表达具有免疫激活功能的单链RNA的DNA疫苗载体及其用途

摘要

本发明公开了一种用于提高DNA疫苗免疫原性的表达载体，该载体包含可操纵地连接于启动子的编码具有免疫激活功能的单链RNA(ssRNA)的DNA序列。本发明还公开了一种重组质粒，其包含上述表达载体和插入所述表达载体中的编码抗原的外源基因。本发明同时公开了具有增强的免疫原性的DNA疫苗及其制备方法。

说明书

技术领域

本发明涉及基因免疫领域。具体而言，本发明涉及用于提高DNA疫苗免疫原性的表达载体、具有增强的免疫原性的DNA疫苗及其制备方法。

背景技术

DNA疫苗又称基因疫苗、核酸疫苗或裸露的DNA。该类疫苗通过把抗原基因导入体内表达来诱导抗原特异性免疫反应，从而达到预防或治疗疾病的目的，因此也被称为基因免疫。DNA疫苗既可以诱导抗原特异的细胞免疫反应，又可以诱导抗原特异的体液免疫反应，具有安全、模拟天然抗原呈递过程、构建周期短、生产简单、成本低、载体本身无免疫原性、储存简单、无需冷链等诸多优点。作为一种新的疫苗形式，DNA疫苗的前景已经逐步得到肯定，不但在动物模型中表现出非常好的潜力(Haigwood N L，Immunol lett，1999，66(1-3)：183-188；Shiver JM，J PharmSci.1996，85(16)：1317-1324)，而且在临床试验中表现出很好的安全性，受试者对DNA疫苗的耐受性也非常好。目前DNA疫苗面临的主要问题是免疫原性较弱，通常很难单独诱导出保护性免疫反应。多年来，疫苗学家一直在尝试不同的策略，期望能够提高DNA疫苗的免疫效果，并为此进行了许多努力和尝试。

DNA疫苗诱导免疫反应需要抗原呈递细胞获取足够的抗原并将其有效呈递，在这一过程中，协同刺激信号、炎症信号和细胞因子的产生是诱导特异性免疫反应所必需的。研究表明，细胞凋亡能够提供这类信号(Albert ML，Nature.1998，392(6671)：86-9)。DNA疫苗诱导的凋亡能够有效地促进APC对抗原的摄取与呈递，提高DNA疫苗的免疫效果(Sasaki S，etc，Nat Biotechnol.2001，19(6)：543-7)。近年来，甲病毒载体为代表的复制型载体成为疫苗载体研究的热点。以甲病毒复制子载体为代表的DNA疫苗设计思路很好的模拟了病毒感染的过程，能够全面诱导细胞凋亡和免疫激活，但庞大的载体和复杂的作用机制限制了这类载体的发展。一些以诱导细胞凋亡为目的DNA疫苗载体设计虽然取得了一定的成功，却忽略了病毒感染这一复杂事件所引发的其它免疫激活机制。如何利用简单的刺激信号诱导凋亡并激活更广泛的免疫调节机制，这成为提高DNA疫苗免疫原性的关键之一。

发明内容

在一个方面，本发明提供一种表达载体，该表达载体包含可操纵地连接于启动子的编码具有免疫激活功能的单链RNA(ssRNA)的DNA序列。

在另一方面，本发明还提供一种重组质粒，该重组质粒包含一种表达载体和插入所述表达载体中的编码抗原的外源基因，其中所述载体包含可操纵地连接于启动子的编码具有免疫激活功能的单链RNA的DNA序列。

在另一方面，本发明还提供一种宿主细胞，该宿主细胞包含如上所述的本发明的表达载体或者本发明的重组质粒。

在另一方面，本发明提供一种具有增强的免疫原性的DNA疫苗，其包含如上所述的本发明的重组质粒。

在另一方面，本发明提供一种提高DNA疫苗免疫原性的方法，其包含将编码抗原的外源基因克隆到本发明的表达载体中以构建DNA疫苗。

此外，本发明还涉及本发明的表达载体在制备具有增强的免疫原性的DNA疫苗中的应用。

附图说明

图1为单链RNA(ssRNA)表达盒结构示意图，U6 promoter表示鼠U6启动子，Transcription termination表示ssRNA表达盒的转录终止信号。

图2为载体pDRVI3.0构建流程图，通过将ssRNA表达盒克隆入载体pDRVISV1.0的BGH pA下游，构建成新的DNA疫苗载体pDRVI3.0。ssRNA表示单链RNA编码序列。polyT表示ssRNA转录终止序列。pU6表示鼠U6启动子。BGH PolyA表示牛生长激素基因的多聚腺苷加尾信号，MCS表示供外源基因插入的多克隆位点。ExonA-IntronA表示人巨细胞病毒主要即刻早期蛋白基因(Human cytomegalovirus majorimmediate-early protein gene)外显子1和内含子1。pCMV表示人巨细胞病毒主要即刻早期蛋白基因增强子/启动子序列。

图3为载体pDRVISV1.0、pDRVI3.0结构示意图。载体元件说明见图1说明。Kan表示卡那霉素抗性基因，ColE1表示ColE1复制起始区，BGH PolyA表示牛生长激素基因的多聚腺苷加尾信号，MCS表示供外源基因插入的多克隆位点，ExonA-IntronA表示人巨细胞病毒主要即刻早期蛋白基因外显子1和内含子1，pCMV表示人巨细胞病毒主要即刻早期蛋白基因增强子/启动子序列，pU6表示鼠U6启动子，ssRNA表示可激活PKR的单链RNA的基因，pT表示ssRNA表达盒的转录终止信号。

图4为pDRVISV1.0-gagtm和pDRVI3.0-gag结构示意图。载体元件说明见图2和图3说明。

图5为PCR扩增ssRNA表达盒片段电泳图，1为PCR扩增产物ssRNA表达盒，M为DNA分子量标准DL2000。

图6为PCR扩增BGH pA片段电泳图，1为PCR扩增产物BGH pA片段，M为DNA分子量标准DL2000。

图7为PCR扩增BGH pA-ssRNA表达盒片段电泳图，1为PCR扩增产物BGH pA-ssRNA表达盒，M为DNA分子量标准DL2000。

图8为pDRVI3.0的EcoRV和XbaI酶切鉴定图，M为DNA分子量标准DL2000；1为pDRVI3.0的EcoRV和XbaI酶切产物。

图9为pDRVI3.0-gag的EcoRV和XbaI酶切鉴定图，M泳道为DNA分子量标准DL2000，1为pDRVI3.0-gag的EcoRV和XbaI酶切产物。

图10为pDRVI3.0-gag的SalI和EcoRV酶切鉴定图，M1泳道为DNA分子量标准DL2000，M2泳道为DNA分子量标准DL15000，1为pDRVI3.0-gag的SalI和EcoRV酶切产物。

图11为DNA疫苗质粒体外瞬时转染Hela细胞48小时后Western印迹检测Gag表达的PVDF膜扫描图。M为预染蛋白分子量标准(10-170KD)，样品1为未转染质粒的Hela细胞，2为pDRVISV1.0-gagtm转染的Hela细胞，3为pDRVI3.0-gag转染的Hela细胞。

图12为DNA疫苗质粒体外瞬时转染Hela细胞48小时后，AnnexinV-FITC抗体染色进行流式细胞仪分析(细胞凋亡)结果。

图13为以DNA疫苗免疫Balb/c H-2d小鼠的免疫时间及剂量示意图。DNA疫苗质粒分两个剂量组分别免疫，免疫时间点为第0、2、4周，免疫后第6周进行特异性免疫反应检测。

图14为表示pDRVISV1.0-gagtm和pDRVI3.0-gag在100μg剂量诱导的Gag特异性IgG抗体按终末稀释法进行ELISA检测的结果，抗体滴度为一组小鼠抗体滴度的几何均值，其中pDRVISV1.0-gagtm诱导的抗体滴度为1∶24018.9，pDRVI3.0-gag诱导的抗体滴度为1∶47504.6。

图15为表示pDRVISV1.0-gagtm和pDRVI3.0-gag在10μg剂量诱导的Gag特异性IgG抗体按终末稀释法进行ELISA检测的结果，抗体滴度为一组小鼠抗体滴度的几何均值，其中pDRVISV1.0-gagtm诱导的抗体滴度为1∶380，pDRVI3.0-gag诱导的抗体滴度为1∶6320。

图16为表示pVRC2000-gag和pDRVISV1.0-gagtm在100μg诱导的IgG亚类滴度，A为剂量诱导的IgG亚类滴度，其中IgG2a/IgG1的比值为pDRVISV1.0-gagtm∶1.31，pDRVI3.0-gag∶1.08；B为在10μg剂量诱导的IgG亚类滴度，其中IgG2a/IgG1的比值为pDRVISV1.0-gagtm∶1.25；pDRVI3.0-gag∶1.13。

图17为ELISPOT法检测HIV-1CN54Gag特异性细胞免疫的结果。细胞免疫检测结果用Gag特异肽库刺激小鼠脾细胞后分泌IFN-γ的细胞数量表示。图表1、3分别为pDRVISV1.0-gagtm在100μg和10μg免疫剂量诱导的细胞免疫反应，2、4分别为pDRVI3.0-gag在100μg和10μg免疫剂量诱导的免疫反应，5、6为对照载体pDRVISV1.0和pDRVI3.0诱导的免疫反应，7为未接种任何质粒的空白小鼠对照。分泌IFN-γ的淋巴细胞数为(SFU/10⁶细胞)：pDRVISV1.0-gagtm 100μg免疫剂量：1013.5；pDRVI3.0-gag 100μg免疫剂量：1586.5；pDRVISV1.0-gagtm 10μg免疫剂量：550；pDRVI3.0-gag 10μg免疫剂量：959。

图18表示细胞内细胞因子染色法检测HIV-1CN54Gag特异性细胞免疫的结果。细胞免疫检测结果用Gag特异肽库刺激小鼠脾细胞后分泌IFN-γ的淋巴细胞占总淋巴细胞的比例(％)表示。1、3分别为pDRVISV1.0-gagtm在100μg和10μg免疫剂量诱导的免疫反应，2、4分别为pDRVI3.0-gag在100μg和10μg免疫剂量诱导的免疫反应，5、6为对照载体pDRVISV1.0和pDRVI3.0诱导的免疫反应，7为未接种任何质粒的空白小鼠对照。其中HIV-1 CN54Gag特异性CD8⁺T细胞占CD8⁺T细胞总数的比例分别为(％)：pDRVISV1.0-gagtm 100μg免疫剂量：1.17；pDRVI3.0-gag 100μg免疫剂量：1.68；pDRVISV1.0-gagtm 10μg免疫剂量：0.302；pDRVI3.0-gag 10μg免疫剂量：0.872。

图19所示为鼠源U6启动子的序列。

图20所示为本申请的实施例1-6中所构建的或者使用的本发明的载体中所含的编码ssRNA的DNA序列。

图21所示为转录终止信号。

具体实施方式

本发明提供了一种表达载体，其包含可操纵地连接于启动子的编码具有免疫激活功能的单链RNA(ssRNA)的DNA序列。

术语“可操纵地连接”在本发明中是指两种核苷酸序列是物理上或功能上相关联的，例如一个启动子区域与一个核苷酸序列以这种方式连接，由此核苷酸序列的转录由该启动子区域控制和调节。

术语“具有免疫激活功能”在本发明中是指物质能够激活免疫系统或使免疫系统活性提高的功能，例如，本发明的载体所表达的单链RNA能够引发免疫系统对DNA疫苗所产生的抗原产生更强的免疫应答。

例如，本发明的表达载体所编码的单链RNA可通过激活蛋白激酶R(PKR)而发挥免疫激活功能。蛋白激酶R(PKR)可识别病毒双链RNA(dsRNA)并介导干扰素应答和细胞凋亡。已知一些RNA发夹结构如TNF-α/βmRNA 5’UTR、dsRNA以及一些具有特征性高级结构的单链RNA能够特异性激活PKR (Raymond Kaempfer.EMBO reports 4，1043-1047(2003)；Xiaofeng Zheng and Philip C，RNA(2004)，10：1934-1945)，并能激活细胞的抗病毒机制及诱导细胞凋亡。此外，具有特殊发夹结构的ssRNA也能够有效地激活PKR(Philip C etc，Biochemistry 1998，37，6303-6316)。

本发明的表达载体可产生能够特异性激活PKR的ssRNA，此类ssRNA可用作分子佐剂，用于DNA疫苗，以增强DNA疫苗的免疫原性。例如，可在现有的DNA疫苗载体上插入ssRNA表达盒，经转染后可在抗原表达细胞中产生ssRNA分子，由此诱导包括细胞凋亡在内的广泛免疫激活机制。

可用于本发明的启动子的实例包括但不限于鼠U6启动子、人U6启动子及人H1启动子。在本发明的一个具体实施方式中，表达载体中的启动子是鼠U6启动子。

在本发明的表达载体的优选实施方式中，所产生的单链RNA可具有选自如下一组的序列：

序列号          单链RNA序列                      有关文献

SEQ ID NO：1    GGGAGAGCGGAAGCGUGCUGGGCC         Philip C.Bevilacqua，Cyril X.Binding

                CAUGAGGUCUAUCACUGCAUCGAC         of the Protein Kinase PKR to RNAs

                AGCUAGGCGGACAAUGCUUAAGCC         with Secondary Structure Defects：Role

                AGAGGUCGAUGGAUC                  of the Tandem A-G Mismatch and

                (CLONE2)                         Noncontiguous Helixes.Biochemistry

                                                 1998，37，6303-6316

SEQ ID NO：2    GGGAGAGCGGAAGCGUGCUGGGCC

                GUAAGGGUUCACUCUGCAUCGACA

                ACUGGACUUAAGCCAGAGGUCGAU

                GGAUC

                (CLONE14)

SEQ ID NO：3    GGGAGAGCGGAAGCGUGCUGGGCC

                UCGGAGGUGGUUCAGCUCUGCAUC

                GACAGUUGGCCUUAAGCCAGAGGU

                CGAUGGAUC

                (CLONE11)

SEQ ID NO：4    GGGAGAGAGGUCACUGACUAAGUU         XIAOFENG ZHENG and PHI LIP C.

                GGUGAAAUCUUGAUUUAUCAGUGA         BEVILACQUA，Activation of the

                CAAGAAGGAAGGGAUC                 protein kinase PKR by short double-

                (C26(9，15))                     stranded RNAs with single-stranded

                                                 tails.RNA(2004)，10：1934-1945

根据本发明的一个具体实施方式，本发明的表达载体是如图3所示的pDRVI3.0。该载体是通过将编码SEQ ID NO：1的单链RNA的DNA序列克隆入载体pDRVISV1.0的BGH pA(牛生长激素多聚腺苷加尾信号)下游而获得。

本发明还提供一种重组质粒，其包含本发明的表达载体和插入所述表达载体中的编码抗原的外源基因。本发明的重组质粒中的“外源基因”包括但不限于编码微生物例如病毒或者细菌的抗原性蛋白质或者多肽的基因、以及编码肿瘤抗原的基因。例如，所述外源基因是HIV-1CN54gag基因。

优选地，本发明的重组质粒中的外源基因是来自保藏号为CGMCCNo.1003的DH5α/pCRScript-gpnef中的HIV-1CN54gag基因。在一个具体实施方式中，本发明的重组质粒是如图4所示的pDRVI3.0-gag的重组质粒。

本发明还提供了一种宿主细胞，其包含本发明的表达载体或者重组质粒。优选地，所述宿主细胞是大肠杆菌，例如Top10。

本发明还提供了一种具有增强的免疫原性的DNA疫苗，其包含本发明的重组质粒，其中在现有的DNA疫苗载体上插入了ssRNA表达盒。此类DNA疫苗经接种于动物后可在靶细胞中产生ssRNA分子并表达DNA疫苗所编码的抗原，由此通过ssRNA分子诱导包括细胞凋亡在内的广泛免疫激活机制而增强动物体内针对所述抗原而产生的免疫应答。

因此，本发明同时提供了一种提高DNA疫苗免疫原性的方法，其包含将编码抗原的外源基因克隆到本发明的表达载体中以构建DNA疫苗。

此外，本发明还涉及本发明的表达载体在制备具有增强的免疫原性的DNA疫苗中的应用。

以下将结合实施例对本发明进行详细的描述，但本领域的技术人员应理解，下述实施例的意图是解释本发明，而不应以任何形式理解为意图限制本发明的范围。

本发明所使用的实验材料：pDRVISV1.0是由中国疾病预防控制中心性病艾滋病预防控制中心病毒免疫室构建的DNA疫苗载体，其结构见图2。可按照CN 1560259A(中国专利申请专利申请号200410028280.3)所述的方法构建载体pDRVISV1.0，在此通过引用将CN 1560259 A并入本文。携带遗传密码优化的HIV B’/C重组毒株CN54gag基因的质粒pCRScript-gpnef由本实验室和德国雷根斯堡大学微生物研究所共同构建，转化该质粒的大肠杆菌DH5α/pCRScript-gpnef已于2003年9月11日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)(中国，北京，中关村)，保藏号为1003。携带pDRVISV1.0-gagtm的大肠杆菌Top10/pDRVISV1.0-gagtm已于2003年9月11日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)(中国，北京，中关村)，保藏号为1002。Pyrobest^TM DNA Polymerase高可信度扩增酶为Takara公司产品；碱性磷酸酶、T4DNA连接酶为New England Biolabs公司产品；各种限制性内切酶均为Takara和New England Biolabs公司产品。DNA分子量Marker为宝生物公司和鼎国公司产品；低分子量蛋白标准为Amersham公司产品，预染蛋白分子量标准为Gibco和MBI公司产品。琼脂糖(Agarose)、低熔点琼脂糖、十二烷基硫酸钠(SDS)均为GIBCO BRL公司产品。酵母粉、胰蛋白胨为Oxoid公司产品；巯基乙醇ME、丙烯酰胺和亚甲基双丙烯酰胺为Fluka公司产品。Tris碱、X-gal、高分子量标准蛋白为Promega公司产品；IPTG、DTT、dNTPs为上海生工生物工程有限公司产品。其余生化试剂均为国产分析纯试剂；质粒小量提取试剂盒E.Z.N.A.PlasmidMiniprep Kit I质粒、凝胶回收试剂盒E.Z.N.A.Gel Extraction Kit、纯化试剂盒E.Z.N.A Cycle-Pure Kit为Omega公司产品，制备无内毒素的质粒DNA的Endofree Plasmid Giga Kit为Qiagen公司产品；Lipofectamine 2000质粒转染试剂盒为Invitrogen公司产品；Mouse IFN-γELISPOT检测试剂盒为UC-Tech公司产品。大肠杆菌Top10购自Invitrogen公司；PGEM T-easyVector System I购自Invitrogen公司；BHK-21细胞(Baby Hamster kidneycells，ATCC Number：CCL-10)由中国疾病预防控制中心性病艾滋病预防控制中心病毒免疫室保存，细胞培养于含10％胎牛血清、1％谷氨酰胺、1％青霉素/链霉素的DMEM培养液中37℃5％CO₂培养，培养液均由由中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所配液室提供。培养胎牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司。抗HIV-1阳性血清来性病艾滋病预防控制中心参比室；碱性磷酸酶AP标记羊抗人IgG、辣根过氧化物酶HRP标记羊抗鼠IgG购自北京中山公司；来源于B’/C重组亚型HIV-1CN54毒株gag的合成肽库用于Gag IFN-γ分析，由美国国立卫生研究院艾滋病研究参比试剂项目(NIH AIDS Research & Reference Reagent Program)馈赠；ELISA检测所用HIV-1p55抗原由性病艾滋病预防控制中心病毒免疫室提供；流式细胞仪测细胞内染色所需荧光抗体CD3-cy5、CD8-PE、IFN-γ-FITC和凋亡检测抗体Annexin V-FITC为Pharmingen公司产品；Laborzentrifugen台式冷冻离心机为Sigma公司产品，Beckman J2-MC高速冷冻离心机；GeneAmp PCR System9700PCR仪为PE公司产品；恒压恒流电泳仪Hoefer EPS 2A200，Power PAC300、Power PAC1000垂直蛋白电泳仪和TRANS-BLOT SD SEMI-DRY TRANSFER CELL电转仪为Bio-Rad公司产品；9052型电热恒温培养箱为上海医用恒温设备厂产品；HPS 280恒温生化培养箱HZQ X100振荡培养箱为哈尔滨东联电子技术有限公司产品；JY92 II型超声波破碎仪为宁波新技术公司产品；PVDF膜为Amersham公司产品；二氧化碳培养箱为SANYO公司产品；ELISPOT读板仪为BIOSIS公司产品；实验动物为6-8周龄BALB/c H-2d雌性小鼠体重18-25克购自中国医学科学院动物繁殖中心，清洁级饲养。

实施例1：DNA疫苗载体pDRVI3.0和DNA疫苗质粒的构建

为了使DNA疫苗质粒能够在细胞内产生ssRNA分子，以激活蛋白激酶R(PKR)信号传导途径，我们利用U6启动子介导ssRNA(SEQ IDNO：1)的转录(图1)。

利用人工合成的寡核苷酸，通过基因合成的方式人工合成ssRNA表达盒，并将其插入DNA疫苗载体pDRVISV1.0BGH pA元件的下游(图2和3)，得到DNA疫苗载体pDRVI3.0。

(1)Overlaping PCR合成U6启动子驱动的ssRNA表达盒(mUC)

寡核苷酸的设计和合成：

反应条件：无菌ddH₂O 12μl，10×PCR Buffer 2.5μl(含MgCl₂)，2.5mMdNTP 1μl，上述18条引物各0.5μl(20μM)，混匀后在GeneAmp2400PCR扩增仪中94℃变性5分钟，加入Pyrobest酶0.5μl(5U)。按下列条件进行基因合成：

94℃    变性20sec

56℃    退火20sec

72℃    延伸30sec共10个循环

72℃         延伸5min。

(2)PCR获取ssRNA表达盒mUC

引物设计：

反应条件：无菌ddH₂O 38μl，10×PCR Buffer 5μl(含MgCl₂)，2.5mMdNTP 4μl，上述基因合成产物0.5μl，引物各1μl(20μM)，混匀后在GeneAmp2400PCR扩增仪中94℃变性5分钟，加入Pyrobest酶0.5μl(5U)。

按下列条件进行基因合成：

94℃    变性20sec

60℃    退火20sec

72℃    延伸40sec，共25个循环

72℃    延伸8min。

结果：获得了特异的扩增产物(图5)。

(3)PCR获取BGH pA加尾信号

引物设计：

反应条件：无菌ddH₂O 38μl，10×PCR Buffer 5μl(含MgCl₂)，2.5mMdNTP 4μl，pDRVISV1.0质粒1μl(200ng)，引物各1μl(20μM)，混匀后在GeneAmp2400PCR扩增仪中94℃变性5分钟，加入Pyrobest酶0.5μl(5U)。按下列条件进行基因合成：

94℃    变性30sec

60℃    退火30sec

72℃    延伸40sec，共25个循环

72℃    延伸8min。

结果：获得了特异的扩增产物(图6)。

(4)mUC与BGH pA的拼接(pA-mUC)

引物设计：

Overlaping PCR反应条件：无菌ddH₂O 6.5μl，10×PCR Buffer 1μl(含MgCl₂)，2.5mM dNTP 1μl，人源的ssRNA表达盒基因与BGH pA片段各1μl(20μM)，混匀后在GeneAmp2400PCR扩增仪中94℃变性5分钟，72℃延伸10min。

PCR扩增反应条件：无菌ddH₂O38μl，10×PCR Buffer 5μl(含MgCl₂)，2.5mM dNTP 4μl，加入拼接反应产物1μl，引物各1μl(20μM)，混匀后在GeneAmp2400PCR扩增仪中94℃变性5分钟，加入Pyrobest酶0.5μl(5U)。

按下列条件进行基因合成：

94℃    变性30sec

60℃    退火30sec

72℃    延伸60sec，共25个循环

72℃    延伸8min。

结果：获得了特异性的目的扩增产物(图7)。

(5)质粒构建

将纯化后的pA-mUC片段用EcoRV酶切6h，胶回收后后备用。pDRVISV1.0载体、pDRVISV1.0-gagtm质粒用KpnI酶切，纯化后用T4DNA聚合酶磨平3’端(37℃ 30min)，产物纯化后再用EcoRV单切。胶回收后载体与片段4℃连接过夜，转化Top10感受态菌并挑取克隆，EcoRV和XbaI双酶切进行鉴定。

酶切反应体系

10×Buffer        5μl

内切酶            各1μl

质粒或片段        15μl

ddH₂O             补足至50μl。

酶切鉴定反应体系

10×Buffer        2μl

内切酶1           各1μl

质粒              5μl

ddH₂O             补足至20μl。

DNA末端平端化反应体系

10×Buffer        5μl

T4DNA Polymerase  1μl

dNTP              1μl

酶切后的质粒      30μl

ddH₂O             补足至50μl。

结果：载体pDRVI3.0和DNA疫苗质粒pDRVI3.0-gag构建正确。pDRVI3.0酶切鉴定结果见图8，pDRVI3.0-gag酶切鉴定结果见图9和图10。

实施例2.体外抗原表达分析

(1)细胞转染

细胞接入六孔板，培养至90％单层，用Lipofectamine2000分别将实施例1制备的DNA质粒转染细胞(方法见Lipofectamine2000 protocol，Invitrogen)，质粒用量2μg/孔，DMEM维持液(2％FBS、1％PS、1％Gln)0.5％CO₂37℃培养48小时。

(2)Western印迹

目的蛋白的收获：质粒转染细胞后48h后细胞刮子刮取细胞，离心后重悬细胞沉淀，加入等体积的2X上样缓冲液混匀煮沸5min。

电泳：配制10％聚丙烯酰胺凝胶，加入上述处理后的样品，120V的电压电泳至溴酚蓝到达分离胶底部，切下分离胶。

电转移：甲醇预处理PVDF膜15sec，去离子水清洗后浸泡于正极液。按顺序安装电转移装置，3mA/cm²电转50min。

电转移完成后，甲醇处理PVDF膜15sec，干燥15min。

5％脱脂奶稀释一抗，一抗为HIV-1阳性病人血清。

PBS洗膜3次，每次10min。

加入相应的辣根过氧化物酶标记的二抗(5％脱脂奶按1∶2000稀释)室温孵育1h。

PBS洗膜4次，每次10min。加入DAB显色底物显色后蒸馏水漂洗终止反应。

结果(图11)表明，pDRVISV1.0-gagtm和pDRVI3.0-gag所表达的Gag蛋白能够与HIV感染者的血清发生特异的抗原抗体结合反应，表明表达产物具有与天然抗原相似的抗原性。从表达量来看，pDRVI3.0-gag的表达水平略低于pDRVISV1.0-gagtm的表达水平，这可能是由于pDRVI3.0-gag在细胞内转录产生的ssRNA诱导了宿主细胞的凋亡。

实施例3.细胞凋亡检测

DNA疫苗质粒转染Hela细胞培养48小时，Annexin V-FITC染色后流式细胞仪分析凋亡细胞比例。

步骤1：DNA疫苗质粒用Lipofectamine2000分别转染Hela细胞，质粒用量2μg/孔，以DMEM维持液(2％FBS、1％PS、1％Gln)在0.5％CO₂37℃条件下培养48小时，并用不含质粒的PBS作为阴性对照，以丝裂酶素和LPS(刺激6h)作为阳性对照。

步骤2：清洗并收集细胞，以结合缓冲液洗涤细胞(结合缓冲液：10mM Hepes、140mM NaCl、2.5mM CaCl₂，PH 7.4)，1000rpm离心5min收集细胞。

步骤3：用100μl结合缓冲液重悬细胞，加入5μl Annexin V-FITC(25μg/ml)，37℃避光放置20min。

步骤4：以结合缓冲液洗涤细胞，1000rpm离心5min收集细胞。结合缓冲液重悬后流式细胞仪检测，计数10000点，分析凋亡细胞比例(％)。

细胞凋亡检测结果(图12)：pDRVISV1.0-gagtm、pDRVI3.0-gag诱导细胞凋亡的比例分别为9.72％和25.3％；阴性对照的细胞凋亡比例为0.92％。结果表明，携带ssRNA表达盒的新型DNA疫苗载体pDRVI3.0所构建的DNA疫苗能够在宿主细胞内诱导显著的细胞凋亡。

实施例4.DNA疫苗免疫小鼠

动物分组：35只小鼠分为7组，每组5只，清洁级饲养。质粒DNA免疫小鼠，pDRVISV1.0-gagtm和pDRVI3.0-gag设10μg和100μg两个免疫剂量。

免疫方式：用QIAGEN公司的EndoFree Plasmid Giga Kit制备质粒pDRVISV1.0-gagtm、pDRVI3.0-gag、pDRVISV1.0和pDRVI3.0，分别溶于生理盐水，配成浓度为1μg/μl或0.1μg/μl的质粒溶液。实验组每组5只小鼠(n＝5)，并设空载体对照和空白对照每组各5只。采用双侧后腿胫骨前肌注射方法，DNA疫苗免疫组和载体对照组小鼠注射质粒DNA(100μl/只)，空白对照组注射生理盐水。初次免疫后间隔2周以同样剂量加强免疫2次(图13)。

实施例5.体液免疫检测

第0、2、4周各以DNA疫苗免疫1次，第2、4周尾静脉取血分离血清，第6周杀鼠取血清，ELISA检测第2、4、6周Gag特异性IgG结合抗体滴度。

步骤1：用纯度大于90％的重组Gag p55抗原蛋白(31)包被酶标板(0.1μg/ml)，每孔加0.1ml，4℃过夜。次日洗涤缓冲液洗涤3次，甩尽残余液体。以抗体稀释液封闭60min，洗涤缓冲液洗涤3次，甩干后作检测，或晾干后4℃保存。

步骤2：加一定抗体稀释液稀释的待检样品(从1∶100开始，倍比稀释至1∶51200)0.1ml于上述已包被之反应孔中，置37℃孵育60min，洗涤8次(同时做空白、阴性及阳性孔对照)。

步骤3：于反应孔中，加入新鲜1∶5000抗体稀释液稀释的酶标第二抗体(抗抗体)0.1ml，37℃孵育60min，洗涤8次，最后一遍用DDW洗涤。

步骤4：加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃避光反应10min。终止反应：于各反应孔中加入50μl 2M硫酸0.05ml。

步骤5：结果判定：在ELISA检测仪上，于450nm处(620为参考波长)，以空白对照孔调零后测各孔OD值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性。

结果如图14、图15和图16所示。

实施例6.细胞免疫检测

(1)脾淋巴细胞的制备

1)小鼠眼眶采血，血样标记后4℃过夜，第二天收集血清-20℃保存。

2)处死小鼠后取脾，在5ml Hanks洗液中以纱布研磨分散细胞，转移至15ml离心管，1000rpm离心5min。

3)弃上清，利用约100μl残留液体重悬细胞后，加入2ml红细胞裂解液，从第一管开始计时，作用4min后，每管加入5ml 1640洗液终止裂解，1000rpm离心5min。

4)弃上清，重悬细胞后，每管加入5ml 1640洗液洗细胞，1000rpm离心5min。

5)弃上清，重悬细胞后，每管加入2ml 1640完全培养液，混匀后取50μl细胞悬液以PBS稀释10倍后进行细胞计数，调整淋巴细胞浓度到1×10⁷/ml。

(2)ELISPOT检测脾淋巴细胞反应水平

1)包被：在ELISPOT板中每孔加入包被抗体50μl，用PBS补充体积至每孔100μl。ELISPOT板用adhesive coverslip盖上以防蒸发，37℃2h。

2)ELISPOT板的封闭

3)取出已包被过的ELISPOT板，吸弃每孔中的包被抗体溶液。

4)无菌条件下用PBST洗涤6次300μl排枪。

5)在ELISPOT板中，每孔加入200μl含1％BSA(或Block buffer)的PBS，37℃1h。

6)取出37℃下封闭1h的ELISPOT板，吸弃每孔中的封闭液。(不要洗板！)

7)在ELISPOT板中，加入100μl多肽(先加肽再加细胞)，最后加入100μl淋巴细胞(细胞总数为1×10⁶)，总体积到200μl(每条多肽的终浓度为5μg/ml，细胞的终浓度为1×10⁷/ml，即每孔细胞总数为1×10⁶)。阴性对照不加多肽，加100μl R1640完全培养基。阳性对照不加多肽，加入PMA 2.5μl(25ng/ml)，Innomycin 1μl(1μg/ml)。免疫组各设2个复孔。

8)盖好ELISPOT板，放入37℃ CO2孵箱培养30h。

9)培养30h后，取出ELISPOT板。甩去细胞后，每孔加入200μl冰冷的去离子水。把ELISPOT板放置在冰浴中10分钟。

10)用PBST洗涤8次洗板机。

11)每孔加入100μl生物素化的detector Ab。用膜封住ELISPOT板后，把ELISPOT板放置在37℃孵箱中孵育1h。

12)取出ELISPOT板，倒去detector Ab溶液，用PBST洗涤8次。

13)每孔加入50μl GABA溶液。用膜封住ELISPOT板后，把ELISPOT板放置在37℃孵箱中孵育1h。

14)取出ELISPOT板，倒去GABA溶液。用PBST洗涤8次。洗涤完毕后，在吸水纸上轻轻拍干ELISPOT板。

15)每孔加入30μl Activator溶液。在暗处、室温下孵育(15～40分钟)。

16)出现斑点后，用蒸馏水冲洗，终止反应。

17)室温下避光干燥，读板仪检测。

(3)流式细胞仪检测CTL反应水平

1)在96孔板中每孔加入加入100μl多肽(先加肽再加细胞)，最后加入100μl淋巴细胞(细胞总数为1×10⁶)，总体积到200μl(每条多肽的终浓度为5μg/ml，细胞的终浓度为1×10⁷/ml，即每孔细胞总数为1×10⁶)。阴性对照不加多肽，加100μl R1640完全培养基。阳性对照不加多肽，加入PMA 5μl(25ng/ml)，Innomycin 2μl(1μg/ml)，放入37℃ CO₂孵箱培养17h。

2)将培养的96孔板1500rpm离心5min，迅速一次性甩去培养基，振荡利用残余液体重悬细胞，加入100μl染色缓冲液(PBS+2％FCS+2％NaN₃)洗涤细胞后，将96孔板1500rpm离心5min，迅速甩去液体。

3)加入100μl的Reagent A重悬细胞，室温避光放置15min，加入100μl染色缓冲液，将96孔板1500rpm离心5min，迅速甩去液体。

4)重悬于50μl含CD3-cy5、CD8-PE、IFN-γ-FITC标记抗体的ReagentB，其中抗体含量为1μl/well，室温避光放置25min。

5)加入100μl染色缓冲液洗涤细胞后，将96孔板1500rpm离心5min，迅速甩去液体。

6)用500μl的固定液FACS buffer+1％甲醛重悬细胞准备检测。

7)流式仪检测FACS计数100,000点。

综合动物实验结果，ssRNA表达盒元件显著增强了DNA疫苗的免疫原性，可以作为优化DNA疫苗的元件。

序列表

<110>中国疾病预防控制中心性病艾滋病预防控制中心

<120>表达具有免疫激活功能的单链RNA的DNA疫苗载体及其用途

<130>I200601644CB

<160>26

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>87

<212>RNA

<213>Artificial

<220>

<223>CLONE2

<400>1

gggagagcgg  aagcgugcug  ggcccaugag  gucuaucacu  gcaucgacag  cuaggcggac    60

aaugcuuaag  ccagaggucg  auggauc                                           87

<210>2

<211>77

<212>RNA

<213>Artificial

<220>

<223>CLONE14

<400>2

gggagagcgg  aagcgugcug  ggccguaagg  guucacucug  caucgacaac  uggacuuaag    60

ccagaggucg  auggauc                                                       77

<210>3

<211>81

<212>RNA

<213>Artificial

<220>

<223>CLONE11

<400>3

gggagagcgg  aagcgugcug  ggccucggag  gugguucagc  ucugcaucga  caguuggccu    60

uaagccagag  gucgauggau  c                                                 81

<210>4

<211>64

<212>RNA

<213>Artificial

<220>

<223>C26(9，15)

<400>4

gggagagagg  ucacugacua  aguuggugaa  aucuugauuu  aucagugaca  agaaggaagg    60

gauc                                                                      64

<210>5

<211>47

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>mU6F1

<400>5

gcccgcgccg  gccccctcgc  acagacttgt  gggagaagct  cggctac     47

<210>6

<211>49

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>mU6F2

<400>6

tcccctgccc  cggttaattt  gcatataata  tttcctagta  actatagag    49

<210>7

<211>47

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>mU6F3

<400>7

gcttaatgtg  cgataaaaga  cagataatct  gttcttttta  atactag      47

<210>8

<211>47

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>mU6F4

<400>8

ctacatttta  catgataggc  ttggatttct  ataagagata  caaatac      47

<210>9

<211>48

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>mU6F5

<400>9

taaattatta ttttaaaaaa cagcacaaaa ggaaactcac cctaactg                48

<210>10

<211>56

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>mU6F6

<400>10

taaagtaatt  gtgtgttttg agactataaa  tatcccttgg  agaaaagcct  tgtttg    56

<210>11

<211>43

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>mU6F7

<400>11

ctgggcccat  gaggtctatc  actgcatcga  cagctaggcg  gac                  43

<210>12

<211>49

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>mU6F8

<400>12

cttaagccag  aggtcgatgg atctttttct  agacccagct  ttcttgtac             49

<210>13

<211>21

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>mU6R1

<400>13

gtacaagaaa  gctgggtcta  g                                             21

<210>14

<211>47

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>mU6R2

<400>14

ctcaaaacac  acaattactt  tacagttagg gtgagtttcc ttttgtg    47

<210>15

<211>48

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>mU6R3

<400>15

ctgtttttta aaataataat ttagtatttg tatctcttat agaaatcc    48

<210>16

<211>47

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>mU6R4

<400>16

aagcctatca  tgtaaaatgt  agctagtatt  aaaaagaaca  gattatc    47

<210>17

<211>47

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>mU6R5

<400>17

tgtcttttat  cgcacattaa  gcctctatag ttactaggaa  atattat    47

<210>18

<211>46

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>mU6R6

<400>18

caaattaacc  ggggcagggg  agtagccgag  cttctcccac  aagtct    46

<210>19

<211>44

<212>DNA

 <213>Artificial

<220>

<223>mU6R7

<400>19

gtgcgagggg  gccggcgcgg  gcctagagat  ggcggcgtcg  gatc    44

<210>20

<211>38

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>mU6R8

<400>20

cacgcttccg ctctccccaa  acaaggcttt  tctccaag             38

<2l0>21

<211>43

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>mU6R9

<400>21

tgatagacct  catgggccca  gcacgcttcc  gctctcccca  aac      43

<210>22

<211>49

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>mU6R10

<400>22

gatccatcga  cctctggctt  aagcattgtc  cgcctagctg  tcgatgcag 49

<210>23

<211>22

<212>DNA

<213>Arti ficial

<220>

<223>mU6 up

<400>23

gatccgacgc  cgccatctct  ag                                22

<210>24

<211>21

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>U6down

<400>24

gtacaagaaa  gctgggtcta  g                  21

<210>25

<211>33

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>BGH up

<400>25

tgcaggatat  ctgctgtgcc  ttctagttgc  cag    33

<210>26

<211>24

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>BGH down

<400>26

taggtttggt  ttggtgggct  gatg                24