连续发酵或半连续发酵生产丁二酸的方法

摘要

连续发酵或半连续发酵生产丁二酸的方法，属于生物工程技术领域。本发明提供琥珀酸放线杆菌(Actinobacillus succinogenes)在以甘蔗糖蜜、玉米淀粉糖浆、菊芋水解糖浆、甜高粱秸秆糖浆及纤维质木质原料水解糖浆等碳水化合物原料连续或半连续制备丁二酸方法中的应用。本发明的方法利用多级连续发酵或两级半连续发酵可以提高菌体浓度和细胞活力，可获得高的丁二酸产量和高的丁二酸生产强度；容易实现自动化、连续化操作；较分批发酵可节约反复洗罐、灭菌等非发酵时间，因而生产效率可以大大提高；利用半连续发酵生产丁二酸较连续发酵更容易控制发酵参数，糖利用率、目标产物产率和目标产物产量高，设备及操作简单易行，适合工业化生产。

说明书

技术领域

一种连续发酵或半连续发酵生产丁二酸的方法，本发明属于生物工程技术领域。具体地，本发明涉及用连续发酵或半连续发酵方法在琥珀酸放线杆菌(Actinobacillus succinogenes)CGMCC1593发酵甘蔗糖蜜、玉米淀粉糖浆、菊芋水解糖浆、甜高粱秸秆糖浆及纤维质木质原料水解糖浆等碳水化合物原料制备丁二酸过程中的应用。

背景技术

丁二酸(succinic acid)，又称琥珀酸，是工业上一种重要的四碳化合物，它作为有机合成原材料、中间产物或专业化学制品广泛应用在食品、医药、农药、染料、香料、油漆、塑料和材料工业。其最大的潜在市场是用于制造生物可降解塑料等领域。

目前已开发出多项技术将丁二酸转化为重要的工业化学品，包括N-甲基吡咯烷酮、1，4-丁二醇、四氢呋喃、γ-丁内酯、己二酸、PBT树脂、PBS可降解塑料等。其中许多化工产品目前都是以石油或煤化工产品(如苯、丁烷等)为原料合成的，资源紧缺，不可再生。现报道大约有250种以苯或丁烷等为原料的化工产品可以通过丁二酸为原料来生产。因此，全球对丁二酸的需求不断增加。

工业上丁二酸的生产方法主要为化学方法。目前，国内外主要使用的是催化加氢法。以化学方法获得丁二酸，不可避免地要消耗大量不可再生的化石原料，还具有转化率低，易污染环境等弊端。

丁二酸的生产可通过发酵方法来进行。由于发酵法生产丁二酸是以可再生糖源(如葡萄糖、木糖等)和二氧化碳作为主要原料，因此微生物发酵法生产丁二酸，具有成本低和摆脱对石化原料依赖的优点，而且提供了温室气体二氧化碳利用的新途径，被认为是一个新兴的、很有发展潜力的绿色工艺，成为近年来国内外的研究热点。

目前发酵法生产丁二酸的研究方法主要以分批发酵和补料分批发酵为主(Appl Microbiol Biotechnol，65：664-670，2004；Enzyme Microb Technol，35：648-653，2004；Bioresour Technol，99(6)：1736-1742，2008)，也有一些连续发酵生产丁二酸方法的研究，连续发酵生产强度较分批发酵高，但是丁二酸产量、糖的利用率以及对消耗糖丁二酸产率均较低，如Lee P C等人用Anaerobiospirillum succiniciproducens以乳清(Appl Microbiol Biotechnol，54：23-27，2000)为原料进行连续发酵，丁二酸最高产量12.27g/L(稀释率为0.11h^-1，丁二酸生产强度1.35g/(L·h)，丁二酸产率为61.4％)；用Mannheimiasucciniciproducens MBEL55E以木材水解液为原料进行连续发酵，丁二酸产量7.97g/L(稀释率为0.3h^-1，丁二酸生产强度3.19g/(L·h)，丁二酸产率为55％，糖利用率为57％)。美国Datta Rathin等人公开了两级罐连续发酵生产丁二酸工艺的专利(United States Patent，5168055，1992)，丁二酸产量为23.1g/L，(稀释率为0.087h^-1，两级罐丁二酸平均生产强度2.0g/(L·h)，丁二酸产率为84.9％，糖利用率为58.8％)。中国潘丽军等公开了一种琥珀酸的固定化细胞单罐高强度连续发酵工艺(CN101153294A，2008)，称用海藻酸钠和氯化钙包埋方法固定的Actinobacillus succinogenes ATCC55618细胞，在含有葡萄糖、酵母浸粉和磷酸盐等组分的培养基中进行单罐反复发酵，“连续”发酵10个批次，生产强度3.10g/(L·h)。但这截留固定化细胞的反复(批式)发酵不是真正含义上的连续发酵。

本发明人用肉牛瘤胃中筛选的琥珀酸放线杆菌Actinobacillus succinogenesCGMCC1593进行分批发酵或补料分批发酵，发酵的原料包括多种农副产品如木薯、甘薯、玉米等淀粉质水解糖浆(中国专利申请号200610038113.6)，甜菜、甘蔗糖蜜(中国专利申请号200710019686.9)，菊芋水解糖浆(中国专利申请号200710019686.9)，以及秸秆、木材工业下脚料、制糖造纸业下脚料和城市纤维垃圾等木质纤维物的水解糖浆(中国专利申请号20071092025.6)。本发明的连续发酵与半连续发酵的方法来制备丁二酸是在这些前期研究基础上的新发明。

连续发酵操作是指发酵过程中以相同的速率连续加入新鲜的培养基与连续排出发酵成熟的料液，在整个过程中反应器的有效体积、反应物系组成均保持恒定状态。半连续操作的主要特征是在反应过程中，反应物连续或间歇式加入，产物一次性或间歇性排出。因此，半连续操作既有间歇操作的非稳态的分批特性，又有连续操作的连续加料与出料的有关特性(戚以政，夏杰编著.生物反应工程.北京：化学工业出版社，2004，第232页)。

连续发酵与半连续发酵的特点是：(1)发酵培养的菌体浓度高，菌体细胞对发酵液具有很强的适应性，细胞生长的延迟期几乎没有，所以发酵时间短，可获得高产量和高生产强度，而且发酵产物成分较为稳定；(2)容易实现自动化、连续化操作；(3)和分批发酵相比，连续发酵与半连续发酵不需反复洗罐、灭菌、接种等操作，因而生产效率可以大大提高；(4)半连续发酵和连续发酵相比，半连续发酵具有间歇发酵的非稳态特性，残糖容易控制，糖利用率、目标产物产率和目标产物产量高；(5)连续发酵的控制要求较高，需要严格保持过程的稳定，半连续发酵可操作性较强，设备复杂性也不高。

到目前为止工业上还没有连续发酵与半连续发酵生产丁二酸的实例。

发明内容

本发明的一个目的在于，提供一种运行成本低、发酵强度高、适于工业化生产的连续或半连续发酵生产丁二酸的新方法。本发明的另一个目的在于，提供连续或半连续发酵在琥珀酸放线杆菌(Actinobacillus succinogenes)发酵制备丁二酸中的应用。

针对上述发明目的，本发明提供以下技术方案：一种连续发酵或半连续发酵生产丁二酸的方法，步骤为：

A.种子的制备

菌株：琥珀酸放线杆菌(Actinobacillus succinogenes)CGMCC1593，为本实验室从肉牛的瘤胃中分离获得，保藏在中国北京中关村中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，且已公开，公开号CN1814747A，公开日2006年8月9日；

种子培养基的组成为：葡萄糖5-15g，酵母膏1-10g，K₂HPO₄·3H₂O 0.5-2.0g，NaH₂PO₄·2H₂O 0.2-2.0g，去离子水定容至1000mL；

将CGMCC1593菌株接种到种子培养基中，于30-40℃在充满CO₂的环境中静止或振荡培养24-60h；

B.连续发酵：

发酵培养基以g/L计：总糖20-60，酵母膏0-20，玉米浆0-20，Na₂HPO₄·12H₂O 1.5，NaH₂PO₄·2H₂O 1.5，调节培养基pH 5.5-7.5；

(1)单级连续发酵：

按2％-10％的接种量将培养好的种子接入发酵罐进行培养，发酵罐体积V，当培养5-24h达到恒定的生长状态后，按0.06-0.65V/h流速恒速补加新鲜发酵培养基到发酵罐中，控制稀释速率为0.06-0.65h^-1，并且以0.06-0.65V/h相同流速从发酵罐中抽出发酵液到储料罐；

或(2)多级连续发酵：

按2％-10％的接种量将培养好的种子接入一级发酵罐进行培养，发酵罐体积V，当培养5-24h达到恒定的生长状态后，按0.06-0.65V/h流速恒速补加新鲜发酵培养基到一级发酵罐中，并且以0.06-0.65V/h相同流速从一级发酵罐抽出发酵液或以差压将一级发酵罐中的发酵液流入二级发酵罐，再继以相同方式将前一级发酵罐中的发酵液流入后一级发酵罐，直至发酵成熟，合计2-6级连续发酵，成熟发酵液流入或压入储料罐；

每一级的发酵培养条件为：发酵温度维持30-40℃，用100％CO₂气体保持罐压力0.01-0.10MPa，控制每一级发酵罐的稀释速率为0.06-0.65h^-1，必要时采用机械搅拌方式使物料均匀混合，用碱溶液调节维持发酵液pH 5.5-7.5；

或C、半连续发酵：

发酵培养基及一级补料培养基组分AM₁以g/L计：总糖30-75，酵母膏0-20，玉米浆0-20，Na₂HPO₄·12H₂O 1.5，NaH₂PO₄·2H₂O 1.5，调节培养基初始pH5.5-7.5；

二级罐补料培养基AM₂组分以g/L计：总糖75-150，酵母膏0-20，玉米浆0-20，Na₂HPO₄·12H₂O 1.5，NaH₂PO₄·2H₂O 1.5，调节培养基初始pH 5.5-7.5；

(1)单级半连续发酵：

单级半连续发酵在1只发酵罐和1只补料罐中进行，按2％-10％的接种量将培养好的种子接入发酵罐进行培养，在发酵温度30-40℃，搅拌转速200转数/分钟，通100％CO₂气体保持罐压，并用碳酸盐或碱溶液调节维持发酵液pH 5.5-7.5，发酵8-16h后，放出占初始装液体积50％-80％的料液到储料罐中；

向发酵罐中补入与放料液体积相同的补料培养基AM₁，开始进行新一轮培养，相同条件下进行发酵，发酵8-16h后，放出占初始装液体积50％-80％的料液，下一批次继续重复以上操作，共进行15轮以上半连续发酵；

或(2)两级双流半连续发酵：

一级罐培养与发酵，按2％-10％的接种量将培养好的种子接入一级发酵罐进行培养，发酵条件同单级半连续发酵，发酵4-16h后，放出占初始装液体积50％-80％的料液到二级罐中的一只发酵罐中，放出料液体积为V；

二级发酵罐有2-3个，之后马上在二级罐补加1-3倍V体积的二级罐补料培养基(AM₂)，同时向一级罐补入V体积的一级罐补料培养基(AM₁)，开始新一轮培养；

当二级罐发酵10-20小时后，二级罐抽出全部发酵液到储料罐后，再重复进行新一轮培养；

共进行35轮以上两级双流半连续发酵。

所用糖为：以糖蜜、玉米水解糖浆、农作物秸杆木质纤维素水解糖浆、菊芋水解糖浆、甜高粱秸秆糖浆作为连续发酵或半连续发酵法生产丁二酸的主要碳源。

所用糖蜜选用甘蔗糖蜜或甜菜糖蜜；所用农作物秸杆木质纤维素水解糖浆选用玉米秸秆、稻秸秆、麦秸秆、棉花秆、甘蔗渣、废木材或废纸纤维质水解糖浆。

使用氨水、碳酸盐或碱溶液调节pH，维持pH 5.5-7.5。

进一步优选地，所述连续发酵或半连续发酵方法中，采用机械搅拌或者发酵罐压力差压促使发酵液流动的方式达到物料混合的目的。

以下，本发明将详细描述连续发酵和半连续发酵操作生产丁二酸方法，以及多种实施例。

二酸较分批发酵大大提高了丁二酸生产强度，可节省反复灭菌，洗罐等非发酵时间，提高生产效率，可操作性强，易于自动化，连续化操作，可认为是一种有应用前景的丁二酸发酵方法。

分析方法：

采用高效液相色谱法(HPLC)分析上清液中的丁二酸等代谢产物及糖类物质。采用美国Waters高效液相色谱仪，Waters RI检测器，Breeze色谱工作站。其中，丁二酸，乙酸，乳酸和甲酸等有机酸的测定使用Aminex HPX-87H离子色谱柱(300mm×7.8mm，9μm；Bio-Rad Chemical Division，Richmond，Calif.)，流动相8mM硫酸；柱温55℃；流速0.5mL/分钟；进样量10μL。葡萄糖、果糖、木糖、蔗糖、乳糖和麦芽糖等糖类含量的测定采用Zobax NH₂氨基柱(250mm×4.6mm，5μm；Agilent，USA)，流动相：75％乙腈；流速1mL/分钟进样量10μL。

总还原糖测定采用3，5-二硝基水杨酸法(DNS法)，测定时选用葡萄糖为还原糖标准物。

丁二酸的对糖产率定义为每消耗1克还原糖所能产生的丁二酸克数，并以百分数表示。

糖利用率定义为消耗糖所占投入糖的百分比(以总还原糖计算)。

本发明的有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下的明显优点：

本发明利用从肉牛瘤胃中筛选的琥珀酸放线杆菌Actinobacillus succinogenesCGMCC1593进行连续发酵或半连续发酵生产丁二酸，生产强度高，能节约设备投资；而且较分批发酵还能节约反复灭菌，洗罐等非发酵时间，节约劳力，节约能耗和水耗，提高生产效率，降低生产成本，适合工业化生产。

根据本发明的一种实施方式，所述方法以糖蜜为原料为例，用琥珀酸放线杆菌(Actinobacillus succinogenes)CGMCC1593连续发酵或半连续发酵生产丁二酸。在厌氧和维持pH 5.5-7.5的环境下，单级连续发酵当稀释率为0.63h^-1时，生产强度最高可以达到4.87g/(L·h)，丁二酸产量7.67g/L；两级连续发酵当稀释率为0.30h^-1时，生产强度最高可以达到4.29g/(L·h)，丁二酸产量14.11g/L；单级半连续发酵18个批次丁二酸产量维持在30g/L左右，批次发酵时间10-12h，丁二酸产量和生产强度较高，分别可以达到33.67g/L和1.63g/(L·h)。两级双流半连续发酵丁二酸产量最高可达46.0g/L，较分批发酵(36h，40.8g/L)提高12.9％，生产强度最高可达2.38g/(L·h)，较分批发酵和补料分批发酵分别提高111％和114％，39个批次(一级罐发酵时间269h)丁二酸产量和生产强度仍然较稳定，二级发酵罐平均产酸43.5g/L，平均生产强度达到2.07g/(L·h)。

附图说明

图1连续发酵装置示意图(N＝3，4，5或6)，a-补料培养基；b-碱溶液；c-蠕动泵；d-空气过滤膜；e-储料罐。

图2单级半连续发酵操作步骤示意图，(1)当培养液发酵t小时后，抽出V体积发酵液，作为本批次收获发酵液；(2)当第一步操作完之后，马上在发酵罐中加入V体积的的补料培养基，进行下一批次培养；(3)当培养液培养t小时后，重复第一步操作。

图3两级半连续发酵操作步骤示意图，(1)当二级罐发酵t₂小时后，抽出全部发酵液；(2)从一级罐转移V体积的培养液到二级罐；(3)一级罐加入V体积的AM1和碱溶液)，同时二级罐加入(V2-V)体积的AM2和碱溶液)，开始新一轮培养；(4)当一、二级罐发酵达到一定程度重复以上3个操作步骤。

图4单级连续发酵(稀释率为0.06h^-1)发酵时间曲线OD₆₆₀(□)；残糖(△)；丁二酸(▲)；乙酸(■)；甲酸(●)。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。但这些实施例仅限于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体实验条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照厂商所建议的条件。

实施例1、单级连续发酵

1)在装液量为200mL的反应器中进行单级连续发酵，流加培养基中糖蜜总糖浓度为30g/L，调节培养基流加速度(12mL/h)，进行连续培养，发酵时间曲线见图4。由图4可以看出连续发酵10天，平均稀释率为0.053h^-1，丁二酸浓度和菌体浓度保持稳定，分别保持在19.2g/L，发酵液稀释10倍后OD₆₆₀0.51左右，丁二酸生产强度1.15g/(L·h)。

2)按照1)的发酵条件，流加培养基糖蜜总糖浓度为35g/L，分别在稀释率0.06-0.91h^-1范围内进行连续发酵，结果见表1。

表1 不同稀释率下单级连续发酵结果

  稀释速率  (h^-1)  丁二酸产量  (g/L)  丁二酸生产强度  [g/(L·h)]  0.06  19.20  1.15  0.11  13.35  1.46  0.21  11.52  2.42  0.30  11.10  3.35  0.42  9.20  3.86  0.63  7.75  4.87  0.91  5.22  4.76

从表1可以发现，单级连续发酵较分批发酵可以获得较高的菌体浓度和较高的生产强度，在稀释速率D＝0.63h^-1条件下，生产强度Q＝4.87g/(L·h)。

实施例2、多级连续发酵

采用多级单流连续发酵装置，单只罐有效装液量为200mL，流加培养基糖蜜总糖浓度为35g/L，总稀释速率控制为0.11h^-1，0.21h^-1和0.30h^-1，结果见表2。

表2 多(两)级单流连续发酵生产丁二酸

从表2可以发现：增加反应器的级数丁二酸产量较单级连续发酵有所升高，两级连续发酵稀释速率为0.11h^-1时丁二酸浓度最大达到19.0g/L，较单级连续发酵0.11h^-1时提高42.3％；稀释速率为0.30h^-1时，生产强度最高达到4.29g/(L·h)，较单级连续发酵0.30h^-1时提高28.1％；随着稀释速率的升高，生产强度随稀释速率增大而增大，丁二酸浓度、糖的利用率以及丁二酸产率呈递减趋势，残糖显著增加。

继续增加反应器的级数，采用5级(单只罐有效装液量为200mL的同样反应器)连续发酵，提高流加培养基糖蜜总糖浓度为48.1g/L，对一级罐稀释速率控制为0.44h^-1，总稀释速率平均为0.088h^-1，丁二酸产量、糖利用率以及丁二酸产率较两级连续发酵明显升高，分别达到36g/L、95.6％、78.2％，残糖显著降低(2.1g/L)，总装置容积(5只罐)生产强度3.17g/(L·h)。

实施例3、单级半连续发酵生产丁二酸

发酵在250mL反应器中进行，补料瓶容积为2L。分别以40g/L和60g/L起始总糖浓度，每批发酵时间为8-24h，抽出发酵液体积(V)/反应器装液体积(V₀)＝50％，菌体生长及产酸情况见表3。

表3 甘蔗糖蜜单级半连续发酵生产丁二酸

  发酵批次  发酵  时间  残还原糖  (g/L)  OD_660nm  丁二酸浓  度(g/L)  丁二酸  生产强度  [g/(L·h)]  丁二酸产  率(％)  1  24  10.80  8.80  24.48  1.02  83.84  2  12  11.30  8.70  23.91  0.97  83.31  3  12  5.80  8.68  28.60  1.39  83.63  4  12  2.10  8.97  31.79  1.46  83.88  5  12  2.20  8.90  31.80  1.33  84.13  6  16  1.90  6.87  32.06  1.01  84.15  7  8  11.20  8.21  23.56  0.94  81.81  8  10  8.80  8.58  26.19  1.44  83.94  9  10  6.50  8.20  28.33  1.52  84.57  10  12  16.30  8.50  33.67  1.63  80.74  11  12  22.02  7.60  28.98  1.01  80.54  12  16  19.50  8.50  32.03  1.10  83.19  13  16  23.97  6.90  28.56  0.78  83.93  14  12  30.10  6.80  23.56  0.77  84.44  15  12  24.60  7.68  27.30  1.29  81.74  16  12  29.30  7.44  24.19  0.88  84.29  17  12  31.20  8.29  21.63  0.79  80.71  18  24  25.20  8.40  27.01  0.67  82.35

由表3可以看出，半连续发酵时间为10-12h，丁二酸产量和生产强度较高，分别可以达到33.67g/L和1.63g/(L·h)，发酵时间延长会衰老，进而影响下一批次产酸速度。

实施例4、两级双流半连续发酵生产丁二酸

第一级罐经过5-8小时(t₁)放出80mL(V)的培养液到二级罐，同时一级罐再补80mL(V)AM₁(初糖浓度34g/L)，二级罐补加80mL(V₂-V)AM₂(初糖浓度86.8g/L)，发酵16小时(t₂)，测定培养过程中丁二酸浓度随发酵时间的变化，结果见表4。

表4 甘蔗糖蜜两级双流半连续发酵产丁二酸

表4结果表明，由于一级罐发酵时间(t₁)较短，前几个循环菌体得到不断的活化，菌体生长趋于同步，且处于对数生长期，前几个循环菌体浓度随着循环批次逐渐上升，因而产酸强度不断增加，随着循环批次的增加一级罐发酵时间可以进一步从8h减少到5h左右。二级罐由于加入与一级罐流出培养液等体积的新鲜培养基，菌体活力较高，且丁二酸初始浓度10g/L左右，所以只需发酵16h产酸即可达到40-46g/L。前23批次t₂/t₁＝2(t₁＝8h；t₂＝16h)，后16个批次t₂/t₁＝3(t₁＝5.33h；t₂＝16h)。半连续培养39个批次(一级罐发酵时间269h)丁二酸产量和生产强度仍然较稳定，二级发酵罐平均产酸43.5g/L，平均生产强度达到2.07g/(L·h)。

实施例5-9、不同碳水化合物原料连续发酵制备丁二酸

连续发酵甘蔗糖蜜、玉米淀粉糖浆、菊芋水解糖浆、甜高粱秸秆糖浆及纤维质木质原料水解糖浆等碳水化合物原料制备丁二酸。

分别以甘蔗糖蜜等碳水化合物原料进行多级连续发酵，对一级罐稀释速率控制为0.45h^-1，总稀释速率平均为0.09h^-1，发酵条件同实例2，结果见表5。

表5 不同原料多级连续发酵结果

表5结果表明，用甘蔗糖蜜、玉米淀粉糖浆、菊芋水解糖浆、甜高粱秸秆糖浆及纤维质木质原料水解糖浆等碳水化合物原料，进行多级连续发酵生产丁二酸，均能得到较好的发酵结果。其中以菊芋水解糖浆丁二酸产量和生产强度最高，分别达到38.2g/L和3.55g/(L·h)。

实施例10-14、不同碳水化合物原料两级双流半连续发酵制备丁二酸

半连续发酵甘蔗糖蜜、玉米淀粉糖浆、菊芋水解糖浆、甜高梁秸秆糖浆及纤维质木质原料水解糖浆等碳水化合物原料制备丁二酸：

分别以甘蔗糖蜜等碳水化合物原料进行两级双流半连续发酵，两罐平均投入总糖浓度60g/L左右，发酵条件同实例4，结果见表6。

表6 不同原料两级双流半连续发酵结果

表6结果表明，用甘蔗糖蜜、玉米淀粉糖浆、菊芋水解糖浆、甜高粱秸秆糖浆及纤维质木质原料水解糖浆等碳水化合物原料进行两级双流半连续发酵生产丁二酸，均能得到很好的发酵结果。其中以菊芋水解糖浆丁二酸产量和生产强度最高，分别达到48.2g/L和2.29g/(L·h)。