加(P＜0.01)。结果见图4和表3。

表3两组大鼠胫骨近段松质骨Micro-CT测量结果比较(M±SD，n＝10)

与B组相比较，^*P＜0.01

5.骨生物力学检测测量：

动物造模40天后，A组(模型组)大鼠腰椎(L5)及右侧股骨的生物力学特性最大载荷较同期B组(对照组)值明显降低(P＜0.01)，说明A组(模型组)大鼠在骨密度下降的同时，中轴骨及四肢骨的骨强度亦显著降低，由此所导致的相应部位骨折的风险性明显增加。结果见表4。

表4两组大鼠腰椎(L₅)压缩及股骨三点弯曲试验结果(M±SD，n＝10)

与B组相比较，^*P＜0.01