腺苷酸激活的蛋白激酶抑制剂Compound C的新应用

摘要

本发明公开了腺苷酸激活的蛋白激酶(AMPK)抑制剂compound C的在制备预防和治疗肥胖的药物中的应用。AMPK活性抑制剂compound C可通过抑制前脂肪细胞向脂肪细胞的分化进程。在3T3－L1前脂肪细胞分化过程中，compound C除了抑制AMPK活性外，还剂量依赖性抑制脂质的形成，下调前脂肪细胞分化早期关键转录因子C/EBP家族和PPARγ的表达水平，抑制前脂肪细胞分化早期的克隆性增殖过程。本发明所述的AMPK抑制剂Compound C的新应用，将为临床预防和治疗肥胖提供一种新药物。

说明书

技术领域

本发明涉及腺苷酸激活的蛋白激酶(AMPK)抑制剂compound C的新应用。

背景技术

Compound C(6-[4-(2-piperidin-1-yl-etoxy)-phenyl)]-3-pyridin-4-yl-pyrrazolo[1，5-a]pyrimidine)，又称dorsomorphin，是一种具有细胞渗透性的化合物，分子式为C₂₄H₂₅N₅O，结构式为：

Compound C为腺苷酸激活的蛋白激酶(AMPK)抑制剂，竞争其ATP结合位点。在5μMATP并且缺失AMP的条件下其Ki值为109nM。研究表明，compound C选择性抑制AMPK活性，对于其它一些结构相关的激酶，包括ZAPK，spleen tyrosine kinase(SYK)，protein kinaseC-θ(PKCθ)，protein kinase A(PKA)和Janus kinase 3(JAK3)，均无明显抑制作用。据报道，compound C可降低小鼠的食物摄取，抑制AICAR和metformin的作用，如肝细胞中AICAR诱导的ACC磷酸化和脂肪酸氧化等。在脂肪细胞中，compound C还可通过上调肉碱棕榈酰转移酶-1(CPT-1)的活性来刺激长链脂肪酸的氧化。新近研究发现，compound C可以有效地抑制缺氧诱导的缺氧诱导因子-1(HIF-1)的激活；还可抑制骨形态发生蛋白(BMP)I型受体ALK2，ALK3和ALK6的功能，从而阻断BMP介导的SMAD1/5/8的磷酸化、靶基因的转录以及成骨分化。但是，至今为止尚未见到有关AMPK抑制剂compound C，抑制脂肪细胞分化，从而用于制备防治肥胖药物的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种腺苷酸激活的蛋白激酶(AMPK)抑制剂compound C的新用途。

实现上述目的的技术方案如下：

腺苷酸激活的蛋白激酶(AMPK)抑制剂compound C在制备预防和治疗肥胖的药物中的应用。

本发明的腺苷酸激活的蛋白激酶(AMPK)抑制剂compound C在制备预防和治疗肥胖的药物中的应用，其中，腺苷酸激活的蛋白激酶(AMPK)抑制剂compound C的浓度为优选为10-20μM，更优选为10-15μM。

本发明的依据是：一方面，能量代谢平衡失调是肥胖发生的主要原因。AMPK信号通路是调节细胞状态的中心环节，它通过关闭合成代谢，开启分解代谢，促使周围组织的代谢恢复平衡；同时可以通过激素、细胞因子和胞外配体调控整体水平的能量摄入和消耗。多方面的协同作用降低了机体循环中葡萄糖和脂质的水平，减少了脂质异位沉积，增强了胰岛素敏感性。目前认为AMPK信号通路有望成为防治肥胖的新靶点，以AMPK为靶点的新型药物，将会为肥胖的治疗提供新的希望和保证。另一方面，脂肪细胞分化是正常机体内脂肪贮存的生理基础，也是肥胖发生的病理基础。当成熟脂肪细胞的数量及其贮存的脂肪含量超过一定限度时，便出现了肥胖的病理状况。肥胖传统的治疗方法常以降低成熟脂肪细胞脂质含量为目标，但这些脂肪细胞仍存在着合成脂质所需要的酶和关键蛋白，具有重新台成大量脂肪的能力，这是导致肥胖治疗失败的一个重要因素。因此，抑制脂肪细胞分化才有可能对肥胖进行根本性的治疗。

经大量试验研究发现，AMPK活性抑制剂compound C可通过抑制前脂肪细胞向脂肪细胞的分化进程。在3T3-L1前脂肪细胞分化过程中，compound C除了抑制AMPK活性外，还剂量依赖性抑制脂质的形成，下调前脂肪细胞分化早期关键转录因子C/EBP家族和PPARγ的表达水平，抑制前脂肪细胞分化早期的克隆性增殖过程。本发明所述的AMPK抑制剂Compound C的新应用，将为临床预防和治疗肥胖提供一种新药物。

附图说明

图1为compound C对3T3-L1前脂肪细胞分化的影响示意图；

图2显示在3T3-L1前脂肪细胞分化不同阶段compound C对几种分化早期脂肪细胞特异转录因子表达水平的影响示意图；

图3为compound C对3T3-L1前脂肪细胞分化早期克隆性增殖的影响示意图；

图4为compound C对3T3-L1前脂肪细胞分化过程中AMPK活性的影响示意图。

具体实施方式

实施例1：compound C对3T3-L1前脂肪细胞分化的影响

当3T3-L1前脂肪细胞生长至完全融合后2天，换成分化培养液(含0.5mM 1-甲基-3-异丁基黄嘌呤，1μM地塞米松，5μg/ml胰岛素和10％胎牛血清的DMEM高糖培养液)，诱导其向脂肪细胞分化。同时分别加入终浓度为0.1μM、1μM、5μM、10μM、15μM和20μMcompound C，以DMSO为正常对照。诱导分化2天后换成含5μg/ml胰岛素和10％胎牛血清的DMEM高糖培养液，并分别加入以上终浓度的compound C，培养2天。随后以含10％胎牛血清的DMEM高糖培养液继续培养，每隔2天换1次培养液，同时加入以上终浓度的compound C。在诱导分化的第8天固定细胞，进行Oil Red O染色，显微镜下观察染色情况并拍照。之后，对染色结果进行定量分光光度分析，用100％的异丙醇萃取染液，用酶标仪读取A500nm值。A500nm值代表了细胞中的甘油三酯含量，反映了3T3-L1前脂肪细胞的分化程度。

参见图1，各数值表示为四次检测的平均值±SD。*，与未经compound C处理的分化后细胞相比p＜0.05；#，与未经compound C处理的分化后细胞相比p＜0.001。

从图1-A可以看出，对照组细胞分化良好，胞质中形成许多饱满的脂滴，而经compound C处理后细胞内脂滴的形成明显受到抑制，并且这种抑制效应随着compound C剂量的增加而增强。细胞染色定量分光光度分析的结果如图1-B所示，对照组呈现最高的染色水平，低剂量compound C(0.1μM、1μM和5μM)处理的细胞其脂质染色水平略有降低。而10μM compoundC处理明显降低细胞的脂质含量，与对照组相比差异具有显著性(p＜0.05)；高剂量compoundC(15μM和20μM)处理则显著抑制脂滴的形成，甚至完全阻断脂质生成，与对照组相比差异具有显著性(p＜0.001)。此结果表明，compound C抑制3T3-L1前脂肪细胞的分化，且作用方式呈量效关系。

实施例2：compound C对前脂肪细胞分化早期特异转录因子表达水平的影响

诱导3T3-L1前脂肪细胞向脂肪细胞分化，同时加入15μM compound C，以DMSO为正常对照。分别在诱导分化后的第0、2、8、16、24、36和48小时收集细胞，提取总RNA，进行荧光实时定量PCR分析，检测在分化早期C/EBPβ和C/EBPδ表达水平的变化。诱导3T3-L1前脂肪细胞向脂肪细胞分化，同时分别加入10μM和15μM compound C，以DMSO为正常对照。分别在分化的第0、2、4和8天收集细胞，提取总RNA，进行荧光实时定量PCR分析，检测前脂肪细胞分化早期转录因子C/EBPα和PPARγ表达水平的变化。

参见图2。各数值表示为三次检测的平均值±SD。*，与分化不同时期未经compound C处理的细胞相比p＜0.05；#，与分化不同时期未经compound C处理的细胞相比p＜0.001。

从图2-A可以看出，对照组C/EBPβ和C/EBPδmRNA表达水平在诱导分化后2小时内急剧上升并达到峰值，之后的表达水平逐渐降低，16小时后其表达量趋于稳定。然而，在诱导分化后的8小时内，compound C明显抑制C/EBPβ表达量的上调，差异具有显著性(p＜0.05)。但16小时以后，即对照组C/EBPβ表达量维持在较低水平时，compound C的抑制作用消失。相反地，在分化初期的48小时内，C/EBPδ的表达水平始终被compound C抑制在对照组的50％左右，差异具有显著性(p＜0.05)。

从图2-B可以看出，对照组C/EBPα和PPARγ的表达在分化第2天显著升高，并在后续分化过程中保持高水平表达。然而，10μM compound C处理组C/EBPα和PPARγ的表达水平明显降低，15μM compound C则完全阻断了C/EBPα和PPARγ的表达。C/EBPβ和C/EBPδ的活性可以调解C/EBPα和PPARγ的表达水平，从而诱导分化过程中一系列基因的表达。该结果表明compound C通过抑制C/EBPβ和C/EBPδ的表达来抑制C/EBPα和PPARγ的表达，进而抑制一系列脂肪特异基因的转录，从而抑制3T3-L1前脂肪细胞的分化。

实施例3：Compound C对前脂肪细胞分化早期克隆性增殖的影响

诱导3T3-L1前脂肪细胞向脂肪细胞分化，同时加入10μM和15μM compound C，以DMSO为正常对照。分别在分化的第0、1、2和3天，对不同处理的细胞进行计数。

参见图3，各数值表示为四次检测的平均值±SD。*，与分化不同时期未经compound C处理的细胞相比p＜0.05；#，与分化不同时期未经compound C处理的细胞相比p＜0.001。

从图3可以看出，在分化早期，对照组细胞有一个明显的克隆扩增过程，与第0天相比，第3天的细胞数目增长到3倍。然而，10μM和15μM compound C处理的细胞组则明显抑制了细胞增殖的过程，与第0天相比，第3天的细胞数目分别增长到2倍和1.5倍。前脂肪细胞分化初期的克隆性增殖是脂肪细胞分化所必需的过程，该结果表明，compound C显著抑制前脂肪细胞分化初期的克隆性增殖，从而抑制前脂肪细胞的分化。

实施例4：compound C对前脂肪细胞分化过程中AMPK活性的影响。

诱导3T3-L1前脂肪细胞向脂肪细胞分化，同时加入不同浓度的compound C(1μM、10μM和20μM)，以DMSO为正常对照。在诱导分化的第八天收集细胞，进行Western Blotting检测，分析磷酸化ACC(p-ACC)、总ACC(t-ACC)、磷酸化AMPKα(p-AMPKα)和总AMPKα(t-AMPKα)的水平。从图4-A可以看出，随着compound C使用剂量的增加，p-ACC和t-ACC的水平逐渐下降，但p-ACC降低的程度明显高于t-ACC降低的程度，表明compoundC剂量依赖性抑制AMPK的活性。相反地，p-AMPKα和t-AMPKα的水平并未受到compoundC的影响，因为compound C虽然抑制AMPK的活性，但并不影响AMPK上游激酶的活性，所以它仅引起ACC磷酸化水平的下降，而不降低AMPKα自身的磷酸化程度。

诱导3T3-L1前脂肪细胞向脂肪细胞分化，同时加入10μM compound C，以DMSO为正常对照。分别在分化的第0、2、4天收集细胞，进行Western Blotting检测，分析p-ACC和t-ACC的水平。从图4-B可以看出，在分化早期对照组ACC的表达和磷酸化水平逐渐升高，尤其在分化的起始阶段(前2天)磷酸化ACC水平显著增加。然而，10μM compound C处理则明显抑制ACC磷酸化水平的上升，表明compound C抑制前脂肪细胞分化早期AMPK的活性，从而抑制前脂肪细胞的分化。