过表达拟南芥膜联蛋白基因ANN8削弱RPW8.1介导的细胞死亡和抗病性

摘要

拟南芥抗白粉病基因RPW8.1能够触发植物在侵染点产生过敏反应(hypersensitive response，HR)，从而阻止病原菌的入侵。为了明确RPW8.1是如何调控植物的抗病反应，用一个表达RPW8.1-eYFP的转基因系R1Y4为基础材料，通过EMS诱变得到一系列突变体。通过表型分析，选取了一个细胞死亡明显增强的突变体B7-6，该突变体对白粉菌的抗性强于R1Y4。用PAMP分子flg22或chitin诱导的基础免疫反应，包括程序性细胞死亡、胼胝质的沉积以及活性氧的爆发等在突变体B7-6中比在R1Y4中更加强烈;而且，突变体中RPW8.1的转录水平和RPW8.1-eYFP的积累量都显著高于R1Y4。前期实验通过图位克隆的方法成功地找到了造成该表型的突变基因在At5g12380第280位碱基有一个A到G的点突变，导致了第94位氨基酸残基由丙氨酸(A)变为苏氨酸(T)，该基因编码一个膜联蛋白（ANNEXIN8，ANN8）;互补实验证明了确实是At5g12380基因的突变导致细胞死亡增强的表型。因此，我们推测，ANN8在RPW8.1介导的抗性反应中可能起负调控作用。
　　在本研究中，构建了ANN8过表达载体，分别导入Col-gl和R1Y4，得到这两个背景材料下过表达ANN8的转基因株系（35s-ANN8/Col-gl和35s-ANN8/R1Y4）。我们观察了过表达植株的表型，并对其人工接种了拟南芥混合白粉菌和丁香假单胞杆菌DC3000，以鉴定其抗病性。同时，我们还利用Real-time PCR技术检测了过表达植株(R1Y4背景)中RPW8.1的mRNA水平，以及受白粉菌诱导后相关抗性标志基因的表达量。最后，我们还对ANN8缺失突变体ann8-1在非生物胁迫中的作用进行了探索。主要结果如下:
　　1、R1Y4背景下过表达ANN8后，抑制R1Y4的表型
　　从表型上分析，R1Y4背景下过表达ANN8后，R1Y4植株上小坑洼的表型明显被抑制，植株表现出与野生型相似的表型。
　　2、过表达ANN8后降低RPW8.1的转录水平
　　因为转基因株系35S-ANN8/R1Y4表现出与野生型相似的表型，猜测过表达ANN8后会抑制RPW8.1的表达。因此，我们定量检测了35s-ANN8/R1Y4和R1Y4中RPW8.1的表达量，结果显示，在35s-ANN8/R1Y4中，RPW8.1的转录水平显著低于R1Y4中RPW8.1的转录水平。表明:过表达ANN8后会抑制RPW8.1的转录水平。
　　3、过表达ANN8后削弱RPW8.1介导的抗病反应
　　通过对过表达植株人工接种了拟南芥白粉菌和丁香假单胞菌杆菌DC3000。结果显示，在R1Y4背景下过表达ANN8后，R1Y4的抗病性明显受到抑制，植株表现出感白粉菌，35s-ANN8/R1Y4上细菌的生长量也比R1Y4多。同时，受白粉菌诱导后，35s-ANN8/R1Y4的细胞死亡反应明显比R1Y4弱。
　　4、过表达ANN8后降低抗性标志基因FRK1和PR1的转录水平
　　植物的抗病反应通常跟抗性基因的表达相关，因此我们定量检测了35s-ANN8/R1Y4和R1Y4受白粉菌诱导后FRK1和PR1的表达量。结果表明:在35S-ANN8/R1Y4中，PR1基因以及PTI防御信号通路标志基因FRK1的表达量都显著低于R1Y4中的表达量。
　　5、ANN8缺失突变体ann8-1增强植物根对盐的敏感性
　　我们用不同的激素和低浓度盐胁迫处理了Col-gl、ann8-1和amiANN8的幼苗，检测了这些材料在不同生长环境中根的生长情况。结果显示，在低浓度的盐胁迫下ann8-1和amiANN8的根生长明显受到抑制，而对外源的SA不敏感。
　　综上所述，本论文的研究结果证明，膜联蛋白ANN8不仅负调控RPW8.1介导的细胞死亡和抗病性，还参与植物非生物胁迫反应过程。

目录

声明

摘要

符号说明

第一章 文献综述

1．1 植物的天然免疫系统

1．1．1 病原相关分子模式触发的免疫反应(PTI)

1．1．2 效应因子触发的免疫反应(ETI)

1．2 植物R基因与病原菌无毒(Avr)基因的互作模式

1．2．1 R基因与Avr基因的直接互作模式(受体—配体模式)

1．2．2 R基因与Avr基因的间接互作模式

1．2．3 Avr基因对R基因的转录调控

1．3 拟南芥中广谱抗病蛋白RPW8的研究进展

1．3．1 RPW8的结构特点

1．3．2 RPW8的研究进展

1．3．3 RPW8．1和RPW8．2功能对比

1．4 膜联蛋白(Annexin)的研究进展

1．4．1 膜联蛋白(Annexin)功能概述

1．4．2 拟南芥膜联蛋白家族同源进化关系分析

1．4．3 拟南芥中Annexin的研究进展

1．5 论文研究目的及意义

第二章 材料与方法

2．1 实验材料

2．1．1 拟南芥材料

2．1．2 工程菌和病原菌

2．1．3 质粒载体

2．1．4 分子生物学试剂

2．1．5 试剂盒

2．1．6 抗生素

2．1．7 培养基

2．1．8 主要的仪器设备

2．2 实验方法

2．2．1 ANN8 cDNA的制备

2．2．2 ANN8超表达载体的构建

2．2．3 拟南芥的栽培与遗传转化

2．2．4 蛋白质印迹检测(western blot)

2．2．5 RNA的提取和反转

2．2．6 拟南芥DNA的提取(SDS法)

2．2．7 拟南芥蛋白质的提取

2．2．8 拟南芥细胞死亡染色观察(Trypan Blue)

2．2．9 活性氧爆发(ROS)的测定

2．2．10 细菌生长实验

2．2．11 白粉菌接菌实验及分生孢子数量统计

第三章 结果与分析

3．1 过表达ANN8转基因植株的鉴定

3．2 过表达ANN8减弱了RPW8．1介导的抗病性

3．3 过表达ANN8减弱了RPW8．1介导的基础免疫反应

3．4 过表达ANN8降低了RPW8．1的转录水平

3．5 过表达ANN8降低了R1Y4中PR1和FRK1基因的表达量

3．6 ANN8缺失突变体ann8-1增强植物根对盐的敏感性

第四章 讨论与展望

4．1 ANN8在RPW8．1介导的抗性反应中起负调控作用

4．2 ANN8缺失突变体ann8-1增强植物根对盐的敏感性

4．3 展望

4．3．1 ANN8调控机制的探索

4．3．2 RPW8．1和ANN8在植物免疫反应中内在联系的探索

参考文献

附录

致谢