拟南芥膜联蛋白基因ANN8负调控RPW8.1介导的细胞死亡和抗病性

摘要

拟南芥RPW8对白粉菌具有广谱抗病性，这一基因位点包含两个基因，分别是RPW8.1和RPW8.2。RPW8.2蛋白锚定在吸器外质膜上行使其抗病功能，而RPW8.1蛋白定位在叶肉细胞中的叶绿体周围。为明确RPW8.1产生抗病性的分子机理，用表达RPW8.1-eYFP的转基因系R1Y4为基础材料，进行EMS诱变，筛选细胞死亡和抗病性增强的突变材料，本论文描述对其中一个突变体b7-6进行分析的结果。
　　b7-6突变体表现为比R1Y4更为严重的细胞死亡，与拟南芥生态型Ler杂交构建F2群体，用图位克隆法对突变体基因进行定位克隆，结果发现在At5g12380(编码ANNEXIN8，ANN8)的第280位碱基有一个从A到G的点突变，导致了第94位氨基酸残基由丙氨酸(A)变为苏氨酸(T)。用At5g12380的基因组DNA与eYFP融合导入b7-6后可恢复到R1Y4的表型，说明At5g12380是b7-6中的突变基因，遂将突变体b7-6更名为ann8-1/R1Y4。
　　ANN8是拟南芥膜联蛋白基因家族的一个成员，为了研究NN8在抗病或者细胞死亡过程中的相关功能，将ann8-1/R1 Y4与拟南芥生态型Col-gl杂交分离获得ann8-1（Col-gl为背景的突变材料），同时构建NN8的RNAi载体，导入Col-gl后获得ANN8下调表达的突变体miANN8以及miANN8/R1Y4（下调表达ANN8后与R1Y4杂交获得）。人工接种白粉菌UCSC1和丁香假单胞杆菌DC3000、DC3000（hrcC-）以研究其抗病性;用激光共聚焦显微镜观察，台盼蓝、DAB、苯胺蓝等染色实验以及检测ROS的产生，对ann8-1和ann8-1/R1Y4的抗病性反应做了研究;同时，我们还采用实时荧光定量PCR技术检测抗性标志基因的表达，对ann8-1增强RPW8.1抗病性的机理做了进一步研究;最后，我们检测了膜联蛋白家族在不同组织表达情况以及受丁香假单胞杆菌诱导表达情况。
　　本论文的研究结果表明ANN8参与植物的防御系统，对RPW8.1介导的细胞死亡和抗病性具有负调控作用，主要证据如下:
　　首先，ANN8的突变产生依赖于RPW8.1的细胞死亡以及对白粉菌和细菌的抗病性。ann8-1/R1Y4无论是对强致病白粉菌UCSC1，还是对丁香假单胞菌杆菌DC3000、DC3000（hrcC-）都表现出比R1Y4更强的抗病性;同样地，ann8-1/R1Y4在受病菌侵染后的抗性反应，诸如程序性细胞死亡、过氧化物积累、胼胝质沉积、活性氧爆发，与R1Y4相比都有更强烈的反应。而单独的ann8-1与Col-gl相比抗病性和抗性反应并无明显的差异。ANN8的下调表达突变体miANN8与miANN8/R1Y4分别表现为与ann8-1和ann8-1/R1Y4相似的实验结果。这些结果说明，ANN8的突变可增强RPW8.1的抗病性并加剧相关的抗性反应，但ann8-1行使抗病相关功能依赖于RPW8.1。
　　其次，ANN8对RPW8.1的表达及抗病性具有负调控作用。在研究ann8-1增强R1Y4的抗病性及抗性反应的相关实验中，我们发现ann8-1/R1Y4中的RPW8.1-eYFP荧光强度和RPW8.1的mRNA转录水平都明显高于R1Y4，ann8-1/R1Y4在受白粉菌诱导后的PR1转录水平也同样高于R1Y4。相比于R1Y4，受白粉菌诱导后的ann8-1/R1Y4中的PTI防御信号通路标志基因FRK1的表达也有增高。
　　第三，ANN8可能是拟南芥膜联蛋白基因家族8个成员中与抗病性相关的成员。ANN8的表达模式有别于其它7个膜联蛋白基因，其表达模式为:在植物特定细胞的细胞质中表达，在叶中表达量高，受白粉菌和丁香假单胞菌诱导表达增高明显。这些结果暗示它在拟南芥膜联蛋白家族中参与植物的免疫反应。由此我们推测:ANN8功能缺失突变体ann8-1通过增强RPW8.1的表达，从而激活植物防御相关基因PR1和FRK1，增强植株抗病性。

目录

声明

摘要

符号说明

第一章 文献综述

1．1 植物的抗病性

1．1．1 植物对病原菌入侵的两种防御机制：PTI和ETI

1．1．2 植物对病原真菌的侵入前抗性和侵入后抗性

1．2 植物对病原菌的防御反应

1．2．1 植物的细胞壁、胼胝质与抗性

1．2．2 植物的HR反应、ROS积累、几丁质与抗性

1．2．3 水杨酸信号与抗病性

1．3 拟南芥中的R基因

1．3．1 拟南芥抗病基因研究概况

1．3．2 RPW8的结构和抗性特点

1．3．3 RPW8的最新研究进展

1．4 膜联蛋白及其作用

1．5 论文选题依据及研究意义

第二章 材料与方法

2．1 实验材料

2．1．1 质粒载体

2．1．2 突变体及相关亲本材料

2．1．3 工程菌和病原菌

2．1．4 抗生素

2．1．5 酶和试剂

2．1．6 培养基

2．1．7 主要的实验器材

2．1．8 试剂盒

2．2 实验方法

2．2．1 突变体的筛选、分离群体的构建与基因作图克隆

2．2．2 载体的构建

2．2．3 大肠杆菌和农杆菌感受态的制备

2．2．4 大肠杆菌和农杆菌的电击转化

2．2．5 拟南芥的培养与遗传转化

2．2．6 总RNA的提取

2．2．7 Real-time PCR分析

2．2．8 基因组DNA的提取

2．2．9 活性氧爆发测定

2．2．10 Trypan Blue染色步骤

2．2．11 H2O2的DAB染色

2．2．12 白粉菌侵染后的胼胝质染色

2．2．13 细菌生长实验

第三章 结果与分析

3．1 突变相关基因的图位克隆与互补实验

3．1．1 b7-6群体中的突变基因定位为AT5G12380

3．1．2 互补实验证明ANNEXIN8280A→G引起b7-6细胞死亡增强

3．1．3 ANN8的RNAi分析

3．1．4 ann8-1单突变体的获得

3．2 ann8-1，ann8-1／R1Y4的抗病性及抗性反应研究

3．2．1 ann8-1增强了RPW8．1介导的抗病性

3．2．2 ann8-1增强了RPW8．1介导的抗性反应

3．3 ann8-1增强RPW8．1的抗病性及抗性反应的分子机理

3．3．1 ann8-1增强了RPW8．1的转录水平

3．3．2 ann8-1增强了R1Y4中PR1和FRK1基因受白粉菌诱导表达的程度

3．3．3 ANN8在Annexin蛋白家族中特异的表达模式

第四章 讨论与结论

4．1 ANN8负调控RPWS8．1的抗病性和抗病反应

4．2 展望

参考文献

附录

致谢

攻读学位期间发表的学术论文