用金纳米粒子检测单链DNA碱基突变的方法

摘要

用金纳米粒子检测单链DNA碱基突变的方法，涉及一种基因突变的检测。提供一种用金纳米粒子检测单链DNA碱基突变的方法。制备胶体金，与单链DNA作用形成胶体金与单链DNA复合体系，加入盐酸，复合体系颜色由红变为紫或蓝。利用野生型单链DNA和突变型单链DNA的序列差异，通过复合体系最终颜色的变化或紫外可见吸收光谱最大吸收峰红移位置的不同判定单链DNA是否发生突变。单链DNA和金纳米粒子均无需作任何修饰，不需特殊仪器，可对单碱基突变检测，最低检测限为10fmol，能在30min内提供检测结果，具有简便、快速、低成本、高灵敏度、高特异性等特点，实用性强，临床上具有较大的应用潜力。

说明书

技术领域

本发明涉及一种基因突变的检测，尤其是涉及一种利用金纳米粒子检测单链DNA碱基突变的方法。

背景技术

基因突变是指基因组DNA序列中一个或多个位点的碱基发生突变或者缺失、插入等现象。基因突变检测在生物医学研究中有着非常重要的作用，可以作为遗传性疾病、肿瘤等的早期临床检测指标，对疾病的及时发现和治疗具有重要的意义([1]Ellegren H.Heterogeneousmutation processes in human microsatellite DNA sequences.Nature Genetics，2000，24(4)：400-402)。

传统的基因突变检测方法一般依赖于平板凝胶电泳来分析DNA构象或解链特性，再根据其电泳时迁移率的不同来判断是否存在突变。这些方法有的特异性差、灵敏度不高，有的操作复杂、费时费力，有的易产生假阳性结果和高成本检测，因此不能满足临床上大量样品分析的需要。DNA测序法是最直接最准确的方法，但需要特殊的仪器，且耗时费力，成本昂贵，不便在一般单位使用。理想的基因突变检测技术应当具有简便、快捷、高特异性、高灵敏度、高自动化和低成本性等特点。纳米材料具有独特的光学性质、电学性质、化学性质以及良好的生物相容性，是检测生物大分子的首选工具([2]Daniel MC，Astruc D.Goldnanoparticles：assembly，supramolecular chemistry，quantum-size-related properties，andapplications toward biology，catalysis，and nanotechnology[J].Chem Rev，2004，35(16)：293～346)。

发明内容

本发明的目的旨在提供一种用金纳米粒子检测单链DNA碱基突变的方法。

本发明的具体步骤如下：

1)制备胶体金：将氯金酸溶液和柠檬酸三钠溶液的混合液加热至沸腾，反应完成后冷却至室温，离心，浓缩，加入水重新分散，得胶体金，所述的混合液中，氯金酸的浓度为0.01％，柠檬酸三钠的浓度为0.02％～0.05％；

2)取野生型单链DNA 10～50fmol加入到40～50μL胶体金中，混匀后得胶体金与野生型单链DNA复合体系；

3)取突变型单链DNA 10～50fmol加入到40～50μL胶体金中，混匀后得胶体金与突变型单链DNA复合体系；

4)在步骤2所得的胶体金与野生型单链DNA复合体系中加入2～4μL 1mol/L的盐酸，混匀后发生团聚，作紫外可见吸收光谱检测，胶体金与野生型单链DNA复合体系的紫外可见吸收光谱最大吸收峰发生红移，发生红移后的胶体金与野生型单链DNA复合体系的紫外可见吸收光谱最大吸收峰称之为吸收峰1；

5)在步骤3所得的胶体金与突变型单链DNA复合体系中加入2～4μL 1mol/L的盐酸，混匀后发生团聚，作紫外可见吸收光谱检测，胶体金与突变型单链DNA复合体系的紫外可见吸收光谱最大吸收峰发生红移，发生红移后的胶体金与突变型单链DNA复合体系的紫外可见吸收光谱最大吸收峰称之为吸收峰2；

6)当吸收峰2与吸收峰1有明显差异时，据此可以判断有突变发生。

所述的胶体金的粒径可为10～30nm，最好为15nm。

在步骤2所得的胶体金与野生型单链DNA复合体系中加入2～4μL 1mol/L的盐酸，混匀后可观察颜色的变化，胶体金与野生型单链DNA复合体系由红色变为其它颜色(称之为颜色1)，例如蓝色；在步骤3所得的胶体金与突变型单链DNA复合体系中加入2～4μL 1mol/L的盐酸，混匀后可观察颜色的变化，胶体金与突变型单链DNA复合体系由红色变为其它颜色(称之为颜色2)，例如紫色。当颜色2与颜色1有明显差异时，据此可以判断有突变发生。

本发明的技术方案所涉及的原理是：金纳米粒子在溶液中稳定分散时形成胶体金，呈酒红色，当胶体金与单链DNA相互作用后加入盐酸，金纳米粒子发生不同程度的团聚，溶液颜色由红色变为蓝色或紫色，紫外可见吸收光谱最大吸收峰发生红移。野生型单链DNA和突变型单链DNA由于序列上存在差异，因此所导致的金纳米粒子团聚程度不同，紫外可见吸收光谱最大吸收峰红移程度有明显差异，因此，最终可以通过紫外可见吸收光谱最大吸收峰红移程度是否相同来进行判定。

本发明的突出优点在于不仅胶体金易于大量制备，而且经实验证明能在4℃存放1年不发生聚集，同时不需对金纳米粒子和DNA进行修饰，不需使用特殊的仪器设备，大大简化了检测步骤，降低了检测成本，操作非常简便、快速。本发明可以对单碱基突变进行检测，最低检测限为10fmol。

附图说明

图1为本发明实施例所制备的胶体金TEM电镜图。在图1中，标尺为20nm。

图2为金纳米粒子先与单链DNA作用，再与盐酸作用后发生团聚的TEM电镜图。在图2中，标尺为0.2μm。

图3为p53基因密码子273处野生型和突变型的紫外可见吸收光谱检测结果。

图4为p53基因密码子248处野生型和突变型的紫外可见吸收光谱检测结果。

在图3和4中，横坐标为波长Wavelength(nm)，纵坐标为吸光度Absorbance；曲线a为胶体金，b为胶体金与野生型单链DNA复合体系，c为胶体金与突变型单链DNA复合体系。

具体实施方式

下面通过实施例结合附图对本发明作进一步说明。

实施例1

将该检测方法应用于检测p53基因密码子273处的突变热点，碱基G突变为碱基T(参见文献：Rangel-Lopez A，Maldonado-Rodriguez R，Salcedo-Vargas M，et al.Low density DNAmicroarray for detection of most frequent TP53 missense point mutations.BMC Biotechnol，2005，15(8)：1-13)，具体操作步骤如下：

1)将94mL超纯水、1mL 1％的氯金酸溶液和5mL 1％的柠檬酸三钠溶液，室温下混匀，立即放入微波炉中，高火加热使其沸腾，再调至中火，继续加热保持沸腾状态8min后，自然冷却至室温，然后离心，浓缩，加水重新分散，制备出粒径为15nm的胶体金，颜色深红透亮，所制备的胶体金TEM电镜图参见图1，由图1可见其粒径均一。

2)取野生型单链DNA 50fmol加入到40μL胶体金中，混匀后室温静止30min，得胶体金与野生型单链DNA复合体系。

3)取突变型单链DNA 50fmol加入到40μL胶体金中，混匀后室温静止30min，得胶体金与突变型单链DNA复合体系。

4)在步骤2所得的胶体金与野生型单链DNA复合体系中加入2μL 1mol/L的盐酸，混匀后发生团聚(参见图2所给出的金纳米粒子先与单链DNA作用，再与盐酸作用后发生团聚的TEM电镜图)，作紫外可见吸收光谱检测，胶体金与野生型单链DNA复合体系的紫外可见吸收光谱最大吸收峰发生红移，发生红移后的胶体金与野生型单链DNA复合体系的紫外可见吸收光谱最大吸收峰称之为吸收峰1。

5)在步骤3所得的胶体金与突变型单链DNA复合体系中加入2μL 1mol/L的盐酸，混匀后发生团聚，作紫外可见吸收光谱检测，胶体金与突变型单链DNA复合体系的紫外可见吸收光谱最大吸收峰发生红移，发生红移后的胶体金与突变型单链DNA复合体系的紫外可见吸收光谱最大吸收峰称之为吸收峰2。

结果表明，胶体金与野生型单链DNA复合体系颜色最终为蓝色，吸收峰1位于640nm处；胶体金与突变型单链DNA复合体系颜色最终为紫色，吸收峰2位于607nm。吸收峰2与吸收峰1有明显差异(参见图3所给出的p53基因密码子273处野生型和突变型的紫外可见吸收光谱检测结果)，据此可以判断有突变发生。

实施例2

将该检测方法应用于检测p53基因密码子248处的突变热点，碱基G突变为碱基A(参见文献：Rangel-Lopez A，Maldonado-Rodriguez R，Salcedo-Vargas M，et al.Low density DNAmicroarray for detection of most frequent TP53 missense point mutations.BMC Biotechnol，2005，15(8)：1-13)，具体操作步骤如下：

1)将96mL超纯水、1mL 1％的氯金酸溶液和3mL 1％的柠檬酸三钠溶液，室温下混匀，立即放入微波炉中，高火加使其沸腾，再调至中火，继续加热保持沸腾状态8min后，自然冷却至室温，然后离心，浓缩，加水重新分散，制备出粒径为25nm的胶体金，颜色鲜红透亮。

2)取野生型单链DNA 10fmol加入到50μL胶体金中，混匀后室温静止10min，得胶体金与野生型单链DNA复合体系。

3)取突变型单链DNA 10fmol加入到50μL胶体金中，混匀后室温静止10min，得胶体金与突变型单链DNA复合体系。

4)在步骤2所得的胶体金与野生型单链DNA复合体系中加入4μL 1mol/L的盐酸，混匀后发生团聚，作紫外可见吸收光谱检测，胶体金与野生型单链DNA复合体系的紫外可见吸收光谱最大吸收峰发生红移，发生红移后的胶体金与野生型单链DNA复合体系的紫外可见吸收光谱最大吸收峰称之为吸收峰1。

5)在步骤3所得的胶体金与突变型单链DNA复合体系中加入4μL 1mol/L的盐酸，混匀后发生团聚，作紫外可见吸收光谱检测，胶体金与突变型单链DNA复合体系的紫外可见吸收光谱最大吸收峰发生红移，发生红移后的胶体金与突变型单链DNA复合体系的紫外可见吸收光谱最大吸收峰称之为吸收峰2。

结果表明，胶体金与野生型单链DNA复合体系颜色最终为淡蓝色，吸收峰1位于670nm处；胶体金与突变型单链DNA复合体系颜色最终为蓝紫色，吸收峰2位于635nm。吸收峰2与吸收峰1有明显差异(参见图4给出的p53基因密码子248处野生型和突变型的紫外可见吸收光谱检测结果)，据此可以判断有突变发生。