降钙素基因相关肽与鲑鱼降钙素融合多肽

摘要

降钙素基因相关肽与鲑鱼降钙素融合多肽，它涉及一种融合多肽。它为了得到一种既含有降钙素又含有降钙素基因相关肽的产品，而提供了一种降钙素基因相关肽与鲑鱼降钙素融合多肽。降钙素基因相关肽与鲑鱼降钙素融合多肽的氨基酸序列如SEQ ID No：1所示；且降钙素基因相关肽与鲑鱼降钙素融合多肽C端酰胺化。经实验验证本发明降钙素基因相关肽与鲑鱼降钙素融合多肽保留了降钙素基因相关肽和鲑鱼降钙素各自的活性。

说明书

技术领域

本发明涉及一种融合多肽。

背景技术

降钙素(calcitonin，CT)可直接抑制破骨细胞(osteoclasts，OC)增殖，阻止骨溶解，促进骨形成，并能迅速减轻因骨质疏松而引起的腰锥病疼痛或发病，是治疗骨质疏松症的首选药物之一。它还可以有效调节骨钙与血钙之间的平衡，并有镇痛作用；对治疗高血钙症、变形性骨炎、甲状腺机能亢进以及各种原因引起的骨骼疼痛(如类风湿、肿瘤)等有非常明显的效果，在骨痛病的治疗中，降钙素的镇痛效果可达吗啡的30～50倍。由于降钙素能抑制胃酸分泌，它可用于治疗急性胃溃疡；由于降钙素能抑制胰腺激素分泌及抑制酶的释放，它可用于治疗急性胰腺炎；降钙素对甲状旁腺机能亢进也有治疗作用。降钙素在慢性多关节炎及心血管疾病的治疗方面也有一定的潜力。鲑鱼降钙素(salmon calcitonin，sCT)是天然降钙素中活性最高的一种，其活性约是人降钙素的40倍，与人降钙素具有同源性。细胞实验证明鲑鱼降钙素作用在人降钙素受体上，所产生的第二信使cAMP的量远远大于人降钙素，因此其使用量占临床用降钙素的近50％。

降钙素基因相关肽(calcitonin gene-related peptide，CGRP)是调节心血管活动的重要神经递质之一，是迄今所知的人体最强的舒血管物质。降钙素基因相关肽扩冠状动脉作用比硝酸甘油、硝普钠强240倍，它是由辣椒素敏感的感觉神经末梢释放的一种生物活性多肽，广泛分布于神经及心血管系统。在心血管系统中，降钙素基因相关肽生物活性具有多样性，如强大的舒血管作用、抑制平滑肌细胞增殖和内皮细胞凋亡，也能促进细胞分化增殖，参与血管新生。CGRP的舒张冠状血管的作用远强于P物质(substance P，SP)、心钠素和去甲肾上腺素(norepinephrine，NE)；比乙酰胆碱(acetylcholine，Ach)、5-羟色胺(5-hydroxytryptamine，5-HT)等强10000倍左右，比异丙肾上腺素强10～100倍。CGRP血管舒张反应呈现不同程度的剂效——依赖性，即适当加大CGRP的注入剂量时反应增强，浓度低则效应缓慢，但持续时间长。Shen等(Shen YT，Pittman TJ，Buie PS.Functional role of alpha-calcitonin gene-related peptide in theregulation of the cardiovascular system[J].Pharmacol Exp Ther，2001，298(3)：551-558.)认为尽管外源性的α-CGRP可以引起不同部位血管床的舒张，但在正常状态下的内源性α-CGRP对血管调节并不起重要作用。经反复实验验证降钙素基因相关肽能够抑制血管平滑肌细胞增殖、保护内皮细胞和抑制血管新生，防治高血压，防止充血性心力衰竭，防治心绞痛，防治心肌梗死和治疗休克。而且具有在脊髓水平调制痛觉的功能，可调节破骨细胞骨吸收和促进成骨细胞分裂。

目前市场上只有降钙素产品，而降钙素基因相关肽只停留在实验室研究阶段。

发明内容

本发明的目的是为了得到一种既含有降钙素又含有降钙素基因相关肽的产品，而提供了一种降钙素基因相关肽与鲑鱼降钙素融合多肽。

降钙素基因相关肽与鲑鱼降钙素融合多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示；且降钙素基因相关肽与鲑鱼降钙素融合多肽C端酰胺化。

经实验验证本发明降钙素基因相关肽与鲑鱼降钙素融合多肽保留了降钙素基因相关肽和鲑鱼降钙素各自的酶活性；而且偶联反应产生还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)的速度是同时加入两种单一(降钙素基因相关肽和鲑鱼降钙素)多肽的反应体系反应速度的两倍以上，同时过渡态时间(transienttime)大大缩短，缩短至原过渡态时间的1/4左右。

本发明为了提高msCT生物活性依据msCT生物活性对构象依存性的现象从而对其氨基酸残基进行了改造，将msCT第8位的缬氨酸变为甘氨酸、第16位的亮氨酸用丙氨酸置换、再删除22位的酪氨酸(msCT[Gly⁸，Ala¹⁶，del-Tyr²²])，msCT的生物活性由4500IU/mg提高到8600IU/mg。

本发明降钙素基因相关肽与鲑鱼降钙素融合多肽C端酰胺化可提高降钙素的活性约30倍(C端酰胺化的本发明降钙素基因相关肽与鲑鱼降钙素融合多肽生物学活性为4500IU/mg，C端非酰胺化的降钙素基因相关肽与鲑鱼降钙素融合多肽生物学活性为100～200IU/mg)。

具体实施方式

本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。

具体实施方式一：本实施方式降钙素基因相关肽与鲑鱼降钙素融合多肽的氨基酸序列如下：

AlaCysAspThrAlaThrCysValThrHisArgLeuAlaGlyLeuLeuSerArgSerGlyGlyValValLysAsnAsnPheValProThrAsnValGlySerLysAlaPheGlyThrCysSerAsnLeuSerThrCysGlyLeuGlyLysLeuSerGlnGluAlaHisLysLeuGlnThrProArgThrAsnThrGlySerGlyThrPro；且降钙素基因相关肽与鲑鱼降钙素融合多肽C端酰胺化。

本实施方式降钙素基因相关肽与鲑鱼降钙素融合基因由南京基天有限责任公司合成，融合多肽系本实验室构建菌株进行转入番茄后经亲和层析纯化获得。

本实施方式降钙素基因相关肽与鲑鱼降钙素融合基因中有一段被称为“亲和手柄”(affinity handle)的编码序列相连接，这段“亲和手柄”可以与亲和层析柱上的配基特异性地结合，这样所表达的融合蛋白可以用亲和层析的方法快速而简便地纯化出来，所得到的融合多肽蛋白经化学方法或酶法切割开来之后，混合产物再上同一亲和柱，充作“亲和手柄”的一段多肽或蛋白以及尚未被切开的融合蛋白被吸附于柱上，而重组目的产物则处于流动相中。因此可得到较高纯度的降钙素基因相关肽与鲑鱼降钙素融合多肽。

本实施方式在降钙素基因相关肽与鲑鱼降钙素融合多肽的C端加上一个Gly为肽酰甘氨酸酰化单氧酶酰胺化提供氨基供体。

本实施方式在CGRP和msCT氨基酸序列之间设计一个Kpn I酶切位点(如氨基酸序列下划线所示)，可用于验证阳性克隆及其它基因操作。

对本实施方式降钙素基因相关肽与鲑鱼降钙素融合多肽进行动物实验：

实验1：将骨质疏松模型大鼠随机分成两组(治疗组和模型组)，以正常大鼠为空白对照组；治疗组按体重0.5μg/kg剂量注射本实施方式降钙素基因相关肽与鲑鱼降钙素融合多肽，模型组注射同等剂量的生理盐水。实验进行84天，对大鼠血清酸性磷酸酶(TRAP)、碱性磷酸酶(ALP)和骨钙素(BGP)进行检测，并对大鼠进行了骨密度测定。检测结果如表1和表2所示。

表1大鼠血清TRAP、ALP、BGP测定结果(X±S)

  组别  鼠数  TRAP(U/L)  ALP(U/L)  BGP(μg/L)  空白对照组  10  18.67±3.31  152.84±21.08  1.20±0.25  模型组  10  29.96±3.05  156.22±23.34  1.32±0.23  治疗组  10  19.25±4.23^**  233.70±42.05^**  1.97±0.18^**

表2大鼠股骨、胫骨、腰椎密度值(X±S)

  组别  鼠数  股骨(g/cm³)  胫骨(g/cm³)  腰椎(g/cm³)  空白对照组  10  0.61±0.04  0.58±0.03  0.62±0.04  模型组  10  0.41±0.12  0.42±0.08  0.44±0.06  治疗组  10  0.59±0.07^*  0.59±0.05^*  0.58±0.04^*

根据表1和表2的实验数据说明本实施方式降钙素基因相关肽与鲑鱼降钙素融合多肽对骨质疏松具有优异的治疗效果，证明本实施方式降钙素基因相关肽与鲑鱼降钙素融合多肽具有鲑鱼降钙素活性。

实验2：SD大鼠20只造成心肌缺血模型，然后随机分成两组(治疗组和模型组)，治疗组按体重2.5mg/kg剂量注射本实施方式降钙素基因相关肽与鲑鱼降钙素融合多肽，模型组注射同等剂量的生理盐水。实验进行4次，对大鼠心肌进行危险区域(AAR)、坏死区(IS)及坏死区与危险区域的比值检测，检测结果如表3所示。

表3

  组别  危险区域(g)  坏死区(g)  IS/AAR(％)  模型组  治疗组  0.24±0.03  2.25±0.03  0.14±0.03  0.07±0.03^**  54±13  28±14^**

试验结果表明降钙素基因相关肽与鲑鱼降钙素融合多肽是一种心源性心肌保护物质。根据表3的实验数据说明本实施方式降钙素基因相关肽与鲑鱼降钙素融合多肽对心肌缺血造成的心肌梗塞具有优异的治疗效果，证明本实施方式降钙素基因相关肽与鲑鱼降钙素融合多肽具有降钙素基因相关肽活性。

动物实验证明本实施方式降钙素基因相关肽与鲑鱼降钙素融合多肽同时具有降钙素基因相关肽和鲑鱼降钙素两种肽的活性。

经测试本实施方式降钙素基因相关肽与鲑鱼降钙素融合多肽偶联反应产生NADH的速度是同时加入两种单一(降钙素基因相关肽或鲑鱼降钙素)多肽的反应体系反应速度的两倍以上，同时过渡态时间缩短至原1/4左右。

序列表

<110>黑龙江大学

<120>降钙素基因相关肽与鲑鱼降钙素融合多肽

<160>1

<210>1

<211>70

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>降钙素基因相关肽与鲑鱼降钙素融合多肽。

<400>1

Ala Cys Asp Thr Ala Thr Cys Val Thr His Arg Leu Ala Gly Leu Leu

1               5                   10                  15

Ser Arg Ser Gly Gly Val Val Lys Asn Asn Phe Val Pro Thr Asn Val

            20                  25                  30

Gly Ser Lys Ala Phe Gly Thr Cys Ser Asn Leu Ser Thr Cys Gly Leu

        35                  40                  45

Gly Lys Leu Ser Gln Glu Ala His Lys Leu Gln Thr Pro Arg Thr Asn

    50                  55                  60

Thr Gly Ser Gly Thr Pro

65                  70