自激活抗性蛋白

摘要

本发明涉及在植物中编码对病原体产生抗性的自激活抗性蛋白的核酸，其特征在于核酸具有NBS－LRR抗性基因的有限部分，从NBS－LRR抗性基因编码区的5’端向下延伸到NBS－LRR抗性基因NBS结构域的起始处，该NBS－LRR抗性基因不是TIR－NBS－LRR抗性基因。

说明书

本发明涉及编码可在植物中产生针对病原体的抗性的自激活抗性 蛋白的核酸，该核酸在产生转基因植物的用途以及转基因植物。

由于植物中抵御或延迟及抑制主要的潜在病原体散播的天然防御 机制不充分，因此由真菌、病毒、线虫和细菌引起的植物病害在世界范 围造成极大损失，可影响收获产品的质量并需要更多更大量使用化学杀 虫剂。这些防御机制包括超敏反应、感染部位宿主组织的可控死亡、通 过木质化和愈合组织的形成而增强植物细胞壁、形成植物抗毒素及产生 PR(致病相关的)蛋白。植物抗性基因(R基因)是激活诱导型防御机 制的关键分子。根据Flohr的基因对基因假说，R基因的蛋白与微生物 无毒基因(Avr基因)的对应蛋白相互作用，从而启动诱导型防御反应。

根据其编码的R蛋白的结构可将主要的R基因分为5类(Martin et al，2003)。1类仅包括编码丝氨酸/苏氨酸激酶的番茄Pto基因。而主要 的植物R基因属于NBS-LRR基因超家族，它编码“核苷酸结合位点” (NBS)和“富含亮氨酸的重复”(LRR)。在其N末端具有诸如例如“亮 氨酸拉链”这样的“卷曲螺旋”结构(CC)的NBS-LRR基因可归为2类 CC-NBS-LRR基因。CC-NBS-LRR型R基因在所有被子植物中均有发 现。3类包括TIR-NBS-LRR型R基因，它在N末端具有取代C结构域 的、与动物TIR区(“toll-interleukin-1受体”)同源的序列。虽然在拟南 芥中，TIR-NBS-LRR基因构成了约75％R基因，但未在草和甜菜中发 现(Tian et al.，2004)。

第四类R基因包括番茄的Cf基因。CF蛋白没有NBS结构域，但 具有跨膜结构域(TM)和胞外LRR。第五类包括水稻的Xa21蛋白，它 由胞外LRR结构域、跨膜结构域和胞内激酶结构域构成。

尽管R基因由R基因启动子进行弱表达，但1、2和3类R基因的 强组成型表达甚至在没有相应的无毒基因产物时仍可激活植物的病原 体防御系统，由此导致R蛋白的自激活(Tang et al.，1999；Oldroyd and Staskawicz，1998；Bendahmane et al.，2002)。

但通常R基因在转基因植物中的组成型过表达与诸如植株的微坏 死(Tang et al.，1999)或矮小(Frost et al.，2004)这样的农事上不良特 征相关。

2类和3类R蛋白的自激活的另一个可能原因是在全长CC-NBS- LRR，或TIR-NBS-LRR蛋白中特定的、保守的氨基酸元件发生了突变。 在NBS或马铃薯Rx基因的LRR结构域(Bendahmane et al.，2002)及 亚麻L6基因的NBS结构域(Howles et al.，2005)中序列的突变可产生 突变株，在不存在相应无毒基因的情况下，该突变株在瞬时表达后可启 动细胞死亡。

用Rx基因的缺失实验表明包含CC结构域和部分NBS结构域的缺 失产物可在其瞬时过表达后启动细胞死亡，其发生比使用全长R基因的 情况更快。这些缺失产物除了CC结构域外，还需要NBS结构域中的P 环、激酶2以及完整的激酶3a。相反，与全长R基因相比较，NBS的 进一步缩短可导致更慢的HR引发或启动(Bendahmane et al.2002)。

亚麻L10基因，它也是一种3类R基因，其自激活可通过形成缩短 的、含有TIR结构域以及包括P环在内的限制性NBS结构域的34个氨 基酸的TIR-NBS-LRR蛋白来实现(Frost et al.，2004)。

虽然已知有多种R基因的自激活方法，但目前仍未报道过其中R蛋 白自激活在导致真菌抗性增强的同时可降低农事上不良特征的转基因 植物。在亚麻中，尝试在天然L6抗性基因启动子或真菌诱导型启动子 控制下分别稳定转化两个L6基因的自激活全长变异体，产生的是正常 生长的真菌敏感型植株，或者是矮小的真菌抗性植株(Howels et al.， 2005)。

因此，本发明的目的是改变植物抗病原体的防御能力，从而使植物 的防御反应确实在病原体攻击时可被激活，但不会对植物的农事特征产 生负面影响。

根据本发明，可通过核酸来实现上述目的，该核酸包括NBS-LRR 抗性基因的有限部分，它从NBS-LRR抗性基因编码区的5’端向下延伸 到NBS-LRR抗性基因NBS结构域的起始处，其中NBS-LRR抗性基因 不是TIR-NBS-LRR抗性基因。这种核酸可从植物中分离或人工合成。

NBS-LRR抗性基因的有限部分起始于翻译起始密码子(ATG密码 子)，并延伸到其基本特征是含有P环(激酶-1a元件)的NBS结构域。 对于发明中NBS-LRR抗性基因部分的功能而言，P环不应包括在内。 同样，也不应存在NBS-LRR抗性基因中NBS-LRR-结构域的其它部分。 但可保留包括P环在内的NBS结构域中的个别核苷酸，只要它们不干 扰HR的引发即可。

术语“自激活抗性蛋白”是指在不存在相应的无毒基因产物时可激 活植物病原体防御机制的蛋白。因此，本发明的优势在于不需要抗性蛋 白和无毒蛋白间的相互作用即可形成对病原体的抗性，从而在实质上更 直接地、最终更可靠地进行植物的防御反应。

例如，自激活可通过抗性基因的瞬时过表达而产生。过表达是指在 没有相应的微生物无毒基因产物时，天然R基因启动子的表达强度在一 定程度上超过R蛋白调控的信号传导的级联反应。因此，病原体的防御 机制被激活，表现出部分或完全的病害抗性。

但抗性蛋白的自激活也可通过将甜菜的全长R基因BvKWS3_165、 BvKWS3_135、Bv13033和Bv12069以及马铃薯的StR3a基因缩短到仅 编码含有可能的CC结构域的蛋白的NBS和LRR结构域的自由N末端 的5’区来实现。NBS结构域自由N末端在这种情况下是指NBS-LRR抗 性基因编码区的5’端仅向3’端延伸到以下程度：在其有效或可操作的结 构中不包括NBS-LRR抗性基因的P环。最简单的情况是将P环完全删 除。但P环的个别核苷酸可保留在缩短的抗性基因中，只要它们不降低 或阻碍HR的引发即可。对缩短到N末端的NBS-LRR抗性基因而言， 也删除了根据数据库Prosite(Bairoch et al.，1996)和Pfam(Sonnhammer et al.，1997)，并在Bendahmane at al.(2002)中提供描述的激酶2、激酶3、 GLPC和MHD元件。

与全长R基因相比较而言，缩短的R基因165_#176、135_#147、 13033_#159和Bv12069及StR3a-#1-155的用途是在植物组织中更快地 引发细胞死亡。联合使用病原体诱导型启动子，可诱导改善的诱导型病 原体防御机制。该也可用于那些不被表达135_#147和BvKWS3_135- D480V基因的MHD或VHD结构域中的已知突变所自激活的R蛋白。

与全长R基因相比较而言，由于缩短的R基因可更早地引发细胞死 亡，因此缩短的R基因比R基因135_#147只需要更少的表达即可足以 达到植物防御机制中的临界蛋白浓度。

P环或激酶1a元件与激酶2和激酶3元件均为ATP或GPT水解蛋 白(Traut，1994)，并位于NBS-LRR-基因的NBS结构域中。P环是NBS 结构域N末端区的特征(Bendahmane et al.，2002)。R基因Prf、Rx、 Rpm1、BvKWS3_135、BvKWS3_133和BvKWS3_165的P环的共有序 列是：(I/V)VG(M/I)GG(L/I/S)GKTT(L/V)。

令人惊讶的是，用编码序列元件DAE的氨基酸序列的核酸可获得 非常好的自激活。特别是编码序列元件AVLXDAE的核酸。例如，序列 元件DAE和AVLXDAE位于SEQ ID NOS：13和15中。

优选的核酸序列选自以下组：

a)如SEQ ID NO：1所述的核苷酸序列或与如SEQ ID NO：1所述的 核苷酸序列互补的核苷酸序列，或与如SEQ ID NO：1所述的核苷酸序列 或与如SEQ ID NO：1所述的核苷酸序列互补的核苷酸序列杂交的核苷 酸序列；

b)如SEQ ID NO：2所述的核苷酸序列或与如SEQ ID NO：2所述的 核苷酸序列互补的核苷酸序列，或与如SEQ ID NO：2所述的核苷酸序列 或与如SEQ ID NO：2所述的核苷酸序列互补的核苷酸序列杂交的核苷 酸序列；

c)如SEQ ID NO：3所述的核苷酸序列或与如SEQ ID NO：3所述的 核苷酸序列互补的核苷酸序列，或与如SEQ ID NO：3所述的核苷酸序列 或与如SEQ ID NO：3所述的核苷酸序列互补的核苷酸序列杂交的核苷 酸序列；

d)如SEQ ID NO：4所述的核苷酸序列或与如SEQ ID NO：4所述的 核苷酸序列互补的核苷酸序列，或与如SEQ ID NO：4所述的核苷酸序列 或与如SEQ ID NO：4所述的核苷酸序列互补的核苷酸序列杂交的核苷酸 序列；及

e)如SEQ ID NO：16所述的核苷酸序列或与如SEQ ID NO：16所述 的核苷酸序列互补的核苷酸序列，或与如SEQ ID NO：16所述的核苷酸 序列或与如SEQ ID NO：16所述的核苷酸序列互补的核苷酸序列杂交的 核苷酸序列。

NBS-LRR抗性基因的有限部分(limited part)在优选的核苷酸基因 序列中的延伸程度如下所示：

SEQ ID NO：1的124-654

SEQ ID NO：2的155-598

SEQ ID NO：3的94-573

SEQ ID NO：4的194-694

此处所用术语“杂交“是指在如Sambrook et al.(1989)中所述的传统 条件下，优选地在严谨条件下的杂交。例如，严谨杂交条件是：在4×SSC 中，于65℃杂交，然后在0.1×SSC中，于65℃多次洗涤约1小时。例 如，较弱的严谨杂交条件是：在4×SSC中，于37℃杂交，然后在1×SSC 中，室温下多次洗涤。“严谨的杂交条件”也指：在0.25 M磷酸钠，pH7.2、 7％SDS、1mM EDTA和1％BSA中，于68℃杂交16小时，然后在2×SSC 和0.1％SDS中，于68℃洗涤两次。

优选的编码自激活抗性蛋白的抗性基因来源于甜菜或马铃薯。

在另一个优选的方案中，发明的核酸编码具有SEQ ID NOS：13到 15中共有序列的氨基酸序列。在共有序列中，功能上等价的氨基酸可相 互替代，例如Asp可替换为Glu，Leu可替换为Ile、Ala或Val，Arg可 替换为Lys，Phe可替换为Trp。

如SEQ ID NOS：13和14所述的两个共有序列代表两个功能区，其 间隔距离是不固定的。两个区优选的间隔可参见如SEQ ID NO：15所述 的共有序列和如图10所示的共有序列。

发明的核酸优选地与病原体诱导型启动子连接。病原体诱导型启动 子在病原体，例如有害真菌、细菌、病毒或线虫感染宿主组织的反应中 被激活。病原体诱导型启动子在试图或成功感染的植物组织中的活性比 未感染的植物组织更强。

本领域技术人员已知病原体诱导型启动子。病原体诱导型启动子的 实施例包括几丁质酶启动子(Samac and Shah 1991)、葡聚糖酶启动子 (Henning et al.，1993)和prp-1启动子(Martini et al.，1993)。

例如，通过R基因的病原体诱导型过表达，可避免组成型表达造成 的诸如植株的矮小或畸形这样的负面结果。

已表明合成的启动子本身即是特别合适的启动子。这些通过分子生 物学技术产生的启动子在设计上是自然界没有发现的。一种这样的合成 启动子是最低限启动子(minimalistic promoter)，它除了基本启动子 (minimal promoter)外仅含有一个或多个选择的确定的顺式元件。这些顺 式元件是诸如转录因子这样的DNA结合蛋白的结合位点，它们是从天 然启动子分离获得的，来源于已分离的顺式元件或通过随机重组技术产 生并通过合适的或适当的过程筛选。与天然启动子相比较，由于合成启 动子没有复杂的结构，所以仅被几个外源或内源因素所激活，因此可进 行更特异的调控。

最小启动子或“核心”启动子是含基本转录因子复合物结合位点、并 能精确起始RNA聚合酶II的转录的核酸序列。最小启动子的特征序列 元件是TATA盒、起始子元件(Inr)、“TFBII识别元件”(BRE)和“下 游核心启动子元件”(DPE)。这些元件可单独存在或在最小启动子中联 合存在。最小启动子或其序列元件可从遗传的植物或病毒基因中获得。

在本发明框架中，已开发了新合成的启动子，它与实质上并不编码 自激活抗性蛋白的已知抗性基因连接，可用于产生病原体抗性植物。这 些启动子的类型有nxS-mxD最小启动子、nxW2-mxD最小启动子和 nxGst1-mxD最小启动子，这样合成的启动子包括一个或多个以下顺式 元件组合：

a)nxS-mxD-盒

b) nxW2-mxD-盒

c)nxGst1-mxD-盒 (其中n和m是指1到10的自然数)

在Rushton et al.，2002中描述了包括其功能必需的核心序列的核酸 序列为SEQ ID NO：6的S盒(CAGCCACCAAAGAGGACCCAGAAT)，核酸序列 为SEQ ID NO：7的W2盒(TTATTCAGCCATCAAAAGTTGACCAATAAT)，核酸序列 为SEQ ID NO：8的D盒(TACAATTCAAACATTGTTCAAACAAGGAACC)及核酸序列 为SEQ ID NO：9的Gst盒(TTCTAGCCACCAGATTTGACCAAAC)。

启动子可根据元件的选择性(nxS-mxD、nxW2-mxD或nxGst1- mxD)而与其自身的基础活性、病原体诱导性、激活动力学及启动子强 度有所差异，例如如具有以下顺式元件组合的启动子所示：

核酸序列为SEQ ID NO：10的2xS-2xD，

核酸序列为SEQ ID NO：11的2xW2-2xD，及

核酸序列为SEQ ID NO：12的2xGst1-2xD。

合成启动子的特征可根据基因表达的需要，通过改变顺式元件的数 目(n，m＝1...1 0)来改变。通过对启动子2xS-2xD与变异体2xS-4xD、 4xS-2xD和4xS-4xD的比较表明，与二聚体构建的启动子相比较，可使 用四聚体来增强平均启动子强度。另外，在所有的测定间隔点上，病原 体诱导性从二聚体-二聚体启动子(2xS-2xD)、四聚体-二聚体及二聚体 -四聚体启动子(4xS-2xD、4xS-2xD)，到四聚体-四聚体启动子(4xS- 4xD)依次增强。与启动子强度和病原体诱导性的增强相平行，含四聚 体的启动子的基础活性在所述实施例的情况下也增强了。该实施例表明 重要的启动子特征也可通过顺式元件的数目来调控，并且可产生并鉴定 最适启动子变异体用于不同技术中的翻译或转变。

但也可用顺式元件组合来获得合适的结果，这些组合表示核酸序列 SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12的衍生物，并具有与 顺式元件组合SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12可比较 的特征。

例如，启动子2xS-2xD最小启动子和2xW2-2xD最小启动子与四个 全长R基因BvKWS3_133、BvKWS3_123、BvKWS3_135和BvKWS3_165 连接，并转化到甜菜中。用具有对甜菜而言最重要的有害真菌、可造成 叶斑点病的甜菜褐斑病菌的转基因植物进行的真菌抗性实验，获得了每 种可改善真菌抗性、但转基因植物在其生长或其它农事特征方面与非转 基因植物没有差别的构建体。这些结果表明基本上可以用病原体诱导型 启动子来实现细胞死亡引发的R基因的过表达，并由此具有改善的病害 抗性，而且不对植株发育产生负面影响。选取具有最佳数目的顺式元件 重复的最适启动子，使用它可进一步提高病害抗性。

本发明进一步涉及用新核酸构建体转化的转基因植物，特别是甜菜 植株、该植株的一部分以及种子或遗传材料，及新核酸构建体在产生转 基因植物方面的用途。

本发明将在下面通过附图和实施例进行更详尽的描述。

本发明使用甜菜通过实施例方式来进行描述，可容易将其应用到其 它分离到抗性基因的农事植物中。

附图

图1所示的是二元载体pER-35Sluci的图谱，它可用于甜菜叶中根 癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)诱导的R基因的瞬时表达。载体 携带来自北美萤火虫(Photinus pyra/is)的、被内含子打断的、不能在根癌 土壤杆菌中表达的荧光素酶基因。

图2所示的是通过根癌土壤杆菌，R基因BvKWS3_133的瞬时表达 可在甜菜叶中引发细胞死亡。而瞬时表达构建体pER-35Sluci可在甜菜 叶中产生强的报告基因活性，表达构建体pER133-35Sluci可引发细胞死 亡，因此无法检测到报告基因活性。

图3所示的是用于瞬时生物弹射击法转化甜菜叶的载体pCaMV- 2。全长的和缩短的R基因位于所述载体的双35S启动子控制下。

图4所示的是通过生物弹射击法转化的R基因BvKWS3_123、 BvKWS3_133和BvKWS3_165瞬时表达后在甜菜叶中引发细胞死亡。基 因BvKWS3_123、BvKWS3_133和BvKWS3_165在双35S启动子 (d35S)控制下，并与报告基因构建体p70S-luc共转化。在转化20小 时后测定报告基因活性。与对照(空载体pCaMV-2和p70S-luc)相比较， 由于引发了超敏反应，因此报告基因活性是降低的。所示的是用每个构 建体各自9个实验的3次独立实验重复的平均值。误差为标准偏差。

图5所示的是与表达全长R基因BvKWS3_165相比较，表达R基 因BvKWS3_165的5’末端区可引发增强的细胞死亡。在d35S启动子控 制下的N末端区和全长R基因(p70S-165_#175和p70S-BvKWS3_165) 与构建体p70S-luc通过生物弹射击法共转化到甜菜叶中。所示的是每个 构建体各自9-12个实验的3次独立实验重复的平均值。

图6所示的是与表达全长R基因BvKWS3_135相比较，表达R基 因BvKWS3_135的5’末端区135_#147可引发增强的细胞死亡。在d35S 启动子控制下的全长R基因和N末端区135_#147(p70S-BvKWS3_135 和p70S-135_#147)与构建体p70S-luc通过生物弹射击法共转化到甜菜 叶中。所示的是每个构建体各自9-12个实验的2次独立实验重复的平均 值。

图7所示的是与表达全长R基因Bv13033相比较，表达R基因 Bv13033的5’末端区13033_#159可引发增强的细胞死亡。在d35S启动 子控制下的全长R基因和N末端区13033_#159(p70S-13033和p70S- 13033_#159)与构建体p70S-luc通过生物弹射击法共转化到甜菜叶中。 所示的是每个构建体各自9-12个实验的2次独立实验重复的平均值。

图8所示的是R基因Bv12069的表达启动细胞死亡。

图9所示的是与NBS结构域VHD元件突变相比较，通过缩短cDNA 克隆135_#1475’区的蛋白BvKWS3_135的自激活。

图10a)-c)所示的是缩短的自激活蛋白Bv12069、Bv13033_#159、 BvKWS135_#147、BvKWS3_165_#175和StR3a-#1-155彼此之间的氨基 酸序列比较，及来自马铃薯(RX-160)和StR1(355-540)的非自激活 缩短的抗性蛋白的序列比较，以及与来自拟南芥(AtAB028617)、豆 (PvulgarisJ71)、水稻(OsativaAP003073)、大豆(GmaxKR4)和番 茄(番茄-I2)的NBS-LRR类的完整R蛋白的序列比较。高亮标出了共 有序列。

图11所示的是氨基酸147-175的缺失可显著降低165_#175蛋白的 自激活活性。

图12所示的是合成启动子2xS-2xD在甜菜褐斑病菌感染后在转基 因甜菜中的激活。

图13所示的是合成启动子2xW2-2xD在甜菜褐斑病菌感染后在转 基因甜菜中的激活。

图14所示的是启动子2xS-2xD、4xS-2xD、2xS-4xD和4xS-4xD 在甜菜褐斑病菌(Cercospora beticola)感染后在转基因甜菜中的报告基 因活性的比较。

图15和16所示的是具有合成启动子2xS-2xD的全长R基因123、 133、135、165的组合。

图17和18所示的是具有合成启动子2xW2-2xD的全长R基因123、 133、135、165的组合。

图19所示的是与非转基因对照3DC4156相比较，转基因甜菜系 PR68-6对有害真菌--甜菜褐斑病菌的抗性增加。

图20所示的是与非转基因对照3DC4156相比较，转基因甜菜系 PR70-32对有害真菌--甜菜褐斑病菌的抗性增加。

图21和22所示的是具有合成启动子2xS-2xD和2xW2-2xD的R基 因N末端区165_#176和12069的组合。

实施例

对BvKWS3 133基因的过表达在甜菜叶中引发快速抗性反应的验证。

通过根癌农杆菌的BvKWS3_133基因全长cDNA克隆的瞬时过表 达可在甜菜叶中引发快速细胞死亡，但不形成可见的坏死。将cDNA克 隆BvkWS3_133与d35S启动子连接，并插入到二元载体pER-34Sluci (图1)中。得到的载体命名为pER133-34Sluci。将pER-34Sluci和 pER133-34Sluci转化到农杆菌C58C1(An 1987)中。在50ml含100mg/ml 壮观霉素和20μM乙酰丁香酮的LB培养基将阳性农杆菌培养4-5小时 使其瞬时表达。然后，离心细菌，将沉淀悬浮在含10mM MgCl₂、10mM MES、100μM乙酰丁香酮的溶液中，调整细菌浓度为OD₆₀₀＝0.1。将细 菌悬浮液放置2-3小时，然后用2.5ml皮下注射器通过10周龄甜菜叶的 内侧将其注射到老甜菜的叶中。在25℃温箱中温育，温育后1、2和3 天测定转化的叶中北美萤火虫荧光素酶报告基因的活性。另外，用荧光 素酶检测系统(Promega，Mannheim，Germany)在Sirius Luminometer (Berthold Detection System GmbH，Pforzheim，Germany)上根据说明书测 定荧光素酶的活。为了获得适于测量的酶，在每次测量间隔对两个叶片 进行标注。对每个构建体在每个测量日收集8个测量点。将叶样品在加 入海沙和10倍体积(v/w)Passive Lysis Buffer(PBL)的研钵中进行匀 浆。提取液体上清，并分别用10μl未加工的提取液进行Photinus荧光 素酶活性的测定。用对照构建体pER-35Sluci转化的甜菜叶在第1天的 活性较小，在第2和3天的荧光素酶活性为124,000、或116,000 RLU/mg 叶组织。用构建体pER-34Sluci转化的甜菜叶的活性在3个测量点均大 于接种MgCl₂的叶(图2)。因此，cDNA克隆BvKWS3_133的瞬时表 达可在接种的甜菜叶中启动快速细胞死亡。

R基因BvKW3 123、BvKWS3 133和BvKWS3 165的组成型表达可在甜菜叶中启动细胞死亡。

R基因BvKWS3_133和具有如SEQ ID No.5所述的核苷酸序列的R 基因BvKWS3_165及R基因BvKWS3_123与载体pCaMV-2的双35S启 动子连接(图3)。得到的载体命名为p70S-BvkWS3_133、p70S- bvKWS3_165和p70S-BvKWS3-123。为了验证R基因的功能性，根据 Schmidt et al.(2004)所述，通过生物弹射击法将报告基因载体p70S-luc 与构建体p70S-BvkWS3_133、p70S-bvKWS3_165和p70S-BvKWS3-123 在甜菜中瞬时表达。使用空载体pCaMV-2联合报告基因载体P70S-luc 作为阳性对照。与Schmidt，et al.(2004)相反，摒弃了归一化载体的使 用。用荧光素酶检测系统(Promega，Mannheim，Germany)在转化20小 时后测定荧光素酶活性。转化实验重复3次，其中每次实验的每个构建 体包括9个实验重复。3次实验的平均值表明，与设为100％的阳性对 照(空载体)的荧光素酶活性相比较，p70S-BvKWS3-133的报告基因活 性仅为37.7％，p70S-BvKWS3_165仅为66％，p70S-BvKWS3-123仅为 68.7％(图4)。因此d35S启动子控制的R基因BVKWS3_133、 BVKWS3_165和BVKWS3_123的强表达可启动细胞死亡，或在抑制共 表达同时转化的报告基因载体的一部分转化细胞中启动超敏反。因此表 明这3个R基因的强表达可导致细胞死亡，或在没有相应的无毒基因产 物的情况下产生HR。

基因BVKWS3 165的5’区可比全长cDNA克隆BvKWS3 165启动更快的细胞死亡。

从构建体p70S-BvKWS3_165中其核苷酸序列如SEQ ID No.5 所述的全长cDNA克隆BvKWS3_165开始，用Pfu聚合酶 (Stratagene)和引物S316(CTCGAGAATTCGAGCTCCACCGCGG)及S318 (CTGGATCCTCACCTCCGTTCTTCATGTTGCTCTACC)扩增基因5′区，同时在编码区 引入终止密码子。扩增区对应于如SEQ ID No.1所述的核苷酸序列，它 编码BvKWS3_165 1-175的氨基酸序列(图10)。氨基酸序列仅含 BvKWS3_165的N末端区，不含NBS和LRR结构域(图10)。用限制 性酶SacII和BamHI切割PCR产物，并克隆到载体pCaMV-2中。得到 的载体命名为p70S-BvKWS3_#175。通过瞬时生物弹射击转化来定量检 测构建体P70S-BvKWS3_165和p70S-165_#175在甜菜叶中启动细胞死 亡的能力。为了该目的，将每个载体分别与报告基因载体p70S-luc共转 化。空载体pCaMV-2与报告基因载体p-70S-luc共同使用作为阳性对 照。与空载体(pcAMV-2)的转化相比较，p70S-BvKWS3_165的转化 可产生65％可测的报告基因活性，而p70S-165-#175的转化仅产生38％ 可测的报告基因活性(图5)。该结果表明165_#175 N末端175个氨基 酸的排他表达可在转化的甜菜叶中启动比使用1066个氨基酸长的全长 蛋白BvKWS3_165更强烈的细胞死亡。165_#175的表达比BvKWS3_165 的表达可使更多的转化叶细胞死亡。该差异的原因是R蛋白通过缩短 (缩减)N末端产生了新的、更强烈的自激活方式。

基因BvKWS3 135 5’区比全长cDNA克隆BvKWS3 135启动更快的细胞死亡

从构建体p70S-BvKWS3_135中全长cDNA克隆BvKWS3_135开始， 用Pfu聚合酶(Stratagene)和引物S316(CTCGAGAATTCGAGCTCCACCGCGG) 及S330(CTGGATCCTCAGGGAGAACTCCATCTGGGTGGTCC)扩增基因5′区，同时 在编码区引入终止密码子。扩增区对应于如SEQ ID No.2所述的核苷酸 序列，它编码BvKWS3_1351-147的氨基酸序列(图10)。氨基酸序列 仅含BvKWS3_135的N末端区，不含NBS和LRR结构域，或来自这些 结构域的元件。用限制性酶SacII和BamHI切割PCR产物，并克隆到 载体pCaMV-2中。得到的载体命名为p70S-135_#147。通过瞬时生物弹 射击转化来定量检测构建体p70S-BvKWS3_135和p70S-135_#147在甜 菜叶中启动细胞死亡的能力。为了该目的，将每个载体分别与报告基因 载体p70S-luc共转化。空载体pCaMV-2与报告基因载体p-70S-luc共同 使用作为阳性对照。与空载体(pCaMV-2)的转化相比较，p70S- BvKWs3_135的转化可产生74.5％可测的报告基因活性，而p70S- 135_#147的转化仅产生58％可测的报告基因活性(图6)。该结果表明 全长克隆BvKWS3_135的表达可在转化的组织中启动细胞死亡。但 135_#147 N末端147个氨基酸的排他表达可在转化的甜菜叶中启动比使 用844个氨基酸长的蛋白BvKWS3_135更强烈的细胞死亡。135_#147 的表达比BvKWS3_135的表达可使更多的转化叶细胞死亡。该差异的原 因是R蛋白通过缩减或缩短N末端产生自了新的、更强烈的激活方式。

基因Bv13033 5’区比全长cDNA克隆Bv13033启动更快的细胞死亡

从构建体p70S-Bv13033中全长cDNA克隆Bv13033开始，用Pfu 聚合酶(Stratagene)和引物S316(CTCGAGAATTCGAGCTCCACCGCGG)及S333 (CTGGATCCTCAAGAACAAGTCTCAGGCCTTCTGTT)扩增基因5′区，同时在编码区 引入终止密码子。扩增区对应于如SEQ ID No.3所述的核苷酸序列，它 编码Bv13033 1-159的氨基酸序列(图10)。氨基酸序列仅含Bv13033 的N末端区，不含NBS和LRR结构域，或来自这些结构域的元件。用 限制性酶SacII和BamHI切割PCR产物，并克隆到载体pCaMV-2中。 得到的载体命名为p70S-13033_#159。通过瞬时生物弹射击转化来定量 检测构建体p70S-13033和p70S-13033_#159在甜菜叶中启动细胞死亡的 能力。为了该目的，将每个载体分别与报告基因载体p70S-luc共转化。 空载体pCaMV-2作为阳性对照。与空载体(pCaMV-2)的转化相比较， p70S-13033的转化可产生95％可测的报告基因活性，而p70S-165_#175 的转化仅产生68％可测的报告基因活性(图7)。该结果表明全长克隆 Bv13033的表达仅可在转化的组织中启动较弱的细胞死亡。另一方面， 13033_#159 N末端159个氨基酸的排他表达可在转化的甜菜叶中引发强 烈的细胞死亡。该差异的原因是R蛋白通过缩短N末端产生了新的更强 烈的自激活方式。

通过Bv12069 5’区在甜菜叶中启动细胞死亡

具有如SEQ ID No.4所述的核苷酸序列的R基因Bv12069编码R 蛋白166个氨基酸长的N末端。蛋白Bv12069不含NBS和LRR结构域， 但与自激活R蛋白165_#175、135_#147、13033_#159的175、147和159 个氨基酸长的N末端基因表现出不同的同源性(图10)。cDNA克隆与 载体pCaMV-2的双35S启动子连接(图3)，形成载体p70S-12069。 为了检测基因Bv12069的功能性，将构建体p70S-12069与报告基因载 体p70S-luc通过生物弹射击转化，在甜菜叶中瞬时表达。3次独立实验 中测定的用p70S-12069和p70S-luc转化的叶中的报告基因活性是阳性 对照的活性的51％(空载体pCaMV-2和p70S-luc)(图8)。因此166 个氨基酸长的蛋白Bv12069的表达可在甜菜细胞中启动细胞死亡。

缩短基因BvKWS3 135但不突变MHD结构域可产生自激活R蛋白

将通过把NBS-LRR类型的R蛋白缩减为无NBS和LRR的N末端 的自激活的发明机制，与MHD元件突变的自激活方法进行比较。马铃 薯Rx基因和亚麻L5基因的MHD元件的突变可导致所用基因的自激活 (Bendahamane et al.，2002；Howes et al.，2005)。cDNA克隆 BvKWS3_135对于MHD元件等价于VHD元件，后者是常见的除MHD 元件之外也是R基因的元件(Howles et al.，2005)。如Bendahmane et al. (2002)所述，将相应的突变引入到全长克隆BvKWS3_135。为了该目的， 将基因BvKWS33_135的VHD元件中的氨基酸天冬氨酸用氨基酸缬氨 酸来替代。得到的基因命名为BVKW3_135_D480V。通过根癌土壤杆菌 起始的瞬时过表达来检测甜菜叶中基因135_#147、BvKWS3_135_D408V 和未修饰的基因BvKWS3_135的有效性。为此将cDNA克隆 BvKWS3_135与d35S启动子连在一起并插入到二元载体pER-34Sluci 中。得到的载体命名为pER135-34Sluci。同样地，对缩短的具有如SEQ ID No.2所述的核苷酸序列的cDNA克隆135_#147以及突变的cDNA克 隆BvKWS3_135_D408V进行加工。得到的载体命名为pER135_#147- 35Sluci和pER135_D480V-35Sluci。将载体转化到土壤杆菌菌株或所述 的C58C1细胞系中，并与对照pER-35Sluci同时注射到甜菜叶中。接种 后的1、2和3天在转化叶片中测定北美萤火虫荧光素酶报告基因的活 性。用对照构建体pER-35Sluci转化的甜菜叶在第1天的活性较小，在 第2和3天的荧光素酶活性为299,000和433,000 RLU/mg叶组织。用构 建体pER135-35Sluci转化的甜菜叶的荧光素酶活性在第2天和第3天为 190,000和245,000 RLU/mg叶组织，因此与阳性对照pER-35Sluci相比 较，表现出可测定的细胞死亡。构建体pER_135_D480V-35Sluci的报告 基因活性在第2天和第3天测定为188,000和206,000 RLU/mg(图9)。 因此，在基因BvKWS3_135中引入MHD突变不产生或产生很少可测定 的自激活。根据本过程缩短的R基因135_#147在第2天和第3天的报 告基因活性为90,000和63,000 RLU/mg(图9)，因此比构建体 pER135-35Sluci和pER_135_D480V-35Sluci引发更强的细胞死亡和自激 活。

在BvKWS3 165、BvKWS3 135、Bv13033和Bv12069及StR3a R蛋白的N末端中通用氨基酸元件的鉴定

将175、147、159和166个氨基酸长的R蛋白BvKWS3_165、 BvKWS3_135、Bv13033和Bv12069的N末端与155个氨基酸长的马铃 薯R3a基因(Huang et el.，2005)的N末端进行同源性比较，以鉴定通 用序列元件。通过比较在自激活R蛋白的N末端鉴定出多个共有序列。 在图10a)中高亮标出通用序列元件的共有序列。

一个共有序列对应于如SEQ ID NO：13：AVLXDAEXKQXX XXXLXXWLXD LKDXVYDXDD ILDE所述的氨基酸序列。另一个共有序列对应于 如SEQ ID NO：14：IXEIXXKLDD L所述的氨基酸序列。

此处字母X表示任何氨基酸。

这两个所述形式的共有序列仅包含在这种其表达会导致自激活的 CC-NBS-LRR R蛋白的N末端中。因此，RX基因的160个氨基酸长的 CC结构域不能引发细胞死亡或超敏反应(Bendahmane et al.，2002)。 与全长R基因BvKWS3_133_e08相比较，甜菜R基因BvKWS3_133_e08 177个氨基酸长的N末端和马铃薯R1基因540个氨基酸长的N末端 (Ballvora et al.，2002)的瞬时表达没有引发扩增，对R1基因而言，没 有细胞死亡(数据未显示)。自激活蛋白BvKWS3_165_#176、 BvKWS3_135_#147、Bv13033_#159、Bv12069和StR3a-#1-155 N末端与 Rx-、StR1-和BvKWS3_133_#177蛋白CC结构域氨基酸序列的氨基酸 比较表明，在非激活N末端不含上述共有序列(图10b)。特别是序列 元件DAE对鉴定其N末端是自激活的R蛋白是非常重要的。在共有序 列中的序列元件DAE的协助下，可在多个植物物种中找到合适的自激 活R基因，如图10c所示，例如拟南芥(AtAB028617)、豆(PvulgarisJ71)、 水稻(osativaAp003073)、大豆(GmaxKR4)和番茄(Tomato-I2)。

氨基酸序列147-175对R蛋白165#175的自激活是重要的

为了鉴定165_#175蛋白中对NBS-LRR蛋白N末端自激活重要的氨 基酸部分，将cDNA克隆165_#175的编码区缩短。cDNA克隆165_#93 和165_#146编码165_#175蛋白的1-93或1-146氨基酸。构建体 p70S_165_#93、p70S_165_#146和p70S_165_#175的瞬时生物弹射击实 验表明只有165_#175蛋白可启动强烈的细胞死亡，而165_#93和 165_#146不能(图11)。因此，146-175序列区域对NBS-LRR蛋白自 激活是必需的。在该区域含有所有被检测蛋白中都保守的序列元件(图 10a)。

合成的病原体诱导型启动子2xS-2xD和2xW2-2xD通过真菌侵染而产生的快速激活

对完整或部分抗性基因的病原体诱导的过表达而言，特别合适的是 nxS-mxD、nxW2-mxD和nxGst1-mxD类的合成启动子，其中n＝1、2、 3、4、5、6、7、8、9、10，m＝1、2、3、4、5、6、7、8、9、10。例 如，将如SEQ ID NO.10所述的2xS-2xD类启动子、如SEQ ID NO.11 所述的2xW2-2xD类启动子及如SEQ ID NO.12所述的2xGst1-2xD类启 动子与来自北美萤火虫的荧光素酶基因连接，转化到甜菜中，然后分析 对真菌侵染的反应。

对植物转化而言，可使用二元载体2xS-2xD-luc-kan、2xW2-2xD- luc-kan和2xGst1-2xD-luc-kan。将二元载体通过直接DNA转化过程用定 居质粒pGV2260转化到根癌土壤杆菌C58C1中(An，1987)。用抗生 素卡那霉素(50mg/l)筛选重组根癌土壤杆菌克隆。

根据Lindsey et al.(1991)用抗生素卡那霉素进行甜菜的转化。通过 PCR检测植物的转基因性。使用引物GTGGAGAGGCTATTCGGTA和 CCACCATGATATTCGGCAAG可从nptII基因扩增533个碱基对长的DNA片 段。用10ng基因组DNA进行PCR，引物浓度为0.2μM，退火温度 为55℃，在Mutli-Cycler PTC-200(MJ Reasearch，Watertown，USA)进 行扩增。

为了分析启动子的病原体诱导性，将转基因甜菜在体外条件下用甜 菜叶斑点诱导者甜菜褐斑病菌进行感染。分别将4个转基因系的植株浸 泡在甜菜褐斑病菌菌丝体片段的悬浮液(400,000片段/ml)中，另外4 个植株浸泡在稀释的营养液中作为对照。然后将感染植株和对照植株在 培养箱中25℃光照温育16小时。在接种后1、2、3、4和6-7天除去感 染的和未感染的叶材料，用荧光素酶检测系统(Promega，Mannheim， Germany)如述测定荧光素酶报告基因的活性。

2xS-2xD和2xW2-2xD启动子在感染早期均具有快速强烈的病原体 诱导性，但在基础活性和启动子强度上有所不同(图12-13)。与未感 染植株相比较，2xS-2xD启动子可在转基因系PR39/11、PR39/48和 PR39/49中被快速诱导，在接种后第1天已达到11-59倍，在第2天达 到21-384倍(图12)。而第1天以真菌菌丝在表皮的生长为特征，在 第2天，真菌菌丝通过气孔穿入叶片，进入叶组织。在第7天感染的后 期，可通过可见坏死的发展测定启动子被诱导了113-792倍。未感染植 株以报告基因活性测定的2xS-2xD启动子的基础活性很低，仅为非转基 因植株的荧光素酶活性的1-10倍。

2xW2-2xD启动子的激活有时比2xS-2xD启动子慢。在感染第1天， 2xW2-2xD启动子仅具有2-11倍病原体诱导活性，在感染第2天为5-56 倍。在第7天产生坏死，达到最大的318-672倍病原体诱导性(13)。 与非转基因植物相比较具有10-50倍报告基因活性的2xW2-2-D启动子 的基础活性比2xS-2xD启动子高。2xW2-2xD启动子显著超过了2xS-2xD 启动子约10倍以上的启动子强度。

通过改变顺式元件数目来优化启动子特性

根据基因表达的需要，可通过改变顺式元件的数目来调控和优化具 有n＝1、2、3、4、5、6、7、8、9、10及m＝1、2、3、4、5、6、7、 8、9、10的nxS-mxD、nxW2-mxD和nxGst1-mxD类型合成启动子的特 性。以nxS-mxD型启动子为例进行说明。除了二元载体2xS-2xD-luc-kan 外，构建二元载体4xS-2xD-luc-kan、2xS-4xD-luc-kan和4xS-4xD-luc- kan，并转化到甜菜中。用甜菜褐斑病菌如上所述感染植物，并在真菌 接种后每日测定报告基因的活性。测定来自13个独立的2xS-2xD-luc 系、14个独立的4xS-2xD-luc系、15个独立的2xS-4xD-luc系及15个独 立的4xS-4xD-luc系的实验结果，并比较其启动子强度、病原体诱导性 和基础活性的测定值。

将2xS-2xD启动子与变异体2xS-4xD、4xS-2xD和4xS-4xD进行比 较，结果表明，与二聚体启动子构建体相比较，使用四聚体可增加平均 启动子的强度(图14)。另外，在所有测量的时间间隔，二聚体-二聚 体启动子(2xS-2xD)的病原体诱导性随着四聚体-二聚体和二聚体-四聚 体启动子(4xS-2xD、4xS-2xD)升高至四聚体-四聚体启动子(4xS-4xD) (表1)。

启动子 (独立转化子的数目)   第1天   第2天   第3天   第4天 2xS-2xD (13系)   1.9     3.6   27     59 4xS-2xD (14系)   3.1     4.8   52     135 2xS-4xD (15系)   1.4     9.2   54     87 4xS-4xD (15系)   2.9     9.8   90     93

表1：启动子2xS-2xD、4xS-2xD、2xS-4xD和4xS-4xD在感染甜菜 褐斑病菌后的转基因甜菜中的病原体诱导性。

所示的是每个启动子构建体在接种1-4天13-15个独立转化子(系) 的病原体诱导性的平均值。

随着启动子强度和病原体诱导性的增加，可导致含四聚体的启动子 的基础活性也增加(表2)。

  启动子   (独立转化子的数目)   第1天   第2天     第3天     第4天   2xS-2xD   (13系)   4.7   5.5     5.2     2.6   4xS-2xD   (14系)   14.2   21     7.8     11   2xS-4xD   (15系)   24.6   13.3     7     22.3   4xS-4xD   (15系)   35.5   20.3     6.3     20

表2：启动子2xS-2xD、4xS-2xD、2xS-4xD和4xS-4xD在转基因甜 菜叶中的基础活性。

所示的是每个启动子构建体13-15个独立转化子(系)的基础活性 的平均值，是在4天感染实验中作为未感染对照来测定的。基础活性提 供了与非转基因植物的非特异背景活性相比较而言的转基因植物的报 告基因活性的行为或关系。

该实施例表明，对诸如启动子强度、诱导性和基础活性等概念重要 的启动子特征可通过顺式元件的数目来调控，因此可构建合适的启动子 病原体用于各种技术转换。在实验性实施例中，与病原体的诱导性相关 的病原体诱导性启动子的顺式元件的最佳数目大于如Rushton et al.， 2002所述的二聚体溶液。

通过病原体诱导的抗性基因的转化来产生真菌抗性

为了增加甜菜的真菌抗性，将启动子2xS-2xD或2xW₂-2xD分别与 四个R基因BvKWS3_123、BvKWS3_133、BvKWS3_135和BvKWS3_165 连接，并转化到甜菜中。然后用SacI切割13,959或13,969kb长的二元 载体2xS-2xD-luc-kan和2xW2-2xD-luc-kan，并用T4-DNA聚合酶处理 来填充切割位点。然后将载体用XhoI重新切割，电泳分离，使12,284 或12,294kb长的载体与1,675kb长的荧光素酶基因分开并分离。

从载体p70S-BvKWS3_123、p70S-BvKWS3_133、p70S-BvKWS3_135 和p70S-BvKWS3_165中分离ZR抗性基因。为此，首先用NotI使载体 线性化，切割位点用Klenow处理而填充。然后用XhoI切割载体，并分 离R基因。得到的载体命名为2xS-2xD-BvKWS3_123、2xS-2xD- BvKWS3_133、2xS-2xD-BvKWS3_135和2xS-2xD-BvKWS3_165，或 2xW₂-2xD-BvKWS3_123、2xW₂-2xD-BvKWS3_133、2xW₂-2xD- BvKWS3_135和2xW₂-2xD-BvKWS3_165(图15-18)。用二元载体如上 所述产生转基因甜菜。

通过对植物病原体真菌--甜菜褐斑病菌的抗性实验来鉴定抗真菌的甜菜。

在真菌抗性实验中可观察到增强的真菌抗性，该实验如下进行描 述，作为甜菜对甜菜褐斑病菌的抗性检测的示例。

对用叶斑点诱导物甜菜褐斑病菌所感染甜菜而言，除了转基因植株 外，也使用基因型为3DC4156的甜菜在温室中进行转化。在接种蔬菜汁 前2周，用侵染性甜菜褐斑病菌分离株Ahlburg涂布平板(40％Albani 蔬菜汁)，并在25℃温育。在接种前，将长有真菌的琼脂用刮铲(object carrier)和水刮下来。通过细胞计数器测定菌丝体片段的浓度。用水稀 释调整接种密度为20,000片段/ml。将10-12周龄的植株反向浸泡在5L 含接种物的玻璃烧杯中进行感染。对每个待测的系，将30个植株进行 接种，并将植株在温室中随机排列。

接种后将植株在28℃，95％湿度的温室中温育4天。第4天后，将 湿度降低为60-70％。接种2、3和4周后，用Kleinwanzlebener Saatzucht (KWS)等级方案(1970)(1＝健康叶，9＝100％损坏的叶)目测叶落。 与对照相比较，用构建体2xS-2xD-BvKWS3_123、2xS-2xD- BvKWS3_133、2xS-2xD-BvKWS3_165、2xW₂-2xD-BvKWS3_123、 2xW₂-2xD-BvKWS3_133、2xW₂-2xD-BvKWS3_135或2xW₂-2xD- BvKWS3_165转化的转基因系具有增强的真菌抗性(表3)。

    对照(非转基因)     T3¹  AUDPC²转基因系   T3¹    AUDPC²谱系名称     构建体     6.0    220  PR68-6    4.6    169   2xS-2xD-BvKWS3-133     6.8    193  PR74-73   6.1    157   2xS-2xD-BvKWS3-123     4.1    167  PR75-8    2.8    132   2xS-2xD-BvKWS3-165     6.0    220  PR69-15   5.3    177   2xW₂-2xD-BvKWS3-133     7.0    226  PR70-32   5.5    182   2xW₂-2xD-BvKWS3-123     6.8    193  PR77-42   5.6    155   2xW₂-2xD-BvKWS3-135     6.8    229  PR71-41   5.6    182   2xW₂-2xD-BvKWS3-165

表3：对植物病原体真菌--甜菜褐斑病菌抗性增强的转基因甜 菜。

¹抗性实验中第3个和最后一个等级的值(1＝健康，9＝100％损坏 的叶表面)。

²在3个等级时间段(T1-T3)测定的AUDPC(疾病进程曲线下的 面积)值。AUDPC将多个等级时间点的侵染强度的进程包括在单个值 中。

转化子PR68-6和PR70-32的3个等级时间段的侵染时间进程分析 表明，在实验持续时间内，对照和转基因系的侵染进程的差异增加(图 19和20)。这些结果表明在病原体特异启动子的协助下，甜菜的不同R 基因的诱导型表达可导致对真菌抗性增加。

通过转化在病原体应答启动子控制下的R基因N末端区来产生真菌抗性植株。

为了产生真菌抗性植株，使用R基因N末端区，将缩减或缩短的R 基因13033_#159、135_#147、165_#175和Bv12069与启动子2xS-2xD 和2xW2-2xD连接，并转化到甜菜中。

为此，用SacI切割13,959或13,969kb长的二元载体2xS-2xD-luc- kan和2xW2-2xD-luc-kan，并用T4 DNA聚合酶填充切割位点。然后， 用XhoI进一步切割载体，凝胶电泳分离，使12,284或12,294kb长的载 体与1,675长的荧光素酶基因分开。

从载体p70S-12069、p70S-13033_#159、p70S-135_#147和p70S- 165_#175中分离缩短的R基因。首先将载体用XbaI线性化，DNA末端 用Klenow处理填充，用XhoI进一步切割载体。然后将分离的R基因片 段克隆到制备的二元载体中。得到的载体命名为2xS-2xD-12069、2xS- 2xD-13033_#159、2xS-2xD-135_#147、2xS-2xD-165_#175或2xW2- 2xD-12069、2xW2-2xD-13033_#159、2xW2-2xD-135_#147、2xW2-2xD- 165_#175(图21-22)。将二元载体如上所述转化到甜菜中，并通过甜 菜褐斑病菌抗性实验鉴定真菌抗性植株。

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序列表

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Street：Grimsehlstrasse 31

City：Einbeck

State：

Country：Germany

PostalCode：D-37555

PhoneNumber：004 9-5561-311-0

FaxNumber：004 9-5561-311-322

EmailAddress：info@kws.de

<110>OrganizationName：KWS SAAT AG

Application Project

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<120>Title：自激活抗性蛋白

<130>AppFileReference：KWS SAAT AG

<140>CurrentAppNumber：

<141>CurrentFilingDate：_____-___-___

序列

--------

<213>生物名称：

<400>前序列串：

gaattcgagc  tccaccgcgg  gattctaata  cgactcacta  tagggcaagc  agtggtatca    60

acgcagagta  cgcggrgatt  catactctac  ttccatactt  tgtaaaaaca  aaaaaagata    120

aaaatggtga  taggcggaga  gatttttcta  tcagcgtttc  ttcaagtgct  ctttgaaaag    180

cttgcatcag  gagggataag  tctattccta  aaaagagaaa  aaggaatagg  acctaaagtt    240

attcaaagat  ggaacaaaaa  attgagatta  atagaggcgg  ttttaagtga  cgccgagcaa    300

aagcagtttc  acaacaatgc  cgtcaaattg  tggcttcgag  atcttcaaga  gttcgcgtac    360

gatttagagg  acatcttaga  cgaatttgat  acagatgctc  gacttaagga  gttcaatgat    420

cagcctcagc  cacagccaca  ggaacatcaa  cccaaatctt  cttgttctcc  tttcaataag    480

gtacaaagct  gtctttcttg  tggtttccca  actttaaata  agaaaactac  aaagtattca    540

actagcattg  aagagatgag  cactcgcttg  gaagatcttc  tggaccaagt  aaggtctttg    600

gctctctcaa  cgcagataca  ctcaagggta  gagcaacatg  aagaacggag  gtgaggatcc    660

<212>类型：DNA

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     序列名：序列 1

     序列描述：

序列

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<213>生物名称：

<400>前序列串：

gaattcgagc  tccaccgcgg  gattctaata  cgactcacta  tagggcaagc  agtggtatca    60

acgcagagta  cgcggggaat  ttgaagtcat  catcaacctc  ttatcatcat  ccaactccaa    120

gattctctca  tcactgacag  ttctggagta  gaatatggtg  gacgcagtgg  tcactgtgtt    180

tttggaaaaa  cttttcaatg  tccttgttca  ggagggtggt  gttttacttg  gtttcaaaga    240

tcggtttaag  aagctacaaa  atgatctcaa  atacatgcaa  agcttcttta  aagacgccga    300

gaggctcaaa  aggaaagatg  agtctctaaa  atgcactctg  gccgacatgc  gtgagctggt    360

atatgaagct  gaagacatac  ttgcagattg  ccagcttttg  tcaaatagtt  ctggaaaact    420

tcttgaagac  tattctccta  caaaggttcc  agccaaatat  caaatgggga  aaagaattgg    480

tgaaatcaat  gaaaagatca  atagcattaa  aaataacatc  tcagcttttc  ttgggcctct    540

tcaacctgtc catggtaatg tagaagaaga gggaccaccc agatggagtt ctccctgagg    600

atcc                                                                 604

<212>类型：DNA

<211>长度：604

     序列名：序列 2

     序列描述：

序列

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<213>生物名称：

<400>前序列串：

gaattcgagc tccaccgcgg acgcgtgggc agcagccaaa cacacacttt ctctcctgat    60

catcaatcat cattatcatc tccaaaacca aaaatggaat tcataagcac aacagtctct    120

atcgctgaaa aactgaatac tgcactgcag ttatgggagt tcaaagacaa gctctttagt    180

aacttcagct acgaaaccga acttgaggat ctccaacgca ccgtcagttc cataactgcg    240

gcgctacatg tagcagagac caagctggag ctctccgatg aactacaacg tcaaatcgag    300

gagctcaagg ataccatctt tgaagcggat gatctactgg atgagcttgt cactctttct    360

caccagcagc gggttgtaga tgccgatggt agtctcctag ataaagtaag acacttcttc    420

tctagttcca acccaatctg tgtttcttac tggatgtctc gggggagtaa ggatatcaag    480

aagaaattag atgatattgc taacaataat cagtttagct tagagcttga tcatgagcct    540

atcaggaaca gaaggcctga gacttgttct tgaggatcct                          580

<212>类型：DNA

<211>长度：580

     序列名：序列 3

     序列描述：

序列

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<213>生物名称：

<400>前序列串：

agtttgtaca aaaaagcagg ctggtaccgg tccggaattc ccgggatatc gtcgacccac    60

gcgtccgctt caacaaccca tctcttcaat aattgtgaaa aaccacaaat catgattaag    120

taatttctgc accacttttg catcctcagc cccttctaaa tccttccccc tgaagtgatc    180

aataatcatt agaatgtctg aagcactact gtgggctgtc acaaaaacaa cacttgcaca    240

cattgctact tttgctggtg atcttacctg cagttatgct acacaaggca ttttagcagc    300

tcaaggtgtc cgaaacgacc tcaaaaagat cgagaacaag ctgattgcta ttcgcgctgt    360

tctgcaagat gcagaaagta agcaatatga tagcgaggct gtcaagattt ggctgaaaga    420

tgtcaaaaat gttgtgtatg atatagatga cctcttggat gaagttcaca ctgatctgtt    480

acgaaagaga atcaacaaaa gccatctgct tcgacaaatc aggtactatc tttcatcctc    540

gaatccaatt ctgagtaatt tttattggag tgataagatt agagaccttg ttcaaagatt    600

tgatgacatt gctgctaata gacgagatct tggattggat ggtcatgatc caattgaagt    660

atacaacatt gagaggaatc ctttagatgc ataatcatat gtgaagaaat cagaaattat    720

tggtagagat gaagctaggt ccgaaataat tagacgctta actagtagta ctagtgttgg    780

agatgctagt aggttggttg tgcttccgat agttgggttt ggcgggattg ggaaaacagc    840

attggcaaag cttgttttta atgatgagtg ggttgctagt aactttgata ttaagttgtg    900

ggcatgtgtc tctgaaaaat ttgatctgca gaagactaca gaagaaattt tgaattctgt    960

aagtaatgaa accactgcaa acctcaacat gagacagttg catgaaaaac tccgtgagat    1020

attggatgat cggaagcatt tccttgtgct ggacaatgtg tggatcgagg acatcaaagt    1080

gcactccaca ggaagcattt ccttgtactg gcatttagag agggtgaaga aacaagatac    1140

ccaaagcttg ctacaatcgg gaaaagcatt gttgaaaatt gtggcggggt tcctctggtt    1200

gttaaggttc ttgcaagcct gttacacagt gaaaggaacg agaaagaatg gaggcgaatt    1260

tctgaaacaa acaacataat gatatcaaac aagctttgag agtgagctac aataaactcc    1320

catctcaatt aaaagcatgt ttttcctatt gttcattatt tgtgaaggat agcaagctta    1380

atcctccgat tttgtcatgc ctgtggagtg cacttggaat cttgcaacga ggtaacgaca    1440

atgaagagtt ataatccatt ggatacaagt attgtgaaga cctatagtca agatgtcttc    1500

ttcaggatgc atttcttgtg ttcaccgaaa ttataagtga atgtagaatg cacgacttat    1560

tccatgattt agcaactgac cttgttggtg aagagatagc tgttgtgacc agtaatcatc    1620

ttaatgtttc agatatgtgc aggcatttag tatggggata tgaaggaggt gaaggtttat    1680

cagataagaa tttcccaaaa gagctactta gagcaaagaa ggctcgaact ttcagatttg    1740

gctatgcaat gggctatatt agcaagtcat ttattgaaag tattatacac aacttcaggt    1800

gcttacgtgt gttggatttg cattagagta gcttcgagga gttgtcgatg tcaattggga    1860

agttagaaca tctaagatat cttgacctgt cctacaaccc aatcatcaaa tttcttccaa    1920

gtacactatg caagttgttg aatctacaat cgttgtatgt tccaaaaaaa aaaaaaaagg    1980

gcggccgctc tagagtatcc ctcgaggggc ccaagcttac gcgtacccag ctttcttgta    2040

caaagtg                                                              2047

<212>类型：DNA

<211>长度：2047

     序列名：序列 4

     序列描述：

序列

--------

<213>生物名称：

<400>前序列串：

gattcatact ctacttccat actttgtaaa aacaaaaaaa gataaaaatg gtgataggcg    60

gagagatttt tctatcagcg tttcttcaag tgctctttga aaagcttgca tcaggaggga    120

taagtctatt cctaaaaaga gaaaaaggaa taggacctaa agttattcaa agatggaaca    180

aaaaattgag attaatagag gcggttttaa gtgacgccga gcaaaagcag tttcacaaca    240

atgccgtcaa attgtggctt cgagatcttc aagagttcgc gtacgattta gaggacatct    300

tagacgaatt tgatacagat gctcgactta aggagttcaa tgatcagcct cagccacagc    360

cacaggaaca tcaacccaaa tcttcttgtt ctcctttcaa taaggtacaa agctgtcttt    420

cttgtggttt cccaacttta aataagaaaa ctacaaagta ttcaactagc attgaagaga    480

tgagcactcg cttggaagat cttctggacc aagtaaggtc tttggctctc tcaacgcaga    540

tacactcaag ggtagagcaa catgaagaac ggagggaaac atcatctatg atacgggagc    600

cagttgtata tgggagggac gatgagaaaa atcagataat ccaaagatta ttaaagacag    660

atgagccatt ttgtgaaaat tacaatgtaa ttcctattgt tggaacagga ggcattggga    720

agacgaccct cgctcaggct gtatacaatg atgagcaggt gaaggctcac tttgatgtaa    780

aagcatgggt gtgcatctcc gatgagtttg atgtcaaaca agtgacaaca agcattatca    840

cttcagccac tcgtgataca tgtaatttcg gtgttctaga tgaggcacaa gataaattaa    900 

agaacttgct tgtagacaaa agattcttga tcgttcttga tgatatatgg agtgatgaat    960

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taatcacgac cagaatggag acggtggcaa agaacatggt taaaagacca gatcaaagcc    1080

ccatcatcaa gttaaaggtt ttatctgatg atgattgttg gcttctcttt caaaagcatg    1140

cagtcgtaga tgaagacctc attgtgatgc agaaggactt ggttgggttg ttcaaaggat    1200

tgcctttggc tgcaaaagct ctaggaggtc tcctaaggag agagcgtaag agtaattggg    1260

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tccaaaaact ttcttctaga acacgttatt ggtctttctc tgaagaaata ctgatagatc    1680

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tccctctaat cgaacttcaa caccttgatg ttagtagtag gtatgctgct tcaccgttgg    2040

ggattggaaa attaacaaac ttgcagacat tgaagggatt tactttgaga agatactcta    2100

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tcccatccct aaaagacttg tccattggca aatgcaaaga gttgagattg tcacttccaa    2760

gctgcccttt gctccaaaaa ttgactatta taacatatga gacgccattt agtattgctg    2820

attgtttgcc ctcaactctt gagaccctgg aaatcttgca ctccgaaata gagcagccaa    2880

ttcaagagtg gaaacttgac ctccttactt ctcttaaatc tcttgatctc caaaacatag    2940

gcagagccgc agatacaata gagcatattc cccaaccaga ttttcatctt ccctcttcct    3000

tgtcttcctt atatatctcg gatttcaaga atttgaaatc cttgtcatgc tctacccttc    3060

ccaacctcac tgaaattaaa atctggaatt gtaagaagct ggaatcattg ggtgtcgatt    3120

tcccaccatc gaagcttcag gaagcgtatt ttagtgattg ccctttgatt tatcaacgat    3180

gcaaaccgga tccccatgga cttattgttt ttaattatat tgataaatac aaatattcgt    3240

acatttgaag attccagttt tcattccctg aagattgagt tggaggtgga gttttggggt    3300

ttttttcaga ttttgttttt gttttttttc attttcttta gtttatttgt atgaaactag    3360

aatatattca aggaattgtg ataaaaaaaa aaaaaaaagg gcggccgctc tagagtatcc    3420

ctcgaggggc ccaagcttac gcgacccagc tttcttacaa agg                      3463

<212>类型：DNA

<211>长度：3463

     序列名：序列 5

     序列描述：

序列

--------

<213>生物名称：

<400>前序列串：

cagccaccaa agaggaccca gaat            24

<212>类型：DNA

<211>长度：24

     序列名：序列 6

     序列描述：

序列

-------- 

<213>生物名称：

<400>前序列串：

ttattcagcc atcaaagttg accaataat       29

<212>类型：DNA

<211>长度：29

     序列名：序列 7

     序列描述：

序列

--------

<213>生物名称：

<400>前序列串：

tacaattcaa acattgttca aacaaggaac c    31

<212>类型：DNA

<211>长度：31

     序列名：序列8

     序列描述：

序列

--------

<213>生物名称：

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ttctagccac cagatttgac caaac    25

<212>类型：DNA

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     序列名：序列9

     序列描述：

序列

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<213>生物名称：

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actagtcagc caccaaagag gacccagaat tctagtcagc caccaaagag gacccagaat    60

tctagttaca attcaaacat tgttcaaaca aggaacctct agttacaatt caaacattgt    120

tcaaacaagg aacctctaga g                                              141

<212>类型：DNA

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     序列名：序列 10

     序列描述：

序列

--------

<213>生物名称：

<400>前序列串：

actagtttat tcagccatca aagttgacca ataattctag tttattcagc catcaaagtt    60

gaccaataat tctagttaca attcaaacat tgttcaaaca aggaacctct agttacaatt    120

caaacattgt tcaaacaagg aacctctaga                                     150

<212>类型：DNA

<211>长度：150

     序列名：序列 11

     序列描述：

序列

--------

<213>生物名称：

<400>前序列串：

actagtttct agccaccaga tttgaccaaa ctctagtttc tagccaccag atttgaccaa    60

actctagtta caattcaaac attgttcaaa caaggaacct ctagttacaa ttcaaacatt    120

gttcaaacaa ggaacctcta ga                                             142

<212>类型：DNA

<211>长度：142

     序列名：序列 12

     序列描述：

序列

--------

<213>生物名称：

<400>前序列串：

AVLXDAEXKQ XXXXXLXXWL XDLKDXVYDX DDI LDE    36

<212>类型：PRT

<211>长度：36

     序列名：序列13

     序列描述：

序列

--------

<213>生物名称：

<400>前序列串：

IXEIXXKLDD I                                11

<212>类型：PRT

<211>长度：11

     序列名：序列 14

     序列描述：

序列

--------

<213>生物名称：

<400>前序列串：

AVLXDAEXKQ XXXXXLXXWL XDLKDXVYDX DDILDEXXXX XXXXXXXXXX XXXXXXXXXX    60

XXXXXXXXXX XXXXXXXXXX XXXXXXXXIX EIXXKLDDI                           99

<212>类型：PRT

<211>长度：99

     序列名：序列 15

     序列描述：

序列

--------

<213>生物名称：

<400>前序列串：

atggagattg gcttagcagt tggtggtgca tttctctctt cagctttgaa tgttctcttt    60

gataggcttg ctcctcacgg tgatctgctc aacatgtttc agaagcataa ggatcatgtt    120

aagctcttaa agaagctgga ggacattttg ctcggtcttc agattgtgct aagtgatgca    180

gagaataaac aagcatcaaa tcgacatgtg agccagtggt tcaataagct tcagaatgct    240

gtggacggtg ctgagaactt gatagaacaa gtcaattatg aagctttgag gcttaaggtg    300

gaaggccagc atcaaaatct tgcagaaaca agcaaccagc aagtaagtga ccttaacctg    360

tgcttcagtg atgatttctt tcttaacata aaggataagt tggaagaaac cattgaaaca    420

ttggaggtgt tggaaaagca aattggtcgc cttgtaatca ctagctag                 468

<212>类型：DNA

<211>长度：468

     序列名：序列16

     序列描述.