用作亲和吸附介质的聚N－2－羧乙基吡咯金属螯合纳米管的制备方法

摘要

用作亲和吸附介质的聚N－2－羧乙基吡咯金属螯合纳米管的制备方法，涉及一种亲和吸附的介质材料。提供一种用作亲和吸附介质的聚N－2－羧乙基吡咯金属螯合纳米管的制备方法。以聚碳酸酯膜为模板，在膜孔内聚合N－2－羧乙基吡咯单体，移除模板后得到聚N－2－羧乙基吡咯的纳米管。将纳米管用1－(3－二甲氨基丙基)－3－乙基碳二亚胺和1－羟基－7－偶氮苯并三氮唑活化，偶联上亚氨基二乙酸，在纳米管内外表面螯合上配位基Cu2+，得聚N－2－羧乙基吡咯金属螯合纳米管。制备的聚N－2－羧乙基吡咯金属螯合纳米管具有大量的亲和吸附位点，亲和容量大，非特异性吸附小，化学稳定性、亲水性和生物相容性好。可用于蛋白质的分离纯化。

说明书

技术领域

本发明涉及一种亲和吸附的介质材料，尤其是用作亲和吸附介质的聚N-2-羧乙基吡咯金属螯合纳米管的制备方法。

背景技术

在生物工程和生命科学的领域中，有许多应用价值和经济价值很高的蛋白质产品，在生产过程中这些产品的分离纯化是非常重要的。亲和色谱法(affinity chromatography，AC)以其高选择性、高收率且一步得到高纯度产品的技术优势，成为纯化蛋白质的最有效的技术之一。AC是依据配位体通过范德华力、疏水力、静电力等相互作用，与蛋白质等目标产物能够特异、可逆地结合在一起的特性，从复杂的生物样品中分离得到所需的目标产物。AC的介质在亲和吸附过程中起着举足轻重的作用。AC对介质的要求是：(1)表面积大；(2)有一定的机械硬度和化学稳定性；(3)非特异性吸附弱；(4)抗生物降解；(5)易于功能化，可直接或通过间隔臂与配位基连接。在实际应用时，还应考虑介质的孔隙率和介质骨架对配位基微环境的影响。AC中最早使用的介质是以琼脂糖为代表的多糖类软胶。多糖结构疏松，不易吸附敏感生物大分子也不使其变性，且pH适用范围比较广，亲和容量高，价格比较便宜。这类介质不足之处是质软，不耐压，在较低的pH范围内易降解。为了克服这些缺点，人们通过多糖交联的方法获得了半刚性凝胶-交联琼脂糖。目前，多糖类凝胶仍是应用最广的AC介质。控制孔径的多孔玻璃是AC中一类独特的介质，它不溶解，几乎不受洗脱液、压力、流速、pH和离子强度变化的影响；但非特异性吸附较强，纯化效果不理想。

纳米管是一类具有特殊的结构与性能的新材料，作为亲和吸附介质有着显著的优势：它的中空结构可极大降低蛋白质在介质中的传质阻力；配位基可以固定在纳米管的外壁和内壁上；纳米管巨大的表面积也大大增加了亲和容量。但是，目前尚未见将纳米管用作亲和吸附介质的相关报道。

发明内容

本发明的目的旨在提供一种用作亲和吸附介质的聚N-2-羧乙基吡咯金属螯合纳米管的制备方法。此用作亲和吸附介质的聚N-2-羧乙基吡咯金属螯合纳米管不仅亲和容量大、非特异性吸附小，而且具有良好的化学稳定性、亲水性及优良的生物相容性等优点，可用于蛋白质的分离纯化。

本发明包括以下步骤：

1)以孔径均匀的聚碳酸酯膜为模板，并对模板进行预处理；

2)将预处理后的模板固定于含有双池的扩散池中间；

3)将氧化剂和N-2-羧乙基吡咯单体溶液分别加入扩散池的双池中，控制反应温度60～100℃，反应时间4～6h，双池中的溶液通过模板进行相互扩散并发生氧化聚合反应，经过化学氧化生成的聚(N-2-羧乙基吡咯)沉积到模板的表面和孔壁上；

4)反应后取出模板，用矾土将模板表面的聚N-2-羧乙基吡咯磨掉，再用CH₂Cl₂将模板溶解，即可将沉积在孔壁上的聚N-2-羧乙基吡咯纳米管释放出来，用微孔滤膜过滤收集纳米管；

5)将所收集的纳米管用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)和1-羟基-7-偶氮苯并三氮唑(HOAt)进行活化反应3～7h；

6)将活化好的纳米管浸在亚氨基二乙酸(IDA)的碳酸钠溶液中，反应12～18h，反应温度为50～70℃，使之偶联上螯合剂IDA；

7)将连有IDA的纳米管浸在CuSO₄溶液中，反应2～5h，使之连上配位基Cu2+；即得聚N-2-羧乙基吡咯金属螯合纳米管。

上述聚碳酸酯膜的孔径为0.2～1μm。

上述对模板进行预处理是指将模板置于N-2-羧乙基吡咯单体溶液中抽真空或置于N-2-羧乙基吡咯单体溶液中静置处理。

上述氧化剂为0.576～1.728M的三氯化铁水溶液，N-2-羧乙基吡咯单体溶液为0.144～0.576M的水溶液，N-2-羧乙基吡咯单体溶液与氧化剂的摩尔比为1∶(2～5)。

上述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)浓度为0.368～0.712mg/L，EDC与HOAt浓度比为1∶(0.1～1)。

上述IDA浓度为0.16～0.48M。

上述硫酸铜溶液浓度为0.02～0.08M。

本发明以聚碳酸酯膜为模板，在膜孔内聚合N-2-羧乙基吡咯单体，移除模板后得到聚N-2-羧乙基吡咯的纳米管。纳米管的内径大小为100～500nm，蛋白质等大分子物质除了可以与管外壁上的配位基相互作用外，还可以自由进入管内，与管内壁上的配位基相互作用。这样就充分利用了纳米管的独特结构，增大了吸附容量。选用的配位基金属Cu²⁺能够选择性地与蛋白质表面组氨酸上的咪唑基、色氨酸上的吲哚基或半胱氨酸上的巯基进行配位结合，蛋白质表面这些氨基酸的种类、数量、位置和空间构象不同，因而与金属螯合物的亲和力大小不同，从而可选择性地加以分离纯化。不同的金属离子其亲和力的大小不同，其中Cu²⁺-IDA对蛋白质和氨基酸具有最强的吸附力。此外N-2-羧乙基吡咯具有良好的生物相容性、化学稳定性以及导电性，由于N-2-羧乙基吡咯带有末端羧基，用它聚合得到的纳米管内外表面都分布了大量的羧基，不用再引入活性基团，因此与普通亲和介质的制备方法相比，该法固定配位基的操作简单，所制备的聚N-2-羧乙基吡咯金属螯合纳米管具有大量的亲和吸附位点，亲和容量大，非特异性吸附小，且具有良好的化学稳定性、亲水性及优良的生物相容性。此亲和纳米管可用于蛋白质的分离纯化。

附图说明

图1为实施例1所制备的聚N-2-羧乙基吡咯金属螯合纳米管的扫描电镜照片。

图2为实施例1所制备的聚N-2-羧乙基吡咯金属螯合纳米管的透射电镜照片。在图2中，标尺为0.5μm。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明作进一步说明。

实施例1

1)模板的预处理：

取一张孔径为0.8μm、厚度20μm、直径25mm的聚碳酸酯膜，置于一可密闭抽真空的装置中，加入6mL浓度为0.432M的N-2-羧乙基吡咯水溶液，通过真空泵使装置的真空度在30Pa下保持30min。

2)聚N-2-羧乙基吡咯的氧化沉积：

取出步骤1)处理好的模板固定于扩散池装置中间，然后分别在两池中加入1.728M的三氯化铁溶液6mL和0.432M的N-2-羧乙基吡咯水溶液6mL。在100℃下反应5h。

3)聚N-2-羧乙基吡咯纳米管的形成：

反应到设定的时间后倒出两池内的溶液，取出步骤2)反应后的模板，立刻用蒸馏水冲洗表面，室温放置晾干，用矾土将膜表面聚合生成的聚N-2-羧乙基吡咯打磨掉，再用蒸馏水清洗模板。用CH₂Cl₂将模板溶解，即可将沉积在膜孔壁上的聚N-2-羧乙基吡咯纳米管释放出来，用乙醇清洗释放出来的纳米管，再用微孔滤膜过滤收集，即得聚N-2-羧乙基吡咯纳米管。

4)活化纳米管偶联配位基：

将纳米管浸入HOAt、EDC的5mL混合水溶液中进行活化，EDC的浓度为0.698mg/L，HOAt与EDC浓度比为1∶0.8，在室温下反应5h。反应完成后将纳米管转移至0.48M的IDA溶液中，70℃下反应17h，再将纳米管浸入0.05M的硫酸铜溶液中反应4h，螯合配位基Cu²⁺，即得到聚N-2-羧乙基吡咯金属螯合纳米管。从图1中可以看出纳米管的中空结构。从图2中可以看出纳米管的外径平均大小为0.8μm，内径平均大小为0.5μm。

5)聚N-2-羧乙基吡咯金属螯合纳米管的应用：

将螯合了Cu²⁺的聚N-2-羧乙基吡咯金属螯合纳米管浸入5mL的100mg/L的血红蛋白溶液中，25℃下震荡反应4h，进行血红蛋白的吸附。经检测吸附的血红蛋白的量为26.8(mg/g纳米管)。

实施例2

1)模板的预处理：

取一张孔径为0.2μm、厚度20μm、直径25mm的聚碳酸酯膜，浸于体积为6mL、浓度为0.144M的N-2-羧乙基吡咯水溶液2h。

2)聚N-2-羧乙基吡咯的氧化沉积：

取出步骤1处理好的模板固定于扩散池装置中间，然后分别在两池中加入0.576M的三氯化铁溶液6mL和0.144M的N-2-羧乙基吡咯水溶液6mL，在60℃下反应4h。

3)聚N-2-羧乙基吡咯纳米管的形成：

按照实施例1步骤3的方法制得所需的聚N-2-羧乙基吡咯纳米管。

4)活化纳米管偶连配位基：

将纳米管浸入5mL的HOAt、EDC混合水溶液中进行活化，EDC的浓度为0.368mg/L，HOAt与EDC浓度比为1∶0.1，在室温下反应3h。反应完成后将纳米管转移至0.16M的IDA溶液中50℃下反应12h，再将纳米管浸入0.02M的硫酸铜溶液中室温下反应2h，螯合配位基Cu²⁺，即得聚N-2-羧乙基吡咯金属螯合纳米管。

5)聚N-2-羧乙基吡咯金属螯合纳米管的应用：

将螯合了Cu²⁺的聚N-2-羧乙基吡咯金属螯合纳米管浸入5mL的250mg/L的血红蛋白溶液中，25℃下震荡反应4h，进行血红蛋白的吸附。经检测吸附的血红蛋白的量为46(mg/g纳米管)。

实施例3

1)模板的预处理：

取一张孔径为0.4μm、厚度20μm、直径25mm的聚碳酸酯膜，浸于体积为6mL、浓度为0.144M的N-2-羧乙基吡咯水溶液2h。

2)聚N-2-羧乙基吡咯的氧化沉积：

取出步骤1处理好的模板固定于扩散池装置中间，然后分别在两池中加入0.72M的三氯化铁溶液6mL和0.288M的N-2-羧乙基吡咯水溶液6mL。在70℃下反应5h。

3)聚N-2-羧乙基吡咯纳米管的形成：

按照实施例1步骤3的方法制得所需的聚N-2-羧乙基吡咯纳米管。

4)活化纳米管偶连配位基：

将纳米管浸入5mL的HOAt、EDC混合水溶液中进行活化，EDC的浓度为0.552mg/L，HOAt与EDC浓度比为1∶0.3，在室温下反应5h。反应完成后将纳米管转移至0.32M的IDA溶液中，60℃下反应14h，再将纳米管浸入0.04M的硫酸铜溶液中室温反应3h，螯合配位基Cu²⁺，即得到聚N-2-羧乙基吡咯金属螯合纳米管。

5)聚N-2-羧乙基吡咯金属螯合纳米管的应用：

将螯合了Cu²⁺的聚N-2-羧乙基吡咯金属螯合纳米管浸入5mL的200mg/L的血红蛋白溶液中，25℃下震荡反应4h，进行血红蛋白的吸附。经检测吸附的血红蛋白的量为39.8(mg/g纳米管)。

实施例4

1)模板的预处理：

取一张孔径为0.6μm、厚度20μm、直径25mm的聚碳酸酯膜，置于一可密闭抽真空的装置中，加入6mL浓度为0.432M的N-2-羧乙基吡咯水溶液，通过真空泵使装置的真空度在30Pa下保持30min。

2)聚N-2-羧乙基吡咯的氧化沉积：

取出步骤1处理好的模板固定于扩散池装置中间，然后分别在两池中加入1.152M的三氯化铁溶液6mL和0.432M的N-2-羧乙基吡咯水溶液6mL。在80℃下反应5h。

3)聚N-2-羧乙基吡咯纳米管的形成：

按照实施例1步骤3的方法制得所需的聚N-2-羧乙基吡咯纳米管。

4)活化纳米管偶连配位基：

将纳米管浸入5mL的HOAt、EDC混合水溶液中进行活化，EDC的浓度为0.628mg/L，HOAt与EDC浓度比为1∶0.6，在室温下反应5h。反应完成后将纳米管转移至0.32M的IDA溶液中，65℃下反应16h，再将纳米管浸入0.05M的硫酸铜溶液中反应3h，螯合配位基Cu²⁺，即得到聚N-2-羧乙基吡咯金属螯合纳米管。

5)聚N-2-羧乙基吡咯金属螯合纳米管的应用：

将螯合了Cu²⁺的聚N-2-羧乙基吡咯金属螯合纳米管浸入5mL的150mg/L的血红蛋白溶液中，25℃下震荡反应4h，进行血红蛋白的吸附。经检测吸附的血红蛋白的量为32.6(mg/g纳米管)。

实施例5

1)模板的预处理：

取一张孔径为1.0μm、厚度20μm、直径25mm的聚碳酸酯膜，置于一可密闭抽真空的装置中，加入6mL浓度为0.576M的N-2-羧乙基吡咯水溶液，通过真空泵使装置的真空度在30Pa下保持30min。

2)聚N-2-羧乙基吡咯的氧化沉积：

取出步骤1处理好的模板固定于扩散池装置中间，然后分别在两池中加入1.728M的三氯化铁溶液6mL和0.576M的N-2-羧乙基吡咯水溶液6mL。在100℃下反应6h。

3)聚N-2-羧乙基吡咯纳米管的形成：

按照实施例1步骤3的方法制得所需的聚N-2-羧乙基吡咯纳米管。

4)活化纳米管偶联配位基：

将纳米管浸入HOAt、EDC的5mL混合水溶液中进行活化，EDC的浓度为0.712mg/L，HOAt与EDC浓度比为1∶1，在室温下反应7h。反应完成后将纳米管转移至0.48M的IDA溶液中，70℃下反应18h，再将纳米管浸入0.08M的硫酸铜溶液中反应5h，螯合配位基Cu²⁺，即得到聚N-2-羧乙基吡咯金属螯合纳米管。

5)聚N-2-羧乙基吡咯金属螯合纳米管的应用：

将螯合了Cu²⁺的聚N-2-羧乙基吡咯金属螯合纳米管浸入5mL的50mg/L的血红蛋白溶液中，25℃下震荡反应4h，进行血红蛋白的吸附。经检测吸附的血红蛋白的量为15.8(mg/g纳米管)。