微生物转化油脂生产饱和及不饱和α,ω－二羧酸的方法

摘要

本发明公开了一种利用微生物转化油脂生产饱和及不饱和α、ω－二羧酸的方法，特别是生产9烯－十八碳二元酸(/Δ

说明书

技术领域

本发明涉及微生物转化油脂生产饱和及不饱和α，ω-二羧酸， 尤其是转化油脂中的油酸、油酸甲酯和油醇生产9烯-十八碳二元酸(Δ⁹DC₁₈) 的方法。

背景技术

长链二元酸是合成香料、尼龙工程塑料、热熔胶、涂料、润滑油、 树脂和医药等的重要原料。饱和及不饱和长链二元酸分别是化工上合成麝香型 香料和灵猫香等名贵香料的重要原料。过去4种名贵的动物香料(麝香、龙诞 香、灵猫香、海狸香)只能从野生动物身上获得，例如麝香只能从麝猫、麝鹿 等的睾丸中取得，极其昂贵。如今天然麝香中具有生理活性的主要有效成分— —麝香酮(即3-甲基环十五酮)可以用十五碳二元酸(DC₁₅)进行合成，而灵猫 香可以用9烯-十八碳二元酸进行化学合成。而长链二元酸在自然界不单独不 存在，化工上难以合成，陈远童等从20世纪90年代以来，先后获得用微生物 发酵石油正烷烃生产长链二元酸的7项国家发明专利。并已形成大规模工业生 产。但是，石油是一种不可再生资源，根据国家的战略需求，科学家们正在研 究以油脂(可再生资源)为原料，代替石油正烷烃，进行微生物转化生产饱和 及不饱和长链二元酸的方法和工艺。

发明内容

本发明所用的菌株为热带假丝酵母(Candida tropicalis)ou-3， 是以一株氧化正烷烃生产混合二元酸的热带假丝酵母(参见《微生物学报》20 (1)：88～93，1980)为出发菌株，通过硝基胍、亚硝酸、紫外线和N⁺注入等 多种诱变方法，经过多次反复诱变筛选培育出来的，能从油脂中的各种饱和及 不饱和脂肪酸、脂肪酸酯和脂肪醇，尤其是从油酸、油酸甲酯和油醇生产相应 链长的二元酸。热带假丝酵母(Candida tropicalis)ou-3(以下简称ou-3) 已于2008年5月14日保藏在北京朝阳区大屯路甲3号中国科学院微生物研究 所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO.2496。 ou-3的生理特征如下：

一、糖类的发酵：葡萄糖+，半乳糖+，蔗糖+，麦芽糖+，乳糖-。

二、同化：葡萄糖+，半乳糖+，山梨糖-，蔗糖+，麦芽糖+，纤维二糖+，海藻 糖+，乳糖-，密二糖-，棉子糖-，松二糖+，菊芋糖-，可溶性淀粉+，木糖+， L-阿戊糖+，D-阿戊糖-，核糖-，鼠李糖-，α-甲基葡萄糖苷+，甘油+，乙醇+， 赤鲜醇-，甘露醇+，肌醇-，核糠醇+，半乳糖醇-，葡萄糖醇+，柠檬酸钠-，丁 二酸钠+，乳酸钙-。

三、生长素的需要：生物素++，维生素B₁++，维生素B₂+，维生素B₆+，维生素 B₁₂+，叶酸+，烟酸+，泛酸+，肌醇+，对氨基苯甲酸+。

四、其它：硝酸盐-，冻化牛奶-，熊果酸分解-，凝固牛奶-，油脂酶-。

形态特征：奶油白色，皱褶型，菌落为蛋糕状和桃酥状。

培养特征：在麦芽汁液体培养基中培养时，假菌丝多而长；在烷烃种子培养基 培养时，有一定数量的短假菌丝；而在发酵培养基中发酵时，大部分是单个椭 圆细胞。

本发明的种子培养基：

(1)10Be’糖度的麦芽汁加2％琼脂制成的固体斜面；

(2)10Be’糖度的麦芽汁液体培养基；

(3)种子培养基包含：KH₂PO₄6～12g/L，酵母膏3～8g/L，玉米浆3～8g/L， 蔗糖10～30g/L，自来水配置，自然pH。

培养种子的过程为：取一接种环ou-3酵母菌体，涂布在麦芽汁固体斜面上 (φ15×180试管，每支装6～7mL培养基，灭菌后放成斜面)，于28～30℃培 养40小时。取一支上述培养好的ou-3菌种全部刮入装有30mL麦芽汁种子培养 基的250mL三角瓶中，于28～30℃220转/分的旋转摇床上培养40～48小时， 作为摇瓶发酵种子或取两支上述培养好的ou-3斜面菌种全部刮入装有500mL培 养基的5000mL三角瓶中，于200转/分的旋转摇床28～30℃培养44～48小时， 作为一级种子罐的种子。

用本发明的ou-3菌株转化油脂生产长链二元酸，特别是9烯-十八碳二元 酸的具体方法是：把培养好的经过镜检，没有杂菌的菌种液接入pH5.5～9.0， 最好是6.0～8.0的含有10～30％(v/v)的油醇、油酸或油酸甲酯和90～70％(v/v) 发酵培养基的混合液中。发酵培养基的组成为：碱金属磷酸盐4～12g/L，最好 为6～10g/L，氯化钠0.5～2.5g/L，最好为1.0～2.0g/L，硝酸盐5～15g/L， 最好是6～10g/L，吐温602～5g/L，最好是2～3g/L，尿素1～4g/L，最好是 1.5～2.5g/L，蔗糖15～30g/L，丙烯酸0.5～3g/L及一些其他公知的营养源， 在pH6.0～7.5下将上述混合物在25～34℃，最好在27～31℃通气发酵72～170 小时。第一阶段，体系pH控制在6.0～6.8，以菌体生长为主，同时生产一定数 量的二元酸；第二阶段，体系pH控制7.0～8.0之间，以发酵产酸为主，也生 长部分菌体；第三阶段，只产酸，不长菌体。从72小时开始，每天补加一定量 的油醇等，使发酵液中油醇浓度始终＞5％(v/v)，碱金属磷酸盐可从KH₂PO₄或 NaH₂PO₄中选一种。

发酵结束后，进行破乳分层，上层残油回收再用，放出中间清液，下层菌 体层再处理一次或压滤；合并清液，加入适量活性炭在85～90℃脱色30分钟， 除去活性炭后，脱色液加热至70～80℃，加HCl或H₂SO₄至pH3进行酸化结晶， 冷却至30℃，压滤，空气吹干，烘干，得白色二元酸。

用本发明的ou-3菌株和发酵方法，可生产C₁₁～C₁₈的各种单一饱和及不饱和 二元酸。其中在16L发酵罐，从油醇转化生产Δ⁹DC₁₈时，发酵144小时，产酸量 达110.5g/L。

具体完成方式

实例1.

(1)取一接种环ou-3菌种，涂布在Φ15×180大试管麦芽汁固体斜面上，30 ℃培养两天。

(2)取上述菌种一支，接入装有30mL麦芽汁种子培养基的250mL三角瓶中， 于30℃在220转/分的旋转摇床上培养46小时。

(3)在装有15mL发酵培养基的500mL三角瓶中，接入3.5mL上述种子液，在 220转/分旋转摇床上发酵4天，每24小时用NaOH调一次pH至7.5～8.0。发 酵培养基中含KH₂PO₄8g/L，KNO₃4g/L，吐温603g/L，酵母膏2g/L，玉米浆 2.5g/L，NaCl 1g/L，尿素1.8g/L，蔗糖20g/L，丙烯酸1g/L，油醇150mL/L，自来水 配制，pH7.1，110℃灭菌30分钟。发酵结束后，用6mol HCl调pH至3。用有 机溶剂萃取，先除去残存原料油，再用乙醚提取二元酸，除去乙醚，得白色结 晶，用标准NaOH溶液滴定，计算二元酸含量。结果Δ⁹DC₁₈产量为55.1g/L。

实例2.

按照实例1的方法，只是原料用月桂酸，结果DC₁₂产量为46.5g/L。

实例3.

按照实例1的方法，只是原料用棕榈油酸，结果9烯-十六碳二元酸(Δ⁹DC₁₆) 产量为43g/L。

实例4.

按照实例1的方法，只是原料用芥酸(13-二十二烯酸)，结果Δ¹³-二十二 碳烯二酸(Δ¹³DC₂₂)产量为17.2g/L。

实例5.

(1)种子培养基及培养方法和发酵培养基同实例1。

(2)把2.5L培养两天，OD(×30，620nm)为0.81pH 4.2，健壮，无杂 菌种液接入装有10L发酵培养基，经121℃灭菌40分钟的16L发酵罐中，29±1 ℃650转/分，罐压1.0kg/cm²，通气量1∶1。开始时，油醇1.5L，30小时内， 体系pH控制在7.0以下，菌体迅速生长，同时产生6.5g/L Δ⁹DC₁₈，然后体系 pH在7.0～8.0，继续发酵，到67小时，产酸量达到25.1g/L，70小时后每天 补加一定量油醇，使发酵液中油醇浓度始终＞5％(v/v)。发酵144小时，产酸 量达110.5g/L。发酵结束后，进行破乳分层，回收上层残余油醇，下层菌体层 通过压滤，除去菌体，合并清液，加入0.6～0.7％活性炭90℃脱色20分钟， 压滤除去活性炭，脱色清液加热后加入浓H₂SO₄至pH3，冷却至室温，压滤，空 气吹干，固形物经烘干，得白色Δ⁹DC₁₈产品。油醇转化率为82.1％，后处理总 收率达到84.5％。