一种人分化抑制因子3表达载体、融合蛋白及其制备方法

摘要

本发明属于基因工程和医学生物领域，公开了一种人分化抑制因子3表达载体、融合蛋白及其制备方法。该表达载体是将PCR扩增后的hId3基因克隆于融合表达载体pET32a的EcoR I和Sal I位点之间，得到重组表达载体hId3/pET32a。本发明将hId3编码基因定向克隆到原核表达载体，获得hId3融合蛋白表达载体，实现了hId3在大肠埃希菌中的高效表达，表达量占菌体总蛋白的27％，同时提供了一整套工程菌诱导表达和纯化工艺，并以hId3融合蛋白为免疫原制备兔抗hId3多克隆抗体，为进一步研究hId3蛋白的生物学功能及其在临床医学诊断中的应用奠定基础。

说明书

技术领域

本发明属于基因工程和医学生物领域，涉及一种人分化抑制因子3(hId3)表达载体、hId3融合蛋白、抗hId3多克隆抗体及其制备方法。

背景技术

分化抑制因子(inhibitors of differentiation/DNAbinding，Id)，属螺旋-环-螺旋(HLH)转录因子家族成员之一，对碱性螺旋-环-螺旋(bHLH)转录因子活性起负调节作用，从而抑制细胞分化^[1-4]。哺乳动物细胞含四种Id因子(Id1～Id4)。Id3作为血清诱导的立即早期基因在小鼠成纤维细胞系中被首次发现^[5]。它参与多种细胞生物学过程，包括T细胞和B细胞的发育、骨骼肌的分化、血管平滑肌的增殖、胚胎的神经形成、骨发生和肿瘤诱导的血管发生等^[5-12]。Id3的异常表达与肿瘤、肌肉萎缩、动脉粥样硬化症和炎症、干燥综合征有关^[12]。

与Id家族的其他成员一样，Id3的表达在胚胎发育过程中呈动态调控状态，在细胞发育过程中，Id基因大量表达于未分化的、增殖性细胞；随着细胞分化和成熟，Id基因表达逐渐减少。Id3表达的不确定与多种疾病和病理状态有关，包括癌症、衰老、动脉硬化症、肌肉萎缩和炎症等。在组织创伤后的新生过程中，Id3的表达模式也会发生改变。并且，Id3在不同组织种类的肿瘤中具有截然不同的表达谱。在结直肠癌、星形细胞瘤中Id3呈高表达；而在某些恶性肿瘤中如甲状腺癌、卵巢癌中反而呈下降表达趋势；在正常肝组织中可以检测到Id3的表达，其表达水平随着慢性肝炎到肝硬化的转化而提高，Id3在分化良好的肝癌细胞中的表达要高于分化不良的肝癌细胞。因此，Id3在肿瘤细胞中具有复杂的表达模式和调控途径。

目前国内外对Id3蛋白的表达、功能及调控机制还缺乏深入研究，某些研究尚未取得一致的结论。有关重组hId3蛋白的原核表达及其纯化、抗hId3抗体的制备目前国内外均未见报道。

参考文献：

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[12]贾丽，李晓军.顺铂诱导Daudi细胞增殖抑制中Id3的表达分析[J].临床检验杂志，2007，25(3)：111-113.

发明内容

本发明的目的是提供一种重组hId3原核表达载体。

本发明的另一个目的是提供一种重组hId3融合蛋白。

本发明的另一个目的是提供一种抗hId3多克隆抗体。

本发明还有一个目的是提供上述表达载体、融合蛋白及抗hId3多克隆抗体的制备方法。

本发明采用与硫氧还原蛋白(Trx)-组氨酸(His)融合表达的方式在大肠杆菌DE3中高效表达hId3融合蛋白并分离纯化重组蛋白，使之作为免疫原免疫家兔制备抗hId3多克隆抗体，为进一步研究hId3蛋白生物学功能及建立检测hId3的免疫学方法奠定基础。

本发明的技术内容包括：1.hId3基因编码区cDNA片段的PCR扩增及重组克隆载体Id3/pGEM-T的构建。2.pET32a/Trx-His-hId3原核表达载体的构建。3.hId3融合蛋白在大肠杆菌DE3中的表达及分离纯化和鉴定。4.将hId3融合蛋白免疫家兔制备特异性抗hId3多克隆抗体。

以下是本发明的具体技术措施：

1.根据GeneBank中提供的hId3cDNA编码序列，设计一对特异引物(SEQ ID No.2，SEQ ID No.3)，以pGEM-T/Id3载体为模板(也可以常规方法获得的含hId3的基因片断为模板)，用上述引物进行PCR扩增(结果见图1)。采用pGEM-T Easy Vector System将纯化的PCR产物hId3cDNA插入pGEM-T Easy载体，构建重组克隆载体Id3/pGEM-T(构建流程见图2)。测序结果见SEQ ID No.1。

2.将PCR扩增后的hId3编码基因克隆入带有T7启动子、6个组氨酸和硫氧还原蛋白编码基因的表达载体pET-32a的EcoR I和Sal I位点之间，获得hId3基因的原核表达载体pET32a/Trx-His-hId3。由于hId3基因上游融合了6个组氨酸和硫氧还原蛋白基因片段，利用His标签与Ni离子的亲和作用，融合表达出的蛋白产物可用Ni-NAT树脂进一步纯化，hId3与Trx的融合表达增加表达产物的可溶性，携带Trx-His-hId3融合基因的hId3/pET32a处于pET32a的T7启动子控制之下，融合蛋白基因中的外源蛋白基因与Trx之间还具有肠激酶和凝血酶的识别位点，便于从融合蛋白中切下Trx。

3.重组载体pET32a/Trx-His-hId3转化大肠杆菌BL21(DE3)，经IPTG诱导后，获得高效表达菌株。将转化菌在37℃进行基础培养，当细菌密度OD₆₀₀值为0.4～0.6时，37℃诱导4h，收集细菌，悬浮于1×Binding Buffer(20mM Tris-HCl，pH 7.9，500mMNaCl，10mMβ-巯基乙醇，1mmol/L PMSF)，超声破碎细胞，离心后，取上清液用于Ni-NTA亲和层析柱(Novagen公司)，分离纯化得到hId3融合蛋白，经Western blot证实该融合蛋白具有免疫原性蛋白(Western blotting鉴定时采用抗Id3抗体)。

在纯化过程中，Washing buffer I为：20mM Tris-HCl，pH 7.9，500mM NaCl，10mMβ-巯基乙醇，30mmol/L咪唑；Washing Buffer II为：20mM Tris-HCl，pH 7.9，500mMNaCl，10mMβ-巯基乙醇，45mmol/L咪唑，可大大提高纯化效果。

构建的重组表达载体按本发明所述方法转化大肠杆菌，诱导菌液中可溶性目的蛋白浓度约为0.41g/L。蛋白得率为0.76mg/g湿菌。

按本发明提供的分离纯化方法从转化菌中获得的hId3融合蛋白，经SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色检测，呈分子量约34KD的一条带，纯度大于90％。

4.将hId3融合蛋白免疫家兔制备特异性抗人Id3抗体：将纯化的重组蛋白用凝血酶切割Trx-His-hId3融合蛋白，再并用Ni-NTA亲和层析柱再次分离，获得切下Trx-His的hId3蛋白，以此蛋白为抗原，免疫8周龄新西兰白兔，多点皮内、皮下注射。首次免疫时，取纯化的重组蛋白1mg(容积1ml)与1ml弗氏完全佐剂充分乳化，于每只兔子颈背部皮内注射；15天后，加强免疫一次，剂量同上但用弗氏不完全佐剂充分乳化，注射于颈背部皮下；两周后再次加强免疫一次；第二次加强免疫10天后，从耳缘静脉采血检测抗体效价。用琼脂糖单向扩散试验测得兔源性抗血清的效价为1∶8；收集抗血清，分装，于-70℃冻存。

本发明有益效果：

本发明构建的表达载体由于在hId3基因上游融合了6个组氨酸和硫氧还原蛋白基因片段，利用His标签与Ni离子的亲和作用，融合表达出的蛋白产物可用Ni-NAT树脂进一步纯化，hId3与Trx的融合表达增加表达产物的可溶性，携带Trx-His-hId3融合基因的Id3/pET32a处于pET32a的T7启动子控制之下，融合蛋白基因中的外源蛋白基因与Trx之间还具有肠激酶和凝血酶的识别位点，便于从融合蛋白中切下Trx。

本发明采用PCR技术获得hId3编码基因，使用限制性酶切和连接技术，将hId3编码基因定向克隆到原核表达载体，获得hId3融合蛋白表达载体，实现了hId3在大肠埃希菌中的高效表达，表达量占菌体总蛋白的27％，同时也提供了一整套工程菌诱导表达和纯化工艺。本发明运用基因重组技术，构建pET32a/Trx-His-hId3融合表达载体，并转化表达细菌，经诱导、蛋白纯化获得hId3融合蛋白，以hId3融合蛋白为免疫原制备兔抗hId3多克隆抗体，为进一步研究hId3蛋白的生物学功能及其在临床医学诊断中的应用奠定基础。

附图说明

图1：hId3基因片段PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图。

其中：1.DNA分子量标准(DL2000)；2.PCR产物

图2：重组克隆载体hId3/pGEM-T构建流程。

图3：重组表达载体pET32a/Trx-His-hId3双酶切鉴定电泳图。

其中：1、150bp DNA分子量标准；

2、pET32a/Trx-His-hId3：经EcoR I和Sal I酶切；

3、质粒pET32a

图4：不同诱导时间下重组蛋白的SDS-PAGE分析。

其中：M.低分子量蛋白质标准；

1.未经IPTG诱导的pET32a/Trx-His-hId3；

2～7.经IPTG诱导1，2，4，6，8和12h的hId3/pET32a；

图5：镍离子亲和层析纯化hId3融合蛋白的SDS-PAGE分析。

其中：M.低分子量蛋白质标准；

1.pET32a/Trx-His-hId3质粒转化菌裂解液上清；

2.洗杂液；3.纯化的重组蛋白。

图6：Western blot印迹鉴定重组蛋白的特异性。

其中：M.低分子量蛋白质标准；1.重组蛋白

具体实施方式

下面结合附图对本发明的实施例进行具体说明。

实施例1：

1.根据GeneBank中提供的hId3cDNA编码序列，设计一对特异引物，在上游引物5′端引入EcoR I酶切位点；在下游引物5′端加入Sal I酶切位点，其中还包括终止密码子TAA。

上游引物：5’-CGGAATTCAAGGCGCTGAGCCCGGTG-3’(SEQ ID No.2)

(下划线为EcoR I酶切位点)

下游引物：5’-ACGCGTCGACTTAGTGGCAAAAGCTCCTTTTG-3’(SEQ ID No.3)

(下划线部分为Sal I酶切位点)。

以pGEM-T/Id3载体(见李晓军等，Id3-EGFP融合基因表达载体的构建及其在人肺癌细胞A549中的表达，《中国检验医学杂志》2006年12月第29卷第12期)为模板(也可以常规方法获得的含hId3的基因片断为模板)，用上述引物进行PCR扩增(图1)。采用pGEM-T Easy Vector System将纯化的PCR产物hId3cDNA插入pGEM-T Easy载体，构建重组克隆载体hId3/pGEM-T(构建流程见图2)。测序结果见SEQ ID No.1。。

2.用EcoR I和Sal I从hId3/pGEM-T载体中切出hId3基因克隆到pET32a中，得到表达载体hId3/pET32a(pET32a/Trx-His-hId3)。将hId3/pET32a表达质粒转化大肠杆菌，宿主菌为大肠杆菌BL21(DE3)，质粒hId3/pET32a转化采用氯化钙转化法。转化菌的筛选：从新鲜转化平板上挑取转化菌落，分别接种于含有氨苄青霉素(100mg/L)的LB培养基，37℃振荡培养过夜，收集菌体，提取质粒酶切鉴定(图3)。

3.将转化菌接种于含有氨苄青霉素(100mg/L)的LB培养液，37℃振荡培养过夜。次日将菌液以1∶100的比例接种于新鲜含有氨苄青霉素(100mg/L)的LB培养液，37℃培养至OD₆₀₀值为0.4～0.6，加入IPTG至终浓度为1mmol/L，于37℃继续培养约4h。分别取诱导前以及诱导1～12h的菌体作SDS-PAGE电泳分析。在电泳图谱上出现一条约34kD的新带。光密度扫描结果显示诱导表达4h的转化菌34kD的条带占细菌总蛋白的27％(图4)。

4.大量收集IPTG诱导转化菌E.coli BL21，重悬于1×Binding Buffer(20mMTris-HCl，pH 7.9，500mM NaCl，10mMβ-巯基乙醇)，加入终浓度为1mmol/L的PMSF，置冰浴中30min。用超声波细胞粉碎机进行超声破碎。超声结束后，加入Triton X-100至终浓度为1％(v/v)，6000r/min离心10min，收集离心后上清液上样至1mL的Ni-NTAHis-Bind层析柱，层析柱预先用1×Binding Buffer平衡。上样后，先用1×Binding Buffer洗脱两次，而后用20ml Washing buffer I(20mM Tris-HCl，pH 7.9，500mM NaCl，10mMβ-巯基乙醇，30mmol/L咪唑)洗柱，再用Washing Buffer II(20mM Tris-HCl，pH7.9，500mM NaCl，10mMβ-巯基乙醇，45mmol/L咪唑)洗柱，收集洗脱液；用4mlElution buffer洗脱，收集洗脱液。对收集的各管流出液进行SDS-PAGE分析，纯化的重组Id3融合呈分子量约35KD的一条带，纯度大于90％(图5)。免疫印迹(Westernblotting)鉴定结果与其一致(图6)。Western blotting鉴定时采用抗Id3抗体。

5.将纯化的重组蛋白用凝血酶切割Trx-His-hId3融合蛋白，再并用Ni-NTA亲和层析柱再次分离，获得切下Trx-His的hId3蛋白，以此蛋白为抗原，免疫8周龄新西兰白兔，多点皮内、皮下注射。首次免疫时，取纯化的重组蛋白1mg(容积1ml)与1ml弗氏完全佐剂充分乳化，于每只兔子颈背部皮内注射；15天后，加强免疫一次，剂量同上但用弗氏不完全佐剂充分乳化，注射于颈背部皮下；两周后再次加强免疫一次；第二次加强免疫10天后，从耳缘静脉采血检测抗体效价。用琼脂糖单向扩散试验测得兔源性抗血清的效价为1∶8；收集抗血清，分装，于-70℃冻存。

                                序列表

<110>中国人民解放军南京军区南京总医院

<120>一种人分化抑制因子3表达载体、融合蛋白及其制备方法

<160>3

<210>1

<211>740

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>重组hId3

<400>

ttctccccgc gcgttggccg attcattaat gcagctggca cgacaggttt cccgactgga 60

aagcgggcag tgagcgcaac gcaattaatg tgagttagct cactcattag gcaccccagg 120

ctttacactt tatgcttccg gctcgtatgt tgtgtggaat tgtgagcgga taacaatttc 180

acacaggaaa cagctatgac catgattacg ccaagctatt taggtgacac tatagaatac 240

tcaagctatg catccaacgc gttgggagct ctcccatatg gtcgacctgc aggcggccgc 300

gaattcacta gtgattcgga attcaaggcg ctgagcccgg tgcgcggctg ctacgaggcg 360

gtgtgctgcc tgtcggaacg cagtctggcc atcgcccggg gccgagggaa gggcccggca 420

gctgaggagc cgctgagctt gctggacgac atgaaccact gctactcccg cctgcgggaa 480

ctggtacccg gagtcccgag aggcactcag cttagccagg cggaaatcct acagcgcgtc 540

atcgactaca ttctcgacct gcaggtagtc ctggccgagc cagcccctgg accccctgat 600

ggcccccacc ttcccatcca gacagccgag ctcgctccgg aacttgtcac ctccaacgac 660

aaaaggagct tttgccacta agtcgacgcg taatcgaatt cccgcggccg ccatggcggc 720

cgggagcatc gacgtggccc                                             740

<210>2

<211>26

<212>DNA

<213>人工引物

<220>

<223>上游引物

<400>2

cggaattcaa ggcgctgagc ccggtg 26

<210>3

<211>32

<212>DNA

<213>人工引物

<220>

<223>下游引物

<400>3

acgcgtcgac ttagtggcaa aagctccttt tg 32