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法律状态
2020-08-04
专利权的转移 IPC(主分类):G01N33/68 登记生效日:20200715 变更前: 变更后: 申请日:20070514
专利申请权、专利权的转移
2012-12-19
授权
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2009-01-14
实质审查的生效
实质审查的生效
2008-11-19
公开
公开
技术领域
本发明属于细胞生物学领域，具体涉及经典Wnt信号转导途径中的相互作用蛋白及其用途。
背景技术
经典Wnt信号转导途径调节控制了许多生命过程，这些过程包括生物体的生长、发育、疾病、衰老与死亡等等；也包括细胞形态与功能的分化与维持、免疫、应激、细胞癌变与细胞凋亡等等。Wnt信号转导途径在不同物种之间具有高度的保守性，通过对果蝇、爪蟾、小鼠等模式生物的研究，已经大体确立了经典Wnt信号转导途径的分子框架。发育过程中，特定的时间和特定的环境诱导下，某些组织或细胞群体分泌Wnt蛋白，结合受体卷曲蛋白(Frizzled)家族成员，和共受体低密度脂蛋白LRP5/6，将信号传递至细胞内。在没有Wnt信号刺激时，这条信号转导途径的关键分子β-连环蛋白(β-catenin)参与由Axin，结肠癌抑制因子(APC)，糖原合酶激酶3β(GSK3β)，酪蛋白激酶1(CK1)，以及β-TrCP蛋白形成的巨大的蛋白质复合物，在GSK3β和CK1作用下受到磷酸化标记，进而在β-TrCP蛋白介导的泛素化修饰后被蛋白酶体降解。在Wnt信号刺激下，胞内的Dishevelled(Dvl)和Frat等Wnt途径的正向调节分子打散Axin、APC和GSK3等形成的降解复合物，Axin被LRP带上膜进而降解。β-连环蛋白磷酸化水平降低，进而可以在细胞质中大量积累。部分β-连环蛋白进入细胞核，与核内的含有HMG-Box的转录因子-淋巴细胞增强因子1/T细胞转录因子(LEF1/TCF)家族的蛋白(如TCF-4)相互作用，启动下游靶基因的开放(GumbinerBM.1998.van Noort M.& Clevers H.2002.Wodarz A.& Nusse R.1998.)。
Wnt信号转导途径不仅影响胚胎发育中的体轴诱导、胚层建立、体节分化、组织或器官形成等一系列重要的早期事件，参与体细胞的分化和极化；而且在成体中Wnt信号途径的异常活化已经证明与多种肿瘤的发生密切相关。研究发现，大约90％的结肠癌都是由于Wnt信号转导途径的激活性突变而引起的，此外Wnt信号途径的异常活化还与一系列的肿瘤发生有关，比如小肠腺瘤、肝癌、胃癌、食道腺癌、恶性黑色素瘤、乳腺癌(Giles RH，van Es JH，Clevers H.2003)中均发现了Wnt信号异常或者是转导途径中信号分子的突变。因此对Wnt信号转导途径的分子机制的研究和理解，对于探索肿瘤治疗药物、寻找新的药物靶点和理论依据具有重要意义。
经典Wnt信号转导途径的生物学功能主要是通过下游靶基因的表达而得以实现。而很多靶基因比如c-myc、cyclinD1，在细胞增殖中起到重要作用。研究表明，在很多癌症细胞里可以检测到β-连环蛋白在细胞核中的大量积累以及c-myc、cyclinD1的高表达，说明这些肿瘤细胞中Wnt信号转导途径下游的转录复合物处于高转录活性状态。因为转录复合物的活性高低直接关系到Wnt信号效应，那么对转录复合物的分子调控机制的研究，也就具有十分重要的意义。
综上，尽管目前本领域对于经典Wnt信号途径的分子机制有所了解，然而对于该途径的异常活化的启动等环节仍然不清楚。因此，本领域需要进一步对Wnt信号途径中一些关键影响因素加以研究，以期找到可调节Wnt信号转导途径的物质，从而调控Wnt信号转导相关的细胞事件。
发明内容
本发明的目的在于提供一种筛选调节蓬乱蛋白与β-连环蛋白相互作用的调节剂的方法。
本发明的另一目的在于提供一种蓬乱蛋白的活性片段，其可用于制备调节(特别是抑制)蓬乱蛋白和β-连环蛋白相互作用的调节剂(特别是抑制剂)，或用于筛选调节蓬乱蛋白和β-连环蛋白相互作用的调节剂。
在本发明的第一方面，提供一种筛选调节蓬乱蛋白(Dishevelled，Dvl)与β-连环蛋白(β-catenin，β-cat)相互作用的调节剂的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)将候选物质与蓬乱蛋白和β-连环蛋白相互作用的体系接触；和
(b)检测候选物质对蓬乱蛋白和β-连环蛋白之间相互作用的影响；
其中，若所述候选物质可抑制或促进蓬乱蛋白和β-连环蛋白之间的相互作用，则表明该候选物质是调节蓬乱蛋白和β-连环蛋白相互作用的调节剂。
在本发明的另一优选例中，所述的相互作用是蓬乱蛋白和β-连环蛋白发生结合。
在本发明的另一优选例中，所述的蓬乱蛋白选自：蓬乱蛋白1(Dvl 1)、蓬乱蛋白2(Dvl 2)或蓬乱蛋白3(Dvl 3)。
在本发明的另一优选例中，步骤(a)包括：向蓬乱蛋白和β-连环蛋白相互作用的体系中添加候选物质；和
步骤(b)包括：检测蓬乱蛋白和β-连环蛋白相互作用情况，并与对照组比较，其中所述的对照组是不添加所述候选物质的、蓬乱蛋白和β-连环蛋白相互作用的体系；
若测试组中蓬乱蛋白和β-连环蛋白相互作用在统计学上低于(优选显著低于，如低20％；更优选的低40％)对照组，就表明该候选物质是抑制蓬乱蛋白和β-连环蛋白相互作用的调节剂；
若测试组中蓬乱蛋白和β-连环蛋白相互作用在统计学上高于(优选显著低于，如高20％；更优选的高40％)对照组，就表明该候选物质是促进蓬乱蛋白和β-连环蛋白相互作用的调节剂。
在本发明的另一优选例中，所述体系选自：溶液体系、细胞体系、或组织体系。
在本发明的另一优选例中，所述体系中还包含Wnt蛋白。
在本发明的另一优选例中，所述的Wnt蛋白包括但不限于：Wnt1蛋白、Wnt3a蛋白或Wnt8蛋白。
在本发明的另一优选例中，所述方法还包括：对于筛选出的调节剂，进一步测试其对于Wnt信号途径下游基因的影响；如果其可上调Wnt信号途径下游基因的表达，则表明该调节剂是促进蓬乱蛋白和β-连环蛋白之间的相互作用的促进剂；如果其可下调Wnt信号途径下游基因的表达，则表明该调节剂是抑制蓬乱蛋白和β-连环蛋白之间的相互作用的抑制剂。
在本发明的另一优选例中，Wnt信号途径下游基因例如(但不限于)：哺乳细胞中的c-myc基因、cyclinD1基因、Axin2基因、LEF1基因、PPARdelta基因；或鱼类(如斑马鱼)细胞中的vox基因、tbx6基因。
在本发明的另一优选例中，所述的Wnt信号途径下游基因异常活化(如上调)导致肿瘤(如结肠癌)的发生。
在本发明的第二方面，提供一种通过所述的方法获得的调节蓬乱蛋白与β-连环蛋白相互作用的调节剂。
在本发明的另一优选例中，所述的调节剂是抑制剂，通过抑制蓬乱蛋白与β-连环蛋白的相互作用，从而抑制Wnt信号途径下游基因异常活化。
在本发明的另一优选例中，所述的调节剂是抑制剂，所述的抑制剂为一种多肽，含有SEQ ID NO：5中496～695位氨基酸序列。
在本发明的另一优选例中，该多肽还含有核定位信号蛋白(NLS)的氨基酸序列。
在本发明的另一优选例中，所述的核定位信号蛋白的氨基酸序列位于所述多肽的C末端。
在本发明的另一优选例中，所述的调节剂是一种核酸分子或其转录本(mRNA)，所述核酸分子含有SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列。
在本发明的第三方面，提供一种蓬乱蛋白的用途，用于筛选调节蓬乱蛋白与β-连环蛋白相互作用的调节剂。
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
图1显示了正常组织和结肠癌样本中Dvl3的分布情况。由图显示在结肠癌样本的细胞核里有大量Dvl3积累，而在正常细胞中Dvl3在细胞质和细胞核都有分布，且胞质中的量远高于核内。其中，右上角放大图中箭头所示位置为细胞核。
图2A显示了β-cat本身不能通过与抗Flag抗体结合免疫沉淀得到，只有在转染了Dvl3-NLS-Flag的情况下内源的β-cat才能在免疫沉淀样品中检测到。
图2B显示了在体外Pull Down实验中用抗myc抗体免疫沉淀His-β-cat-myc可以共沉淀到His-Dvl3。
图2C显示了只有在Wnt3a刺激的条件下Dvl3才能共沉淀到内源的β-cat。
图3A显示了用抗myc抗体免疫沉淀His-β-cat-myc时能够共沉淀到His-C-flag。
图3B显示了在共转染了C-NLS-Flag的情况下，用抗HA抗体免疫沉淀Dvl1-NLS-HA不能共沉淀到β-cat-myc。
图3C显示了Dvl 1-C-NLS能够有效地抑制Wnt3a激活的Topflash活性。
图3D显示了在SW480细胞中，Dvl 1-C-NLS对Topflash活性的抑制是剂量依赖的，其中，“+”表示含100ng Dvl-C-NLS，“++”表示含200ngDvl-C-NLS。
图3E显示了在Wnt3a刺激下，β-cat和TCF-4能够结合到Wnt信号下游靶基因c-myc启动子上，在转染Dvl 1-C-NLS片段的细胞中，β-cat结合到下游靶基因c-myc启动子上的能力显著地降低，而TCF-4基本不受影响。
图4A显示了注射Dvl 1-C-NLS的mRNA的胚胎中vox和tbx6的表达明显地较对照组胚胎下降。
图4B显示了注射Dvl-C-NLS的mRNA后，tbx6和vox表达正常以及明显下调的胚胎的统计情况。对99个胚胎统计后有51％的胚胎中tbx6的表达有明显下调，对83个胚胎统计后有59％的胚胎对vox的表达有明显下调(n＝71，83，89，99分别表示统计的胚胎数目)。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，首次发现在经典Wnt信号转导途径中，蓬乱蛋白(Dvl)可与β-连环蛋白(β-cat)在Wnt激活的条件下可发生相互作用，从而促进β-cat的积累及Wnt下游的信号转导途径的异常激活。由于Wnt下游的信号转导的异常激活与肿瘤的发生发展密切相关，因此依据该新发现的Dvl和β-cat之间的相互作用机制，可提供通过抑制Wnt下游的信号转导从而实现抑制肿瘤发生的新的药物靶点。在此基础上完成了本发明。
蓬乱蛋白及其活性片段
目前发现的蓬乱蛋白(Dvl)家族成员有三种，即Dvl1、Dvl2、Dvl3，这三种蛋白具有较高的同源性。在以往的研究中，Dvl蛋白最初被作为一个细胞质蛋白参与经典Wnt信号的传递，它的主要功能是在细胞质中接受Wnt信号促使β-cat在细胞质中积累从而能够大量进入细胞核中启动下游靶基因的转录。近来，本领域人员发现Dvl蛋白不仅在细胞质中转导Wnt信号，而且在细胞核中也具有重要的作用，但对其作用机制尚不了解。然而，本发明人经过长期研究，对此作用机制有了进一步的揭示。
在本发明中，所用的Dvl蛋白可以是天然存在的，比如其可被纯化和分离自哺乳动物。优选的，所述天然存在的Dvl 1蛋白的氨基酸序列可以与SEQ IDNO：2所示的氨基酸序列基本上相同；Dvl 2蛋白的氨基酸序列可以与SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列基本上相同；Dvl 3蛋白的氨基酸序列可以与SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列基本上相同。此外，所述的Dvl蛋白也可以是重组制备的，比如可以根据常规的基因重组技术来生产重组的Dvl蛋白。优选的，本发明采用重组的Dvl蛋白。此外，任何不影响Dvl蛋白的生物活性的变化形式都可用于本发明中，例如Dvl蛋白的活性片段、衍生物，只要其也具有与β-cat相互作用的功能，且不会带来其它不良影响，如可以是含有Dvl蛋白第496～695位氨基酸的蛋白片段。
本发明还提供了一种由Dvl 1蛋白第496～695位氨基酸组成的多肽，本发明人将之命名为Dvl 1-C多肽(片段)，该多肽具有SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列。
所述的Dvl 1-C多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽，优选合成片段。所述的Dvl 1-C多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。此外，任何不影响Dvl 1-C多肽的生物活性的变化形式都可用于本发明中，例如Dvl 1-C多肽的活性片段、衍生物或经过一个或多个氨基酸(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)缺失、插入和/或取代形成的变异体，只要其也具有与β-cat相互作用的功能。
本发明还提供了Dvl 1-C多肽的编码基因。所述的编码基因可以是单链的或是双链的。
优选的，为了使得Dvl 1-C被定位到细胞核中，可将Dvl 1-C与核定位信号(入核信号)相连接；更优选的，可在Dvl 1-C的C末端添加核定位信号。因此，本发明还提供了一种Dvl 1-C-NLS蛋白，其能够与β-cat蛋白相互作用。在细胞内，所述的Dvl 1-C-NLS被定位到细胞核中，通过与β-cat蛋白竞争结合，抑制细胞核内Dvl与β-cat的相互作用。
所述的核定位信号是一种信号肽，其可帮助蛋白进入细胞核。本发明可采用任何不影响Dvl 1-C与β-cat蛋白相互作用的核定位信号。例如，所述的核定位信号具有氨基酸序列如下：DPKKKRKV DPKKKRKV DPKKKRKV(SEQ ID NO：7)。
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法或人工合成法来大批量地获得有关序列。重组法通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
β-连环蛋白及其活性片段
β-连环蛋白(β-cat)是一种多功能胞内蛋白，不仅参与细胞与细胞间的黏附，而且能介导Wnt信号的胞内转导。本发明人发现，Dvl蛋白可与β-cat蛋白发生相互作用。
在本发明中，所用的β-cat蛋白可以是天然存在的，比如其可被纯化和分离自哺乳动物。优选的，所述天然存在的β-cat蛋白的氨基酸序列可以与SEQ IDNO：1所示的氨基酸序列基本上相同。此外，所述的β-cat蛋白也可以是重组制备的，比如可以根据常规的基因重组技术来生产重组的β-cat蛋白。优选的，本发明采用重组的β-cat蛋白。
此外，任何不影响β-cat蛋白的生物活性的变化形式都可用于本发明中，例如β-cat蛋白的生物活性片段、衍生物，只要其也具有与Dvl蛋白相互作用的功能，并且不会带来其它不良影响。
应用及筛选方法
在研究过程中，本发明人通过体外结合实验、体内外、内源结合实验证实了Dvl和β-cat之间存在相互作用，并分别在真核细胞和模式生物斑马鱼中进行各种功能分析实验，阐明了Dvl蛋白与β-cat蛋白之间存在相互作用，并且所述的相互作用对于经典Wnt信号转导途径产生了影响，抑制所述的相互作用可抑制经典Wnt信号转导途径下游的基因转录。
首先，本发明人利用免疫组化技术检测结肠癌组织以及正常组织中Dvl3的分布情况。结果发现，在很多结肠癌样本中Dvl3在细胞核里有大量的积累，而在正常的组织细胞中Dvl在细胞质和细胞核都有分布，而胞质中的量远高于核内。因此，可见，在肿瘤组织中Dvl蛋白可在细胞核中大量积累。
接着，本发明人利用免疫沉淀技术，分析了Dvl和β-cat蛋白在细胞核中的相互作用情况。结果发现，β-cat本身不能通过与Flag抗体结合免疫沉淀得到，只有在转染了Dvl3-NLS-Flag的情况下内源的β-cat才能在免疫沉淀样品中检测到，这提示Dvl在细胞内可以和β-cat发生蛋白质相互作用。进一步的体外Pull Down实验证明，用myc抗体免疫沉淀His-β-cat-myc可以共沉淀到His-Dvl3，这说明Dvl和β-cat之间蛋白质相互作用是直接的。并且，Dvl和β-catenin在体内存在蛋白质相互作用受到Wnt信号的调节。
进一步地，本发明人通过构建Dvl缺失突变体，深入研究了Dvl和β-cat之间的相互作用在经典Wnt信号转导途径中的功能。通过体外结合发现His-C-flag和His-β-cat-myc之间存在直接相互作用。进一步在HEK293T中共转染含有入核信号的C-NLS-Flag、Dvl1-NLS-HA和β-catenin-myc质粒，竞争结合实验发现C-NLS-Flag能够阻断Dvl和β-catenin之间的相互作用。
本发明人还将带有入核信号(NLS)的C片段分别转染入HEK293T细胞中，通过Topflash报告基因的活性来检测它们对转录复合物的转录活性的影响。结果证实，Dvl-C-NLS片段是在核里β-cat的下游发挥作用的，通过阻断Dvl和β-catenin的相互作用来抑制Wnt3a激活的转录活性。
本发明人还利用核染色质免疫沉淀的方法(Chip)来研究Dvl与β-cat之间的相互作用对Wnt3a激活前后转录复合物形成的影响。结果表明，Dvl与β-catenin之间的相互作用对于Wnt3a诱导的转录复合物的形成是必需的。
本发明人还利用模式生物斑马鱼来检测Dvl和β-catenin之间的相互作用在生物体中的功能。在斑马鱼胚胎一至四细胞的时期注射Dvl-C-NLS的mRNA，分别在胚胎发育的二个时期：动物极细胞包被40％和胚盾时期收获胚胎，利用原位杂交的技术来检测Wnt信号途径下游基因vox和tbx6的表达。结果发现，注射Dvl-C-NLS的mRNA的胚胎中vox和tbx6的表达明显地较对照组胚胎下降。这一结果表明，Dvl和β-cat之间的相互作用在斑马鱼的发育过程中的功能。
基于本发明人的新发现，对Dvl蛋白或其活性片段与β-cat蛋白或其活性片段相互作用的研究有着多方面的用途，所述的用途包括(但不限于)：筛选抑制Dvl蛋白或其活性片段与β-cat蛋白或其活性片段相互作用的物质，从而抑制经典Wnt信号转导途径的异常激活，以防治由于经典Wnt信号转导途径的异常激活导致的疾病，如肿瘤。
因此，本发明提供了一种筛选调节Dvl蛋白与β-cat蛋白相互作用的调节剂方法，通过向Dvl蛋白与β-cat蛋白相互作用的反应体系中添加待筛选的候选物，并观察Dvl蛋白与β-cat蛋白的相互作用情况来进行筛选。所述方法包括以下步骤：
(a)将候选物质与Dvl蛋白与β-cat蛋白相互作用的体系接触；和
(b)检测候选物质对Dvl蛋白与β-cat蛋白相互作用的影响；
其中，若所述候选物质可抑制或促进Dvl蛋白与β-cat蛋白相互作用，则表明该候选物质是调节Dvl蛋白与β-cat蛋白相互作用的调节剂。
更优选的，步骤(a)包括：在Dvl蛋白与β-cat蛋白相互作用的体系中添加候选物质；和步骤(b)包括：检测Dvl蛋白与β-cat蛋白相互作用情况，并与对照组比较，其中所述的对照组是不添加所述候选物质的、Dvl蛋白与β-cat蛋白相互作用的体系。
作为筛选的条件，若测试组中Dvl蛋白与β-cat蛋白相互作用在统计学上低于(优选显著低于，如低20％；更优选的低40％)对照组，就表明该候选物质是抑制Dvl蛋白与β-cat蛋白相互作用的调节剂；若测试组中Dvl蛋白与β-cat蛋白相互作用在统计学上高于(优选显著低于，如高20％；更优选的高40％)对照组，就表明该候选物质是促进Dvl蛋白与β-cat蛋白相互作用的调节剂。
如本文所用，所述的“蓬乱蛋白和(或“与”)β-连环蛋白相互作用的体系”指一种体系，其中含有蓬乱蛋白和β-连环蛋白，并且蓬乱蛋白和β-连环蛋白可发生相互作用(如相互结合)。
在本发明中，所述的体系选自(但不限于)：溶液体系、细胞体系、亚细胞体系、组织体系、器官体系、或动物体系。
作为本发明的优选方式，所述体系中还包含：Wnt家族蛋白。例如，所述的Wnt家族蛋白包括(但不限于)：Wnt1、Wnt3a、Wnt8。
调节蓬乱蛋白与β-连环蛋白相互作用的物质及其组合物
通过上述方法初步筛选出的调节剂可构成一个筛选库，以便于人们最终可以从中筛选出能够对于调节Wnt信号途径有用的药物。
本发明还提供了一种通过所述的方法筛选获得的调节Dvl蛋白与β-cat蛋白相互作用的物质。例如，所述物质是抑制Dvl蛋白与β-cat蛋白相互作用的物质，如抑制剂、拮抗剂、阻滞剂；或者，所述物质是促进Dvl蛋白与β-cat蛋白相互作用的物质，如促进剂、激动剂。通常，抑制Dvl蛋白与β-cat蛋白相互作用的物质可抑制Wnt信号途径的异常激活，从而可防治Wnt信号途径的异常激活导致的疾病，因此，Dvl蛋白与β-cat蛋白相互作用的抑制剂、拮抗剂、阻滞剂是尤其有用的。
此外，针对本发明发现的Dvl蛋白与β-cat蛋白之间的相互作用特性，还可设计一些通过竞争结合或抑制其中一种蛋白而阻止Dvl蛋白与β-cat蛋白结合的物质。除了作为本发明的一种优选方式，提供了一种基于Dvl 1设计的可通过竞争性结合β-cat蛋白来阻止胞内Dvl蛋白与β-cat蛋白相互作用的物质，即Dvl 1-C多肽。更优选的，将Dvl 1-C多肽与核定位信号(NLS)相连接，从而其在被导入细胞后，可直接被定位到细胞核中，在细胞核中阻止Dvl蛋白与β-cat蛋白的相互作用。
所述的Dvl蛋白与β-cat蛋白相互作用的调节剂，可以施用于个体，用于调节细胞内Wnt信号途径的活性。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中βH通常约为5-8，较佳地βH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：肌内、静脉内、或皮下给药。
本发明还提供了一种组合物(如药物组合物)，它含有安全有效量的(a)Dvl蛋白与β-cat蛋白相互作用的调节剂，以及(b)药学上可接受的载体或赋形剂。所述的Dvl蛋白与β-cat蛋白相互作用的调节剂优选一种抑制剂，如Dvl 1-C多肽。
目前，已知DNA序列，将该目的DNA序列引入到各种已知DNA分子(如载体)和细胞中是本领域中的常规技术，一般人员只要根据本发明的提示，都可以方便的进行操作。此外，将各种形式的突变引入到各种DNA分子中也是本领域熟知的技术。本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。
用重组DNA转化宿主细胞也是本领域技术人员熟知的常规技术。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。可供选择的是用Mg Cl2。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。获得的转化子可以用常规方法培养，表达目的多肽。
在本发明中，检测蛋白与蛋白之间相互作用以及相互作用的强弱可采用多种本领域技术人员熟知的技术，比如GST沉降技术、噬菌体展示技术、酵母双杂交系统或免疫共沉淀技术。
在本发明的一种优选方式中，采用免疫沉淀技术来验证蛋白与蛋白之间的特异性相互作用。所述的免疫共沉淀技术的原理是：在保持蛋白-蛋白相互作用的条件下，收获和裂解细胞，从细胞提取液中特异性地免疫沉淀目的蛋白，然后通过电泳等方法分离免疫沉淀物。具有已知特性的蛋白的共沉淀，可采用抗该蛋白的抗体，通过比如Western印迹来检测。此外，如果细胞在裂解前已经用标记物进行过标记，则可通过放射自显影或其它免疫学技术来观察共沉淀的蛋白。
本发明的主要优点在于：
(1)首次揭示在经典Wnt信号转导途径中，Dvl蛋白可与β-cat蛋白在Wnt激活的条件下可发生相互作用，从而促进β-cat的积累及Wnt下游的信号转导途径的异常激活。
(2)由于已知Wnt途径下游的信号转导的异常激活与肿瘤的发生发展密切相关，因此，依据本发明的新发现，可提供抑制Wnt下游的信号转导从而实现抑制肿瘤发生的新的药物靶点。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室指南(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
实施例1
Dvl蛋白质在结肠癌组织中定位到细胞核中
本发明人利用常规的免疫组化技术检测结肠癌组织芯片，组织芯片经过二甲苯脱腊、复水、抗原热修复、染色，然后进行显微成像检测(所采用的芯片来源于上海芯超生物科技有限公司，检测方法参照其所附的使用说明书)。
结果如图1所示，对比正常的组织细胞，在93例结肠癌样本中有30％左右的样本中发现Dvl3在细胞核里有大量的积累；而在正常细胞中Dvl3在细胞质和细胞核都有分布，且胞质中的量远高于核内。
实施例2
Dvl和β-cat相互作用
1.Dvl以及β-cat基因的获得
Dvl1基因的获得：
设计引物如下：正向：5’-CTAGTCTAGAGGCGGAGACCAAAATCA-3’(SEQID NO：9)，反向：5’-CTAGCTCGAGCATGATGTCCACAAAGAA-3’(SEQ ID NO：10)。以常规方法制备的鼠cDNA库为模板，通过PCR反应得到含有全长Dvl1的序列。
Dvl3基因的获得：
设计引物如下：正向：5’-CTAGTCTAGAGGGCGAGACCAAGAT-3’(SEQIDNO：11)，反向：5’-CTAGCTCGAGCATCACATCCACAAAGA-3’(SEQ ID NO：12)。以常规方法制备的人cDNA库为模板，通过PCR反应得到含有全长Dvl3的序列。
β-cat基因的获得：
利用常规方法分别针对β-cat蛋白(序列见SEQ ID NO：1)编码基因的5’和3’末端设计正向和反向引物(在引物中添加XbaI/XhoI酶切位点)，利用所述引物、以常规方法制备的人cDNA库为模板，通过PCR反应得到含有全长β-cat的序列。
2.Dvl在细胞内可以和β-cat发生蛋白质相互作用
为了验证Dvl在细胞核中的功能，本发明人采用常规的方法在Dvl基因的后面引入了一个核定位信号，通过瞬时转染导入细胞，进行功能分析。
为了证实这一相互作用，本发明人首先构建了携带Dvl 3-NLS-Flag的载体pCMV/Dvl3-NLS-Flag，方法如下：利用引物退火后二端带有的XbaI/NotI酶切位点的粘端，将NLS的基因序列(序列为：5’-CTAGACTAGACCTAGCTCGAGGATCCAAAAAAGAAGAGAAAGGTAGATCCAAAAAAGAAGAGAAAGGTAGATCCAAAAAAGAAGAGAAAGGTAG-3’(SEQ ID NO：8))引入pCMV/Flag(购自Bioscience，自带Flag标签)中，形成pCMV/NLS-Flag；然后再利用XbaI/XhoI酶切Dvl3，将酶切产物克隆入经同样酶切的pCMV/NLS-Flag中，获得重组载体pCMV/Dvl3-NLS-Flag。
接着，在人的胚胎肾细胞HEK293T细胞(ATCC)中瞬时转染该外源的pCMV/Dvl3-NLS-Flag重组载体，转染后加Wnt3a(Wnt3a通过收获wnt3a/NIH3T3细胞的培养上清获得，wnt3a/NIH3T3细胞及其培养方法参见尹宗生，张辉等，《第四军医大学学报》，Vol.26，No.24，p2212-2215，2006)刺激细胞，收获细胞，用1×裂解缓冲液(NP401％，甘油10％，NaCl 0.135M，Tris-Cl PH8.0，PMSF 0.5M，PPi 1mM，NaF 10mM，Na3VO42mM)裂解细胞，离心(14,000rpm/10min)后取上清，加入抗Flag抗体(anti-Flag，购自Sigma)和protein A/G Plusagarose珠子，低温旋转3小时，离心(5000rpm/1min)收集珠子，通过Western印迹检测珠子上所带的蛋白(上述过程即Pull Down实验)。结果见图2A。
由图2A所示，β-cat本身不能通过与抗Flag抗体(anti-flag)结合免疫沉淀得到，只有在转染了Dvl3-NLS-Flag的情况下内源的β-cat才能在免疫沉淀样品中检测到。上述结果提示，Dvl在细胞内可以和β-cat发生蛋白质相互作用。
3.Dvl和β-连环蛋白之间蛋白质相互作用是直接的
为了确定Dvl和β-cat之间的蛋白质相互作用是否为直接作用，本发明人首先构建了含有His-Dvl3和His-β-cat-myc的重组载体。含有His-Dvl3的重组载体构建如下：以SalI/NotI酶切Dvl3，将酶切产物克隆入经过同样酶切的pET28c/Hi s(购自Novagen，自带His标签)中，获得重组载体pET28c/His-Dvl3。含有His-β-cat-myc的重组载体构建如下：在β-cat基因的C端连接常规使用的myc标签，形成β-cat-myc，然后通过常规的引物设计和PCR技术在β-cat-myc的末端设置Sal I/Not I酶切位点，克隆入经同样酶切的pET28c/His载体(购自Novagen，自带His标签)中，获得重组载体pET28c/His-β-cat-myc。
接着，利用大肠杆菌表达得到了His-Dvl3和His-β-cat-myc(β-cat-myc)。重组表达质粒pET28c/His-Dvl3和pET28c/His-β-cat-myc分别转化大肠杆菌BL21，接种单克隆菌落于LB培养液，37℃培养过夜；取上述过夜菌1∶100接种于新鲜的LB培养基中，22℃培养至A600为0.6～0.8，分别加入异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)达终浓度1μM，22℃培养16h。离心收集菌体，将菌体溶于含有0.5mg/ml溶菌酶的破菌缓冲液中，液氮冻融，反复三次，加入DNase I至终浓度为25mg/ml以及MgSO4至终浓度20mM，冰上消化至不粘，高速离心(16000rpm/20min)后取上清得到破菌抽提物，进行体外Pull Down实验(实验方法同前述)。
由图2B所示，在体外Pull Down实验中用抗myc抗体(购自Sigma)免疫沉淀His-β-cat-myc可以共沉淀到His-Dvl3，这说明Dvl和β-cat之间蛋白质相互作用是直接的。
4.Dvl和β-连环蛋白之间相互作用需要Wnt3a的刺激
为了进一步证实β-cat和Dvl在内源是否存在相互作用，本发明人分别收获Wnt3a刺激或不刺激的HEK293T细胞(非转染)，分离细胞核得到核组分上清，分别用IgG和抗Dvl3抗体(anti-Dvl3，购自Santz Cruz)免疫沉淀内源的Dvl3。
由图2C所示，只有在Wnt3a刺激的条件下Dvl3才能共沉淀到内源的β-cat。
综上，这些实验一致证明，Dvl和β-cat在体内存在蛋白质相互作用并且这种相互作用受到Wnt3a信号的调节。
实施例3
Dvl和β-连环蛋白之间的相互作用在经典Wnt信号转导途径的功能
本发明人通过常规的缺失突变技术对Dvl 1进行缺失突变，并验证各突变体与β-cat的相互作用情况。结果发现，Dvl 1上第496～695位氨基酸是与β-cat相互作用的片段(Dvl 1-C，简称C)。为了便于后续的克隆，通过常规的引物设计和PCR技术在Dvl 1-C基因片段的末端设置SalI/NotI(或XbaI/XhoI)酶切位点的序列；另一种情况下，在Dvl 1-C基因片段的C端连接常规使用的Flag(或myc)标签，形成Dvl1-C-flag(或Dvl1-C-myc)，然后在Dvl 1-C-flag(或myc)的末端设置SalI/NotI(或XbaI/XhoI)酶切位点。
首先，构建含有His-C-flag和His-β-cat-myc的重组载体。含有His-C-flag的重组载体构建如下：将C端带有Flag标签的Dvl 1-C-flag用SalI/NotI酶切，克隆入经同样酶切的pET28c/His载体中，获得重组载体pET28c/His-C-flag。含His-β-cat-myc的重组载体构建同上(即：pET28c/His-β-cat-myc)。
接着，将前述构建的重组载体分别转化入大肠杆菌BL21，在大肠杆菌BL21中分别表达得到His-C-flag蛋白和His-β-cat-myc(His-β-cat-myc)蛋白，通过体外结合发现His-C-flag和His-β-cat-myc之间存在直接相互作用，如图3A所示，用抗myc抗体(anti-myc)免疫沉淀His-β-cat-myc时能够共沉淀到His-C-flag。
进一步地，本发明人在HEK293T中共转染含有C-NLS-Flag、Dvl1-NLS-HA和β-cat-myc的质粒pCMV/C-NLS-Flag、pCMV/Dvl 1-NLS-HA和pCMV/β-cat-myc。其中，pCMV/C-NLS-Flag重组质粒的构建方法同前pCMV/Dvl3-NLS-Flag构建方法，以Dvl 1-C取代Dvl3。pCMV/Dvl1-NLS-HA重组质粒的构建方法同前pCMV/Dvl3-NLS-Flag构建方法类似，采用pCMV/HA(购自购自Bioscience，自带HA标签)取代pCMV/Flag，且以Dvl1取代Dvl3。pCMV/β-cat-myc重组质粒的构建方法如下：将β-cat基因用XbaI/XhoI酶切，克隆入经同样酶切的pCMV/myc载体(购自Bioscience，自带myc标签)中，获得重组载体pCMV/β-cat-myc。将前述制备的重组载体转染入HEK293T中，分别表达C-NLS-Flag、Dvl1-NLS-HA和β-cat-myc。通过竞争结合实验发现，C-NLS-Flag能够阻断Dvl和β-cat之间的相互作用。
如图3B所示，在共转染了C-NLS-Flag的情况下，用抗HA抗体(anti-HA，购自Sigma)免疫沉淀Dvl1-NLS-HA不能共沉淀到β-cat-myc。以上实验结果说明，Dvl 1上的片段C是负责和β-cat相互作用的片段。
为了进一步研究所述的相互作用在Wnt/β-cat信号途径中的作用，本发明人构建了带有入核信号(NLS)和Dvl 1-C片段的重组载体pCMV/C-NLS(将C-NLS用XbaI/XhoI酶切，克隆入经同样酶切的pCMV载体(购自Bioscience)中)，将该重组载体转染入HEK293T细胞中，通过Topflash报告基因的活性来检测它们对转录复合物的转录活性的影响。以常规的LacZ作为空白质粒对照，并且，Wnt3a为在HEK293T细胞的培养基中加入Wnt3a的情况，Ctr为不利用Wnt3a进行刺激、其它条件相同的情况。
由图3C所示，Dvl 1-C-NLS能够有效地抑制Wnt3a激活的Topflash活性。
此外，本发明人还将上述重组载体转染SW180细胞(购自ATCC，是APC蛋白功能缺失的结肠癌细胞株)，通过Topflash报告基因的活性来检测它们对转录复合物的转录活性的影响。Topflash报告基因来源于Upstate公司；报告基因的活性检测采用：Luciferase Reporter Gene Assay，High Sensitivity，来源于Roche公司，检测方法参见同时提供的使用说明书。
结果如图3D所示，在SW480细胞中，Dvl 1-C-NLS对Topflash活性的抑制是剂量依赖的(其中，“+”表示含100ng Dvl-C-NLS，“++”表示含300ngDvl-C-NLS)。该结果进一步证实了Dvl 1-C-NLS片段是在核里β-cat的下游发挥作用的，通过阻断Dvl和β-cat的相互作用来抑制Wnt3a激活的转录活性。
从以上的实验本发明人证明了Dvl和β-cat之间的相互作用对于Wnt3a激活的转录活性是必需的。进一步本发明人利用核染色质免疫沉淀的方法(ChIP)来研究Dvl与β-cat之间的相互作用对Wnt3a激活前后转录复合物形成的影响。HEK293T细胞加入Wnt3a刺激3小时，然后通过甲醛固定细胞，超声裂解细胞，预结合等步骤得到可用于免疫沉淀的上清，分别加入IgG抗体(购自sigma)、β-cat抗体(购自BD.Biotech)或TCF-4抗体(购自Upstate)和protein A/GPlus agarose珠子进行免疫沉淀，然后进行洗涤和洗脱得到可用于PCR扩增的样品，最后通过Agarose电泳检测。
结果如图3E所示，在Wnt3a刺激下，β-cat和TCF-4能够结合到Wnt信号下游靶基因c-myc启动子上，在转染Dvl 1-C-NLS片段的细胞中，β-cat结合到下游靶基因c-myc启动子上的能力显著地降低，而TCF-4基本不受影响。这表明Dvl与β-cat之间的相互作用对于Wnt3a诱导的转录复合物的形成是必需的。
最后本发明人利用模式生物斑马鱼来检测Dvl和β-cat之间的相互作用在生物体中的功能。
本发明人在斑马鱼胚胎一至四细胞的时期注射Dvl 1-C-NLS的mRNA。然后，分别在胚胎发育的二个时期：动物极细胞包被40％和胚盾时期(shield phage)收获胚胎，利用常规的原位杂交技术来检测Wnt信号途径下游基因vox和tbx6的表达。并且，以向斑马鱼胚胎细胞内注射绿色荧光蛋白(GFP)的mRNA来作为对照。
结果如图4所示，注射Dvl 1-C-NLS的mRNA的胚胎中vox和tbx6的表达明显地较对照组胚胎下降(图4A)，对99个胚胎统计后有51％的胚胎中tbx6的表达有明显下调，对83个胚胎统计后有59％的胚胎对vox的表达有明显下调(图4B)。这一结果表明了Dvl和β-cat之间的相互作用在斑马鱼的发育过程中的功能，它对于Wnt靶基因的启动子上β-cat/TCF-4的转录复合物的形成是必需的。
本发明人的上述研究揭示了细胞核内Dvl调节经典Wnt信号途径的分子机制，揭示了Dvl与β-cat之间的相互作用的重要性。并且发现，片段Dvl 1-C-NLS可抑制转录复合物的形成，从而抑制肿瘤发生，该发现为肿瘤药物的筛选提供了很好的筛选模型方案，为设计分子药物提供了作用的靶位点。
实施例4筛选抑制Dvl与β-cat之间相互作用的物质
如实施例2中“2”所述相同的方法，构建带有pET28c/His-Dvl3和pET28c/His-β-cat-myc的重组载体。
测试组：添加候选物且转染有pET28c/His-Dvl3和pET28c/His-β-cat-myc的大肠杆菌BL21细胞体系。
对照组：未添加候选物且转染有pET28c/His-Dvl3和pET28c/His-β-cat-myc的大肠杆菌BL21细胞体系。
采用如实施例2的Pull Down实验，检测测试组以及对照组中Dvl 3蛋白与β-cat蛋白相互作用情况。
如果与不添加候选物质的对照组相比较，添加候选物质后Dvl 3蛋白与β-cat蛋白的相互作用明显被抑制(如利用抗myc抗体免疫沉淀共转染His-β-cat-myc与His-Dvl3的体系无法共沉淀到His-Dvl3)，则说明该候选物质是抑制Dvl蛋白与β-cat蛋白之间相互作用的物质，因而是一种预期可影响Wnt信号转导途径的物质。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110>中国科学院上海生命科学研究院
<120>蓬乱蛋白和β-连环蛋白之间的相互作用在经典Wnt信号转导途径中的新功能
<130>071528
<160>12
<170>PatentIn version 3.3
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<212>PRT
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690 695 700
Arg Asp Leu Gly Ser Val Pro Pro Glu Leu Thr Ala Ser Arg Gln Ser
705 710 715 720
Phe His Met Ala Met Gly Asn Pro Ser Glu Phe Phe Val Asp Val Met
725 730 735
<210>4
<211>716
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>4
Met Gly Glu Thr Lys Ile Ile Tyr His Leu Asp Gly Gln Glu Thr Pro
1 5 10 15
Tyr Leu Val Lys Leu Pro Leu Pro Ala Glu Arg Val Thr Leu Ala Asp
20 25 30
Phe Lys Gly Val Leu Gln Arg Pro Ser Tyr Lys Phe Phe Phe Lys Ser
35 40 45
Met Asp Asp Asp Phe Gly Val Val Lys Glu Glu Ile Ser Asp Asp Asn
50 55 60
Ala Lys Leu Pro Cys Phe Asn Gly Arg Val Val Tyr Trp Leu Val Ser
65 70 75 80
Ala Glu Gly Ser His Pro Asp Pro Ala Pro Phe Cys Ala Asp Asn Pro
85 90 95
Ser Glu Leu Pro Pro Pro Met Glu Arg Thr Gly Gly Ile Gly Asp Ser
100 105 110
Arg Pro Pro Ser Phe His Pro His Ala Gly Gly Gly Ser Gln Glu Asn
115 120 125
Leu Asp Asn Asp Thr Glu Thr Asp Ser Leu Val Ser Ala Gln Arg Glu
130 135 140
Arg Pro Arg Arg Arg Asp Gly Pro Glu His Ala Thr Arg Leu Asn Gly
145 150 155 160
Thr Ala Lys Gly Glu Arg Arg Arg Glu Pro Gly Gly Tyr Asp Ser Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Met Ser Ser Glu Leu Glu Thr Thr Ser Phe Phe Asp Ser
180 185 190
Asp Glu Asp Asp Ser Thr Ser Arg Phe Ser Ser Ser Thr Glu Gln Ser
195 200 205
Ser Ala Ser Arg Leu Met Arg Arg His Lys Arg Arg Arg Arg Lys Gln
210 215 220
Lys Val Ser Arg Ile Glu Arg Ser Ser Ser Phe Ser Ser Ile Thr Asp
225 230 235 240
Ser Thr Met Ser Leu Asn Ile Ile Thr Val Thr Leu Asn Met Glu Lys
245 250 255
Tyr Asn Phe Leu Gly Ile Ser Ile Val Gly Gln Ser Asn Glu Arg Gly
260 265 270
Asp Gly Gly Ile Tyr Ile Gly Ser Ile Met Lys Gly Gly Ala Val Ala
275 280 285
Ala Asp Gly Arg Ile Glu Pro Gly Asp Met Leu Leu Gln Val Asn Glu
290 295 300
Ile Asn Phe Glu Asn Met Ser Asn Asp Asp Ala Val Arg Val Leu Arg
305 310 315 320
Glu Ile Val His Lys Pro Gly Pro Ile Thr Leu Thr Val Ala Lys Cys
325 330 335
Trp Asp Pro Ser Pro Arg Gly Cys Phe Thr Leu Pro Arg Ser Glu Pro
340 345 350
Ile Arg Pro Ile Asp Pro Ala Ala Trp Val Ser His Thr Ala Ala Met
355 360 365
Thr Gly Thr Phe Pro Ala Tyr Gly Met Ser Pro Ser Leu Ser Thr Ile
370 375 380
Thr Ser Thr Ser Ser Ser Ile Thr Ser Ser Ile Pro Asp Thr Glu Arg
385 390 395 400
Leu Asp Asp Phe His Leu Ser Ile His Ser Asp Met Ala Ala Ile Val
405 410 415
Lys Ala Met Ala Ser Pro Glu Ser Gly Leu Glu Val Arg Asp Arg Met
420 425 430
Trp Leu Lys Ile Thr Ile Pro Asn Ala Phe Ile Gly Ser Asp Val Val
435 440 445
Asp Trp Leu Tyr His Asn Val Glu Gly Phe Thr Asp Arg Arg Glu Ala
450 455 460
Arg Lys Tyr Ala Ser Asn Leu Leu Lys Ala Gly Phe Ile Arg His Thr
465 470 475 480
Val Asn Lys Ile Thr Phe Ser Glu Gln Cys Tyr Tyr Ile Phe Gly Asp
485 490 495
Leu Cys Gly Asn Met Ala Asn Leu Ser Leu His Asp His Asp Gly Ser
500 505 510
Ser Gly Ala Ser Asp Gln Asp Thr Leu Ala Pro Leu Pro His Pro Gly
515 520 525
Ala Ala Pro Trp Pro Met Ala Phe Pro Tyr Gln Tyr Pro Pro Pro Pro
530 535 540
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Gly Gly Gly Ser Ala Ser Ser Gln His Ser Glu Gly Ser Arg Ser Ser
565 570 575
Gly Ser Asn Arg Ser Gly Ser Asp Arg Arg Lys Glu Lys Asp Pro Lys
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Thr Arg Ser Ser Leu Arg Gly Pro Arg Glu Arg Ala Pro Ser Glu Arg
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Ser Gly Pro Ala Ala Ser Glu His Ser His Arg Ser His His Ser Leu
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Ala Ser Ser Leu Arg Ser His His Thr His Pro Ser Tyr Gly Pro Pro
645 650 655
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660 665 670
Pro Ala Ala Met Gly Pro Pro Gly Ala Pro Pro Gly Arg Asp Leu Ala
675 680 685
Ser Val Pro Pro Glu Leu Thr Ala Ser Arg Gln Ser Phe Arg Met Ala
690 695 700
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705 710 715
<210>5
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<212>PRT
<213>鼠(Mus musculus)
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20 25 30
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35 40 45
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50 55 60
Ser Ala Gly Ser Gln Gln Ser Glu Gly Ser Lys Ser Ser Gly Ser Thr
65 70 75 80
Arg Ser Ser His Arg Thr Pro Gly Arg Glu Glu Arg Arg Ala Thr Gly
85 90 95
Ala Gly Gly Ser Gly Ser Glu Ser Asp His Thr Val Pro Ser Gly Ser
100 105 110
Gly Ser Thr Gly Trp Trp Glu Arg Pro Val Ser Gln Leu Ser Arg Gly
115 120 125
Ser Ser Pro Arg Ser Gln Ala Ser Ala Val Ala Pro Gly Leu Pro Pro
130 135 140
Leu His Pro Leu Thr Lys Ala Tyr Ala Val Val Gly Gly Pro Pro Gly
145 150 155 160
Gly Pro Pro Val Arg Glu Leu Ala Ala Val Pro Pro Glu Leu Thr Gly
165 170 175
Ser Arg Gln Ser Phe Gln Lys Ala Met Gly Asn Pro Cys Glu Phe Phe
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Val Asp Ile
195
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<212>DNA
<213>鼠(Mus musculus)
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ctgtgcagta acctcgcatc cctgaacctc aacagtggct ccagtggagc ctcagatcag 60
gacacactgg ccccactgcc ccacccatca gtaccctggc ccttgggtca aggctacccc 120
taccagtacc caggaccccc gccctgcttc ccacctgctt accaggaccc tggcttcagc 180
tgcggcagcg gcagtgctgg gagccagcag agtgaaggga gcaagagcag tgggtccaca 240
cggagcagcc atcggacccc aggccgagag gagcgccggg caactggagc tgggggtagt 300
ggcagtgaat cagaccacac agtaccaagt gggtctggta gcaccggctg gtgggagcgg 360
cctgtcagcc agcttagccg tggcagtagc cctcgaagtc aggcttcagc tgttgcccca 420
gggctccccc cactgcaccc ccttacaaag gcctatgcag tagtgggtgg gccacctgga 480
gggccacctg tccgggagct ggctgctgtc cctccagaac ttacaggtag ccgccagtcc 540
ttccaaaagg ccatgggaaa cccctgtgag ttctttgtgg acatcatg 588
<210>7
<211>24
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>MISC_FEATURE
<223>核定位信号
<400>7
Asp Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Asp Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val
1 5 10 15
Asp Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val
20
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<223>核定位信号
<400>8
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agaaaggtag atccaaaaaa gaagagaaag gtag 94
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<212>DNA
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<220>
<221>misc_feature
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ctagtctaga ggcggagacc aaaatca 27
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
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<223>引物
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
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<223>引物
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<223>引物
<400>12
ctagctcgag catcacatcc acaaaga 27
机译： 调节患者lrp5，lrp6或hbm活性以及患者dkk-wnt途径，调节患者骨量和脂质水平，诊断高或低骨量和/或高或低脂质水平的方法筛选具有与dkk相互作用的蛋白质的，调节dkk与lrp5，lrp6，hbm或lrp5，lrp6或hbm和dkk的dkk结合片段的dkk相互作用的化合物，组成，药物组合物，鉴定可调节dkk和lrp5 / lrp6 / hbm相互作用，以及用于识别dkk蛋白的结合伴侣的方法，编码与dkk相互作用的肽蛋白适体的核酸，载体，用于检测转基因动物化合物调节活性的方法，用于识别可能调节dkk的化合物的方法活性，肽适体，抗体或抗体片段，以及通过调节dkk与wnt信号通路的相互作用来鉴定与dkk相互作用的蛋白质的方法，以鉴定可调节
机译： 抑制α-连环蛋白和β-连环蛋白之间相互作用的化合物和方法。
机译： 抑制α-连环蛋白和β-连环蛋白之间相互作用的化合物和方法
