体内电穿孔递送途径在DNA疫苗中的应用以及DNA疫苗载体转录产生的dsRNA的佐剂效应研究

摘要

DNA疫苗是一种很有希望的新型疫苗策略。如何大幅度提高DNA疫苗的免疫原性是其发展所面临的首要问题，如何把质粒DNA高效率导入宿主细胞以及如何实现抗原蛋白的高效率呈递是DNA疫苗的两个关键环节。 首先，本论文应用体内电穿孔技术增强DNA疫苗的递送效率。我们构建了荧光素酶(Luciferase)表达质粒p1.0-luc，将其通过直接肌肉注射、肌注后以双针电极进行电穿孔、肌注后以钳式电极进行电穿孔等三种不同方法注射小鼠，72小时后取注射部位的肌肉测定Luciferase的表达情况。同时构建携带密码子优化的HIV-1B'/C重组亚型CN54株gag基因的DNA疫苗质粒p1.0-gag，在10μg、100μg两个剂量水平上通过以上三种不同的方法免疫Balb/c雌性小鼠，EUSA方法检测Gag特异的抗体反应，ELISPOT方法和细胞内因子染色技术检测细胞免疫应答。结果表明应用体内电穿孔技术可以使Luciferase在小鼠肌肉中的表达水平显著提高(最高达到66倍)，并增强了Gag特异的体液免疫应答(最高达到28倍)，显示了体内电穿孔技术在DNA疫苗递送方面的良好作用，其中使用双针电极的效果要显著好于钳式电极。同时，研究表明体内电穿孔对于Gag特异的细胞免疫应答并没有显著影响。 其次，本论文创造性地构建了能够在抗原表达细胞内转录产生双链RNA(dsRNA)分子的新型DNA疫苗载体，探索dsRNA分子对DNA疫苗的佐剂效果。我们构建了一双表达盒的DNA质粒pDRVI3.1，并克隆入3个含回文结构的DNA片段(包括正义链-茎环序列-反义链)，获得质粒pDS40、pDS200及pDS750，通过在细胞内的转录，可分别形成长度为40bp、200bp和750bp的dsRNA分子(含9nt或12nt的环)。我们利用上述载体分别构建了携带luciferase基因、HIV-1env基因、HIV-1 nef基因的重组质粒。体内外基因表达和细胞凋亡检测结果表明，长的750bp dsRNA分子能够显著抑制外源基因表达并诱导细胞的凋亡。小鼠免疫结果表明，在相同的免疫剂量和免疫次数下，携带短的40bp dsRNA：表达盒的DNA疫苗所诱导的特异性细胞免疫反应显著高于传统DNA疫苗所诱导的反应水平(最高达到4倍)；在低1个数量级的质粒剂量或少1次免疫注射的情况下，携带短的40bp dsRNA表达盒的DNA疫苗能够诱导出与传统DNA疫苗相同水平的细胞免疫应答；而携带750bp dsRNA表达盒的质粒不能增强细胞免疫应答。同时，dsRNA表达盒在诱导体液免疫应答方面不具备优势，甚至降低了体液免疫应答水平。 综合以上两部分的结果，体内电穿孔作为一种新的基因递送途径能够显著增强目的基因表达水平和抗原特异的体液免疫反应；而携带短的dsRNA表达盒的新型DNA疫苗载体能够显著增强抗原特异的细胞免疫应答。

目录

声明

摘 要

前 言

第一部分体内电穿孔对报告基因表达和HIV Gag DNA疫苗诱导的免疫反应的影响

一、 实验材料与方法

(一)、实验材料

(二)、实验方法

二、 结果与分析

(一)、目的基因的扩增

(二)、载体的构建及鉴定

(三)、Western Blot检测

(四)、小鼠注射部位肌肉的荧光素酶(Luciferase)表达检测

(五)、体液免疫检测

(六)、细胞免疫检测

三、 讨论

四、 第一部分小结

第二部分DNA疫苗载体转录产生的dsRNA的佐剂效应研究

一、 实验材料与方法

(一)、实验材料

(二)、实验方法

二、 结果与分析

(一)、目的基因的扩增

(二)、载体的构建及鉴定

(三)、转染效率分析

(四)、Luciferase表达水平分析

(五)、凋亡水平分析

(六)、抗原表达分析

(七)、携带dsRNA表达盒的质粒对小鼠免疫应答的影响(Env组)

(八)、携带dsRNA表达盒的质粒对小鼠免疫应答的影响(Nef组)

三、 讨论

四、 第二部分小结

参考文献

论文综述：DNA疫苗优化策略

附录

致谢

研究生简历