鞣花酸化合物及其制备和在抗癌药物中的应用

摘要

本发明公开了鞣花酸化合物及其制备和在抗癌药物中的应用，该化合物都是从九牛造(大戟属植物湖北大戟的根及地上部分)提取分离得到的抗癌单体化合物，其制备方法是首先将风干的九牛造粉碎后用乙醇提取，浓缩得浸膏；其次，再用氯仿和乙酸乙酯萃取，分别经过柱层析，再用洗脱剂洗脱分别得到两种鞣花酸化合物，经抗癌药理实验对人肝癌细胞和胃癌细胞的生长有明显的抑制作用，并具有抗癌谱广抗癌活性较强等优点，从而这两种鞣花酸化合物与药学上可接受的载体及辅料结合后可以用于制备抗肝癌或抗胃癌药物。

说明书

技术领域

本发明涉及一种抗癌药物及其制备方法，具体地说是以九牛造为原料提取分离得到的两种具有抗癌活性鞣花酸类化合物及其制备方法和在抗癌药物中的应用。

背景技术

癌症是危害人类健康的大敌。我国每年新发癌症病例约有160万人，每年死于癌症的约有130万人，全国因癌症而死亡的人数逐年上升，我国为肝癌、胃癌、肺癌、乳腺癌等癌症的高发区域，癌症死亡率居高不下。癌症给患者的身心都造成了难以修复和治愈的创伤。

目前尚无有效的药物可以治愈大多数癌症患者，化疗药物对癌症虽有一定疗效，但毒副作用大，中成药对癌症的疗效普遍较低，疗效均不理想。目前临床应用的抗癌药物大多为细胞毒性药物，在抑制肿瘤细胞增殖的同时，机体正常细胞的增殖也被抑制，如造血干细胞等，从而导致骨髓造血机能受损，红细胞或白细胞水平低下，往往是抑制了肿瘤的增殖，但也破坏了患者的免疫力，最终很难取得良好的治疗效果，也限制了化疗药物的临床应用。因此，开发高效低毒、靶向性强的抗肿瘤药物成为抗肿瘤药物开发的热点。经资料查阅目前还没有文献报道这两种鞣花酸化合物3，3’-di-O-methylellagic acid和3，3’-di-O-methylellagic acid-4’-O-β-D-xylopyroside用于抗肝癌、胃癌等癌症的治疗。

发明内容

本发明的目的是提供一种鞣花酸化合物，是一种高效、抗癌谱广的抗癌单体化合物，具体地说是以九牛造为原料提取分离得到的两种鞣花酸类化合物及其在制备治疗肝癌胃癌药物方面的应用。

本发明的技术方案是这样实现的：

本发明九牛造的浸膏中其抗癌的活性物质主要是本发明的鞣花酸类物质。本发明从九牛造(又名五朵云、翻天印、震天雷，Euphorbia hylonomaHand-Mazz.)中提取分离了两种鞣花酸化合物，它们是3，3’-di-O-methylellagic acid或3，3’-di-O-methylellagic acid-4’-O-β-D-xylopyroside，其分子式分别为C₁₆H₁₀O₈或C₂₁H₁₈O₁₂，结构分别如下：

3，3’-di-O-methylellagic acid

或

3，3’-di-O-methylellagic acid-4’-O-β-D-xylopyroside

本发明两种鞣花酸类化合物3，3’-di-O-methylellagic acid和3，3’-di-O-methylellagic acid-4’-O-β-D-xylopyroside的制备方法，其步骤是：

a、将九牛造粉碎后用体积浓度为50～100％乙醇浸泡3～12h，回流提取1～5次，每次1～6h，合并提取液，减压浓缩至浸膏；

b、向浸膏中加入1～10倍量水，再分别用石油醚、氯仿、乙酸乙酯萃取，回收溶剂，分别得到石油醚部分、氯仿部分、乙酸乙酯部分；

c、将氯仿部分进行硅胶柱层析，先用石油醚-乙酸乙酯后用氯仿-甲醇为洗脱剂进行梯度洗脱，中间洗脱下来的化合物即为3，3’-di-O-methylellagic acid-4’-O-β-D-xylopyroside；

d、将乙酸乙酯部分也进行柱层析，以氯仿-甲醇为洗脱剂进行梯度洗脱，中间洗脱下来的化合物即为3，3’-di-O-methylellagic acid。

所述的C步骤洗脱剂石油醚-乙酸乙酯梯度变化为100∶1～1∶100，氯仿-甲醇梯度变化为100∶1～1∶100。

所述的D步骤洗脱剂氯仿-甲醇梯度变化为100∶1～1∶100。

3，3’-di-O-methylellagic acid或3，3’-di-O-methylellagic acid-4’-O-β-D-xylopyroside在制备抗肝癌或胃癌药物中的应用。

采用MTT法。取对数生长期SMMC-7721肝癌细胞，用完全培养液调整细胞浓度为3×10⁴个/ml，接种于96孔培养板内，每孔接种200μl，常规培养24h后加入化合物终浓度为10，25，50，80，100μg/ml，另设无药物(含配制药物的乙醇)培养液和空白对照孔，每个药物浓度设5个复孔。加药后将96孔板置于CO₂恒温箱37℃培养。在24、48、72h不同时间点，分别取出细胞板，每孔加入20μl质量浓度为5mg/ml的MTT，常规培养4h，吸弃上清，每孔加入DMSO 150μl，充分振荡混匀，使沉淀结晶充分溶解，以490nm为检测波长，利用酶标仪检测各孔吸光度(OD)值。

抑制率(％)＝(1-处理组OD值/对照组OD值)×100％

试验结果表明，随着3，3’-di-O-methylellagic acid和3，3’-di-O-methylellagic acid-4’-O-β-D-xylopyroside各自浓度的升高，其对人肝癌细胞的抑制率也升高，当3，3’-di-O-methylellagic acid的浓度为100μg/ml时对人肝癌细胞的抑制率高达75.3％，当和3，3’-di-O-methylellagic acid-4’-O-β-D-xylopyroside的浓度为100μg/ml时对人肝癌细胞的抑制率高达64.9％。

本发明中两种鞣花酸类化合物在治疗胃癌的药物方面的应用。

采用MTT法。取对数生长期SGC-7901胃癌细胞，用完全培养液调整细胞浓度为3×10⁴个/ml，接种于96孔培养板内，每孔接种200μl，常规培养24h后加入化合物终浓度为10，25，50，80，100μg/ml，另设无药物(含配制药物的乙醇)培养液和空白对照孔，每个药物浓度设5个复孔。加药后将96孔板置于CO₂恒温箱37℃培养。在24、48、72h不同时间点，分别取出细胞板，每孔加入20μl质量浓度为5mg/ml的MTT，常规培养4h，吸弃上清，每孔加入DMSO150μl，充分振荡混匀，使沉淀结晶充分溶解，以490nm为检测波长，利用酶标仪检测各孔吸光度(OD)值。

抑制率(％)＝(1-处理组OD值/对照组OD值)×100％

试验结果表明，随着3，3‘-di-O-methylellagic acid和3，3’-di-O-methylellagic acid-4’-O-β-D-xylopyroside各自浓度的升高，其对人胃癌细胞的抑制率也升高，当3，3’-di-O-methylellagic acid的浓度为100μg/ml时对人胃癌细胞的抑制率高达75.5％，当和3，3’-di-O-methylellagic acid-4’-O-β-D-xylopyroside的浓度为100μg/ml时对人胃癌细胞的抑制率高达70.5％。

本发明的两种鞣花酸化合物3，3’-di-O-methylellagic acid和3，3’-di-O-methylellagic acid-4’-O-β-D-xylopyroside是从中药材九牛造中提取分离出来的抗癌单体化合物，毒副作用小，抗癌谱广，对癌细胞有很明显的抑制作用。本发明的两种鞣花酸化合物3，3’-di-O-methylellagicacid和3，3’-di-O-methylellagic acid-4’-O-β-D-xylopyroside经抗癌药理试验，结果表明其抗癌活性高。3，3’-di-O-methylellagic acid和3，3’-di-O-methylellagic acid-4’-O-β-D-xylopyroside的浓度均为100μg/ml时对人肝癌细胞的抑制率分别高达75.3％和64.9％，对人胃癌细胞的抑制率分别高达75.5％和70.5％。

据文献报道，鞣花酸类物质具有很强的抗肿瘤和抗突变作用，小鼠体内实验和人组织体外实验都表明鞣花酸类物质对各种肿瘤细胞都有很好的抑制作用，特别是对结肠癌、食道癌、肺癌、肝癌、乳腺癌和皮肤癌等肿瘤细胞效果显著。Sehrawat Anuradha等研究表明3，3’-di-O-methylellagic acid以50mg/kg body wt.的剂量灌喂小鼠后产生肝癌肿瘤启动抑制作用，据此推断该化合物的木糖苷3，3’-di-O-methylellagic acid-4’-O-β-D-xylopyroside在动物体内也同样具有较好的抗癌活性，因此初步推断本发明中的两种鞣花酸类化合物3，3’-di-O-methylellagic acid和3，3’-di-O-methylellagic acid-4’-O-β-D-xylopyroside对各种癌症尤其是肝癌和胃癌具有较好的作用，从而这两种鞣花酸化合物与药学上可接受的载体及辅料结合后可以用于制备抗肝癌或抗胃癌药物。

附图说明

图1是本发明3，3’-di-O-methylellagic acid的¹H-NMR图谱；

图2是本发明3，3’-di-O-methylellagic acid的¹³C-NMR图谱；

图3是本发明3，3’-di-O-methylellagic acid-4’-O-β-D-xylopyroside的¹H-NMR图谱；

图4是本发明3，3’-di-O-methylellagic acid-4’-O-β-D-xylopyroside的¹³C-NMR图谱；

图5是本发明3，3’-di-O-methylellagic acid-4’-O-β-D-xylopyroside的DEPT图谱；

图6中A是空白对照组作用48h后SMMC-7721细胞的光镜下形态图；

图6中B是3，3’-di-O-methylellagic acid在浓度为10μg/mL时作用48h后SMMC-7721细胞的光镜下形态图；

图6中C是3，3’-di-O-methylellagic acid在浓度为50μg/mL时作用48h后SMMC-7721细胞的光镜下形态图；

图6中D是3，3’-di-O-methylellagic acid在浓度为100μg/mL时作用48h后SMMC-7721细胞的光镜下形态图；

图7中A是空白对照组作用48h后SGC-7901细胞的光镜下形态图；

图7中B是3，3’-di-O-methylellagic acid-4’-O-β-D-xylopyroside在浓度为10μg/mL时作用48h后SGC-7901细胞的光镜下形态图；

图7中C是3，3’-di-O-methylellagic acid-4’-O-β-D-xylopyroside在浓度为50μg/mL时作用48h后SGC-7901细胞的光镜下形态图；

图7中D是3，3’-di-O-methylellagic acid-4’-O-β-D-xylopyroside在浓度为100μg/mL时作用48h后SGC-7901细胞的光镜下形态图。

下面结合附图对本发明的内容作进一步详细说明。

具体实施方式

实施例1：

两种鞣花酸化合物3，3’-di-O-methylellagic acid和3，3’-di-O-methylellagic acid-4’-O-β-D-xylopyroside的提取分离方法：

①九牛造药材于2005年10月采自陕西省太白县境内，经自然风干后粉碎，将粉碎的九牛造9kg用85％乙醇浸泡12h，回流提取3次，每次4h，合并提取液，减压浓缩至浸膏；

②向浸膏中加入适量水，再分别用石油醚、氯仿、乙酸乙酯萃取，回收溶剂，分别得到石油醚部分、氯仿部分、乙酸乙酯部分各20g、89g、170g；

③将氯仿部分进行硅胶柱层析，先用石油醚-乙酸乙酯后用氯仿-甲醇为洗脱剂进行梯度洗脱，等量收集洗脱液每份150ml，共收集324份，将洗脱液分别做硅胶薄层层析，薄层板喷以10％硫酸乙醇溶液显色，合并相同的洗脱液，从其中合并的212～240份中析出了晶体，再以甲醇重结晶得到针状结晶，即为本发明的3，3’-di-O-methylellagic acid-4’-O-β-D-xylopyroside；

④将乙酸乙酯部分也进行柱层析，以氯仿-甲醇为洗脱剂进行梯度洗脱，等量收集洗脱液每份150ml，共收集350份，将洗脱液分别做硅胶薄层层析，薄层板喷以10％硫酸乙醇溶液显色，合并相同的洗脱液，从其中合并的87-142份中析出了晶体，再以丙酮重结晶得到的晶体即为本发明的3，3’-di-O-methylellagic acid。

实施例2：

两种鞣花酸化合物3，3’-di-O-methylellagic acid和3，3’-di-O-methylellagic acid-4’-O-β-D-xylopyroside的结构鉴定

乙酸乙酯部分柱层析时洗脱液中析出的晶体为淡黄色粉末状结晶，熔点为332-334℃，MS显示分子量为344，分子式为C₁₆H₁₀O₈。通过¹H-NMR和¹³C-NMR图谱(见附图1和附图2)提示得其为鞣花酸类物质，其化学结构式如下：

3，3’-di-O-methylellagic acid

附图1¹H-NMR图谱中波谱数据及归属如下：

¹H-NMR(DMSO-d₆)δppm：4.05(6H，s，2×OCH₃)，7.54(2H，s，H-5，H-5’)，10.79(2H，s，OH-4，OH-4’)。

附图2¹³C-NMR图谱波谱数据及归属如下：

¹³C-NMR(DMSO-d₆)δppm：111.46(s，C-1，C-1’)，141.25(s，C-2，C-2’)，140.23(s，C-3，C-3’)，152.23(s，C-4，C-4’)，111.69(d，C-5，C-5’)，112.18(s，C-6，C-6’)，158.52(s，C-7，C-7’)，61.00(q，2×OCH₃)。

¹H-NMR、¹³C-NMR图谱数据经与文献对照基本一致，根据波谱数据确定此化合物为3，3’di-o-methylellagic acid。

氯仿部分柱层析时洗脱液中析出的晶体为白色粉末状结晶，熔点为227-229℃，MS显示分子量为462，分子式为C₂₁H₁₈O₁₂。通过¹H-NMR，¹³C-NMR和DEPT图谱提示得其为鞣花酸类物质，其化学结构式如下：

3，3’-di-O-methylellagic acid-4’-O-β-D-xylopyroside

附图3¹H-NMR图谱中波谱数据及归属如下：

¹H-NMR(DMSO)δppm：δ7.48(1H，d，J＝5.3，H-5)，δ7.73(1H，d，J＝3.2，H-5)，δ4.05(1H，s，3-OCH₃)，δ4.08(1H，s，3’-OCH₃)，δ10.8(1H，s，4-OH)。

附图4¹³C-NMR图谱波谱数据及归属如下：

¹³C-NMR(DMSO)δppm：111.07(C-1)，140.94(C-2)，140.19(C-3)，151.26(C-4)，111.65(C-5)，111.82(C-6)，158.37(C-7)，114.19(C-1’)，141.58(C-2’)，141.98(C-3’)，152.84(C-4’)，112.02(C-5’)，112.72(C-6’)，152.40(C-7’)，101.94(C-1”)，73.09(C-2”)，76.17(C-3”)，69.31(C-4”)，65.84(C-5”)，61.48(3-OCH₃)，61.02(3’-OCH₃)。

附图5DEPT图谱波谱数据及归属如下：

DEPT谱提示该化合物有δ111.89，111.60，101.84，76.18，73.08，69.28，61.68，61.02处为甲基或次甲基碳原子信号，δ65.84为亚甲基碳原子信号，其余的均为季碳信号。

¹H-NMR、¹³C-NMR及DEPT图谱数据经与文献对照基本一致，根据波谱数据确定此化合物为3，3’-di-O-methylellagic acid-4’-O-β-D-xylopyroside。

实施例3：

3，3’-di-O-methylellagic acid和3，3’-di-O-methylellagic acid-4’-O-β-D-xylopyroside抗肝癌作用

1.细胞培养与单体化合物

人肝癌细胞株SMMC-7721由西安交通大学医学研究试验中心提供，细胞培养于含10％小牛血清的RPMI-1640培养基中，培育在37℃、5％CO₂的饱和湿度培养箱中，每2～3天细胞汇合时，用0.25％胰蛋白酶消化传代，取对数生长期细胞用于试验。两个单体化合物是经化学结构鉴定的九牛造中鞣花酸物质3，3’-di-O-methylellagic acid和3，3’-di-O-methylellagic acid-4’-O-β-D-xylopyroside。

2.试验方法

采用MTT法测定九牛造中鞣花酸类物质3，3’-di-O-methylellagic acid和3，3’-di-O-methylellagic acid-4’-O-β-D-xylopyroside(用DMSO溶解)对肝癌细胞生长抑制作用。

取对数生长期SMMC-7721肝癌细胞，用完全培养液调整细胞浓度为3×10⁴个/ml，接种于96孔培养板内，每孔接种200μl，常规培养24h后加入化合物终浓度为10，25，50，80，100μg/ml，另设无药物(含配制药物的乙醇)培养液和空白对照孔，每个药物浓度设5个复孔。加药后将96孔板置于CO₂恒温箱37℃培养。在24、48、72h不同时间点，分别取出细胞板，每孔加入20μl质量浓度为5mg/ml的MTT，常规培养4h，吸弃上清，每孔加入DMSO150μl，充分振荡混匀，使沉淀结晶充分溶解，以490nm为检测波长，利用酶标仪检测各孔吸光度(OD)值。

抑制率(％)＝(1-处理组OD值/对照组OD值)×100％

3.试验结果

结果如表1所示，随着3，3’-di-O-methylellagic acid和3，3’-di-O-methylellagic acid-4’-O-β-D-xylopyroside各自浓度的升高，其对人肝癌细胞的抑制率也升高，当3，3’-di-O-methylellagic acid的浓度为100μg/ml时对人肝癌细胞的抑制率高达75.3％，当和3，3’-di-O-methylellagic acid-4’-O-β-D-xylopyroside的浓度为100μg/ml时对人肝癌细胞的抑制率高达64.9％。

表1样品1、2对SSMC-7721细胞的生长抑制率

  样品  浓度(μg/ml)  24h  48h  72h    1  10  25  50  80  100  10  10.2±0.84  17.3±1.05  20.6±1.25  27.1±0.67  30.3±0.58  10.2±0.28  13.9±1.02  18.3±0.85  23.5±0.13  32.7±0.38  35.6±1.54  13.6±0.67  15.8±1.13  19.5±0.86  32.2±1.27  62.4±0.93  75.3±1.56  22.3±1.07

   2  25  50  80  100  15.4±0.83  27.8±0.57  37.6±0.86  37.8±0.68  18.5±1.47  33.3±1.06  41.7±1.24  45.1±0.32  28.1±1.14  39.5±0.83  58.2±0.77  64.9±0.52

1-3，3’-di-O-methylellagic acid

2-3，3’-di-O-methylellagic acid-4’-O-β-D-xylopyroside

其中3，3’-di-O-methylellagic acid在不同浓度时作用于人SMMC-7721肝癌细胞后肝癌细胞的光镜下形态可见附图6。由附图6可以看出，在空白对照组中基本上都为活细胞，而在给药组中都有不同比例的死细胞，并且随着药液浓度的增大，死细胞所占的比例越大，其中当药液浓度达到100μg/ml时，死细胞的比例高达约3/4。

实施例4：

3，3’-di-O-methylellagic acid和3，3’-di-O-methylellagic acid-4’-O-β-D-xylopyroside的抗胃癌作用

1.细胞培养与单体化合物

人胃癌细胞株SGC-7901由西安交通大学医学研究试验中心提供，细胞培养于含10％小牛血清的RPMI-1640培养基中，培育在37℃、5％CO₂的饱和湿度培养箱中，每2～3天细胞汇合时，用0.25％胰蛋白酶消化传代，取对数生长期细胞用于试验。两个单体化合物是经化学结构鉴定的九牛造中鞣花酸物质3，3’-di-O-methylellagic acid和3，3’-di-O-methylellagic acid-4’-O-β-D-xylopyroside。

2.试验方法

采用MTT法测定九牛造中鞣花酸类物质3，3’-di-O-methylellagic acid和3，3’-di-O-methylellagic acid-4’-O-β-D-xylopyroside(用DMSO溶解)对胃癌细胞生长抑制作用。

取对数生长期SGC-7901胃癌细胞，用完全培养液调整细胞浓度为3×10⁴个/ml，接种于96孔培养板内，每孔接种200μl，常规培养24h后加入化合物终浓度为10，25，50，80，100μg/ml，另设无药物(含配制药物的乙醇)培养液和空白对照孔，每个药物浓度设5个复孔。加药后将96孔板置于CO₂恒温箱37℃培养。在24、48、72h不同时间点，分别取出细胞板，每孔加入20μl质量浓度为5mg/ml的MTT，常规培养4h，吸弃上清，每孔加入DMSO150μl，充分振荡混匀，使沉淀结晶充分溶解，以490nm为检测波长，利用酶标仪检测各孔吸光度(OD)值。

抑制率(％)＝(1-处理组OD值/对照组OD值)×100％

3.试验结果

结果如表2所示，随着3，3’-di-O-methylellagic acid和3，3’-di-O-methylellagic acid-4’-O-β-D-xylopyroside各自浓度的升高，其对人胃癌细胞的抑制率也升高，当3，3’-di-O-methylellagic acid的浓度为100μg/ml时对人胃癌细胞的抑制率高达75.5％，当和3，3’-di-O-methylellagic acid-4’-O-β-D-xylopyroside的浓度为100μg/ml时对人胃癌细胞的抑制率高达70.5％。

表2样品1、2对SGC-7901细胞的生长抑制率

  样品  浓度(μg/ml)  24h  48h  72h  1  10  4.5±0.38  9.2±0.67  19.7±0.85

      2  25  50  80  100  10  25  50  80  100  6.6±1.42  18.3±0.26  32.4±1.27  37.9±0.53  3.2±0.31  7.6±0.51  26.9±0.83  37.2±0.35  40.0±1.49  13.9±0.68  26.5±0.56  42.1±0.58  46±0.34  8.6±0.59  18.4±1.28  36.1±0.19  49.3±1.02  52.6±0.12  27.2±0.92  38.8±0.48  64.3±1.08  75.5±0.59  15.9±0.67  28.8±0.2  42.4±1.41  62±1.39  70.5±0.04

1-3，3’-di-O-methylellagic acid

2-3，3’-di-O-methylellagic acid-4’-O-β-D-xylopyroside

其中3，3’-di-O-methylellagic acid-4’-O-β-D-xylopyroside在不同浓度时作用于人SGC-7901胃癌细胞后胃癌细胞的光镜下形态可见附图7。由附图7可以看出，在空白对照组中基本上都为活细胞，而在给药组中活细胞数下降，并且随着药液浓度的增大，活细胞的比列越来越小，对应的死细胞所占的比例越来越大，其中当药液浓度达到100μg/ml时，死细胞的比例可达到7/10左右。