一种在自动化核酸提取工作站上进行基因组提取的试剂盒及方法

摘要

一种在自动化核酸提取工作站上进行基因组提取的试剂盒及方法，试剂盒包括：裂解缓冲液；胍盐缓冲液；磁珠；洗脱液。方法包括：以裂解液对生物组织或细胞进行裂解，用试剂盒中的磁珠进行DNA的吸附，并利用洗涤液去除杂质，最后以洗脱液回收DNA，完成DNA的提取。所提取的DNA可以进行常规PCR，荧光定量PCR，Genotyping，STR等多种后续处理操作。本发明的优点为：所用的试剂具有样品适用性广，易于操作，整个处理过程不需要进行离心处理，有助于后续操作的进行。可以配合自动化核酸提取工作站进行有效的DNA提取，并且可以用于手工操作提取基因。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是一种可以在自动化核酸提取工作站有效进行基因组DNA提取的试剂盒及方法。

背景技术

从生物组织或细胞中进行核酸提取现在是一项非常成熟的技术，其技术含量较低，多是重复性工作，而利用工作站进行核酸提取是一类新型技术，它是利用经过处理的磁珠可以在一定的溶液环境中有效的进行DNA吸附的原理，应用工作站进行基因组的DNA提取工作，其特点是工作效率高，可以同时进行96通道的提取工作，并且大大提高了提取工作的可重复性。目前在血站、农业和医院检验中心等行业已经广泛采用利用工作站法提取基因组，市场容量较大，但是目前只有二种CTAB和SBS法，可以配合自动化核酸提取工作站进行核酸提取的试剂，这些试剂都存在着通用性不好，操作步骤繁杂，价格较高等缺陷。本发明中提到的试剂具有样品适用性广，易于操作，整个过程不需要进行离心处理，有助于后续操作的进行等优点。

发明内容

本发明的目的在于提供一种在自动化核酸提取工作站上进行基因组提取的试剂盒及方法，该试剂具有样品适用性广，易于操作，整个过程不需要进行离心处理，有助于后续操作的进行等优点。

为实现上述目的，本实用新型采取以下设计方案：

这种在自动化核酸提取工作站上进行基因组提取的试剂盒，它包括以下组份：

(1)、裂解缓冲液：它含有异硫腈酸胍(4-8％)；盐酸胍(4-8％)；Tris·Cl(pH6.4)10mmol/L；TritonX-100(0.1％-0.5％)；Tween 20(0.1-0.3％)；十二脘基肌酸钠(1-3％)；

(2)、胍盐缓冲液：它含有异硫腈酸胍(4-8％)、盐酸胍(4-8％)；

(3)、磁珠；

(4)、洗脱液含Tris 100mmol/L(pH＝8)、EDTA10mmol/L(pH＝8)。

本试剂盒中，％均表示重量百分比。

一种利用权利要求1所述的试剂盒进行基因组提取的方法，它包括以下步骤：

(1)、利用裂解液对植物、动物或其他生物组织或细胞进行裂解；

(2)、利用试剂提取组织或细胞的基因(组)DNA；

(3)、对所提取的基因组DNA进行PCR扩增，检验。

所述的进行裂解的生物组织或细胞可以为血液样品，它包括血滤纸、全血、血清。

本发明所述的试剂盒可用于手工方法提取基因组。

附图说明

图1Yb8引物扩增产物1％琼脂糖凝胶电泳图

图2D13S317引物扩增产物1％琼脂糖凝胶电泳图

图1中，1、为阳性对照(K562 genomic DNA)，2、为血滤纸样品，3、为阴性对照(水)，4、为参照物DL2000(2000，1000，750，500，250，100)。

图2中1、为阳性对照(K562 genomic DNA)，2、为血滤纸样品，3、为阴性对照(水)，4、为参照物DL2000(2000，1000，750，500，250，100)。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明，而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人.分子克隆：实验室手册(New York：coldspring Harbor Laboratory)，Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

具体实施例1：

1)血滤纸直接水洗法实验步骤(建库)：

磁珠法实验步骤：

以血滤纸为样本，说明实施操作：

将样品处理为(0.5cm×0.5cm)的大小，分别加入样品板的孔内，并另备处理板和DNA搜集板各一块。

1)样品板加入90μL裂解液A(裂解液为含有异硫腈酸胍(6％)；盐酸胍(6％)；Tris·Cl(pH6.4)10mmol/L；TritonX-100(0.3％)；Tween 20(0.2％)；十二脘基肌酸钠(1％)；

2)样品板置68度加热器上加热30分钟

3)样品板补水40μL，600rpm振荡20秒

4)样品板置100度加热器上加热10分钟

5)样品板补水40μL，600rpm振荡20秒

6)样品板置100度加热器上加热10分钟

7)样品板补水40μL，600rpm振荡20秒

8)样品板置100度加热器上加热10分钟

9)样品板加入100μL胍盐缓冲液，600rpm振荡20秒，重复一次；

10)加入2倍体积胍盐缓冲液(异硫腈酸胍4％、盐酸胍4％)稀释混合磁珠，并在处理板上每孔加21μL磁珠悬液；

11)由样品板转移约130μL的裂解液到DNA处理板；

12)处理板760rpm振荡30秒，每10秒换向一次。静置2分钟，再次振荡。静置2分钟，第三次振荡；

13)处理板转移到磁铁上，静置30秒后吸出裂解液废弃；

14)处理板加入90μL 70％乙醇，800rpm振荡30秒，每10秒换向一次。

15)处理板转移到磁铁上，静置20秒后吸出裂解液废弃

16)处理板加入90μL 70％乙醇，800rpm振荡30秒，每10秒换向一次；

17)处理板转移到磁铁上，静置20秒后吸出裂解液废弃，处理板静置5分钟；

18)处理板中加入75μL水，1200rpm振荡30秒，每10秒换向一次；

19)处理板置68度加热器上加热10分钟；

20)处理板1000rpm振荡30秒，每10秒换向一次；

21)处理板置磁铁上，转移DNA搜集板；

22)由处理板转移30μL DNA溶液到DNA搜集板；

23)完成DNA提取实验

所述的磁珠购自江苏百维信公司(用于提取DNA的磁珠)

所提取的DNA进行常规PCR，荧光定量PCR，Genotyping，STR等多种后续处理操作或任何两种以上处理组合。

以4μl基因组DNA为模板进行PCR/Real-time PCR/STR检测。

处理后PCR步骤：

Primers  D13S317

D13S317-5： ACAGAAGTCTGGGATGTGGA

D13S317-3：GCCCAAAAAGACAGACAGAA

Genbank No.：G09017

Primers Yb8：

Genbank No.：AF015169.

Yb8-5：5’-CGA GGC GGG TGG ATC ATG AGG T-3’

Yb8-3：5’-TCT GTC GCC CAG GCC GGA CT-3’

realtime PCR system：

10X buffer          2μl

Mg²⁺(3mM)           1.76μl

dNTP(2.5mM/each)    2μl

primers             0.25μM/each

SYBR(final density0.01％)，add ddH₂O to total 20μl volume.

94℃，5min；

94℃，15s，59℃，15s，72℃30s，80℃，6s，30cycle；

72℃，3min；

70-95℃，0.3℃，6s，melt curve.

实验结果见图1和图2。

序列表

<110>北京东胜创新生物科技有限公司

<120>一种在自动化核酸提取工作站上进行基因组提取的试剂盒及方法

<130>

<160>4

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>20

<212>DNA

<213>人工合成

<400>1

 acagaagtct gggatgtgga      20

<210>2

<211>20

<212>DNA

<213>人工合成

<400>2

 gcccaaaaag acagacagaa      20

<210>3

<211>22

<212>DNA

<213>人工合成

<400>3

cgaggcgggt ggatcatgag gt    22

<210>4

<211>20

<212>DNA

<213>人工合成

<400>4

tctgtcgccc aggccggact       20