一种从梨花粉管中分离纯化线粒体的方法

摘要

本发明涉及一种梨花粉管中分离和纯化线粒体的方法，属于生物技术领域。包括花粉的采集、培养，线粒体提取液的配制、清洗液的配制、Percoll梯度的配制以及花粉管线粒体分离过程，将培养好的花粉管用细胞筛过滤，添加线粒体提取液研磨，获得细胞质液体，振荡离心后，用Percoll梯度液纯化、清洗获得线粒体。采用本方法获得完整的具有活力的花粉管的线粒体，提高了线粒体分离纯化效率。这种从微量花粉管中分离纯化线粒体技术，适合于作为花粉管的生理生化及细胞遗传等实验材料。对于研究开发花粉管的快速生长、以及不亲和花粉管的生长抑制技术将具有重要意义。

说明书

技术领域

本发明是从梨花粉管中分离纯化线粒体的方法，涉及植物组织细胞匀浆和获取完整具有活力的线粒体，属于生物技术领域。

背景技术

线粒体是细胞的主要细胞器，是细胞的“动力工厂”，是呼吸代谢进行的主要场所，也是细胞内能量代谢和物质转化的中枢，在维持细胞动态平衡方面起到关键作用；并且线粒体含有自身基因组结构，能够自我复制，可编码一些呼吸代谢过程中的重要酶成分，是核外相对独立的遗传体系；此外，线粒体还和动植物细胞的程序性死亡具有直接关系。

线粒体蛋白质组及基因组的研究是认识发生在线粒体内各种生理生化反应、探索细胞器起源和进化的重要手段。而对线粒体蛋白质组及基因组研究的前提就是将线粒体从细胞中分离出来。

目前线粒体分离纯化技术要明显落后于蛋白质组学和基因组学的研究。植物细胞线粒体的纯化主要是通过组织匀浆搅拌或细胞匀浆，再用Percoll(由乙烯吡咯烷酮包裹的硅胶颗粒组成的细胞分离液)梯度离心获得。而匀浆是从植物细胞中提取线粒体的关键步骤。在动物细胞中，可以利用低渗的方法来破坏细胞膜从而简易获得完整的线粒体。然而植物细胞具有细胞壁，必须要采用机械的方法来破坏，这就要求在破壁与保持线粒体完整之间取得平衡，并且对细胞匀浆的强度和时间上要求特别高。目前从植物材料中分离纯化线粒体采用的常规匀浆方法，对线粒体结构破坏比较大，效率较低，开始时往往需求几十克甚至几千克的新鲜植物组织材料。因此，将目前已有的方法应用于一些数量不多的植物组织或器官如植物花粉来分离纯化线粒体是不现实的。迄今，国际上尚无从梨花粉管中分离纯化出完整具有活性的线粒体的报道。这种从微量花粉管中分离纯化线粒体技术，对于研究花粉管的快速生长、以及不亲和花粉管的生长抑制技术将具有重要意义。

发明内容

技术问题本发明的目的是提供一种从梨花粉管中分离纯化线粒体的方法，有效得分离出结构完整、具有活力的花粉管线粒体。该方法也可用于分离纯化其他植物花粉管的线粒体，为其他植物组织器官的线粒体分离纯化提供参考。

技术方案本发明提供一种从梨花粉管分离纯化线粒体的方法，是应用花粉培养、匀浆、以及分离纯化三步法来获取花粉管线粒体的方法，其过程是将花粉先培养，再匀浆，然后分离纯化而获得结构完整具有活力的线粒体。

从花粉管中分离纯化线粒体的方法包括下列步骤：

1)花粉的采集：采集当天开放的花粉，然后让花粉充分干燥；

2)花粉培养基的制备：将10％蔗糖(sucrose)，0.03％Ca(NO₃)₂·4H₂O，30mM MES(α-磺基甲脂磺酸钠)，20％PEG 4000(聚乙二醇4000)，0.01％硼酸溶于蒸馏水中，用NaOH调整溶液pH值至6.0～6.5。

3)花粉的培养：

取20mg干燥花粉，于20ml花粉培养基中，在黑暗条件下，25℃，180rpm，培养3～3.5h，获得培养好的花粉管。

4)线粒体提取液的配制：50mM Hepes(羟乙基哌嗪乙硫磺酸)，600mM sorbitol(山梨醇)，5mM EDTA(乙二胺四乙酸)，0.1％BSA(牛血清蛋白)，1％PVP 40(聚乙烯吡咯烷酮40000)，1mM DTT，5mM KH₂PO₄溶于蒸馏水中，用KOH调整溶液pH值至7.4。

5)清洗液的配制：50mM Hepes(羟乙基哌嗪乙硫磺酸)，0.5M sucrose(蔗糖)，5mMEDTA(乙二胺四乙酸)，0.1％BSA(牛血清蛋白)，5mM KH₂PO₄溶于蒸馏水中，用KOH调整溶液pH值至7.4。

6)Percoll(由乙烯吡咯烷酮包裹的硅胶颗粒组成的细胞分离液)梯度的配制：分别取45％，21％，13.5％(v/v)Percoll溶于50mM Hepes-KOH(pH 7.4)缓冲液中，并包含0.5M sucrose(蔗糖)，5mM EDTA(乙二胺四乙酸)，0.1％BSA(牛血清蛋白)，5mMKH₂PO₄。

7)匀浆：将培养好的花粉管连同培养基一起，用细胞筛(500目/英寸)过滤，用吸水纸从细胞筛底部将培养基吸干，然后将细胞筛置于一培养皿上，往花粉管上添加线粒体提取液，以200rpm速度在细胞筛上研磨，研磨过程中不断添加线粒体提取液，使从已经破碎的花粉管中流出的细胞质能及时的经细胞筛流入到培养皿中，避免被再次研磨而破坏线粒体结构。以上操作均在0～4℃条件下进行。

8)分离：将上述得到的液体转入30ml离心管中，振荡4秒后迅速离心(2000g，5min，4℃)，将上清液转入另一离心管中，继续离心30min(18000g，4℃)，得沉淀，即为粗线粒体组分。

9)纯化：将上述得到的沉淀悬浮于1ml清洗液中，将Percol l梯度液按45％，21％，13.5％顺序1∶1∶1从下往上加入离心管中，将粗线粒体组分置于Percoll梯度顶部，于80000g，4℃，离心45min，离心后线粒体在45％和21％Percoll之间，为乳白色。

10)Percoll的去除：将纯化的线粒体溶液用20倍体积的清洗液稀释后，在4℃，20000g离心45min，获得纯线粒体，用少量清洗液悬浮后，备用。

有益效果

为了满足从微量植物材料中分离纯化出完整具有活力的线粒体的需要，我们发明了一种新的匀浆技术(图1)，并将这种技术运用到梨花粉管线粒体的分离和纯化。在这一技术中，我们只用了20mg花粉，经新鲜离体培养三小时后，就能分离纯化出足够量、用于蛋白质组学研究的线粒体，使利用少量的花粉管材料分离纯化出线粒体成为可能。这种从微量花粉管中分离纯化线粒体技术，对于研究花粉管的快速生长、以及不亲和花粉管的生长抑制技术将具有重要意义。

1)首次从蔷薇科果树梨花粉管中分离纯化出完整、具有活力的线粒体，可以用于线粒体蛋白质组学的研究，尤其是梨花粉生理生化特性的基础性研究；比如，花粉快速生长的能量提供及不亲和花粉管的生长抑制；

2)应用本发明的方法提取的完整、具有活力的线粒体，可进一步用于线粒体DNA提取，进行基因组研究，对探索细胞器的起源和进化具有重要意义；

3)本发明是基于对梨花粉及花粉管生理生化及细胞信号转导等特性研究的工作基础。多种生理代谢均与线粒体有关，如植物中重要的信号分子活性氧的产生，植物细胞程序性死亡的调控等。总之，本方法具有坚实的理论依据，科学性强，方法较简便，易于操作和实际应用。

4)用这种花粉管线粒体提取纯化的方法，通过发明新的研磨方法，可以高效的获得完整、有活力的线粒体；应用该方法获取的花粉管线粒体，非常适合于作为花粉及花粉管的生理生化、细胞信号转导特性等方面研究的实验材料。

附图说明

图1梨花粉管线粒体分离纯化流程图。

图2花粉管匀浆工具实物图。

图3分离纯化得到线粒体电镜图。得到线粒体杂质较少，线粒体结构完整。Bar＝1μm。

图4离体线粒体膜电位检测。利用Rhodamine 123标记线粒体膜电位进行标记，荧光强度大小的改变与膜电位大小改变相对应。利用流式细胞仪对线粒体荧光强度进行检测：a没有利用Rhodamine123标记的线粒体的基本没有荧光强度；b在没有呼吸底物的情况下，用Rhodamine 123对线粒体进行标记，线粒体具有一定荧光强度，但线粒体荧光强度情况不一致；c在有呼吸底物琥珀酸存在的条件下，用Rhodamine 123标记的线粒体荧光升高，这说明分离出来的线粒体具有活力。图5蛋白质免疫印记法检测线粒体内蛋白--细胞色素c。结果显示，在线粒体组分里，能够检测到线粒体内特有的蛋白质组分，而胞质组分里却检测不到。图中，Cyt指细胞质组分，Mic指线粒体组分。

具体实施方式

众所周知，分离纯化花粉管线粒体是开展线粒体蛋白质组学和基因组学实验研究的前提，而迄今，由于提取效率的低下，要获得足够的线粒体用于线粒体蛋白质组学的研究，往往需要几十克到几千克的植物材料，原有方法不能满足从体积较小、质量较轻的花粉管中分离和纯化线粒体的需要。目前在国际上，还没有从蔷薇科植物花粉管中分离纯化出线粒体的报道。我们应用本发明的方法，获取了完整的、具有活力的梨花粉管线粒体，利用蛋白质免疫印记的方法，在线粒体组分成功检测到线粒体内特有蛋白质的阳性条带，为开展和深入研究花粉管线粒体蛋白质组学和基因组学奠定基础。这种从微量花粉管中分离纯化线粒体技术，对于研究花粉管的快速生长、以及不亲和花粉管的生长抑制技术将具有重要意义。

本实施例就以梨花粉作为材料，采用本发明方法从用20mg花粉培养3h后的花粉管中获得了500μg完整的、具有活力的线粒体，利用蛋白质免疫印记的方法，在线粒体组分成功检测到线粒体内特有蛋白质-细胞色素c的阳性条带(图5)。实验过程如下：

1.花粉采集：在梨树开花期采集成熟的梨花粉，风干后-20℃冰冻低温下保存。

2.培养基的制备：将10％蔗糖(sucrose)，0.03％Ca(NO₃)₂·4H₂O，30mM MES(α-磺基甲脂磺酸钠)，20％PEG 4000(聚乙二醇4000)，0.01％硼酸溶于蒸馏水中，用NaOH调整溶液pH值至6.0～6.5。

3.花粉的培养：取保存的花粉20mg，先在常温下解冻2h，用上述培养基培养花粉，在25℃、黑暗条件，180rpm，在摇床上培养3h，获得培养好的花粉管(图2)。

4.线粒体提取液的配制：50mM Hepes(羟乙基哌嗪乙硫磺酸)，600mM sorbitol(山梨醇)，5mM EDTA(乙二胺四乙酸)，0.1％BSA(牛血清蛋白)，1％PVP 40(聚乙烯吡咯烷酮40000)，1mM DTT，5mM KH₂PO₄溶于蒸馏水中，用KOH调整溶液pH值至7.4。

5.清洗液的配制：50mM Hepes(羟乙基哌嗪乙硫磺酸)，0.5M sucrose(蔗糖)，5mMEDTA(乙二胺四乙酸)，0.1％BSA(牛血清蛋白)，5mM KH₂PO₄溶于蒸馏水中，用KOH调整溶液pH值至7.4。

6.Percoll(由乙烯吡咯烷酮包裹的硅胶颗粒组成的细胞分离液)梯度的配制：分别取45％，21％，13.5％(v/v)Percoll溶于50mM Hepes-KOH(pH 7.4)缓冲液中，缓冲液中并含有0.5M sucrose(蔗糖)，5mM EDTA(乙二胺四乙酸)，0.1％BSA(牛血清蛋白)，5mM KH₂PO₄。

7.花粉管线粒体分离过程：

1)匀浆：将步骤3培养好的花粉管连同培养基一起，用细胞筛(500目/英寸)过滤，然后直接加入线粒体提取液，在细胞筛上研磨。研磨过程中不断添加线粒体提取液，使从已经破碎的花粉管流出的细胞质能够及时的经过细胞筛流入到培养皿中，避免被再次研磨而破坏线粒体结构。以上操作均在0～4℃条件下进行。

2)分离：将上述得到的液体转入30ml离心管中，振荡4秒后迅速离心(2000g，5min，4℃)，将上清液转入另一离心管中，继续离心30min(18000g，4℃)，得沉淀，即为粗线粒体组分。

3)纯化：将上述得到的沉淀悬浮于1ml清洗液中，将Percoll(由乙烯吡咯烷酮包裹的硅胶颗粒组成的细胞分离液)梯度液按45％，21％，13.5％顺序1∶1∶1从下往上加入离心管中，将粗线粒体组分置于Percoll梯度顶部，于80000g，4℃，水平离心45min，离心后线粒体在45％和21％Percoll之间，为乳白色。

4)Percoll的去除：将纯化的线粒体溶液用20倍体积的清洗液稀释后，在4℃，20000g离心45min，获得了500μg完整的、具有活力的线粒体。用少量清洗液悬浮后，备用。

5)蛋白质免疫印记：将上述得到的线粒体溶液，于-70℃反复冻溶后，将样品于SDS-PAGE上进行电泳，然后转膜，先后结合一抗、辣根过氧化物酶标记的二抗，最后用DAB显色法显色。结果成功检测到线粒体内特有蛋白质-细胞色素c的阳性条带(图5)。