Ⅰ，稻瘟病抗性蛋白Pi36卷曲螺旋结构域免疫自激活的分子机理；Ⅱ，拟南芥广谱抗病蛋白RPW8.1与乙烯信号的相互调控

摘要

第一部分稻瘟抗性蛋白Pi36卷曲螺旋结构域免疫自激活的分子机理
　　植物在长期与病原菌的共存中进化出了许多结构保守的抗病蛋白，这些蛋白往往包含一个N端的卷曲螺旋(CC)结构域，一个中部的核苷酸绑定(NB)结构域和一个亮氨酸重复序列(LRR)。在模式植物拟南芥中有很多CC-NB-LRR蛋白的CC结构域往往能触发自身免疫。但是，是否所有的或者哪些CC结构域都能够激发自身免疫这一问题尚不清楚。此处，我们成功的扩增到Pi36, RGA4，RGA5，Pikm-1，Pikm-2，Pish，Pita和Pb1这八个稻瘟病抗病基因编码CC结构域的序列。通过瞬时表达试验证明只有Pi36的CC结构域能够在本氏烟和水稻原生质体中触发细胞死亡。通过酵母双杂交和双分子荧光互补试验证明Pi36 CC结构域的自身相互作用是其激活细胞死亡所必需的。而后，证明使用拟南芥抗白粉病蛋白8.2(RPW8.2)的启动子在拟南芥中异位表达Pi36 CC结构域能够提高拟南芥对白粉菌的抗病性;使用噻菌灵诱导蛋白1(PBZ1)的启动子在水稻中异位表达Pi36 CC结构域能够提高水稻对稻瘟菌的抗病性。随后，使用Pi36 CC结构域作为诱饵筛选稻瘟菌侵染后的水稻叶片cDNA酵母文库找到Pi36 CC结构域的互作蛋白，一个乙烯信号通路转录因子OsEIL2，并结合双子分荧光互补试验进行验证，确认OsEIL2为Pi36 CC结构域的互作蛋白。构建OsEIL2过表达与干涉水稻转基因材料，证明OsEIL2正调控水稻稻瘟病抗病性。综上，本论文证明稻瘟病抗病蛋白Pi36 CC结构域能够触发自身免疫并且异位表达能够提高拟南芥和水稻抗病性，并与OsEIL2相互作用，而OsEIL2正调控水稻抗病性。因此，本论文揭示了诱导表达某一抗病蛋白CC结构域可能是一种潜在的构筑作物抗病性的方式。
　　第二部分拟南芥广谱抗病蛋白RPW8.1与乙烯信号的相互调控
　　拟南芥广谱抗病蛋白RPW8.1是一个具有非典型结构的抗病蛋白，它由一个跨膜结构域（TM）和一个CCR亚型卷曲结构域(CCR)组成。在使用RPW8.1自身启动子表达RPW8.1-YFP融合蛋白的转基因材料(R1Y4)中，发现RPW8.1-YFP定位在叶绿体周围，使拟南芥产生独特的细胞死亡，并提高对白粉病和霜霉病的抗病性。但是，RPW8.1-YFP融合蛋白产生独特细胞死亡和抗病性的分子机制尚不清楚。因此，我们使用RPW8.1蛋白作为诱饵筛选白粉菌侵染后的拟南芥叶片cDNA酵母文库找到RPW8.1的互作蛋白ACC氧化酶4(ACO4)，并结合双子分荧光互补试验进行验证，确认ACO4与RPW8.1特异互作。随后，证明RPW8.1稳定表达和瞬时表达都能影响乙烯的生物合成并能激发乙烯信号响应。同时，我们通过杂交获得以R1Y4为背景的乙烯核心转录因子EIN3过表达、ein3/eil1突变体以及aco2/4突变体并证明了EIN3/EIL1负调控RPW8.1的表达以及RPW8.1介导细胞死亡和抗病性。综上，本论文证明了RPW8.1与ACO4相互作用并影响乙烯的生物合成、激发乙烯信号响应;乙烯信号转导负调控RPW8.1的表达以及RPW8.1介导细胞死亡和抗病性;RPW8.1与乙烯信号之间形成了反馈调节。

目录

声明

摘要

缩略词表

第一章 文献综述

1．1 植物抗病的调控机制

1．1．1 植物抗病基本分类

1．1．2 植物抗病的分子调控机制

1．2 植物抗病蛋白的类型和结构

1．2．1 植物抗病蛋白的类型

1．2．2 NLR抗病蛋白结构的结构和功能

1．3 植物过敏性坏死与抗性蛋白免疫自激活

1．4 水稻稻瘟病抗性蛋白研究进展

1．5 转录因子参与的抗病反应

1．5．1 WRKY、MADS-box与NAC等转录因子参与的水稻抗病反应

1．5．2 水稻中EIL1／2转录因子的功能与参与水稻抗病反应的可能

1．6 乙烯信号系统与植物先天免疫

1．6．1 乙烯生物合成受到多数抗病进程关键因素的影响

1．6．2 植物体中乙烯生物合成概述

1．6．3 植物体中乙烯信号转导概述

1．6．4 乙烯信号是植物先天免疫中的重要组件

1．7 白粉病与抗性基因RPW8研究进展

1．7．1 白粉病简述

1．7．2 拟南芥广谱抗病蛋白RPW8

1．8 选题意义

第二章 材料与方法

2．1 实验材料与试剂

2．1．1 植物材料

2．1．2 菌株

2．1．3 载体质粒

2．1．4 酶和试剂

2．2 培养基和试剂的制备

2．2．1 培养基的配置

2．2．2 试剂配置

2．3 试验方法

2．3．1 序列分析

2．3．2 植物与病原菌培养条件

2．3．3 植物组织DNA提取

2．3．2 植物与病原菌培养条件

2．3．3 植物组织DNA提取

2．3．4 Trizol法提拟南芥及水稻RNA

2．3．5 植物RNA中gDNA去除与逆转录为cDNA

2．3．6 载体构建

2．3．7 大肠杆菌感受态的制备与转化

2．3．8 农杆菌感受态的制备与转化

2．3．9 农杆菌介导的烟草叶片瞬时表达

2．3．10 酵母感受态的制备与转化

2．3．11 双分子荧光互补试验

2．3．12 水稻原生质体的制备和转化

2．3．13 水稻原生质体活力检测

2．3．14 植物病理试验相关染色方法

2．3．15 共转法酵母cDNA文库筛选

2．3．16 水稻稻瘟病抗病性鉴定

2．3．17 农杆菌介导的拟南芥遗传转化与筛选鉴定

2．3．18 农杆菌介导的水稻遗传转化与筛选鉴定

2．3．19 拟南芥乙烯释放量的测定

2．3．20 拟南芥幼苗与叶片乙烯响应试验

2．3．21 细菌生长试验

第三章 稻瘟病抗性蛋白Pi36卷曲螺旋结构域免疫自激活的分子机理

3 结果与分析

3．1 Pi36卷曲螺旋结构域在本氏烟和水稻原生质体中激发细胞死亡

3．2 Pi36通过CC结构域自身互作

3．3 Pi36 CC结构域激发的细胞死亡依赖于CC结构域的自身互作

3．4 异位表达Pi36 CC-YFP提高拟南芥白粉病抗病性

3．5 异位表达Pi36 CC结构域提高水稻稻瘟病抗病性

3．6 Pi36 CC结构域互作组分的筛选与鉴定

3．7 OsEIL2正调控水稻稻瘟病抗病性

4 讨论与结论

4．1 Pi36 CC结构域在激发细胞死亡中的作用

4．2 通过病原菌诱导表达自激活结构域构筑植物抗病性

4．3 Pi36 CC结构域介导细胞死亡与抗病性的下游信号通路与OsEIL2

4．4 结论

第四章 拟南芥广谱抗病蛋白RPW8．1与乙烯信号间的相互调控

5 结果与分析

5．1 RPW8．1互作蛋白的筛选与鉴定

5．2 RPW8．1影响拟南芥乙烯生物合成与信号响应

5．3 ACO家族基因参与负调控RPW8．1介导的细胞死

5．4 EIN3／EIL1负调控RPW8．1介导的细胞死亡和抗病性

6 讨论与结论

6．1 RPW8．1与ACO4相互作用与影响乙烯生物合成及信号转导

6．2 EIN3／EILl对RPW8．1的反向调节

6．3 乙烯与RPW8．1之间的双向反馈调节造就的动态平衡

6．4 结论

参考文献

附录

攻读博士学位期间发表的学术论文

致谢