公开/公告号CN101248177A
专利类型发明专利
公开/公告日2008-08-20
原文格式PDF
申请/专利权人 沃尔特及伊莱萨霍尔医学研究院;
申请/专利号CN200680030608.2
申请日2006-06-23
分类号
代理机构中国国际贸易促进委员会专利商标事务所;
代理人罗菊华
地址 澳大利亚维多利亚
入库时间 2023-12-17 20:41:01
法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2020-06-23
未缴年费专利权终止 IPC(主分类):C12N15/01 授权公告日:20120905 终止日期:20190623 申请日:20060623
专利权的终止
2012-09-05
授权
授权
2008-10-15
实质审查的生效
实质审查的生效
2008-08-20
公开
公开
发明背景
发明领域
本发明通常涉及用于调节靶细胞或细胞群体中的凋亡的治疗性分子。更特别地，本发明提供了抑制促存活分子的和能够诱导或促进靶细胞或细胞群体例如癌细胞的凋亡的治疗剂。本发明还提供了用于产生或选择该治疗分子和包含所述治疗分子的药物组合物的方法。
现有技术的描述
本说明书中参考的现有技术不被和不应当被当作对该现有技术在任何国家形成了共同的一般知识的承认或任何形式的暗示。
本申请中提供的资料的详细目录列于本申请书的结尾。
癌症是发达国家中的第二大死亡原因。除了它使患者和其家庭遭受痛苦外，其也是治疗花费最昂贵的疾病之一(Zhang，Nat Rev DrugDiscov 1：101-102，2002)。因此，虽然对人生活产生极大的代价，但如果考虑到治疗费用和减少的经济生产率的代价，对社会的年经济负担预期到2010年时大约为2000至5000亿美元。
对编程性细胞死亡(凋亡)的干扰是许多主要疾病包括癌症的发展中的中心步骤。凋亡的至关重要的调节物的一个家族是Bc1-2蛋白家族。研究已显示人滤泡性淋巴瘤中增强的Bc1-2家族的过度表达抑制了凋亡和促进肿瘤发生(Vaux等人，Nature 335：440-442，1988；和Strasser等人，Nature 348：331-333，1990)。在高达90％的乳腺癌、结肠癌和前列腺癌中发现Bc1-2的过度表达(Zhang，2002，同上)，所述癌症代表了一些最常见的癌症。Bc1-2的促存活相关物也在许多肿瘤中过度表达。事实上，现已接受被削弱的凋亡为大多数恶性肿瘤发生的中心步骤(Cory等人，Nat Rev Cancer 2：647-656，2002)。
被削弱的凋亡也是细胞毒性癌症治疗功效的主要障碍(Cory等人，2002，同上；Johnstone等人，Cell 108：153-164，2002)。大多数细胞毒性剂，包括许多化疗药物和放射性药物，通过分子例如肿瘤抑制剂p53间接触发凋亡(Cory等人，2002，同上)。然而，在大多数肿瘤中，p53途径被失活，这阻止了启始凋亡。因此p53功能的丧失或Bc1-2的过度表达可引发药物抗性，是治疗失败的共同原因。
促进细胞存活的Bc1-2蛋白家族的成员，包括哺乳动物Bc1-2、Bc1-xL、Bc1-w、Mc1-1和A1，包含3或4个序列相似的BH(Bc1-2同源性)区，并且持续作用直至被其唯一的BH3 only相关物中和。这些促细胞凋亡拮抗剂，包括哺乳动物Bim、Puma、Bmf、Bad、Bik、Hrk、Bid和Noxa相互相关，并且是只被短的BH3结构域识别的广泛家族(Huang和Strasser，Cell 103：839-842，2000)。相反地，Bax和Bak(促细胞凋亡家族成员的亚组)与Bc1-2共有3个BH结构域，并且可能在胞内膜的透化中具有基本的下游功能(Wei等人，Science292：727-730，2001)。
BH3-only蛋白监控细胞正常，而破坏信号触发它们对促存活Bc1-2样蛋白的给合，从而起始细胞死亡(Cory等人，Oncogene22：8590-8607，2003；Huang和Strasser，2000，同上)。其由转录信号(例如Bim、Puma、Noxa)或不同翻译后机制(例如Bim、Bmf、Bad、Bid)诱导的差异激活提供了一些信号转导特异性(Puthalakath等人，Cell Death Differ 9：505-512，2002)。然而，一旦被激活，通常认为不同的BH3-only蛋白通过靶向所有促存活Bc1-2样蛋白类似地起作用(Adams等人，Genes Dev 17：2481-2495，2003；Cory等人.2003同上；Huang和Strasser，2000，同上)。直到最近其相互作用才得到系统性表征，少数研究局限于Bc1-xL或Bc1-2(Letai等人，CancerCell 2：183-192，2002；Petros等人，2000，同上；Sattler等人，1997，同上)。现已出版了揭示一些BH3 only蛋白是泛宿主性结合剂而其他为更具选择性的结合剂的详尽研究(Chen等人，Mol Cell17：393-403，2005)。确定不同的BH3-only蛋白和促存活家族成员是选择性地相互作用还是泛宿主性地相互作用对于阐明细胞死亡启动的机制(Adams，2003，同上；Cory等人，2003，同上；Danial和Korsmeyer，Cell 116：205-219，2004)是非常重要的并且对发展模拟BH3-only蛋白的作用、作为新抗癌药的化合物的当前努力是紧密相关的。
根据对具有更少的毒性和更好的被靶向的抗癌疗法的需要，存在对鉴定与Bc1-2样蛋白相互作用以抑制其促存活功能的分子的明确需要。
发明概述
本发明涉及用于调节细胞或细胞群体的凋亡的分子。特别地，本发明提供了促存活分子的拮抗剂，特别是促存活Bc1-2蛋白家族的一个或多个成员的拮抗剂。
受试促存活Bc1-2相互作用分子的产生和/或选择基于BH3-only促凋亡蛋白内的氨基酸残基的鉴定，所述氨基酸残基是发生BH3-only蛋白和促存活Bc1-2蛋白之间的BH3结构域结合所必需的。
可在与其相互作用的促存活Bc1-2蛋白谱方面从功能上区分BH3-only蛋白。通过鉴定特定BH3-only蛋白与特定促存活Bc1-2蛋白之间发生结合所必需的氨基酸，可产生或选择特异性与促存活Bc1-2蛋白相互作用和抑制其功能的拮抗剂。此类拮抗剂与靶细胞或细胞群的接触阻止了促存活Bc1-2蛋白的活性，从而在靶细胞或靶细胞群体中诱导凋亡。可选择地，这些靶的鉴定导致用于抑制凋亡分子和促存活分子的相互作用从而导致促进细胞存活的分子的产生。此类分子用于治疗退行性疾病(degenerative disease)。
因此，本发明的一个实施方案涉及试剂，所述试剂拮抗特定促存活Bc1-2蛋白，从而使得能够在选择的类型的细胞或细胞群体例如但不限于与癌细胞或过度增殖性疾病相关的细胞中诱导凋亡。
特别地，本发明涉及用于产生促存活Bc1-2家族成员的方法，该方法包括步骤：
a.突变来自BH3-only促凋亡蛋白的BH3结构域的一个或多个氨基酸残基；
b.将突变的BH3结构域与促存活Bc1-2家族成员接触；
c.检测突变的BH3结构域与促存活Bc1-2家族成员之间的结合的存在，从而鉴定促凋亡蛋白的BH3结构域中与BH3结构域和促存活Bc1-2家族成员之间的结合相互作用相关的氨基酸残基；和
d.产生拮抗剂，其模拟在BH3结构域与Bc1-2蛋白之间发生结合所必需的氨基酸处的野生型BH3结构域的。
上述部分c)中的“检测”包括通过促存活蛋白或促凋亡蛋白的效应进行的间接检测和结合的直接检测。
方便地，所述拮抗剂是结合促存活蛋白并且抑制其功能的肽。因此，在一个特定的实施方案中，所述拮抗剂是基于经修饰的BH3-only促凋亡蛋白的肽拮抗剂或肽模拟物。
本发明的肽拮抗剂对于一种或多种促存活分子(包括但不限于Bc1-2、Bc1-xL、Bc1-w、Mc1-1或A1)可以是特异性的。通过突变促凋亡蛋白例如但不限于Noxa、Bim、Puma、Bmf、Bad、Bik、Hrk和Bid中的一种或多种中的残基来进行拮抗剂的鉴定。
在特定的实施方案中，从具有选自SEQ ID NOs：1至10的BH3-only结构域序列的促凋亡蛋白衍生本发明的拮抗剂，其中所述BH3-only结构域在一个或多个氨基酸位点和/或在N和/或C末端部分具有一个或多个氨基酸置换、缺失或添加。
促凋亡分子的特定突变体包含选自下列的突变：
Bim：D1A、M2A、R3A、P4A、E5A、16A、W7A、I8A、A9E、Q10A、E11A、L12A、R13A、R14A、I15A、G16E、D17A、E18A、F19A、N20A、A21E、Y22A、Y23A、A24E、R25A和R26A；
Bad：N1A、L2A、W3A、A4E、A5E、Q6A、R7A、Y8A、G9E、R10A、E11A、L12A、R13A、R14A、M15A、S16E、D17A、E18A、F19A、V20A、D21A、S22A、F23A、K24A、K25A和G26E；
Bid：Q1A、E2A、D3A、I4A、I5A、R6A、N7A、I8A、A9E、R10A、H11A、L12A、A13E、Q14A、V15A、G16E、D17A、S18A、M19A、D20A、R21A、S22A、I23A、P24A、P25A和G26E；
mNoxaA：R1A、A2E、E3A、L4A、P5A、P6A、E7A、F8A、A9E、A10E、Q11A、L12A、R13A、K14A、I15A、G16E、D17A、K18A、V19A、Y20A、C21A、T22A、W23A、S24A、A25E和D26A
Bak：P1A、S2A、S3A、T4A、M5A、G6E、Q7A、V8A、G9E、R10A、Q11A、L12A、A13E、I14A、I15A、G16E、D17A、D18A、I19A、N20A、R21A、R22A、Y23A、D24A、S25A和E26A。
在上面的突变的目录中，“XnY”代表在残基编号n上用氨基酸残基X置换氨基酸残基Y。残基编号对应于BH3结构域的氨基酸序列。对于任何给定的促凋亡分子，可存在一个或多个突变。
可通过方法例如但不限于计算机筛选方法(silico screening)、高通量化学筛选法、基于功能的筛选法或构效关系法(structure-activity relationship)产生促存活Bc1-2家族成员的拮抗剂。
在另一个实施方案中，以药物形式例如药物组合物方便地提供本发明的拮抗剂。
本发明的拮抗剂特别适用于治疗具有癌症或过度增生性疾病或对发生癌症或过度增生性疾病易感的受试者。
本发明的促存活分子包括但不限于Bc-2促存活家族蛋白的成员，包括但不限于Bc1-2、Bc1-XL、Bc1-W、Mc1-1和A1。
在表1中提供了整个本说明书中使用的序列标志符的概述。
表1
序列标志符概述
序列的开始或末尾的“-”表示氨基酸残基的缺失。
发明详述
在详细描述本发明之前，要理解除非另外指出，本发明不限定于特定组分的制剂、生产方法、剂量或诊断方案等。也要理解，此处使用的术语只是为了描述特定的实施方案而不希望受到限定。
除非上下文明确指出，单数形式“a”、“an”和“the”包括复数。因此，例如，“a BH3-only蛋白”包括单个BH3-only蛋白也包括2个或更多个BH3-only蛋白；“an试剂”包括一种试剂，也包括2种或更多种试剂；“the制剂”包括单种制剂或多种制剂；等等。
此处参考的所有科学引述、专利、专利申请和厂商技术说明书在此以其全文引用作为参考。
序列的开始或结尾的“-”表示氨基酸残基的缺失。
BH3结构域中的突变表示为“X n Y”，其中氨基酸残基X在位点编号n上取代氨基酸残基Y。
在描述本发明和要求本发明的权利中，按照下面所示的定义使用下列术语。
在整个说明书和其后的权利要求中，除非上下文需要，术语“包括”，和变化形式“包含”和“含有”，理解为表示包括所述整体或步骤或整体或步骤的分组但不排除任何其他整体或步骤或整体或步骤的分组。
术语“试剂”、“化合物”、“药物活性剂”、“药物”和“活性的”在此处可互换使用，表示诱导想要的药理学和/或生理学效应的物质。所述术语也包括其药学上可接受的形式和药学活性形式，包括但不限于盐、酯、酰胺、前体药物、活性代谢物、类似物等。在一个实施方案中想要的效应是抑制或拮抗促存活分子，从而诱导细胞凋亡。在另一个实施方案中，想要的效应是通过拮抗促凋亡分子来促进细胞存活。
“药剂”、“药物活性剂”、“药物”可包括两种或更多种此类物质例如两种或更多种促存活拮抗剂的混合物。“混合物”也包括多部分混合物例如两部分组合物，其中在分配之前分开地提供和分开地给予或分配所述药剂或将其混合在一起。例如，多部分药物包装可具有分开保存的针对两种或更多种促存活蛋白的两种或更多种拮抗剂。包括使用促存活拮抗剂和抗癌剂(即化学治疗剂)的组合疗法也形成了本发明的部分。
此处使用的术语：“有效量”和“治疗有效量”是指足以提供想要的治疗或生理学效应或效果例如抑制促存活蛋白的活性或诱导靶细胞凋亡的药剂的量。此外，所述效应可以是细胞病症例如癌症的症状的改善。同时再次要提出的是，想要的效应可以是在例如退行性疾病的情况下促进细胞的存活。不想要的效应，例如副作用，有时随想要的治疗效应一起表现；因此，医生在确定什么是恰当的“有效量”中要平衡潜在的益处对潜在的风险的平衡。药剂的确切量随受试者的不同而不同，依赖于物种、年龄和受试者的一般状况、施用的模式等。因此，不可能确定确切的“有效量”。然而，通过使用常规实验本领域技术人员可确定任何个体情况下的合适的“有效量”。例如，可容易地在体外或动物模型中确定促存活蛋白的拮抗剂发挥作用的能力。关于后者，本领域技术人员能够基于这样的因素例如动物的，动物的症状的严重度和选择的特定组合物或施用途径确定所需量。然后将该信息外推至更大型的动物例如人。
在本发明的一个实施方案涉及蛋白或肽的用途的范围内，有效量包括大约10μg/kg体重的抗体至20mg/kg体重的抗体例如10、20、30、40、50、60、70、80、90、100μg/kg体重、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000μg/kg体重或2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20mg/kg体重。为单一治疗或组合治疗提供相似的量。
“药学上可接受的”载体和/或稀释剂是由非生物或想要的材料即可与选择的活性剂一起施用但不导致任何或显著不利反应的材料组成的药物媒介物。载体可包括任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗菌剂和抗真菌剂、用于调节张力的试剂、缓冲剂、螯合剂和吸收延迟剂等。
类似地，此处提供的化合物的“药学上可接受的”盐、酯、酰胺、前体药物或衍生物是非生物的或不想要的的盐、酯、酰胺、前体药物或衍生物。
此处使用的术语“治疗”和“医治”是指治疗性处理和预防性或防护性措施。例如，治疗可导致癌症的症状的严重度和/或频率的减少、癌症的症状和/或背后的病因的消除、癌症和/或其背后病因的发生的预防以及患癌症后的损伤的改善、补救或好转。因此，治疗可以不导致症状的“治愈”但可以导致症状的改善。此外，治疗可以不是原发性癌症的治疗但可以是续发性癌症或转移癌的治疗。
术语“病状”和“疾病”在整个本说明书中可互换使用。
此处使用的“受试者”是指动物，优选哺乳动物和更优选可从本发明的药物组合物和方法受益的人。不存在对可从本发明描述的药物组合物和方法受益的动物类型的限定。无论是人或非人动物的受试者可称作个体、患者、动物、宿主或接受者以及受试者。本发明的组合物和方法用于人的药物和兽医药物。
优选哺乳动物是人、实验室实验动物和参与赛跑和耐力行业的动物。实验室实验动物的实例包括小鼠、大鼠、兔子、豚鼠、仓鼠、猫和狗。赛跑和耐力行业的动物的实例包括马、狗、牛和骆驼。
本发明涉及用于产生促存活蛋白的拮抗剂的方法。所述拮抗剂诱导或促进凋亡。基于促凋亡分子中参与本发明的拮抗剂BH3-only促凋亡蛋白家族的成员和Bc1-2蛋白的促存活家族的成员之间的结合的氨基酸残基的鉴定产生本发明的拮抗剂。
因而本发明涉及用于调节细胞或细胞群体的凋亡的分子。特别地，本发明在一个实施方案中涉及Bc1-2蛋白家族的促存活成员的拮抗剂。
此处的“凋亡”是指其中程序化的事件顺序导致细胞的死亡和消除的细胞死亡形式。凋亡细胞经历独特的形态学变化。凋亡的标志包括细胞皱缩、细胞核和细胞质凝缩以及质膜拓扑学的改变。在生物化学上，凋亡细胞的特征在于增加的细胞内钙浓度、染色体DNA的片段化和新的细胞表面组分的表达。
因此，在本发明的一个实施方案，产生一个或多个Bc1-2蛋白家族成员的拮抗剂，使得能够在选择的细胞或细胞群体例如但不限于癌细胞和正在经历不想要的过度增殖的细胞中诱导凋亡。
此处的“癌细胞”是指展示非正常生长和倾向于以不受控制的方式增殖的和在一些情况下导致肿瘤和/或转移的细胞。涉及使用本发明的拮抗剂治疗的癌症包括，但不限于ABL1原癌基因、AIDS相关性癌症、听神经瘤、急性淋巴细胞性白血病、急性髓细胞样白血病、囊性腺样癌、肾上腺皮质癌、特发性骨髓外化生、斑秃、软组织腺泡状肉瘤、肛门癌、血管肉瘤、再生障碍性贫血、星形细胞瘤、共济失调性毛细血管扩张症、基底细胞癌(皮肤)、膀胱癌、骨癌、肠癌、脑干神经胶质瘤、脑和儿童中枢神经系统肿瘤(brain and cns tumor)、乳腺癌、儿童中枢神经系统肿瘤(cns tumor)、类癌瘤、子宫颈癌、儿童期脑肿瘤、儿童期癌(childhood cancer)、儿童期非白血性白血病(childhood leukemia)、儿童期软组织肉瘤、软骨肉瘤、绒毛膜癌、慢性淋巴细胞性白血病、慢性髓细胞样白血病、结肠直肠癌、皮肤T淋巴细胞瘤、隆凸性皮肤纤维肉瘤、结缔组织增生性小圆细胞肿瘤、导管癌、内分泌癌(endocrine cancer)、子宫内膜癌、室管膜瘤、食管癌、尤文氏肉瘤、肝外胆管癌、眼癌、眼：黑素瘤、视网膜母细胞瘤、输卵管癌、范可尼贫血、纤维肉瘤、胆囊癌、胃癌、胃肠癌、胃肠类癌瘤、泌尿生殖器肿瘤、生殖细胞肿瘤、妊娠性滋养层细胞病、神经胶质瘤、妇科癌症(gynaecological cancer)、血液肿瘤(hematological malignancy)、毛细胞性白血病、头颈癌(head andneck cancer)、肝细胞癌、遗传性乳腺癌、组织细胞增多病、何杰金病、人乳头状瘤病毒、葡萄胎、高血钙症、喉咽癌、眼内黑色素瘤、胰岛细胞癌、卡波西肉瘤、肾癌、朗格汉斯细胞组织细胞增生症、喉癌、平滑肌肉瘤、非白血性白血病、李弗劳明综合征、唇癌、脂肉瘤、肝癌、肺癌、淋巴水肿、淋巴瘤、何杰金氏淋巴瘤、非何杰金氏淋巴瘤、男性乳癌、肾的恶性棒状肿瘤(malignant-rhabdoid-tumor-of-kidney)、成神经管细胞瘤、黑素瘤、Merkel细胞癌、间皮瘤、转移癌、口腔癌、多发性内分泌腺瘤综合征、蕈样肉芽肿、骨髓增生异常综合征、骨髓瘤、骨髓增生性疾病、鼻癌、鼻咽癌、肾胚细胞瘤、成神经细胞瘤、神经纤维瘤病、nijmegen染色体断裂综合征(breakage syndrome)、非黑素瘤(non-melanoma)皮肤癌、非小细胞肺癌(non-small-cell-lung-cancer)-(NSCLC)、眼癌、食管癌、口腔癌、口咽癌(oropharynx cancer)、骨肉瘤、造瘘术卵巢癌(ostomy ovarian cancer)、胰腺癌、鼻旁癌(paranasalcancer)、甲状旁腺肿瘤、腮腺癌、阴茎癌、原始神经外胚层肿瘤(peripheral-neuroectodermal-tumors)、脑下垂体癌(pituitarycancer)、真性红细胞增多症、前列腺癌、rare-cancers-and-associated-disorders、肾细胞癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、先天性血管萎缩性皮肤异色病、涎腺恶性肿瘤、肉瘤、神经鞘瘤、恶性皮肤网状细胞增多综合征、皮肤癌、小细胞肺癌(SCLC)、小肠癌、软组织肉瘤、脊髓瘤、皮肤鳞状细胞癌(squamous-cell-carcinoma-(skin))、胃癌、滑膜肉瘤、睾丸癌、胸腺癌(thymus cancer)、甲状腺癌、移行细胞癌(膀胱)(transitional-cell-cancer-(bladder))、移行细胞癌(肾脏-骨盆-/-输尿管)、滋养细胞肿瘤、输尿管癌、泌尿系统肿瘤、异地排尿(uroplakins)、子宫肉瘤、子宫癌、阴道癌、外阴癌、华氏巨球蛋白血症和维尔姆斯氏肿瘤。
作为本发明的特定靶的癌症是产生过量Bc1-2蛋白或促存活蛋白相关蛋白和/或减少量的抑制Bc1-2成员的促凋亡分子的癌症。
按照本发明，促存活分子包括但不限于Bc1-2蛋白。Bc1-2蛋白家族以及其他细胞质蛋白是凋亡的至关重要的调节因子。目前已鉴定了3个亚家族内的至少15个Bc1-2家族成员。已在哺乳动物细胞和病毒中鉴定了此类蛋白，并且所述蛋白各自具有高度保守的4个Bc1-2同源结构域(BH1至BH4)中的至少一个结构域。Bc1-2家族蛋白包含在促存活亚家族的成员中发现的BH1和BH2结构域，然而与Bc1-2最相似的蛋白具有所有4个保守的结构域，这使得能够在遇到多种细胞毒性挑战时抑制细胞的凋亡。在哺乳动物中促存活亚家族的成员包括Bc1-2、Bc1-XL、Bc1-w、Mc1-1和A1(在哺乳动物中)；NF-13(鸡)；CED-9(秀丽隐杆线虫)；和病毒蛋白BHRF1、LMW5-HL、ORF16、KS-Bc1-2和ElB-19K。BH3结构域是促凋亡亚家族蛋白的功能所必需的。两个促凋亡亚家族Bax和BH3分别包括Bax、Bak和Bok(也称为Mtd)；和Bik、Blk、Hrk、BNIP3、BimL、Bad、Bid和Eg1-1(秀丽隐杆线虫)。Bax亚家族的成员包含BH1、BH2和BH3结构域，并且与Bc1-2非常相似。相反地，BH3亚家族的成员只具有9-16个残基的BH3结构域，或与任何已知的蛋白不相关，只有Bik和Blk共有序列相似性。两种促凋亡亚家族的蛋白可以是促存活亚家族蛋白的拮抗剂。在秀丽隐杆线虫中对此进行了说明，在所述秀丽隐杆线虫中，进行凋亡所需的Eg1-1结合至CED-9并通过其起作用(关于综述，参见，Adams，J.M.和S.Cory Science 281：1322-1326，1998)。
促凋亡和抗凋亡亚家族蛋白之间的异二聚体对这些蛋白亚家族具有滴定效应，这表明各亚家族成员的相对浓度可用于调节凋亡。
Bc1-2蛋白具有2种通过选择性剪接形成的同种型α和β。其形成了同型二聚体和与Bax和Bak蛋白以及Bc1-XL同种型Bc1-Xs形成异二聚体。与Bax的异二聚化需要完整的BH1和BH2结构域，并且对于促存活活性是必需的。BH4结构域似乎也参与促存活活性。Bc1-2位于线粒体内膜和线粒体外膜内，以及位于核膜和内质网内，并在多种组织中表达。在染色体易位T(14；18)(q32；q21)中看到其参与产生滤泡性淋巴瘤(II型慢性淋巴性白血病)，并且其参与产生滤泡性淋巴瘤涉及免疫球蛋白区域。
Bc1-XL蛋白是编程性细胞死亡的主要调节者。选择性剪接导致产生3种同种型，Bc1-xB、长同种型和短同种型。长同种型展示细胞死亡阻抑物活性，而短同种型促进凋亡。Bc1-XL与Bax和Bak形成异二聚体，尽管与Bax的异二聚化似乎对于促存活(抗凋亡)活性不是必需的。Bc1-Xs与Bc1-2形成异二聚体。在线粒体膜和核周膜中发现Bc1-x。Bc1-Xs以高水平在发育中的淋巴细胞和经历高循环率(highrate of turnover)的其他细胞中表达。在成人脑和其他组织的长寿命有丝分裂后细胞中发现Bc1-XL。至于Bc1-2，BH1、BH2和BH4结构域参与促存活活性。
在几乎所有骨髓细胞系和多数组织中的细胞质中发现Bc1-w蛋白，其在脑、结肠和唾液腺中表达水平最高。该蛋白以低水平在睾丸、肝、心脏、胃、骨骼肌和胎盘以及淋巴样细胞系中表达。Bc1-w包含BH1、BH2和BH4结构域，所述结构域都是其细胞存活促进活性所需要的。尽管其中Bc1-w基因功能被同源重组破坏的小鼠是可存活的、健康的和外表正常的，并且成年雌性具有正常的生殖功能，但成年雄性是不育的。在这些雄性中，在初始的青春前期前精子发生未受到明显影响并且睾丸发育正常。然而，曲细精管被破坏，包含大量凋亡细胞，从而不能产生成熟精子。该小鼠模型可用于人男性不育的一些情况，暗示着睾丸中程序化细胞死亡的改变可用于调节生育力(Print等人Proc Natl Acad Sci USA 95：12424-12431，1998)。
大鼠局部缺血大脑中的研究发现Bc1-w相对于其在非局部缺血的大脑中的低组成型水平表达为过度表达。此外，检查Bc1-w的作用机制的体外研究显示，当Bc1-w也存在时，分离的大鼠脑线粒体不能对重组Bax或高浓度的钙的加入起反应。正常反应是从线粒体释放细胞色素c。此外，发现重组Bc1-w蛋白抑制钙诱导的线粒体跨膜电位的丧失，这表示通透性转换。这些发现一起表明Bc1-w可以是抗局部缺血神经元死亡的神经保护剂和可通过线粒体死亡调节途径获得该保护(Yan等人，J Cereb Blood Flow Metab 20：620-630，2000)。
Bf1-1基因是Bc1-2家族的另外的成员，其也是凋亡的阻抑物。Bf1-1蛋白具有175个氨基酸，并且包含Bc1-2家族成员中发现的BH1、BH2和BH3保守结构域。其也包含富含Gln的NH2末端区域和缺少BH结构域1，与其他Bc1-2家族成员不同。小鼠A1蛋白共有与Bf1-1的高序列同源性并且具有3个Bf1-1中发现的保守结构域。类似于Bc1-2、Bc1-XL和EBV-BHRF1的作用，由p53肿瘤阻抑蛋白诱导的凋亡被Bf1-1抑制(D′Sa-Eipper，C.等人.Cancer Res.56：3879-3882，1996)。Bf1-1经发现存在于细胞内，在造血区室(hematopoieticcompartment)即血液、脾和骨髓中表达最高；在肺、小肠和睾丸中表达中等；在其他组织中表达最低。也在血管平滑肌细胞和血液肿瘤(hematopoietic malignancy)中发现其。已注意到Bf1-1的表达水平和胃癌发生之间的相关性，这表明Bf1-1蛋白在促进癌性细胞存活中和在癌症中参与胃癌的发展(Choi等人.Oncogene 11：1693-1698，1995)。在某些实施方案中，促存活分子包括但不限于Bc1-2、Bc1-xL、Bc1-w、Mc1-1和A1。
本发明涉及的促凋亡分子包括但不限于BH3-only蛋白家族的成员。在一些实施方案中，BH3-only蛋白包括但不限于Noxa、Bim、Puma、Bmf、Bad、Bik、Hrk和Bid。
本发明提供了可选择性结合Bc1-2、BC1-xL、Bc1-w、Mc1-1和A1中的一种或多种的拮抗剂，从而导致靶细胞或细胞群体的凋亡。
因此，本发明提供了产生促存活Bc1-2家族成员的拮抗剂的方法，所述方法包括步骤：
a.突变来自BH3-only促凋亡蛋白的BH3结构域的一个或多个氨基酸残基；
b.将突变的BH3结构域与促存活Bc1-2家族成员接触；
c.检测突变的BH3结构域与促存活Bc1-2家族成员之间的结合的存在或不存在，从而鉴定促凋亡蛋白的BH3结构域中与BH3结构域和促存活Bc1-2家族成员之间的结合相互作用相关的氨基酸残基；和
d.产生在BH3结构域与Bc1-2蛋白之间发生结合所必需的氨基酸上模拟野生型BH3结构域的拮抗剂。
“突变”是指BH3结构域序列内的一个或多个残基的置换或缺失。所述突变的实例公开于SEQ ID NOs：1-10。插入氨基酸序列突变体是其中一个或多个氨基酸残基被导入蛋白中预先确定的位点的突变体，尽管在对所得的产物进行合适的筛选的情况下也可能进行随机插入。缺失突变体的特征在于从序列除去一个或多个氨基酸。置换型氨基酸突变体是其中序列中的至少一个氨基酸被除去而不同的残基在其位置上插入的突变体。置换型氨基酸突变体的实例是保守性氨基酸置换。保守性氨基酸置换通常包括下列组内的置换：甘氨酸和丙氨酸；缬氨酸、异亮氨酸和亮氨酸；天冬氨酸和谷氨酸；丝氨酸和苏氨酸；赖氨酸和精氨酸；以及苯丙氨酸和酪氨酸。对氨基酸序列的加入包括与其他肽、多肽或蛋白的融合。
特定的突变体选自：
Bim：D1A、M2A、R3A、P4A、E5A、16A、W7A、I8A、A9E、Q10A、E11A、L12A、R13A、R14A、I15A、G16E、D17A、E18A、F19A、N20A、A21E、Y22A、Y23A、A24E、R25A和R26A；
Bad：N1A、L2A、W3A、A4E、A5E、Q6A、R7A、Y8A、G9E、R10A、E11A、L12A、R13A、R14A、M15A、S16E、D17A、E18A、F19A、V20A、D21A、S22A、F23A、K24A、K25A和G26E；
Bid：Q1A、E2A、D3A、I4A、I5A、R6A、N7A、I8A、A9E、R10A、H11A、L12A、A13E、Q14A、V15A、G16E、D17A、S18A、M19A、D20A、R21A、S22A、I23A、P24A、P25A和G26E；
mNoxaA：R1A、A2E、E3A、L4A、P5A、P6A、E7A、F8A、A9E、A10E、Q11A、L12A、R13A、K14A、I15A、G16E、D17A、K18A、V19A、Y20A、C21A、T22A、W23A、S24A、A25E和D26A
Bak：P1A、S2A、S3A、T4A、M5A、G6E、Q7A、V8A、G9E、R10A、Q11A、L12A、A13E、I14A、I15A、G16E、D17A、D18A、I19A、N20A、R21A、R22A、Y23A、D24A、S25A和E26A。
上面c)部分中使用的“检测”是指结合的直接检测或通过促存活或促凋亡分子的功能进行的间接检测。
在一个实施方案中，对BH3结构域内的氨基酸残基进行系统性突变。在本发明的某些方面，用丙氨酸置换氨基酸残基，或在其中丙氨酸或甘氨酸存在于野生型序列中的情况下，置换具有不同性质的氨基酸。例如，谷氨酸，当与丙氨酸或甘氨酸相比时，大小更大并且带电荷。
可使用筛选测定法确定突变的BH3结构域与促存活Bc1-2蛋白家族的成员之间的结合存在或不存在。该筛选测定法的实例包括但不限于ELISA、酵母双杂交筛选测定法或能够鉴定两种靶蛋白之间相互作用的任何其他测定法。
例如，在一个筛选测定法中，将突变的BH3结构域融合至M13噬菌体的基因-3次要包衣蛋白(minor coat protein)序列。然后将促存活蛋白例如Bc1-2、Bc1-xL、Bc1-w、Mc1-1或A1以不同的浓度与固定稀释度的展示突变的BH 3蛋白的噬菌体一起温育。然后就给定的BH3突变体与促存活Bc1-2蛋白家族的成员之间的结合相互作用确定IC50。
不结合或显示减少的对一个或多个Bc1-2蛋白家族成员的结合的能力的BH3突变体鉴定了与BH3-only蛋白对Bc1-2蛋白的结合相关的氨基酸残基。
结合测定法可简单地检测受试化合物对多肽的结合，其中通过荧光基团、放射性同位素、酶缀合物或其他可检测标记检测结合。例如，测定可包括将至少一种BH3突变体与至少一种存在于溶液中或附着至固体支持物的Bc1-2蛋白混合，然后检测Bc1-2对BH3突变体的结合的步骤。可选择地，测定可检测或测量在标记的竞争者存在的情况下BH3突变体的结合。此外，可使用无细胞制剂、化学文库或天然产物混合物进行测定，BH3突变体可以在游离于溶液中或附着至固体支持物。这样的测定的实例包括放射性标记测定法例如美国专利5,914,236和美国专利6,372,724中描述的测定法。
突变的BH3结构域或突变的BH3结构域片段可用于筛选调节Bc1-2蛋白的活性的化合物。此类化合物可包括激动剂、拮抗剂或部分激动剂或反激动剂。在一个实施方案中，在允许BH3对Bc1-2结合的条件下进行测定，其中将BH3结构域与至少一种受试化合物混合，然后将BH3结构域在受试化合物存在的情况下诱导凋亡的能力与BH3结构域在所述受试化合物不存在的情况下诱导凋亡的能力比较。在受试化合物存在的情况下凋亡水平的改变表示调节Bc1-2的活性的化合物。可选择地，将受试化合物在适合于BH3对Bc1-2结合的条件下与包含BH3的体外或无细胞体系混合，进行测定。在这些测定中的任一测定中，调节BH3诱导凋亡的能力的受试化合物可以间接地进行调节，并且不必直接与受试化合物接触。可筛选至少一种或多至多种受试化合物。
如此处所用的，“BH3结构域蛋白”可包括全长BH3结构域或其部分。全长BH3结构域可以存在于完整的BH3-only蛋白的背景中，或可以以分离的形式使用。本发明的BH3蛋白可以是天然发生的蛋白、重组产生的蛋白或可以是合成的肽。
“片段”是BH3结构域的独特部分或编码可在序列上对亲本序列同一但在长度上比亲本序列更短的BH3结构域的多核苷酸。片段可包含大约5至大约1000个连续核苷酸或氨基酸残基。用作探针、引物、抗原、治疗性分子或用于其他目的的片段在长度上可以是至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250或至少500个连续核苷酸或氨基酸。片段优选选自分子的某些区域。很明显这些长度是示例性的，本说明书支持的任何长度，包括序列目录、列表和图表，可包括在本实施方案中。
本发明部分地涉及调节Bc1-2蛋白功能从而用于增加凋亡的试剂的产生。
如此处所用的“拮抗剂”是指抑制或减弱Bc1-2蛋白的生物学活性的分子。拮抗剂可包括蛋白例如抗体、抗钙素(anticalin)、核酸、糖类、小分子或任何其他化合物或组合物，所述任何其他化合物或组合物通过直接与Bc1-2相互作用或通过对其中BH3-only蛋白和/或Bc1-2蛋白参与的生物途径的组分作用增加细胞或细胞群体对凋亡的易感性。
此处的“试剂”应当理解为是指来源于天然的、重组或合成来源的任何蛋白质性质的分子或非蛋白质性质的分子。有用的来源包括天然产生的文库、化学文库以及组合文库、噬菌体文库和基于体外翻译的文库的筛选。特别有用的来源是修饰泛宿主性BH3 only结构域以产生拮抗或刺激它们之间的相互作用的分子。在特别有用的实施方案中，试剂是基于BH3-only促凋亡蛋白(所述促凋亡蛋白在SEQ ID NO：1至10中的一个中所列的氨基酸序列中具有至少一个突变)的肽或蛋白。
在一个实施方案中，用于完全抑制或显著减少Bc1-2或促存活相关蛋白的促存活功能的水平或活性的本发明的试剂可以是蛋白质性质的分子或化学分子。术语“拮抗剂”或“拮抗作用”或“对抗”包括Bc1-2家族蛋白促存活活性的所有这些降低、抑制、减少和下调。这些试剂的结果是诱导或使细胞或细胞群体对凋亡易感。
关于为蛋白质性质的分子的试剂，此类分子包括肽、多肽和蛋白。此外，术语突变体、部分、衍生物、同源物、类似物或模拟物是指包括各种形式的试剂，所述试剂完全抑制或显著减少Bc1-2家族蛋白的促存活功能。
所述试剂可以是天然发生的或人工产生的分子。所述试剂可以是包含一个或多个氨基酸置换、缺失或添加的BH-3 only蛋白或其BH3结构域或片段。可通过诱变或其他化学方法或重组产生或合成产生所述试剂。丙氨酸扫描是用于鉴定重要氨基酸的有用技术(Wells，Methods Enzymol 202：2699-2705，1991)。在该技术中，用丙氨酸替代氨基酸残基，然后确定其对多肽活性的影响。以该方式分析试剂的各氨基酸残基以确定重要的结构和/或电荷和/或构象和/或疏水/亲水区。就其对Bc1-2的结合的能力和其他性质例如寿命、结合亲和力、离解速率、穿膜能力或诱导凋亡的能力检测试剂。
本发明的试剂也包括全长BH3-only蛋白的Bc1-2结合部分。部分是界定Bc1-2结合片段例如两亲性α螺旋结构的至少1个、至少10个、至少20个和至少30个连续氨基酸，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29和30个氨基酸。有人提出该结构与Bc1-2蛋白的疏水沟相互作用。可通过使用标准的重组核酸技术获得或使用常规液相或固相合成技术合成该类型的肽。例如，可参考由Nicholson编著和由Blackwell Scientific Publication的出版的标题为“SyntheticVaccines”的出版物中包括的Atherton和Shephard编写的标题为“Peptide Synthesis”的第9章中描述的溶液合成或固相合成。可选择地，可通过用蛋白酶例如endoLys-C、endoArg-C、endoGlu-C和葡萄球菌V8蛋白酶降解本发明的氨基酸序列来产生肽。可通过例如高效液相色谱(HPLC)技术纯化降解的片段。任何这样的片段，无论其产生的方法，要理解为此处使用的术语“拮抗剂”所包含的意义。
因此拮抗剂可包括BH3结构域的衍生物。这样的衍生物包括BH3结构域或BH3-only蛋白的部分、突变体、同源物、片段、类似物以及杂交分子或融合分子和糖基化变体。衍生物也包括在最优比对后在比较窗口上具有百分比氨基酸序列同一性的分子。优选地，特定序列和参照序列之间的百分比相似性是至少大约60％或至少大约70％或至少大约80％或至少大约90％或至少大约95％或更高例如至少大约96％、97％、98％、99％或更高。优选地，本试剂的种间、功能或结构同源物之间的百分比相似性是至少大约60％或至少大约70％或至少大约80％或至少大约90％或至少大约95％或更高例如至少大约96％、97％、98％、99％或更大。60％和100％之间的相似性或同一性的百分比也包括例如60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％。
此处涉及的蛋白拮抗剂例如BH3-only蛋白或BH3结构域的衍生物中的残基的类似物包括但不限于对侧链的修饰、在肽、多肽或蛋白质合成期间非天然氨基酸和/或其衍生物至肽中的整合、以及对蛋白性质的分子或其类似物施加构象限制的交联剂和其他方法的使用。该术语也不排除多肽的修饰，例如糖基化、乙酰化、磷酸化等。包括在该定义中的是例如包含氨基酸(包括，例如，非天然氨基酸例如表2中给出的氨基酸)的一种或多种改变的多肽或具有取代键的多肽。这样的多肽可能需要能够进入细胞。
本发明涉及的侧链修饰的实例包括氨基的修饰，例如通过还原烷基化(通过与醛基反应，然后用NaBH4还原)；使用甲基乙酰亚胺酯的二次胺化(amidination)；使用醋酸酐的酰化；使用氰酸盐的氨基的氨甲酰化；使用2，4，6-三硝基苯磺酸(TNBS)的氨基的三硝基苄基化；使用琥珀酸酐和四氢邻苯二甲酸酐的氨基的酰化；和使用吡哆醛-5-磷酸，然后用NaBH4还原的赖氨酸的吡醇羟乙酰化(pyridoxylation)。
可通过使用试剂例如2，3-丁二酮、苯乙二醛和乙二醛形成杂环缩合物来修饰精氨酸残基的胍基。
可通过形成O-acylisourea，然后进行随后的衍生化例如形成对应的酰胺来通过碳化二亚胺活化修饰羧基。
可通过方法例如使用碘乙酸或碘乙酰胺的羧甲基化；对磺基丙氨酸的过甲酸氧化；使用其他巯基化合物形成的混合二硫键；与马来酰亚胺、马来酸酐或其他取代马来酰亚胺的反应；使用4-氯汞苯甲酸、4-氯汞酚磺酸(chloromercuriphenylsulphonic acid)、氯化苯汞、2-氯汞-4-硝基酚和其他汞制剂的汞衍生物的形成；在碱性pH下使用氰酸盐的氨甲酰化来修饰巯基。
可通过例如使用N-溴代琥珀酰亚胺的氧化或使用2-羧基-5-硝基溴化苄或磺酰卤的吲哚环的烷化修饰色氨酸残基。另一方面，可通过使用四硝基甲烷硝化来改变酪氨酸残基，从而形成3-硝基酪氨衍生物。
可通过使用碘乙酸衍生物的烷化或使用焦碳酸二乙酯的N-乙氧羰基化(carbethoxylation)进行组氨酸残基的咪唑环的修饰。
在肽合成期间将非天然氨基酸和衍生物整合入肽中的实例包括但不限于正亮氨酸、4-氨丁酸、4-氨基-3-羟基-5-苯戊酸、6-氨己酸、叔-丁基甘氨酸、正缬氨酸、苯基甘氨酸、鸟氨酸、肌氨酸、4-氨基-3-羟基-6-甲基庚酸2-噻吩基丙氨酸和/或氨基酸的D-异构体的使用。此处涉及的非天然氨基酸的目录示于表2。此类非天然氨基酸可用于提供类似于BH3结构域的三级结构。
表2：非常规氨基酸的代码
可以例如使用交联剂稳定3D构象，使用同质双功能(homo-bifunctional)交联剂例如具有n＝1至n＝6的(CH2)n间隔基团的双功能亚胺酯、戊二醛、N-羟基琥珀酰亚胺酯和通常包含氨基反应部分例如N-羟基琥珀酰亚胺酯和另一个基团特异性反应部分例如马来酰亚胺基或二硫代部分(SH)或碳化二亚胺(COOH)的异质双功能(hetero-bifunctional)试剂。此外，可通过例如整合Cα和Nα-甲基氨基酸，在氨基酸的Cα和Cβ原子之间引入双键和通过引入共价键(例如在N和C末端之间、两个侧链之间或侧链和N或C末端之间形成酰胺键)形成环肽或类似物来在限制肽的构象。
BH3结构域的模拟物包括在结构和/或功能水平上的靶结合剂(即BH3-only蛋白)并且其抑制促存活Bc1-2蛋白。根据本发明的一个实施方案，提出产生选择的BH3结构域模拟物。基于BH3结构域(所述结构域具有阻止对Bc1-2蛋白结合的突变)之间的结构差异设计BH3结构域模拟物。
肽模拟物可以是包含肽的模拟蛋白二级结构的元件的分子(Johnson等人，Peptide Turn Mimetics in Biotechnology andPharmacy，Pezzuto等人，Eds.，Chapman and Hall，New York，1993)。肽模拟物的用途背后的基本原理是蛋白的肽主链主要以这样的方式如促进分子相互作用例如促进抗体和抗原、酶和底物或支架蛋白(scaffolding protein)的相互作用的方式确定氨基酸侧链的方向而存在。设计肽模拟物以允许类似于天然分子的分子相互作用。BH3结构域的肽或非肽模拟物可作为减少Bc1-2的促存活功能从而诱导或使细胞或细胞群体对凋亡易感的试剂用于本发明。
将模拟物设计为药物活性化合物是已知的产生基于“先导”化合物的药物的方法。当活性化合物难以合成或合成代价昂贵时或当其不适合用于特定的施用方法(例如肽是不适合于口服组合物的活性剂，因为其倾向于被消化道内的蛋白酶降解)时，这可以是想要的。模拟物的设计、合成和检测通常用于避免就靶性质随机筛选大量分子。
在从具有给定的靶性质的化合物设计模拟物中通常要进行几个步骤。第一，确定在确定靶性质中是至关重要和/或重要的化合物的特定部分。在肽的情况下，这可以通过例如依次置换各残基，系统性改变肽中的氨基酸残基来进行。如上文中所描述的，肽的丙氨酸扫描通常用于精炼(refine)此类肽基元。这些构成化合物的活性区的部分或残基称为其“药效团”。
当发现药效团后，根据其物理性质例如立体化学、键合、大小和/或电荷，使用来自许多来源例如分光镜技术、X射线衍射和NMR的数据对其结构建模。可在该建模过程中使用计算机分析、相似性作图(其建立药效团的电荷和/或体积而非原子之间的键的模型)，可将其他技术用于该建模方法。
在该方法的变异中，建立配体和其结合伴侣的三维结构模型。当配体和/或结合伴侣在结合时改变构象，从而允许模型在模拟物的设计中考虑该现象时，这可以是特别有用的。建模可用于产生与线性序列或三维构型相互作用的抑制剂。
然后选择可将模拟药效团的化学基团嫁接至其上的的模板分子。可方便地选择所述模板分子和嫁接至其上的化学基团以使模拟物容易合成，所述模板分子可能是药学上可接受的，并且在体内不降解，同时保持先导化合物的生物学活性。可选择地，当模拟物基于肽时，可通过环化肽增加其刚性来获得进一步的稳定性。然后可筛选通过该方法发现的模拟物以看其是否具有靶性质或看它们展示其的程度。然后可进行进一步的最优化或修饰以获得一种或多种用于体内或临床试验的终模拟物。
本发明的推理性药物设计的目的是使用计算机方法产生和/或选择限制性BH3-only蛋白的结构类似物以产生药物，所述药物是例如多肽的更具有活性或稳定的形式和具有限制性结合谱。在一个方法中，人们首先通过X射线衍射晶体分析法、通过计算机建模或最常见地方法的组合确定目的蛋白的三维结构。也可通过基于同源蛋白的结构建模获得关于多肽结构的有用信息。推理性药物设计的实例是HIV蛋白酶抑制剂的产生(Erickson等人，Science 249：527-533，1990)。
药物筛选的一个方法优选在竞争结合测定中使用用重组多核苷酸转化的表达多肽或片段的真核或原核宿主细胞。此类细胞(以活的或固定的形式存在)可用于标准结合测定法。可测量例如靶或片段和受试试剂之间的复合物的形成，或检查受试试剂促进或干扰靶或片段和已知的配体之间的复合物的形成的程度。
筛选方法包括测定(i)药物和靶之间的复合物的存在，(ii)编码所述靶的核酸分子的表达水平的改变。测定的一种形式包括竞争结合测定法。在该竞争结合测定中，通常标记靶。将游离靶与任何假定的复合物分离，游离(即未复合的)标记的量是受试试剂对靶分子的结合的量度。也可测量结合的靶而非游离的靶的量。也可能标记化合物而不是靶，然后测量在受试药物存在和不存在的情况下结合靶的化合物的量。
用于药物筛选的另一种技术提供了针对具有对靶的合适结合亲和力的化合物的高通量筛选，在Geysen(国际专利公开号WO 84/03564)中详细地描述了该技术。简而言之，在固体基质例如塑料针(plasticpin)或一些其他表面上合成大量不同的小肽受试化合物。将所述肽受试化合物与靶反应，然后进行洗涤。之后使用本领域中熟知的方法检测结合的靶分子。该方法可适合用于筛选非肽、化学实体。因此该方面扩展至筛选靶拮抗剂或激动剂的组合方法。
可将纯化的靶直接包被在上述药物筛选技术中使用的板上。然而，也可使用针对靶的非中和抗体将靶固定在固相上。可选择地可以以与方便选择的标记的融合蛋白形式表达靶以有利于结合和鉴定。
在另一个实施方案中，可进行Bc1-2蛋白和Bc1-w的抑制剂的高通量化学筛选(HTCS)。假定BH3-only蛋白如Bim与促存活Bc1-2分子的相互作用参与凋亡，那么可就有机小分子(所述有机小分子以这样的方式如阻止BH3结合的方式结合促存活蛋白)筛选文库。为了鉴定靶向一种或两种抗凋亡分子的化合物，可进行多个筛选过程。
可在细菌中产生高容量测定所必需的蛋白，使用光学生物传感器(BiaCore)的初步研究显示生物素化的BH3肽以高亲和力(Kd～11nM)结合His6标记的Bc1-2蛋白(Hinds等人，EMBO Journal 22：1497-1507，2003)。已使用AlphaScreenTM(Amplified Luminescent ProximityHomogeneous Assay)技术发展了进行HTCS所必需的高容量结合测定法(Glickman等人，J Biomol Screen 7：3-10，2002)。通过显示作为两个伴侣蛋白相互作用的荧光输出的变化，其可以敏锐的灵敏性监控蛋白的相互作用。AlphaScreenTM非常适合用于HTCS，因为其非常强大并且可作为具有很大动态范围的均相测定法在小体积中容易地进行。
在一个实施方案中，将His6 Bc1-2结合至镍包被的受体小珠和将生物素化的BH3肽结合至链霉抗生物素包被的供体小珠。然后将小珠与受试化合物在384孔微量滴定板的小孔(每孔一种受试化合物)一起温育，然后使用Fusion alpha板读出器读出测定结果。可就蛋白伴侣和小珠的浓度、温育时间和测定体积最优化结合测定法以使测定通常产生大于30∶1的信号背景比。已验证所述测定法是有效的，因为获得的系列肽的IC50值与使用光学生物传感器获得的相当。尽管肽的亲和力横跨3个数量级(8nM-35μM)，但两组结果之间的强相关性(R2＝0.9983)显示所述测定法测量相同的相互作用。也可最优化用于His6Bc1-2Δ/BH3的结合测定法。在最优化测定法后，可使其接受严格的质量控制以评估板对板和天对天的重现性。然后使用各测定法筛选独特的发现文库。为消除假阳性，可在第二竞争测定(AlphaScreenTM，荧光偏振和BiaCore光学生物传感器)中验证满足靶潜能(IC50＜25μM)的所有抑制性化合物。光学生物传感器帮助定量Bc1-2家族成员之间的相互作用，和可进行强候选物对通过BH3-only蛋白产生的生理结合的亲和力之间的容易的比较。
可通过，除其他以外，液相色谱-质谱光谱测定法(liquidchromatography-mass spectrometry)就本体(identity)和纯度检查通过这些初步检测的化合物，然后就其靶特异性即对于Bc1-2、Bc1-xL、Bc1-w、Mc1-1或A1的亲和力对其进行检测。也可在设计用于预测肠吸收(Wohnsland等人，J Med Chem 44：923-930，2001)和肝毒性的测定法中检测活性化合物。此外，可使用in silico法(in silicomethod)预测其生物分布特性，和排除可提供于代谢或毒性问题的药效团(Drug Metabolism Databases and High-Throughput TestingDuring Drug Design and Development，Ed Erhardt，BlackwellScience，Malden，MA，USA，1999)。可通过结合测定法中的效能、靶选择性、有利的预测的ADMET(吸收、分配、代谢、排泄和毒性)性质(van de Waterbeemd和Gifford，Nat Rev Drug Disc 2：192-204，2003)和化学易处理性(chemical tractability)对关于所有活性化合物的数据进行分级。然后，可获得顶部化合物的所有可获得的相近的结构类似物并就结合和杀伤测定中的抑制性活性检验其以确定各结构系列的初步构效关系。
关于就生物学活性对先导化合物进行的测定法，当发现有前景的先导化合物时，可估量其对细胞存活率的活性。可在成组的培养的致瘤性细胞系和非致瘤性细胞系以及原代小鼠和人细胞群体例如淋巴细胞中检验多至50种根据上述标准最优化的化合物。可在与1nM至100μM的所述化合物一起温育的3至7天中监控细胞存活率。当然将对比其正常细胞对应物更有效杀死肿瘤细胞的化合物投入是大的关注。可就其靶的特异性和作用模式评价在低于10μM的浓度上发生杀死作用的化合物。验证其作用模式是非常重要的，因为受试化合物可间接杀死细胞。例如，如果先导化合物以高选择性结合Bc1-2，其不应当杀死缺乏Bc1-2的细胞。因此可通过将野生型细胞中的化合物的活性与缺乏Bc1-2的细胞中的比较来确认作用的特异性。
可将最有前景的候选物在小鼠模型中接受其抗肿瘤功效的全面分析。在之前已完全表征的两个模型中，用B细胞淋巴瘤注射的、来源于myc转基因小鼠(Adams等人，Nature 318：533-538，1985)或myc/bc1-2双转基因动物(Strasser等人，同上)的免疫活性小鼠快速死亡并重现白血病/淋巴瘤症状。尽管两种肿瘤都对标准的化学疗剂(环磷酰胺)起反应，但用myc/bc1-2肿瘤细胞注射的小鼠不可避免地复发。这两种可移植肿瘤将允许在治疗这些恶性肿瘤中检验单独提供的或与环磷酰胺一起提供的任何化合物，所述恶性肿瘤是非常接近人淋巴瘤的模型。
关于先导化合物的构效关系(SAR)和其最优化，选自初步筛选的先导物可要求相当多的修饰以增强其生物化学、生物学和药理学性质(Bleicher等人，Nat Rev Drug Discov 2：369-378，2003)。为促进这些化合物的最优化，可在生物化学和结构研究中验证其作用模式。此外，可通过核磁共振分光检定法分析所述试剂与促存活分子之间形成的复合物。因为NMR可检测低亲和力的配体和显示其在靶蛋白上的结合位置，所以其可大大地帮助结合的最优化，从而加速药物发现过程(Hajduk等人，J Med Chem 42：2315-2317，1999；Pellecchia等人，Nst Rev Drug Discov 1：211-219，2002)。通过使用技术例如化学位移作图，可监控受试化合物对Bc1-2蛋白的结合和可选择模拟BH3结构域的分子进行最优化。
在相关方法中，可使用适合的DOCK程序(Kuntz，Science257：1078-1082，1992)进行先导试剂的分子建模以在硅片上(insilico)估量其结合。可对先导物结合至靶Bc1-2的沟进行建模，然后对使用的功能评分以预测最可能的结合模式。这可指导提供额外的相互作用以增强结合的衍生物的设计。NMR产生的实验数据的可获得性也使得可能如意地停靠配体和靶以预测改进的配体(Lugovskoy等人，J Am Chem Soc 124：1234-1240，2002)。
该信息和来自生物学测定的信息可用于合成用于进一步检验的衍生化合物。对于各类先导化合物，存在用于合成衍生物的策略。例如，典型的击中化合物(hit compound)由两个或三个连锁的环系统组成，所述各环系统可被许多种官能团取代。通过系统性地取代各官能团，可产生和检测具有广泛的化学特性的化合物。
根据本发明鉴定的试剂用于治疗癌症或过度增生性疾病或病症。
此处的“改善”可以是指当前状况的严重度的减轻。术语“好转”也用于包括预防病症发生的“预防性措施”。术语“好转”不必表示将受试者治疗至完全康复。类似地，“预防”不必指受试者最终不感染病症。
此处使用的受试者是指可受益于本发明的试剂的人和非人灵长类动物(例如大猩猩、猕猴、狨猴)、家畜类动物(例如绵羊、牛、马、驴、猪)、伴侣动物(例如狗、猫)、实验室试验动物(例如小鼠、兔子、大鼠、豚鼠、仓鼠)、俘获的野生动物(例如狐狸、鹿)、爬行类动物或两栖动物(例如蟾蜍(cane toad))、鱼(例如斑马鱼)和任何其他生物(例如，线虫)。对可受益于目前描述的试剂的动物类型没有限制。本发明的最优选受试者是人。受试者，无论其是人或非人生物，可称为患者、个体、动物、宿主或接受者。
因此，本发明的另一个方面提供了在受试者中预防或减少癌症或过度增生相关性疾病的方法，所述方法包括在一段时间内和在足以预防或减少癌症或过度增生病症的条件下给所述受试者施用有效量的Bc1-2蛋白的拮抗剂。
能够拮抗Bc1-2和诱导凋亡的试剂的鉴定提供了用于癌症的治疗性治疗的药物组合物。
可将本发明的试剂与一种或多种药学上可接受的载体和/或稀释剂混合，从而形成药物组合物。药学上可接受的载体可包含生理上可接受的化合物，所述化合物用于例如稳定或增加或减少本发明的药物组合物的吸收或清除率。生理可接受的化合物可包括例如糖类例如葡萄糖、蔗糖或葡聚糖、抗氧化剂例如抗坏血酸或谷光苷肽、螯合剂、低分子量蛋白、减少肽或多肽的清除或水解的组合物、或赋形剂或其他稳定剂和/或缓冲剂。去垢剂也可用于稳定或增加或减少药物组合物包括脂质体载体的吸收。用于肽和多肽的药学上可接受的载体和制剂对于本领域技术人员来说是已知的并且详细描述于科学和专利文献中，参见例如，Remington′s Pharmaceutical Sciences，第18版，Mack Publishing Company，Easton，PA，1990(″Remington′s″)。
其他生理可接受化合物包括湿润剂、乳化剂、分散剂或特别地用于预防微生物的生长或作用的防腐剂。不同的防腐剂是熟知的，包括例如酚和抗坏血酸。本领域技术人员将认识到药物可接受的载体包括生理可接受的化合物的选择依赖于例如本发明的调节剂的施用途径和其特定的物化特性。
可通过本领域技术人员已知的任何方便的方法以药物组合物的形式施用试剂。施用途径包括但不限于经呼吸、气管内、经鼻咽、静脉内、腹膜内、皮下、颅内、皮内、肌内、眼内、鞘内、大脑内、鼻内、输注、口服、经直肠、贴附和植入施用途径。
对于口服施用，可将化合物配制成固体或液体制剂例如胶囊、丸剂、片剂、锭剂、粉剂、悬浮剂或乳剂。在制备以口服剂型存在的组合物中，在口服液体制剂(例如悬浮剂、酏剂或溶液)的情况下，可使用任何常用的药物介质，例如，水、乙二醇、油、乙醇、调味剂、防腐剂、着色剂、悬浮剂等；或在口服固体制剂(例如粉剂、胶囊剂和片剂)的情况下可使用载体例如淀粉、糖、稀释剂、颗粒化试剂(granulating agent)、润滑剂、粘合剂、崩解剂等。因为其施用的容易性，片剂和胶囊剂代表了最有利的口服剂量单位形式，在该情况下，很显然使用固体药物载体。如果想要，可使用标准技术对片剂进行糖包被或肠溶衣包被。可将活性剂封装入胶囊以使其稳定地通过胃肠道，同时允许通过血脑屏障，参见，例如，国际专利公开号WO96/11698。
本发明的试剂，当口服施用时，可获得保护免受降解。可通过将核酸、肽或多肽与组合物复合以使其对酸和酶水解产生抗性或通过将核酸、肽或多肽封装入合适的抗性载体例如脂质体来实现该目的。保护化合物免受降解的方法在本领域内是熟知的，参见，例如Fix，PharmRes 13：1760-1764，1996；Samanen等人，J Pharm Pharmacol48：119-135，1996；美国专利5,391,377，描述了用于口服递送治疗剂的脂质体组合物(在下文中更详细地描述脂质体递送)。
适合用于注射用途的药物形式包括无菌水溶液(当可溶于水时)或用于无菌注射液或分散体的临时制备的分散体和无菌粉剂或可以乳膏的形式或适合用于局部施用的其他形式存在。其必须在生产和贮上的条件下是稳定的并且必须保持免受微生物例如细菌和真菌的污染作用。载体可以是溶剂或分散介质，包含例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)、其合适的混合物和植物油。可以例如通过使用包衣例如卵磷脂，在分散体的情况下通过保持颗粒大小和通过使用表面活性剂保持恰当的流动性。可使用各种抗菌剂和抗真菌剂例如对羟苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等预防微生物的作用。优选包含等渗剂例如糖或氯化钠。可通过在组合物中使用延迟吸收的试剂例如单硬脂酸铝和明胶产生可注射组合物的延迟吸收。
通过将试剂以需要的量按要求与上面列举的各种其他组分一起整合入合适的溶剂中，然后进行过滤灭菌来制备无菌注射液。一般地，通过将各种无菌活性组分整合入包含基本分散介质和所需的来自上面列举的组分中的其他组分的无菌媒介物中。在用于制备无菌注射液的无菌粉剂的情况下，制备的优选方法是真空干燥和冷冻干燥技术，所述技术用于产生活性组分和来自其之前无菌过滤的溶液的任何额外想要的组分的粉剂。
对于胃肠外给药，可将试剂溶解在药物载体中，然后以溶液或悬浮液施用。合适的载体的实例是水、盐水、葡萄糖溶液、果糖溶液、乙醇或动物、植物或合成来源的油。载体也可包含其他组分，例如防腐剂、悬浮剂、增溶剂、缓冲剂等。当向鞘内施用试剂时，也可将其溶解在脑脊液中。
对于透粘膜给药或透皮给药，可使用适合于待穿透的屏障的穿透剂递送试剂。此类用于透粘膜给药的穿透剂在本领域内通常是已知的，例如胆汁酸盐和夫西地酸衍生物。此外，去垢剂可用于促进渗透。透粘膜给药可通过鼻腔喷雾或使用栓剂进行，例如Sayani和Chien，Crit Rev Ther Drug Carrier Syst 13：85-184，1996。对于局部透皮给药，可将试剂配制成软膏、乳膏、药膏、粉剂和凝胶。透皮给药系统也可包括贴剂。
对于吸入，可使用本领域内已知的任何系统包括无水烟雾剂、液体递送系统、空气喷射雾化器、喷射系统等递送本发明的试剂，参见，例如，Patton，Nat Biotech 16：141-143，1998；使用例如DuraPharmaceuticals(San Diego，CA)、Aradigm(Hayward，CA)、Aerogen(Santa Clara，CA)、Inhale Therapeutic Systems(San Carlos，CA)等的多肽大分子的产品和吸入递送系统。例如，可以烟雾剂或水剂(mist)的形式施用药物制剂。对于烟雾剂施用，可以以精细微粒的形式与表面活性剂和喷射剂一起提供制剂。在另一个方面，用于递送制剂至呼吸组织的装置是其中使制剂蒸发的吸入器。其他液体递送系统包括，例如，空气喷射雾化器。
本发明的试剂也可以持续递送或持续释放的机制(所述机制可在内部递送制剂)施用。例如，可将能够持续递送肽的生物可降解的微球或胶囊或其他生物可降解的聚合物结构包含在本发明的制剂中(例如，Putney和Burke，Nat Biotech 16：153-157，1998)。
在制备本发明的药物中，可使用和操作多种制剂修饰来改变药物动力学和生物分布。用于改变药物动力学和生物分布的许多方法对于本领域技术人员来说是已知的。此类方法的实例包括在由物质例如蛋白质、脂质(例如，脂质体，参见下面)、糖或合成的聚合物(上面描述的)组成的载体中保护本发明的组合物。关于药物动物学的一般描述，参见例如，Remington′s。
在一个方面，将包含本发明的试剂的药物制剂包装入脂质单层或双层例如脂质体中，参见，例如，美国专利6,110,490、6,096,716、5,283,185和5,279,833。本发明也提供了其中已将本发明的水溶性调节剂附着至单层或双层的表面的制剂。例如，可将肽附着至含有酰肼-PEG-(二硬酯酸磷酸脂酰)乙醇胺的脂质体(例如Zallpsky等人，Bioconjug Chem 6：705-708，1995)。可使用脂质体或任何形式的脂质膜例如平面脂质膜或完整细胞例如红细胞的细胞膜。可使用任何方法包括通过静脉内、透皮(Vutla等人，J Pharm Sci 85：5-8，1996)、透粘膜或口服途径施用脂质体制剂。本发明也提供了其中本发明的核酸、肽和/或多肽被整合入微团和/或脂质体的药物制剂(Suntres和Shek，J Pharm Pharmacol 46：23-28，1994；Woodle等人，Pharm Res9：260-265，1992)。可按照标准方法制备脂质体和脂质体制剂，所述制剂在本领域内也是熟知的，参见例如，Remington′s；Akimaru等人，Cytokines Mol Ther 1：197-210，1995；Alving等人，Immunol Rev145：5-31，1995；Szoka和Papahadjopoulos，Ann Rev Biophys Bioeng9：467-508，1980，美国专利4,235,871、4,501,728和4,837,028。
依赖于施用的方法，可以多种单位剂型施用本发明的药物组合物。用于常规的药物组合物的剂量对于本领域技术人员来说是熟知的。这样的剂量在自然状况下通常是建议性的，依赖于特定的治疗背景、患者耐受力等对其进行调整。足以实现该用途的试剂的量定义为“有效量”。用于该用途的剂量方案和有效量即“给药方案”将依赖于多种因素，包括疾病或病症的阶段、疾病或病症的严重度、患者健康的一般状况、患者生理状况、年龄、药物制剂和活性剂的浓度等。在计算用于患者的剂量方案中，也考虑施用的模式。剂量方案也必须考虑药物动力学，即药物组合物的吸收率、生物利用度、代谢、清除等。参见，例如，Remington′s；Egleton和Davis，Peptides 18：1431-1439，1997；Langer，Science 249：1527-1533，1990。
根据这些方法，本发明定义的试剂和/或药物组合物可与一种或多种其他试剂共施用。此处的“共施用”是指在相同的制剂中同时施用或通过相同的或不同的途径在两种不同的制剂中施用或通过相同的或不同的途径相继施用。此处的“相继”施用是指两种类型的试剂和/或药物组合物的施用之间的从秒至分钟、小时或天的时间差异。可以任何顺序进行试剂和/或药物组合物的共施用。
可选择地，通过使用靶向性系统例如抗体或细胞特异性配体或特异性核酸分子，可将靶向疗法用于更特异地将活性剂递送至某些类型的细胞。因为许多原因例如如果试剂具有不可接受的毒性或如果其不能够进入靶细胞，那么靶向可以是想要的。
不用直接施用试剂，可在靶细胞中例如在病毒载体例如上述载体或在基于细胞的递送系统例如美国专利5,550,050和国际专利公开号WO 92/19195、WO 94/25503、WO 95/01203、WO 95/05452、WO 96/02286、WO 96/02646、WO 96/40871、WO 96/40959和WO 97/12635中描述的系统中产生其。可将载体靶向靶细胞。设计基于细胞的递送系统以在想要的靶位点植入患者体内，所述递送系统包含靶试剂的编码序列。可选择地，可以前体形式施用所述试剂，所述前体形式可被待治疗的细胞中产生的活性剂或被靶向所述细胞的激活剂转化成活性形式。参见，例如，欧洲专利申请号0425731A和国际专利公开号WO 90/07936。
在另一个方面，本发明提供了包含本发明的组合物例如试剂的试剂盒。所述试剂盒也可包括教导此处所描述的本发明的方法和用途的说明材料。
本领域技术人员将认识到此处描述的发明易于进行除了明确描述的变化外的改变和修饰。要理解本发明包括所有此类变化和修饰。本发明也包括本说明书中单个地或一起提及的或指出的所有步骤、特征、组合物和化合物以及任何两个或多个所述步骤或特征的任何和所有组合。
通过下列非限定性实施例更详细地描述本发明。
实施例1
BH3结构域突变体
重组蛋白和合成的多肽
使用标准技术在大肠杆菌(E.coli)中表达所有重组蛋白。以GST融合蛋白的形式表达在其C末端具有25个氨基酸截断的重组人Bc1-xL(Bc1-xLΔC25)和在其N末端具有151个氨基酸截断以及在其C末端具有23个氨基酸截断的小鼠Mc1-1(Mc1-1ΔN151ΔC23)，然后如之前所描述的(Day等人Cell Death and Differentiation6：1125-1132，1999；Hinds等人.2003同上)使用PreScission蛋白酶将其从谷光苷肽-琼脂糖柱上切离，然后对其进行纯化。使用模拟位(Mimotope)(Victoria，Australia)分析合成的肽，通过反相HPLC进行纯化，纯度大于90％。除非另外指出，所有肽对应于人BH3结构域序列。使用电喷射质谱测定法确证其本体。称取肽的重量，以1-2mM的贮液形式将其溶解在水中，在检测之前通过测量其在280nm处的吸光率确定其浓度。
噬菌体展示构建体
使用互补寡核苷酸通过连接体序列(GGGT)将包含Bim(DMRPEIWIAQELRRIGDEFNAYYARR)(SEQ ID NO：1)或Bad(NLWAAQRYGRELRRMSDEFVDSFKKG)(SEQ ID NO：4)或mNoxaA(SEQ ID 9)或Bid(SEQ ID 7或Bak(SEQ ID 11)的BH3结构域的26个氨基酸长的肽融合至M13噬菌体基因3(残基249至406)序列的氨基末端，所述寡核苷酸也分别在5′和3′末端产生用于克隆入Fairlie等人Protein Expression and Purification 26：171-178，2002之前描述的噬菌粒载体的NcoI和KpnI限制性内切酶位点。此后上述肽序列中的残基参照其在26聚体中的序列位置。为了产生序列的FLAG标记形式，使用Kunkel诱变方法(Kunkel等人.Methods Enzymol204：125-139，1991)将编码FLAG表位的寡核苷酸在已融合至上述的基因3的肽序列的N末端环入(loop-in)所需的序列。对于BimBH3或其他BH3序列的丙氨酸扫描构建体和其他点突变，在对FLAG-BimBH3或FLAG-BadBH3模板进行的Kunkel诱变反应中使用具有想要的密码子错配的寡核苷酸。通过化学方法将诱变反应物转化入SS320大肠杆菌菌株，然后在M13 K07辅助噬菌体存在的情况下培养过夜后，使用之前描述的盐/聚乙二醇沉淀法(Sidhu等人Methods Enzymol328：333-363，2000)从细胞上清液分离噬菌体颗粒。
实施例2
BH3/Bc1-2结合相互作用
噬菌体ELISA
如之前所述(Fairlie等人.J Biol Chem 279：2125-2134，2004)进行所有ELISA。在各情况下，在4℃下将促存活Bc1-2样家族蛋白(5μg/mL)或M2抗FLAG抗体(0.5μg/mL)包被在Maxisorp 96孔板上过夜。在用6％(w/v)的PBS中的脱脂奶粉封闭后，以合适的稀释度在PBS/0.1％(v/v)Tween-20/1％(w/v)脱脂奶粉中加入噬菌体，在振荡条件下在室温下温育1.5小时。在用PBS/Tween洗涤后，使用过氧化物酶缀合的抗M13抗体检测结合的噬菌体。对于竞争测定法，使用不同浓度的Bc1-2样蛋白溶液，通过在室温下共温育1.5小时来取代固定的亚饱和稀释度(sub-saturating dilution)的噬菌体展示BimBH3或其他BH3肽对固定的Bc1-2样蛋白的结合。为了确定相对于天然序列，结合亲和力是减少还是增加，用野生型BimBH3或BadBH3的IC50值除以促存活蛋白的丙氨酸扫描突变体的IC50值。
表面等离子体共振(Surface plasmon resonance)
使用表面等离子体共振在Biacore 3000生物传感器(以HBS(10mMHEPES pH 7.2，150mM NaCl，3.4mM EDTA，0.005％Tween 20)作为电泳缓冲液)上确定促存活Bc1-2蛋白的野生型和突变BimBH3肽的相对亲和力。使用胺偶联化学物质(Wilson-Annan等人，同上)固定26聚体BimBH3和对照非结合BimBH3突变体。通过将固定的亚饱和浓度(大约10nM)的促存活Bc1-2与不同量的竞争BH3蛋白在冰上在HBS中温育超过2小时，比较其与固定的BimBH3肽竞争对Bc1-2样蛋白的结合的能力来估量BH3肽对促存活Bc1-2样蛋白的相对亲和力(Wilson-Annan等人.Journal of Cell Biology 162：877-888，2003；Chen等人.Mol Cell 17：393-403，2005)。然后在包含槽(在其上固定有野生型BimBH3)和对照槽(固定有非结合BimBH3突变体)的CM5传感器芯片上注射所述混合物。减去基线反应(对照槽)，从而获得绝对结合反应。然后如之前所述(Chen等人.2005同上)分析数据。
逆转录病毒测定法
使用LipofectamineTM(Invitrogen)将亲本pMIG质粒DNA或包含编码Bim或Bim突变体的插入片段的pMIG瞬时转染入PhoenixEcotropic包装细胞(http://www.stanford.edu/group/nolan/retroviral_systems/phx.html)(Kinesella和Nolan，1996)。通过旋转接种(在4μg/mL聚凝胺(Sigma)存在的情况下在32℃下以2,500rpm离心45分钟)使用经过滤的包含病毒的上清液感染感染3T9小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)。常规地获得超过90％的感染效率。从Stanley Korsmeyer教授获得SV40大T抗原固定的野生型和Bax-/-Bak-/-MEFS并将其保持在完全DME中。使用被感染的细胞(GFP+ve；FL-1)的流式细胞计数分析确定细胞的存活率(对于短期存活测定)，通过使用
实施例3
Bim和Bad的BH3结构域在噬菌体上的表达和其对促存活Bc1-2家族蛋白的结合
在进行BimBH3和其他BH3结构域的任何结构-功能分析之前，首先必需确定序列是否可在噬菌体上展示，和确定其是否以这样的方式起作用，所述方式与观察到的例如BimBH3或BadBH3合成肽在其他生物化学测定中对促存活Bc1-2蛋白的结合方式相似。在初步测定中，就其对固定的Bc1-xL和Mc1-1的直接结合的能力检测BimBH3和其他BH3噬菌体。观察到两种BH3结构域对Bc1-XL的相对强的可滴定的结合，同时只有Bim BH3结合Mc1-1。这与之前显示Bim可以以高亲和力结合所有促存活蛋白同时Bad对于Bc1-xL、Bc1-2和Bc1-w是特异性的数据一致(Chen等人，2005同上)。使用竞争测定法进一步估量相互作用的特异性，在所述竞争测定法中，在溶液中用对应的重组蛋白竞争噬菌体对固定的蛋白的结合。获得的IC50值显示于表3中，其与在表面等离子共振BIAcore仪(Chen等人2005同上)上使用表面等离子共振和使用等温量热术(isothermal calorimetry)(数据未公开)测量的BimBH3和BadBH3合成肽的IC50值非常相似。
表3
噬菌体展示的BH3-only蛋白的BH3结构域对促存活Bc1-2样蛋白的结合亲和力
丙氨酸扫描诱变
为了研究BimBH3或BadBH3结构域序列中的特定残基对结合Bc1-2样促存活蛋白的重要性，产生成组的突变构建体，在所述构建体中将各残基单个地突变成丙氨酸，或在其中丙氨酸或甘氨酸是野生型残基的位置上，将其突变成谷氨酸。将各突变体作为融合至M13噬菌体上的g3的N端的融合物单价地在M13噬菌体上表达，然后就其对固定的促存活蛋白以及对抗FLAG抗体的结合的能力对其进行检测。产生在氨基末端都具有FLAG表位的所有构建体，因为对抗FLAG抗体的结合提供了可用于估量各肽之间表达水平的差异的方法。为了确定用于竞争ELISA中的各突变噬菌体的亚饱和稀释度，进行初步滴定测定。为了确定突变肽对促存活蛋白的结合亲和力，则在竞争ELISA中使用在滴定测定法中确定的亚饱和稀释度的噬菌体检测噬菌体突变体。噬菌体展示的BH3突变体对Bc1-XL、Bc1-w、Bc1-2和/或Mc1-1中的一种或多种的结合的亲和力显示于表4a至4e中。
表4a
噬菌体展示的Bim BH3突变体对Bc1-XL、Bc1-w、Bc1-2和Mc1-1的结合的亲和力
NB＝无结合
倍数/wt＝每野生型倍数
表4b
噬菌体展示的Bad BH3突变体对Bc1-XL、Bc1-w和Bc1-2的结合的亲和力
表4c
噬菌体展示的Bid BH3突变体对Bc1-XL、Bc1-w和Mc1-1的结合的亲和力
表4d
噬菌体展示的mNoxa BH3突变体对Mc1-1的结合的亲和力
表4e
噬菌体展示的Bak BH3突变体对Bc1-XL和Mc1-1的结合的亲和力
BimBH3对Bc1-xL、Bc1-w和Bc1-2：
参考表4a.三种突变体A9E、G16E和D17A，即使对抗FLAG抗体的结合可与所有其他突变体相当，但在最初的滴定中显示不结合Bc1-xL，这表明观察到的效应不是异常表达的结果。对于几乎5种受试突变体，在BimBH3结合上IC50值的变化只随小于4的因数而改变。由于A9E、G16E和D17A的结合很弱，不能获得这些突变体的实际定量亲和数据，然而，L12A和F19A的结合大约分别比野生型BimBH3弱50和20倍(IC50＝130nM和60nM)。根据可获得的不同BH3-only蛋白和促存活Bc1-2样蛋白之间的复合物的结构了解到BH3结构域的4个保守的疏水残基位于所有促存活蛋白的结合表面上发现的疏水口袋中。因此预期这些残基可明显促成两个家族的蛋白之间的结合能(如对于上述L12A和F19A突变体所看到的)的产生。从而基于竞争测定的结果，有趣地注意到将其他两个疏水残基突变(除了L12和F19)，I8和115突变成丙氨酸不表现具有对其对Bc1-xL的结合的任何显著影响。
BimBH3对Mc1-1
参考表4a。大多数针对Mc1-1的受试BimBH3丙氨酸突变体与它们对Bc1-xL的结合能力相比，未表现具有对结合的显著影响。只有两个突变，G16E(38倍)和D17A(15倍)对与Mc1-1的结合具有显著的影响，尽管这些影响不如观察到的对相同突变体与Bc1-xL的结合的影响大。此外，与它们和Bc1-xL的相互作用相反，L12A突变和F19A突变都不具有对结合的任何可检测的影响。再一次地，通过检测对FLAG抗体的结合来验证不同突变体在噬菌体表面的表达。
表4a中的结果总地表明Bim双突变体L12A/F19A，与任何天然发生的BH3 only蛋白不同，应当对于Mc1-1是有选择性的。实施例5中显示了该关系。
BadBH3对Bc1-x Bc1-w和Bc1-2：
参考4b。类似地，提供的数据表明具有突变F19A的Bad BH3结构域对于Bc1-xL是有选择性的，具有D17A或F23A的Bad BH3结构域对于Bc1-xL和Bc1-w是有选择性。
BidBFD对Bc1-xL、Bc1-w和Mc1-1：
参考表4c。类似地，提供的数据表明具有突变I8A或A13E的BidBH3结构域对于Bc1-w是有选择性的。
Bak BH3对Bc1-xL和Mc1-1
参考表4e。具有突变V8A或I19A的Bak BH3对于Mc1-1是有选择性的。类似地双突变R10A/Q11A对于Mc1-1是有选择性的。
如表4a至4e中所示的数据所反映的，很清楚对保持(或形成)复合物具有重要作用的残基在不同的BH3-only蛋白和促存活蛋白配体之间是不同的。例如BimBH3和Bc1-xL之间的相互作用涉及许多残基包括L12、F19和特别是D17，同时BadBH3/Bc1-xL相互作用更依赖于L12的接触。
实施例4
L12、D17和F19的详细结构-功能分析
在通过研究例如上述丙氨酸扫描诱变鉴定了BH3结构域-促存活相互作用的至关重要的残基后，则可进行这些残基的系统性替代以确定在这些位点的各位点上可被耐受的氨基酸残基的物理化学性质。例如，在BimBH3中的对于对Bc1-xL的结合非常重要的L12的情况下，可估量用其他更大的疏水残基例如异亮氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸或更小的氨基酸例如缬氨酸取代其的影响。然后将这些结合亲和力与前面描述的野生型序列比较。可在小分子拟肽类药物设计中利用来源于所述实验的数据。在上述实施例中，如果在用酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸取代后观察到非常弱的结合，那么经设计模拟亮氨酸相互作用的小分子可避免使用上述氨基酸侧链中发现的环状基团。可选择地，如果耐受上述残基而在亲和力上无显著减少，那么可包含相似大小的环状化合物。
在BimBH3对Bc1-xL的结合的情况下，当侧链的大小从苯丙氨酸增加至色氨酸，观察到5至22倍的结合亲和力的累进减少(表5)。类似地，侧链长度从缬氨酸至丙氨酸的减少导致亲和力减少大约50至80倍。表5具有在Bim BH3位点12、17和19上的置换，所述置换不引起低于100nM的对于4种促存活分子的亲和力的减少。
表5
在L12、D17和F19处的Bim BH3突变体
这些结果连同结构分析一起提供了用于设计模拟Bim在对Bc1-xL、Bc1-2、Bc1-w和Mc1-1的结合上的作用的小分子化合物的合适构架。表5中的数据教导如何产生促存活特定BH3序列的方法。因此，包含L12A、L12Q、L12H、D17R、F19D、F19K中的任一个突变的Bim BH3对于Mc1-1是特异性的，对于上述突变的组合的选择也具有相同的效果。
实施例5
BIAcore研究
为进一步验证噬菌体展示筛选结果，在竞争测定法中使用在BIAcore装置上进行的表面等离子体共振分析和检测许多对应于目的序列的肽。在这些实验中，确定所述肽对促存活家族的所有成员(即Bc1-2、Bc1-xL、Bc1-w、Mc1-1和A1)的亲和力，这些测定的结果显示于表6中。就其结合不同促存活Bc1-2样蛋白的能力检测4种其中4个保守性疏水残基(I8、L12、I15和F19)中的每一个被单个地突变成丙氨酸的合成肽。I8A和I15A突变体保持野生型对促存活蛋白的结合亲和力，这与从噬菌体ELISA获得的结合相当一致。L12A突变体对Bc1-2、Bc1-w和Bc1-xL的结合亲和力减少了30至70倍，同时对其余两种促存活蛋白Mc1-1和A1的结合只受到轻微影响，观察到的结合亲和力分别减少2和7倍。这些结果再次与之前描述的噬菌体ELISA结果相当一致。F19A突变肽对不同促存活Bc1-2样蛋白的结合似乎只受到轻微影响，其对Bc1-w的结合受到的影响最大，观察到结合亲和力减少8倍。对其余促存活蛋白的结合亲和力的减少低于3倍。
表6
在Biacore仪器上通过表面等离子共振测量的BimBH3突变合成肽对促存活Bc1-2样蛋白的结合亲和力相对野生型BimBH3肽对Bc1-2样蛋白的结合亲和力的差异。
使用来自噬菌体分析和Biacore的数据，设计可对于特定促存活蛋白是特异性的序列。因为与其他促存活蛋白相比，Mc1-1似乎耐受大多数丙氨酸突变，因此其提供了适合检测该想法的靶。组合Bim上的L12和F19的丙氨酸置换，因为这些置换似乎都不影响对Mc1-1的结合，但对Bc1-xL、Bc1-2和Bc1-w结合具有中等影响。如所预期的，包含这些突变的BimBH3结构域合成肽对与Bc1-xL、Bc1-2和Bc1-w的结合具有显著的破坏效应(在亲和力上大于500倍的减少)但基本上保持对Mc1-1的野生型亲和力。
实施例6
细胞测定
迄今已检测了26个氨基酸长度的BimBH3肽内的不同突变(当在噬菌体颗粒上展示时或作为合成肽时)对与不同促存活蛋白的结合的影响。因此接下来重要的是验证当整合入全长Bim蛋白时观察到的效应是可重现的，以及使数据与不同突变的生物学结果发生相关性。因此将各个至关重要的突变体整合入通过逆转录病毒导入哺乳动物细胞的BimS表达载体。然后在感染后30小时测量细胞的存活率。用消除对促存活蛋白的结合的Bim突变体感染的细胞预期可保持存活。然而，不影响结合的突变体应当保持致死活性。表7中显示了来自致死测定的代表性数据。如所预期的，野生型Bim能够有效地杀死小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)，通过碘化丙啶(PI)排除法测量的细胞存活率为19％。类似地，当将F19A突变整合入全长Bim蛋白并在MEF中表达时，该突变蛋白几乎与天然Bim一样有效地杀死细胞，这与该突变体以接近野生型亲和力结合所有促存活蛋白的能力一致。G16E突变体在游离的合成肽和噬菌体上展示的背景中已丧失大量的对所有促存活蛋白的亲和力，这反映了该突变体不能杀死MEF(93％的细胞存活率)。在D17A突变体的情况下，在噬菌体结合实验中，我们不能检测到当在噬菌体颗粒的表面表达时该突变体对Bc1-xL的任何结合。与该结果一致，野生型MEF不表现被BimS(D17A)杀死(89％的细胞存活率)，这表明，在一些情况下，使用噬菌体展示的肽获得的结合数据与游离的合成肽相比可以更准确地反映它们的结合能力。由Willis等人Genes andDevelopment 19：1294-1305，2005所做的以前的工作已证明Mc1-1和Bc1-xL的失活都足以产生有效的Bak介导的凋亡(Willis等人，2005同上)。A9E和L12A突变体对Bc1-w、Bc1-2和Bc1-xL的结合亲和力都具有适度的减少，同时仍保持接近对于Mc1-1和A1的野生型亲和力。这与当两种突变体在野生型MEF中表达时观察到的中等杀伤一致。当整合入全长Bim蛋白时也检测I8A和I15A突变体的杀死能力。与都表明任一突变都不影响促存活蛋白结合的噬菌体和BIAcore的结果一致，这些突变体能够杀死野生型MEF，达到与天然Bim蛋白相同的程度。作为对照实验，检测不同突变体杀死Bax/Bak双缺陷型MEF的能力。如所预期的，没有突变体杀死这些细胞，因为Bax和Bak是促进(commitment)细胞死亡所需要的。
表7
当在野生型和Bax/Bak双缺陷型小鼠胚胎成纤维细胞(MEFs)中表达为全长蛋白(BimS)时，永生化的MEF被Bim突变体杀死
本领域技术人员认识到此处描述的发明除了明确描述的实施方案外易于改变和修改。要理解本发明包括所有此类改变和修饰。本发明也包括本说明书中提及的或指出的所有步骤、特征、组合物和化合物，包括单个地或集体地步骤、特征、组合物和化合物，以及任何两个或更多个所述步骤或特征的任何和所有组合。
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Asp Glu Phe Val Asp Ser Phe Lys Lys Gly
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<212>PRT
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Asp Lys Leu Asn Phe Arg Gln Lys Leu Leu
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Arg Ala Glu Leu Pro Pro Glu Phe Ala Ala Gln Leu Arg Lys Ile Gly
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Asp Lys Val Tyr Cys Thr Trp Ser Ala Pro
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Pro Ala Asp Leu Lys Asp Glu Cys Ala Gln Leu Arg Arg Ile Gly Asp
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Pro Ser Ser Thr Met Gly Gln Val Gly Arg Gln Leu Ala Ile Ile Gly
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Asp Asp Ile Asn Arg Arg Tyr Asp Ser Glu
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机译： 治疗性促凋亡BH3样分子，以及产生和/或选择这些分子的方法
机译： 治疗性促凋亡BH3样分子及其产生和/或选择方法
机译： 治疗性促凋亡BH3样分子及其产生和/或选择方法
