黄珠子草中有效成分短叶苏木酚及8,9－单环氧短叶苏木酚的提取分离方法

摘要

黄珠子草中有效成分短叶苏木酚及8，9－单环氧短叶苏木酚的提取分离方法，取黄珠子草粉粗用乙醇回流提取，提取液减压回收乙醇后再加蒸馏水并用石油醚对其提取至无色，去除石油醚后用乙酸乙酯提取，得到含黄珠子草的乙酸乙酯提取液；将黄珠子草的乙酸乙酯提取液减压回收溶剂得残渣，在残渣中加甲醇，活性炭脱色，拌样，装入硅胶柱进行分离，用氯仿－甲醇洗脱；采用乙醇溶解用聚酰胺柱分离，再用不同浓度的乙醇洗脱，收集不同浓度乙醇的洗脱液，再次用氯仿－甲醇洗脱甲醇重结晶，得短叶苏木酚和8，9－单环氧短叶苏木酚。本发明采用乙醇提取，硅胶柱分离，利用短叶苏木酚和8，9－单环氧短叶苏木酚的极性不同进行分离，大大节约时间和能源。

说明书

技术领域

本发明涉及一种中药的提取、分离方法，具体涉及一种黄珠子草中有效成分短叶苏木酚及8，9-单环氧短叶苏木酚的提取分离方法。

背景技术

黄珠子草为大戟科叶下珠属植物黄珠子草(Phyllanthus SimplexRetz.)的全草，具有平肝、清热、利水、解毒之功效，用于治疗肠炎、肝炎、尿路感染、无名肿痛等。黄珠子草对乙肝病毒有很强的杀灭作用和保护肝损伤的作用，实验证明，黄珠子草中的短叶苏木酚和8，9-单环氧短叶苏木酚是它的主要活性成分。

由于短叶苏木酚和8，9-单环氧短叶苏木酚在植物体中含量较低，所以提取分离是富积有效成分，提高药材药效减少副作用的主要方法之一。提取分离过程中在尽可能的保留有效成分的前提下，简化提取分离步骤，减少成本，是由药材转换为药用原料的关键。

发明内容

本发明的目的是提供一种工艺简单，提取率高的黄珠子草中有效成分短叶苏木酚和8，9-单环氧短叶苏木酚的提取方法。

为达到上述目的，本发明采用的技术方案是：首先取黄珠子草药材粉碎成粗粉，然后加入粗粉重量的6～8倍的质量浓度为50～70％的乙醇回流提取2～3次，每次1～3小时，过滤，合并提取液，备用；将提取液减压回收乙醇至无醇味，再向其中加入回收后溶液体积3～4倍的蒸馏水形成混悬液，用石油醚在60～90℃下对混悬液提取至无色，去除石油醚后用乙酸乙酯提取，回收溶剂得到含黄珠子草的乙酸乙酯提取液；将黄珠子草的乙酸乙酯提取液减压回收溶剂，回收后的残渣加等量的甲醇在40～50℃下溶解，活性炭脱色，拌样，装入硅胶柱进行分离，用氯仿-甲醇(9∶1→1∶9)为洗脱剂梯度洗脱，采用TLC法检测洗脱液，每份洗脱液700mL，共收集200份洗脱液；合并第68～102份的洗脱液，减压回收溶剂至总量三分之一，在4℃静置24小时，滤过，滤液减压回收溶剂，在回收后的残渣中再加入等量的质量浓度为60～70％的乙醇溶解用聚酰胺柱分离，再用分别用质量浓度为10％→100％的乙醇对分离液进行梯度洗脱，采用TLC法检测洗脱液，每份洗脱液600mL，共收集110份洗脱液；合并第37～61份的洗脱液，滤过，回收乙醇，再进行硅胶柱分离，氯仿-甲醇(9∶1→1∶9)为洗脱剂梯度洗脱，甲醇重结晶，得淡黄色粉末短叶苏木酚；合并第72～95份的洗脱液，滤过，减压回收溶剂，在回收的残渣中加入等量的甲醇溶解，拌样，再进行硅胶柱分离，氯仿-甲醇(9∶1→1∶9)为洗脱剂梯度洗脱，用甲醇重结晶，得黄色粉末8，9-单环氧短叶苏木酚。

本发明采用乙醇提取，硅胶柱分离，利用短叶苏木酚和8，9-单环氧短叶苏木酚的极性不同进行分离，大大节约时间和能源。而且提取的短叶苏木酚和8，9-单环氧短叶苏木酚可作为制药生产的对照品或原料也可以用其单成分制药。

附图说明

图1是本发明提取的短叶苏木酚及8，9-单环氧短叶苏木酚的纯度检查图，其中1是短叶苏木酚，2是8，9-单环氧短叶苏木酚。

具体实施方式

实施例1，首先取黄珠子草药材粉碎成粗粉，然后加入粗粉重量的7倍的质量浓度为70％的乙醇回流提取2次，每次1小时，过滤，合并提取液，备用；将提取液减压回收乙醇至无醇味，再向其中加入回收后溶液体积3倍的蒸馏水形成混悬液，用石油醚在80℃下对混悬液提取至无色，去除石油醚后用乙酸乙酯提取，回收溶剂得到含黄珠子草的乙酸乙酯提取液；将黄珠子草的乙酸乙酯提取液减压回收溶剂，回收后的残渣加等量的甲醇在45℃下溶解，活性炭脱色，拌样，装入硅胶柱进行分离，用氯仿-甲醇(9∶1→1∶9)为洗脱剂梯度洗脱，采用TLC法检测洗脱液，每份洗脱液700mL，共收集200份洗脱液；合并第68～102份的洗脱液，减压回收溶剂至总量三分之一，在4℃静置24小时，滤过，滤液减压回收溶剂，在回收后的残渣中再加入等量的质量浓度为66％的乙醇溶解用聚酰胺柱分离，再用分别用质量浓度为10％→100％的乙醇对分离液进行梯度洗脱，采用TLC法检测洗脱液，每份洗脱液600mL，共收集110份洗脱液；合并第37～61份的洗脱液，滤过，回收乙醇，再进行硅胶柱分离，氯仿-甲醇(9∶1→1∶9)为洗脱剂梯度洗脱，甲醇重结晶，得淡黄色粉末短叶苏木酚；合并第72～95份的洗脱液，滤过，减压回收溶剂，在回收的残渣中加入等量的甲醇溶解，拌样，再进行硅胶柱分离，氯仿-甲醇(9∶1→1∶9)为洗脱剂梯度洗脱，用甲醇重结晶，得黄色粉末8，9-单环氧短叶苏木酚。

实施例2，首先取黄珠子草药材粉碎成粗粉，然后加入粗粉重量的8倍的质量浓度为50％的乙醇回流提取3次，每次2小时，过滤，合并提取液，备用；将提取液减压回收乙醇至无醇味，再向其中加入回收后溶液体积3.5倍的蒸馏水形成混悬液，用石油醚在90℃下对混悬液提取至无色，去除石油醚后用乙酸乙酯提取，回收溶剂得到含黄珠子草的乙酸乙酯提取液；将黄珠子草的乙酸乙酯提取液减压回收溶剂，回收后的残渣加等量的甲醇在40℃下溶解，活性炭脱色，拌样，装入硅胶柱进行分离，用氯仿-甲醇(9∶1→1∶9)为洗脱剂梯度洗脱，采用TLC法检测洗脱液，每份洗脱液700mL，共收集200份洗脱液；合并第68～102份的洗脱液，减压回收溶剂至总量三分之一，在4℃静置24小时，滤过，滤液减压回收溶剂，在回收后的残渣中再加入等量的质量浓度为60％的乙醇溶解用聚酰胺柱分离，再用分别用质量浓度为10％→100％的乙醇对分离液进行梯度洗脱，采用TLC法检测洗脱液，每份洗脱液600mL，共收集110份洗脱液；合并第37～61份的洗脱液，滤过，回收乙醇，再进行硅胶柱分离，氯仿-甲醇(9∶1→1∶9)为洗脱剂梯度洗脱，甲醇重结晶，得淡黄色粉末短叶苏木酚；合并第72～95份的洗脱液，滤过，减压回收溶剂，在回收的残渣中加入等量的甲醇溶解，拌样，再进行硅胶柱分离，氯仿-甲醇(9∶1→1∶9)为洗脱剂梯度洗脱，用甲醇重结晶，得黄色粉末8，9-单环氧短叶苏木酚。

实施例3，首先取黄珠子草药材粉碎成粗粉，然后加入粗粉重量的6倍的质量浓度为60％的乙醇回流提取3次，每次3小时，过滤，合并提取液，备用；将提取液减压回收乙醇至无醇味，再向其中加入回收后溶液体积4倍的蒸馏水形成混悬液，用石油醚在60℃下对混悬液提取至无色，去除石油醚后用乙酸乙酯提取，回收溶剂得到含黄珠子草的乙酸乙酯提取液；将黄珠子草的乙酸乙酯提取液减压回收溶剂，回收后的残渣加等量的甲醇在50℃下溶解，活性炭脱色，拌样，装入硅胶柱进行分离，用氯仿-甲醇(9∶1→1∶9)为洗脱剂梯度洗脱，采用TLC法检测洗脱液，每份洗脱液700mL，共收集200份洗脱液；合并第68～102份的洗脱液，减压回收溶剂至总量三分之一，在4℃静置24小时，滤过，滤液减压回收溶剂，在回收后的残渣中再加入等量的质量浓度为70％的乙醇溶解用聚酰胺柱分离，再用分别用质量浓度为10％→100％的乙醇对分离液进行梯度洗脱，采用TLC法检测洗脱液，每份洗脱液600mL，共收集110份洗脱液；合并第37～61份的洗脱液，滤过，回收乙醇，再进行硅胶柱分离，氯仿-甲醇(9∶1→1∶9)为洗脱剂梯度洗脱，甲醇重结晶，得淡黄色粉末短叶苏木酚；合并第72～95份的洗脱液，滤过，减压回收溶剂，在回收的残渣中加入等量的甲醇溶解，拌样，再进行硅胶柱分离，氯仿-甲醇(9∶1→1∶9)为洗脱剂梯度洗脱，用甲醇重结晶，得黄色粉末8，9-单环氧短叶苏木酚。

短叶苏木酚及8，9-单环氧短叶苏木酚的结构解析与鉴定

短叶苏木酚及8，9-单环氧短叶苏木酚的结构解析

化合物I(短叶苏木酚)、化合物II(8，9-单环氧短叶苏木酚)

黄色针状结晶(甲醇)，mp＞300℃，难溶于丙酮、氯仿、甲醇，可溶于二甲亚砜中，三氯化铁反应显蓝色，示含有酚羟基。

IR(KBr)cm^-1：3400示具有OH，1700，1685为C＝O的吸收峰，1625示具有不饱和键C＝C，1600、1548、1502为芳环的特征吸收峰，2930，1445示具有亚甲基-CH₂-结构。

¹H-NMR(DMSO-d₆)δppm：7.28处有一尖锐单峰，为苯环上质子的特征信号，积分1个H，示苯环为五取代结构；9.85、10.15、10.90出现三个宽单峰，各1个H，为酚羟基的特征峰，示存在三个酚羟基；3.16、2.50各为三重峰，J＝1.6Hz，各2个H，为-CH₂-CH₂-中H的特征信号，并且与这两个碳相连的原子上不含H。

¹³C-NMR(DMSO)δppm：有12个碳信号，其中195.48、160.42为两个羰基碳的特征谱线；107.76～149.10为典型的烯碳信号区，示含有8个烯碳；23.71、32.85为饱和碳信号。

将化合物I的¹³C-NMR谱数据与文献报道的短叶苏木酚酸甲酯相对照，它比短叶苏木酚酸甲酯少一个羰基碳(172.83ppm)和一个甲氧基碳(52.18ppm)的信号，即少一个-COOCH₃基团。综合以上分析，故鉴定该化合物为短叶苏木酚(brevifolin)。对其¹³C-NMR谱归属见表1。

表1化合物I、II的¹³C-NMR数据

化合物II(8，9-单环氧短叶苏木酚)

黄色粉末，mp＞300℃，难溶于丙酮、氯仿，可溶于甲醇，三氯化铁反应显蓝色，示含有酚羟基。

IR(KBr)cm^-1：3400示具有OH，1700、1685为C＝O的吸收峰，1625示具有不饱和键C＝C，1600、1548、1502为芳环的特征吸收峰，2919、1450示具有亚甲基-CH₂-结构。

¹H-NMR(DMSO-d₆)δppm：7.25处有一尖锐单峰，为苯环上质子的特征信号，积分1个H，示苯环为五取代结构；9.85、10.15、10.88出现三个宽单峰，各1个H，为酚羟基的特征峰，示存在三个酚羟基；3.17、3.23各为三重峰，J＝0.8Hz，各1个H，为-CH-中H的特征信号，并且与此相连的原子上含2个H；3.38、3.32各为双峰，J＝1.8Hz，各2个H，为-CH₂-中H的特征信号，并且与这两个碳相连的原子上含1个H，可能的结构为一五元环醚基。

¹³C-NMR(DMSO)δppm：有14个碳信号，与上述化合物VIII的谱图数据相对照，多出了48.45、53.71ppm两个峰，即多出两个饱和碳，与文献所列标准图谱数据对照，确定为与氧相连的两个-CH₂-。

综合以上分析，故鉴定该化合物为8，9-单环氧短叶苏木酚(8，9-epoxybrevifolin)。对其¹³C-NMR谱归属见表1。

短叶苏木酚及8，9-单环氧短叶苏木酚的结构鉴定

化合物I(短叶苏木酚)

短叶苏木酚：黄色针状结晶(甲醇)，mp＞300℃，难溶于丙酮、氯仿、甲醇，可溶于二甲亚砜中，FeCl₃反应阳性。

UVλ_max^NeOHnm：278，350，364。

IR(KBr)cm^-1：3400(OH)，1700，1685(C＝O)，1625(C＝C)，1600，1548，1502(芳环)，2930，1445(-CH₂-)。

¹H-NMR(DMSO-d₆)δppm：7.28(1H，s，H-7)，10.90(1H，br，s，4-OH)，10.15(1H，br，s，6-OH)，9.85(1H，br，s，5-OH)，3.16(2H，t，J＝1.6Hz，H-8)，2.50(2H，t，J＝1.6Hz，H-9)。

¹³C-NMR谱数据及归属见表1。

化合物II(8，9-单环氧短叶苏木酚)

8，9-单环氧短叶苏木酚：黄色粉末，mp＞300℃，难溶于丙酮、氯仿，可溶于甲醇，三氯化铁反应显蓝色。

IR(KBr)cm^-1：3400(OH)，1700，1685(C＝O)，1625(C＝C)，1600，1548，1502(芳环)，2919，1450(-CH₂-)。

¹H-NMR(DMSO-d₆)δppm：7.25(1H，s，H-7)，10.90(1H，br，s，4-OH)，10.15(1H，br，s，6-OH)，9.85(1H，br，s，5-OH)，3.17(1H，t，J＝0.8Hz，H-9)，3.23(1H，t，J＝1.8Hz，H-8)，3.38(2H，d，J＝0.8Hz，H-11)，3.32(2H，d，J＝1.8Hz，H-12)。

¹³C-NMR谱归属见表1。

短叶苏木酚及8，9-单环氧短叶苏木酚的纯度测定

色谱条件与系统适用性试验

色谱柱Thermo Hypersil-Keystone ODS C₁₈柱(250mm×4.6mm)，流动相∶甲醇-1％醋酸(35∶65)，检测波长278nm，流速1.0mL·min^-1，柱温：室温，进样量10μL。理论塔板数以8-9单环氧短叶苏木酚峰计算应不低于2000。

对照品溶液的制备

分别精密称取短叶苏木酚及8，9-单环氧短叶苏木酚对照品各5mg，置50mL的量瓶中，加50％甲醇使溶解并稀释至刻度，摇匀，精密吸取1mL，置10mL量瓶中，用50％甲醇稀释至刻度，作为对照品溶液。

供试品溶液的制备

分别精密称取所制备的短叶苏木酚及8，9-单环氧短叶苏木酚化合物5mg，分别置50mL的量瓶中，加50％甲醇使溶解并稀释至刻度，摇匀，精密吸取1mL，置10mL量瓶中，用50％甲醇稀释至刻度，作为供试品溶液。

纯度检测

采用高效液相色谱法，对所制备的化合物进行了纯度检测，面积归一化法计算，两种化合物的纯度都达到了98％以上，可作为原料药供试验用。结果见图1。上述检测方法适用于黄株子草生药及有效成分短叶苏木酚及8，9-单环氧短叶苏木酚的纯度检查和含量测定。