一种具有抗肿瘤活性的针层孔菌多糖Ⅱ及其提取分离方法

摘要

本发明提供了一种针层孔菌多糖及其提取分离方法，首先用水煮醇沉法提取粗多糖，粗多糖用离子交换法分离提纯，先用pH为4～5的醋酸－醋酸钠缓冲液洗脱弃去，再用pH值为4～5的含NaCl浓度≥0.2mol/L的醋酸－醋酸钠缓冲液洗脱，洗脱液经透析袋透析除盐后浓缩，低温干燥，即得抗肿瘤活性高的针层孔菌多糖Ⅱ，与现有技术相比，本发明采用活性跟踪分离方法从针层孔菌子实体中分离纯化出具有抗肿瘤作用的水溶性活性多糖成分，和传统的先分离纯化单体化学成分再进行活性测试方法相比，能大大减少分离工作中的盲目性和在分离过程中造成的活性成分丢失。

说明书

技术领域

本发明涉及针层孔菌多糖技术领域，特别是涉及具有抗肿瘤活性的针层孔菌多糖II及其提取分离方法。

背景技术

进入21世纪以来，癌症已成为人类健康的头号杀手。据统计，我国每年新增癌症患者近200万人，每年因癌症死亡约150万人，而癌症的发病率还在以每年2.5％的速度不断增加。国际癌症研究中心(IARC)2005年10月公布的一份研究报告中指出：根据目前癌症的发病趋势，到2020年全世界癌症发病率将比现在增加50％，全球每年新增癌症患者人数将达到1500万人，可见开发高效低毒的抗肿瘤药物已刻不容缓。目前用于癌症治疗的化学药物存在许多缺陷：1、药物在作用于靶细胞的同时往往也对正常细胞具有毒性，使病人出现水肿、消瘦、乏力、白细胞数下降、肝功能不良等严重的副作用；2、大多数药物都有不同程度的致突变遗传毒性，为此治疗肿瘤的同时增加了病人患第二种肿瘤的可能性。近年来中草药治疗癌症研究不断深入，由于其具有较低的毒副作用、无致突变性以及在增强机体自身对癌细胞的免疫以及促进癌细胞凋亡两方面独特的疗效，越来越引起人们的关注。

针层孔菌最早以“桑黄”名称被记载于《神农本草经》、《本草纲目》等药典，具有清热、滋阴、收敛、止血功效，可治血崩、血淋、脱肛泻血、带下、经闭、瘰疬溃疡、脾虚泄泻等。桑黄非某种真菌，而是针层孔菌属(Phellinus)的一类子实体。目前常用的种名有3个：火木针层孔菌(P.igniarius)、裂蹄针层孔菌P.linteus)及鲍氏针层孔菌(P.baumii)。自1968年日本学者Ikekawa T报道桑黄的热水提取物对移植小鼠皮下的肿瘤S180抑制率高达96.7％而对正常细胞没有毒性，它已成为药用真菌研究的一个热点。各国学者特别是中国、韩国、日本等国学者对其进行了大量研究，已证实桑黄具有抗肿瘤、免疫调节、降血糖等作用，它的活性成分主要有多糖、黄酮、萜类，其中研究最多的是桑黄多糖。

目前，桑黄多糖的提取主要是先将各种单体化学成分分离纯化，再进行活性测试，这样的提取方法使得提取分离工作中的盲目性很大，而且在分离过程中也容易造成活性成分的丢失。另，针层孔菌属具有多种不同形状和种名的针层孔菌，其提取到的桑黄多糖也不一定具有活性作用，即具有抗肿瘤活性。

本发明的针层孔菌(P.sp.)是针层孔菌属中的一种(参见图10)，暂未定种名，其核糖体rDNA基因转录间隔序列(ITS1-5.8S-ITS2全长序列)已递交至GenBank，其登录号为EU787449。其子实体多年生，无柄，单生，硬木质，蹄形或半圆形，初期有微细绒毛，后变光滑，不规则龟裂，灰白色、灰黄褐色至灰黑色，具同心环沟，长10-15cm，宽5-8.5cm，厚7-11cm；菌盖顶端具黑色硬皮壳，边缘钝。菌肉锈褐色或咖啡色，硬木质，厚4-8cm。菌管与菌肉色相似，或比菌肉稍浅，多层，每层厚3-6cm；管口与菌管同色，小，圆形；菌肉和菌管组织在氢氧化钾试剂中变黑。二型菌丝系统：生殖菌丝透明，薄壁，直径为2-2.5μm，无锁状联合；骨骼菌丝黄褐色至锈褐色，厚壁，直径为2-4μm。子实层中有刚毛，锥形，黄褐色，厚壁，22-31×6-9μm。孢子近球形至广椭圆形，黄褐色至锈褐色，光滑，4-6×4-5μm，在Melzer试剂及棉兰试剂中无变色反应。该登录号为EU787449的针层孔菌可在野外采集到，市场上也有销售，例如在广州清平药材市场、广州同仁堂等有售。

发明内容

本发明所要解决的技术问题之一是解决现有针层孔菌多糖提取分离方法的盲目性，减少活性成分的丢失，针对GenBank，其登录号为EU787449的针层孔菌(P.sp.)提供一种采用活性跟踪分离方法分离纯化具有抗肿瘤作用的针层孔菌(P.sp.)多糖II的方法。

为了解决上述技术问题，本发明采用如下的技术方案：

本发明针层孔菌多糖II的提取分离方法，所述针层孔菌的GenBank登录号为EU787449，该方法包括如下步骤：

a、粗多糖的提取：取针层孔菌子实体，粉碎，加水煮沸提取，提取液浓缩后加入乙醇，置于低温冰箱内，静置5-20小时，离心分离，沉淀在低温干燥即得粗多糖；

b、针层孔菌多糖的分离：取粗多糖，溶于pH值为4～5的醋酸-醋酸钠缓冲液中，离心，过滤，滤液上离子交换柱，用pH值为4～5的醋酸-醋酸钠缓冲液洗脱1～3个柱体积，洗脱液弃去，然后再用pH值为4～5的含NaCl浓度≥0.2mol/L的醋酸-醋酸钠缓冲液洗脱1～3个柱体积，洗脱液经透析除盐后浓缩，在低温干燥，即得多糖II。

上述针层孔菌多糖的提取分离方法中，所述步骤a为：取针层孔菌子实体，粉碎，加2～10倍量水煮沸提取2～4次，每次1～3小时，合并提取液，浓缩后加入3～5倍量90％乙醇，置于4℃冰箱内，静置5-20小时，以3500～4500r/min的速度离心分离，沉淀在40-60℃低温干燥即得粗多糖。

前述针层孔菌多糖的提取分离方法中，所述步骤b为：取粗多糖，溶于pH值为4～5的浓度为0.005～0.015mol/l的醋酸-醋酸钠缓冲液中，以3500～4500r/min的速度离心，过滤，滤液上离子交换柱，用pH值为4～5的浓度为0.005～0.015mol/l的醋酸-醋酸钠缓冲液洗脱2个柱体积，洗脱液弃去，然后再用pH值为4～5的含NaCl浓度≥0.2mol/L的浓度为0.005～0.015mol/l的醋酸-醋酸钠缓冲液洗脱2个柱体积，洗脱液经截留分子量＜1000MW透析袋透析除盐后浓缩，低温干燥，即得多糖II。

具体地，前述针层孔菌多糖II的提取分离方法包括如下步骤：

a、粗多糖的提取：取针层孔菌子实体，粉碎，过直径260μm孔径筛，分别加10倍量、5倍量和2倍量水煮沸提取3次，每次2小时，合并提取液，浓缩，加入4倍量90％乙醇，置于4℃冰箱内，静置过夜，以4000r/min的速度离心分离，沉淀在40℃低温干燥即得粗多糖。

b、针层孔菌多糖的分离：取粗多糖，溶于pH值为4.5的浓度为0.01mol/l的醋酸-醋酸钠缓冲液中，以4000r/min的速度离心，离心液经0.45μm微孔滤膜过滤，滤液上离子交换柱，用pH值为4.5的浓度为0.01mol/l的醋酸-醋酸钠缓冲液洗脱2个柱体积，洗脱液弃去，然后再用pH值为4.5的含0.2mol/l NaCl的浓度为0.01mol/l的醋酸-醋酸钠缓冲液洗脱2个柱体积，洗脱液经100MW透析袋透析除盐后浓缩，低温干燥，经凝胶渗透色谱法测定，得分子量为8439±427Da的多糖II。

本发明的另一需要解决的技术问题是提供一种具有抗肿瘤活性的针层孔菌多糖II。

为了解决上述技术问题，本发明采用如下的技术方案：

一种针层孔菌多糖II，其是按上述所述提取分离方法制备得到的，其分子量为8439±427Da。

本发明还涉及上述针层孔菌多糖II在制备治疗肿瘤药物或制剂中的应用。

与现有技术相比，本发明的GenBank登录号为EU787449的针层孔菌是从几种针层孔菌中筛选到的抗肿瘤活性最强的材料，本发明经过大量实验，采用活性跟踪分离方法得知，可从针层孔菌(P.sp.)子实体中分离纯化出一种新的具有抗肿瘤作用的水溶性活性多糖II成分，和传统的先分离纯化单体化学成分再进行活性测试方法相比，本发明所述提取分离方法能大大减少分离工作中的盲目性和在分离过程中造成的活性成分丢失。并且，本发明在初步提取针层孔菌粗多糖的基础上，采用离子交换法对粗多糖进一步的提取和纯化，经实验证明，所得到的针层孔菌多糖II具有更好的抗肿瘤活性，为制备治疗肿瘤的药物或保健食品提供新的选择。

附图说明

图1为针层孔菌子实体粗多糖对Hela、SF268、NCI-H460、MCF-7肿瘤细胞的抑制作用示意图；

图2为针层孔菌子实体多糖I对Hela、SF268、NCI-H460、MCF-7肿瘤细胞的抑制作用示意图；

图3为针层孔菌子实体多糖II对Hela、SF268、NCI-H460、MCF-7肿瘤细胞的抑制作用示意图；

图4为针层孔菌子实体粗多糖DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换层析示意图，以管数为横坐标，各管的吸光度OD为纵坐标作图；

图5为多糖II Sephacryl S-200HR凝胶柱层析示意图；

图6为针层孔菌子实体多糖II对Hela细胞的增殖抑制作用示意图；

图7为针层孔菌子实体多糖II对SF268细胞的增殖抑制作用示意图；

图8为针层孔菌子实体多糖II对NCI-H460细胞的增殖抑制作用示意图；

图9为针层孔菌子实体多糖II对MCF-7细胞的增殖抑制作用示意图；

图10为针层孔菌子实体形态特征示意图。

具体实施方式

实施例1：取针层孔菌子实体，粉碎，过直径260μm孔径筛，取子实体干粉1kg，分别加入蒸馏水10kg、5kg和2kg，100℃提取3次，每次2小时，合并提取液，用旋转蒸发仪浓缩至3kg。缓慢地向浓缩液中加入12kg的90％乙醇，将溶液放入4℃冰箱内，静置过夜(约10小时)，然后以4000r/min的速度离心10min，取沉淀，40℃低温干燥，即得粗多糖。

取粗多糖溶于pH值为4.5的0.01mol/L醋酸-醋酸钠缓冲液中，配制成多糖含量10mg/ml的溶液，4000r/min离心10min，弃沉淀，离心液0.45μm微孔滤膜过滤除杂质，滤液上样于2.6×20cm DEAE-Sepharose Fast Flow柱，pH值为4.5的0.01mol/L醋酸-醋酸钠缓冲液洗脱2个柱体积后，该洗脱液弃去或收集为抗肿瘤实验所用(分步收集器收集该洗脱液、浓缩、透析后，称为多糖I)pH值为4.5的含0.25mol/L NaCl的0.01mol/L HAc-NaAc缓冲液洗脱2个柱体积，(可分步收集器收集，用苯酚硫酸法跟踪检测，用于体外肿瘤细胞抑制实验)，该次洗脱收集的洗脱液经100MW透析袋透析除盐后浓缩，在40℃低温干燥，即得具有更好抗肿瘤作用的针层孔菌多糖II。

取制得的针层孔菌多糖II，溶于0.05mol/L NaCl溶液中配制浓度为2mg/ml的多糖溶液，上样Sephacryl S-200HR凝胶柱，以流速为0.5ml/min，用0.05mol/LNaCl溶液洗脱1个柱体积，分步收集器收集，5ml/管，各管用苯酚硫酸法在490nm波长跟踪检测，发现为单一多糖峰，表明其纯度较高。

多糖含量测定采用苯酚硫酸法：吸取用蒸馏水稀释至适当浓度，测得OD值在0.1～1范围内灵敏度高的溶液0.4ml，置于20ml试管中，加入5％重蒸苯酚溶液0.8ml，混匀后迅速加入浓硫酸4ml，于沸水浴中加热15min后，冷却到室温，在490nm处测定吸光度。

凝胶渗透色谱法测定多糖II分子量。采用2.6×60cm Sephacryl S-200HR凝胶预装柱，蓝色葡聚糖上样求得柱的外水体积V₀＝105ml。将3种已知分子质量的葡聚糖标准品T-10、T-40、T-70依次进行凝胶层析，用苯酚-硫酸法检测，求得洗脱体积V_e分别为125ml、135ml、215ml，以V_e/V₀为纵坐标，lgMr为横坐标，得到分子质量测定标准曲线：y＝-1.0366x+6.1464  r＝0.9683，接着，待测分子质量的多糖II样品上样2次，亦求得相应的洗脱体积V_e＝215ml、220ml，求得V_e/V₀值，查标准曲线即求得多糖II的分子量范围为8439±427Da。

实施例2：取针层孔菌子实体，粉碎，子实体粉末分别加5倍量水煮沸提取4次，每次1小时，合并提取液，浓缩后加入3倍量90％乙醇，置于4℃冰箱内，静置过夜(约7小时)，以3500r/min的速度离心分离，沉淀在40℃低温干燥即得粗多糖。

取粗多糖溶于pH值为5.0的0.01mol/L醋酸-醋酸钠缓冲液中，3500r/min离心10min弃沉淀，离心液经0.45μm微孔滤膜过滤除杂质，滤液上样于2.6×20cm DEAE-Sepharose Fast Flow柱，pH值为5.0的0.01mol/L醋酸-醋酸钠缓冲液洗脱2个柱体积，该洗脱液弃去或收集为抗肿瘤实验所用(该洗脱液收集、浓缩、透析后，称为多糖I)。然后再用pH值为5.0的含0.5mol/l NaCl的醋酸-醋酸钠缓冲液洗脱，(可分步收集器收集洗脱液，用苯酚硫酸法跟踪检测，用于体外肿瘤细胞抑制实验)洗脱液经100MW透析袋透析除盐后浓缩，在50℃低温干燥，即得针层孔菌多糖II。

针层孔菌多糖II其纯度测定和分子量测定如实施例1。

实施例3：取针层孔菌子实体，粉碎，子实体粉末分别加10倍量、2倍量、5倍量、3倍量水煮沸提取4次，每次1.5小时，合并提取液，浓缩后加入5倍量90％乙醇，置于4℃冰箱内，静置过夜(约14小时)，以4500r/min的速度离心分离，沉淀在45℃低温干燥即得粗多糖。

取粗多糖，溶于pH值为4.0的醋酸-醋酸钠缓冲液中，4500r/min的速度离心，弃沉淀，离心液经0.45μm微孔滤膜过滤，滤液上离子交换柱，用pH值为4.0的醋酸-醋酸钠缓冲液洗脱2个柱体积，该洗脱液弃去或收集为抗肿瘤实验所用(分步收集器收集该洗脱液、浓缩、透析后，称为多糖I)。然后再用pH值为4.0的含2mol/l NaCl的醋酸-醋酸钠缓冲液洗脱，(可分步收集器收集，用于用苯酚硫酸法跟踪检测，用于体外肿瘤细胞抑制实验)该洗脱液经100MW透析袋透析除盐后浓缩，在60℃低温干燥，即得针层孔菌多糖II。

针层孔菌多糖II其纯度测定和分子量测定如实施例1。

实施例4.

对上述实施例1-3所制得的粗多糖和针层孔菌多糖I和多糖II的体外肿瘤细胞抑制作用进行了测定：

1、样品：粗多糖、针层孔菌多糖多糖I和多糖II

2、实验方法：样品对细胞株增殖的影响按ABD Serotec公司Alamar Blueassay给出的方法检测。处于对数生长期的癌细胞经0.25％胰酶处理后，离心收集，重新悬浮，用台盼蓝法计数，配成5×10⁴个/ml的细胞悬液。然后，往96孔板各孔中加入180μl混匀的细胞悬液，24小时后，按比例在各孔中加入20μl用0.85％NaCl配制的样品溶液，使样品的最终浓度为50μg/ml、100μg/ml、250μg/ml、500μg/ml、1000μg/ml，每个浓度做三个重复，加培养基和20μl 0.85％NaCl的孔作为对照，1000μg/ml 5-Fu作为阳性对照。在37℃含5％CO₂的潮湿培养箱培养48h后，吸去各孔中溶液，每孔中加入200μl培养基和20μlAlamar Blue，培养6h，用酶标仪测定各孔在570nm和600nm的吸光度，然后根据Alamer Blue assay给出的公式计算各样品对肿瘤细胞株增殖的抑制率，并在加药前及加药后在倒置显微镜下观察细胞的生长状况及细胞形态。每个样品在同样条件下独立实验三次，每次实验采用EXCEL软件计算各组数据的变异系数CV，将其控制在5％～8％之间，以保证实验的可重复性。对三次实验计算出的抑制率采用SPSS 10.0 for Windows软件分析。

3、实验结果：

3.1、取粗多糖，按实验设计最高浓度的10倍(10mg/ml)配置母液，经0.22μm微孔滤膜过滤除菌，进行体外肿瘤细胞抑制实验，发现其抑制作用在50μg/ml～1000μg/ml剂量范围内呈正相关量效关系，在最高浓度1000μg/ml时，粗多糖对Hela肿瘤细胞的抑制率为24.11％，对SF268肿瘤细胞的抑制率为37.62％，对NCI-H460肿瘤细胞的抑制率为36.25％，对MCF-7肿瘤细胞的抑制率为40.31％。(参见图1-9).

表1粗多糖样品对人肿瘤细胞的抑制作用

3.2、配制样品进行体外肿瘤细胞抑制实验，发现多糖I抗肿瘤作用弱，在1000μg/ml时对Hela肿瘤细胞的抑制率为0.32％，对SF268肿瘤细胞的抑制率为12.68％，对NCI-H460肿瘤细胞的抑制率为4.52％，对MCF-7肿瘤细胞的抑制率为4.99％。多糖II抗肿瘤作用强，其抑制作用在50μg/ml～1000μg/ml剂量范围内呈正相关量效关系。在250μg/ml时对Hela肿瘤细胞的抑制率为32.96％，对SF268肿瘤细胞的抑制率为38.65％，对NCI-H460肿瘤细胞的抑制率为53.83％，对MCF-7肿瘤细胞的抑制率为32.96％。在1000μg/ml时对Hela肿瘤细胞的抑制率为40.23％，对SF268肿瘤细胞的抑制率为39.97％，对NCI-H460肿瘤细胞的抑制率为52.00％，对MCF-7肿瘤细胞的抑制率为40.54％。(如图2和图3)

表2多糖1对人肿瘤细胞的抑制作用

表3多糖2对人肿瘤细胞的抑制作用