使用扭转嵌入核酸（TINA）稳定并选择性地形成Hoogsteen型三链体和双链体以及制备TINA的工艺

摘要

本发明描述了一种柔性碱基堆积的单体，其可以被掺入到寡聚核苷酸或寡聚核苷酸的类似物中，以及形成三链体的包含柔性碱基堆积的单体的寡聚核苷酸中。本发明中形成三链体的寡聚核苷酸能够序列特异性地结合到双链目标核酸上，并因此可以用于目标核酸活性的调节以及目标核酸的检测。

说明书

发明概述

本发明涉及寡聚核苷酸和被修饰的寡聚核苷酸领域，其中所述寡聚核苷酸和被修饰的寡聚核苷酸具有改进的性能，例如形成三链体链的能力以及对检测、诊断和/或治疗的适合性。

特别地，本发明提供了新型的柔性碱基堆积的单体，其能够被掺入到寡聚核苷酸中提供形成三链体的寡聚核苷酸(TFO)，其中所述TFO能够序列特异性地与目标双链或单链核酸结合，以形成具有非常高热稳定性的三链螺旋。其他的方面是用于合成所述TFO的方法以及它们在检测、诊断和治疗中的应用。

发明背景

WO2005083084描述了嵌入剂假核苷酸(pseudonucleotide)，其能够被掺入到寡聚核苷酸或寡聚核苷酸类似物的主链中。包含所述嵌入剂假核苷酸的寡聚核苷酸具有降低的形成三链体的能力，但具有区分DNA和RNA的能力，即它们与DNA形成的复合物比与RNA形成的复合物更稳定。

Malakhov等人，2004(Eur.J.Org.Chem.2004，1298-1307)公开了用于掺入到寡聚核苷酸或寡聚核苷酸中的单体。该研究的目的是提供一种天然碱基即泛宿主性碱基(promiscuous base)，其适合形成与所有天然存在的碱基相反的Watson-Crick螺旋。还没有关于形成三链体的研究被报道。

双链DNA(dsDNA)的序列特异性识别是分子生物学、治疗学和生物纳米技术中基于寡聚核苷酸的工具的开发中吸引相当大兴趣的主题。如果单链的形成三链体的寡聚核苷酸(TFO)通过特异性大沟相互作用与dsDNA结合，则形成三螺旋，这已经成为用于基因靶向的深入研究的课题。这种途径能够进行转录控制、基因敲除和对以突变的或者重组的基因为目标的基因组DNA进行序列选择性的治疗。

TFO第三链与其目标的亲和力通常是有问题的，因为它们需要识别dsDNA的同型嘌呤序列，以及在相匹配的(嘧啶)结合基序中在生理条件下不能令人满意地形成pH敏感C⁺G-C Hoogsteen碱基三链体。在过去的几十年中，已经进行许多努力以修饰TFO，用于提高与它们的目标的结合亲和力，同时改进对三链体核酸碱基的设计，其能够减少dsDNA序列的限制。具有被修饰核酸的寡聚核苷酸例如，能够诱导提高的结合亲和力的肽核酸(PNA)、锁定核酸(locked nucleic acid，LNA)、2’-氨乙基-寡聚核糖核苷酸(2’-AE-RNA)和N3’-＞P5’氨基磷酸酯(phosphoramidate)属于最成功的被化学修饰的TFO。通过向含有所有三种寡聚核苷酸序列的水溶液加入杂环化合物(嵌入剂)(有时具有带正电的侧链)也能够观察到三链体结构的稳定化。已经显示，共价连接到TFO的3’-或5’-末端的嵌入剂导致了平行三链体在+3.0℃～+16.1℃范围内的热稳定性，这依赖于连接体的长度和嵌入剂的类型。然而，对于被插入到TFO中部作为凸起的共价附着的嵌入剂已经有一定的关注。

这种设计具有多种优点。首先，与合成至少四种核苷酸单体需要糖修饰的核酸相比，只需要合成一种嵌入的假核苷酸亚磷酰胺(phosphoramidite)。第二，与单一插入相比，嵌入剂单体的几个凸起插入能够大大地提高双链体和三链体的稳定性。而且，Watson-Crick和Hoogsteen结合模式之间的结构差别以及DNA和RNA中2’-OH的缺乏和存在能够引起各种螺旋类型的不同性能。因此，预期连接体的凸起插入以及由嵌入剂分裂螺旋以导致用于适当选择的螺旋的独特性能。这已经得到了能够区分不同类型单链核酸的化学修饰的寡聚核苷酸。

发明的详细描述

将(R)-1-O-[4-(1-芘基乙炔基)苯基甲基]甘油凸起插入到同型嘧啶寡聚脱氧核苷酸(扭转嵌入核酸，TINA)的中部导致Hoogsteen型三链体和双链体相当高的热稳定性，而相同核苷酸内容物的Watson-Crick型双链体被去稳定化，其中同型嘧啶寡聚脱氧核苷酸是通过合成后Sonogashira偶联反应获得的。

一方面，本发明提供了具有下列通用结构的柔性碱基堆积的单体：

X-L-I₁-C-I₂

其中，X是主链单体单元，其能够被掺入到寡聚核苷酸或寡聚核苷酸类似物或PNA或PNA类似物的主链中；L是连接体；I₁是第一嵌入剂，其含有至少一种基本平面(flat)的共轭体系，其能够与DNA、RNA或它们的类似物的核酸碱基(nucleobase)共堆积；C是共轭剂(conjugator)；I₂是第二嵌入剂，其含有至少一种基本平面的共轭体系，其能够与DNA、RNA或它们的类似物的核酸碱基共堆积。

柔性碱基堆积的单体由至少两个嵌入体系I₁和I₂构成，其中I₁和I₂被通过共轭剂C连接，共轭剂C提供了必要的结构刚性和扭结柔性(twistingflexibility)。后者被认为对于帮助嵌入剂调节自身到核酸螺旋内部适当的位置是重要的。

在优选的实施方式中，主链X能够被掺入到下列寡聚核苷酸中：DNA、RNA、HNA、MNA、ANA、LNA、CAN、INA、CeNA、TNA、(2’-NH)-TNA、(3’-NH)-TNA、α-L-核糖-LNA、α-L-木糖-LNA、β-D-核糖-LNA、β-D-木糖-LNA、[3.2.1]-LNA、双环-DNA、6-氨基-双环-DNA、5-表-双环-DNA、α-双环-DNA、三环-DNA、双环[4.3.0]-DNA、双环[3.2.1]-DNA、双环[4.3.0]酰胺-DNA、β-D-核糖吡喃基-NA、α-L-来苏糖吡喃基-NA、2’-R-RNA、2’-OR-RNA、2’-AE-RNA、α-L-RNA、β-D-RNA及它们的组合和修饰。

核酸及其类似物提供了能够通过Watson-Crick或Hoogsteen或反式Hoogsteen碱基配对与互补核酸结合的寡聚核苷酸。在这些序列的3’-末端和/或5’-末端和/或中部可以引入X。被修饰的核酸碱基、烃、肽链、磁珠、琼脂糖珠、琼脂糖凝胶珠、玻璃、塑料表面、重金属和芯片表面被认为用作对核酸的额外修饰。

在另一种实施方式中，主链单体单元X包括亚烷基二醇基(alkylendiol)例如乙二醇基或者1-O-亚甲基丙三醇(1-O-methyleneglycerol)，其可选择地具有部分包含在环体系中的亚烷基二醇基(alkylendiol)，例如糖基(glycon)。例如，主链单体X可以是四元环、五元环或六元环的一部分，其最终具有选自氮、硫、磷和氧的杂原子。

在一种实施方式中，柔性碱基堆积的单体的连接体L包含0～60个原子。

在另一种实施方式中，L含有链或环或它们的组合和/或它们的取代物。

在另一种实施方式中，L含有烷基链或氧杂烷基链或者氮杂烷基链或硫代烷基或羧酰胺基或硫代羧酰胺基或者磺酰胺基或它们的组合。

X和L的组合提供了将嵌入体系I₁-C-I₂置于核酸螺旋中心的体系，其能够与核酸碱基堆积。

本发明柔性碱基堆积的单体的I₁是第一嵌入剂，其包含至少一种基本平面的共轭体系，其能够与DNA、RNA或它们的类似物的核酸碱基共堆积。

在优选的实施方式中，I₁是单环或多环芳香环体系，其可选择地选自由苯、萘、甘菊环、双环杂芳环体系及它们的取代物所组成的组中。

本发明柔性碱基堆积的单体的C是共轭剂。在优选的实施方式中，C选自由1～12个碳的烷基、2～12个碳的烯基、2～25个碳的炔基、或重氮基或长度不超过25个碳原子和/或氮原子的它们的组合所组成的组中。

在另一种实施方式中，C选自由直链或支链或单环芳香环及它们的取代物所组成的组中，其最终具有选自氮、硫、磷和氧的杂原子。

在另一种实施方式中，C的烯基是乙炔基或重复的乙炔基。

在优选的实施方式中，含有磷原子的主链单体单元X的单元长度小于6个原子，其中，主链单元长度为从一个单体到下一个单体之间最短的距离。

在优选的实施方式中，连接部分L(linking moiety)具有至少2个原子的长度，其最终具有选自氮、硫、磷和氧的杂原子。

柔性碱基堆积的单体的I₂是第二嵌入剂，其包含至少一种基本平面的共轭体系，其能够与DNA、RNA或它们的类似物的核酸碱基共堆积。

在优选的实施方式中，I₂选自由双环芳香环体系、三环芳香环体系、四环芳香环体系、五环芳香环体系以及它们的芳杂环类似物及取代物所组成的组中。

在优选的实施方式中，柔性碱基堆积的单体是寡聚核苷酸或寡聚核苷酸类似物的一部分。

在另一种优选的实施方式中，柔性碱基堆积的单体适合掺入到寡聚核苷酸中。

在优选的实施方式中，适合掺入到寡聚核苷酸中的柔性碱基堆积的单体选自由亚磷酰胺(phosphoroamidite)、亚磷酰二胺(phosphordiamidite)、磷酸二酯(phosphordiester)、磷酸三酯(phosphortriester)、膦酸酯、H-膦酸酯、亚磷酸酯、氯代亚磷酸酯、氯代亚磷酰胺(chlorophosphoramidite)、膦酰胺(phosphonamidite)、膦酰氯(phosphonchloridite)、三磷酸酯、二磷酸酯所组成的组中。

在另一种实施方式中，本发明柔性碱基堆积的单体可以由下式描述：

其中，R选自由芳基乙炔基所组成的组中。

本发明的另一个方面是寡聚核苷酸，其包含本发明的柔性碱基堆积的单体。所述寡聚核苷酸可以是能够形成Watson-Crick碱基配对和Hoogstein碱基配对以及反向Hoogstein碱基配对的任何寡聚核苷酸。本发明寡聚核苷酸的重点是它们能够形成Watson-Crick碱基配对和Hoogstein碱基配对以及反向Hoogstein碱基配对。因此，如果将本发明的柔性碱基堆积的单体掺入到寡聚核苷酸中，则该寡聚核苷酸能够形成三链体。

本发明的另一个方面是制备柔性碱基堆积的单体的方法，其包括下列步骤：

提供柔性碱基堆积的单体的前体，其中，所述前体是包含被卤素取代或者被C取代或者被叠氮化物取代的I₁的柔性碱基堆积的单体。

将步骤a的前体中所述卤素或C取代基或者叠氮化物取代基替换为C-I₂；

使C-I₂取代的柔性碱基堆积的单体的前体适合掺入到寡聚核苷酸中。

本发明的另一个方面是用于制备包含柔性碱基堆积的单体的寡聚核苷酸的方法，其包括下列步骤：

提供适合掺入到寡聚核苷酸中的柔性碱基堆积的单体；

提供用于合成寡聚核苷酸的标准试剂；

在寡聚核苷酸的合成中，将一种或者多种柔性碱基堆积的单体掺入到寡聚核苷酸中；

这样产生了包含柔性主链单体的寡聚核苷酸。

另一个方面是制备包含柔性碱基堆积的单体的寡聚核苷酸的方法，其包括下列步骤：

提供适合掺入到寡聚核苷酸中的柔性单体的前体，其中，所述前体是包含被卤素取代或者被C取代或者被叠氮化物取代的I₁的柔性碱基堆积的单体；

提供用于合成寡聚核苷酸的标准试剂；

在寡聚核苷酸的合成过程中，将一种或者多种柔性碱基堆积的单体的前体掺入到寡聚核苷酸中；

在合成寡聚核苷酸之后，将I₁上的所述卤素或C取代基或者叠氮化物取代基替换为C-I₂；

这样产生了含有柔性碱基堆积的单体的寡聚核苷酸。

本发明的进一步方面是含有柔性碱基堆积的单体的寡聚核苷酸用于形成三链体核酸结构的应用。与传统的通过杂交的检测相比，使用TFO进行检测不需要变性步骤。

因此，本发明的另一个方面是形成双链体或者三链体核酸的方法，其包括下列步骤：

提供权利要求16所述的寡聚核苷酸；

提供单链或双链目标核酸；

将步骤a的寡聚核苷酸与步骤b的单链或双链目标核酸在双链体或三链体形成的条件下进行孵育；

这样，形成了双链核酸或者三链体核酸结构。

重要的是，正如从实施例部分能够清楚看出的，本发明的TFO能够在pH大约7处形成三链体。这一特征对于各种应用例如作为药物的应用是非常重要的。

在优选的实施方式中，三链体核酸的形成被用于目标核酸活性的序列特异性调节。

在优选的实施方式中，目标核酸选自由染色体基因、mRNA、rRNA、tRNA和微RNA或它们的任何前体所组成的组中。因此，所述三链体核酸结构可以抑制mRNA的翻译、rRNA或tRNA的功能以及前体-miRNA到成熟微RNA的过程。

在另一种优选的实施方式中，形成三链体核酸结构被用于对目标核酸的序列特异性检测。

因此，其能够检测特定的前体微RNA，或者检测特定的等位基因。这些检测方法是例如对于诊断目的是有利的。

在另一种实施方式中，含有柔性碱基堆积的单体的寡聚核苷酸被用作药物。这类药物的作用机制可以是抑制某种基因的表达，即通过抗原机制。其也可以是抑制mRNA或微RNA的水平。

因此，本发明的寡聚核苷酸可以用于制备药物。

项目：

1.用于稳定天然或者被修饰的DNA和RNA三链体、双链体和它们的杂交体的嵌入寡聚核苷酸具有式1的通用结构：

式1

其中，

R₁、R₂和R₃互相独立地是单环或多环芳香环体系，

R₁、R₂和R₃可以互相独立地被取代，

寡聚物是由下列亚单元(subunit)构成的寡聚核苷酸：DNA、RNA、HNA、MNA、ANA、LNA、CAN、INA、CeNA、TNA、(2’-NH)-TNA、(3’-NH)-TNA、α-L-核糖-LNA、α-L-木糖-LNA、β-D-核糖-LNA、β-D-木糖-LNA、[3.2.1]-LNA、双环-DNA、6-氨基-双环-DNA、5-表-双环-DNA(5-epi-bicyclo-DNA)、α-双环-DNA、三环-DNA、双环[4.3.0]-DNA、双环[3.2.1]-DNA、双环[4.3.0]酰胺-DNA、β-D-核糖吡喃基-NA、α-L-来苏糖吡喃基-NA、2’-R-RNA、2’-OR-RNA、2’-AE-RNA、α-L-RNA、β-D-RNA及它们的修饰物。这些亚单元可以含有被修饰的核酸碱基、烃和肽链。寡聚核苷酸主链可以被修饰。

连接体包含1～60个原子，其可以含有非芳香环区域，其中，寡聚物被通过连接连接体(lingkage lingker)连接到芳香环体系R₁，接着R₁被依次通过确定共轭体系的共轭剂1连接到共轭体系R₂，其中，所述共轭剂1包含单环和/或多环芳香环体系和/或烷基、烯基和/或炔基，R₂接着被依次通过确定共轭体系的共轭剂2连接到芳香环体系R₃，其中，所述共轭剂2包含单环和/或多环芳香环体系和/或烷基、烯基和/或炔基，其中，所述连接体是主链单体单元，其能够通过磷酸部分、或者糖部分、或者核酸碱基、或者被修饰的寡聚物主链，被插入到核酸或者核酸类似物的主链中。

包含R₁、共轭剂1、R₂、共轭剂2和R₃的共轭体系可以采用非平面体系。

根据权利要求1所述的嵌入寡聚核苷酸，其中，所述共轭剂1和共轭剂2是相互独立的。共轭剂1由芳基R₄构成，其通过x个单键、n个双键和/或m个三键连接到R₁，通过y个单键、k个双键和/或l个三键连接到R₂，其中k、l、m、n、x和y相互独立地是0～5的整数。共轭剂2由芳基R₅构成，其通过z个单键、p个双键和/或r个三键连接到R₂，通过v个单键、s个双键和/或t个三键连接到R₃，其中p、r、s、t、v和z相互独立地是0～5的整数。所形成的共轭体系可以形成非平面体系。

根据项目2所述的嵌入寡聚核苷酸，其中所述芳基含有杂原子。

根据项目2或项目3所述的嵌入寡聚核苷酸，其中如式2中所描述的，R₃被单原子所取代。所述包含R₁、共轭剂1、R₂和共轭剂2的共轭体系可以采用非平面体系。

式2

根据项目2～4中任一项所述的嵌入寡聚核苷酸，其中，所述共轭剂1和/或共轭剂2相互独立地选自由1～12个碳的烷基、2～12个碳的烯基、2～25个碳的炔基及它们的组合所组成的组中。

根据项目2～5中任一项所述的嵌入寡聚核苷酸，其中，所述的炔基是重复的乙炔。

根据项目2～5中任一项所述的嵌入寡聚核苷酸，其中，所述炔基是乙炔。

根据项目2～7中任一项所述的嵌入寡聚核苷酸，根据式3其不含有R₃和共轭剂2。

式3

根据前述项目中任意一项所述的嵌入寡聚核苷酸，其中，所述连接体选自由直链或支链或环基所组成的组中。

根据项目9所述的嵌入寡聚核苷酸，其中，所述直链或支链或环基具有选自氮、硫、磷和氧的杂原子。

根据前述项目中任意一项所述的嵌入寡聚核苷酸，其中，主链单体包含乙二醇(式4)：

式4

其中，X由直链或支链或环基构成，寡聚核苷酸1和寡聚核苷酸2是分别独立地限定为项目1中的寡聚物。

根据项目11所述的嵌入寡聚核苷酸，其中，所述直链或支链或环基具有选自氮、硫、磷和氧的杂原子。

根据前述项目中任意一项所述的嵌入寡聚核苷酸，其中，主链单体包含1-O-亚甲基丙三醇(式5)：

式5

根据项目13所述的嵌入寡聚核苷酸，其中，R₁是由间-、邻-、或对-取代的苯环所构成的(式6)：

式6

根据项目14所述的嵌入寡聚核苷酸，其中，根据式7，R₂是芘，而不含有R₃和共轭剂2。

式7

根据项目15所述的嵌入寡聚核苷酸，其中，所述共轭剂1由重复的多个乙炔或乙炔或芳基构成。

根据项目16所述的嵌入寡聚核苷酸，其中，所述芳基含有杂原子。

根据项目11～17中任意一项所述的嵌入寡聚核苷酸，其中，取代的乙二醇基(ethylenglycole)是纯的立体异构体(R)或(S)。

式8所限定的嵌入寡聚核苷酸，其中，寡聚核苷酸1和寡聚核苷酸2是独立地由项目1中的寡聚物所限定的。

式8

根据项目1～19所述的嵌入寡聚核苷酸，其中，寡聚核苷酸1和寡聚核苷酸2是单链富含嘧啶的寡聚脱氧核糖核苷酸或寡聚核糖核苷酸。

项目1～20的嵌入寡聚核苷酸中的共轭剂1和/或共轭剂2是通过合成仅具有最终共轭体系的一部分(前体嵌入寡聚核苷酸)后进行装配的，例如通过Sonogashira偶联反应(在Pd-催化剂和/或CuI存在下，具有末端乙炔基的芳基和卤代芳基之间的反应)或者通过Glazer反应(在铜离子存在下，具有末端乙炔基的芳基之间的反应)或者通过点击化学(click-chemistry)(在铜离子存在下，有机叠氮化物与具有末端乙炔基的有机分子之间的反应)。

根据项目21所述的合成是在前体嵌入寡聚核苷酸进行的，该前体嵌入寡聚核苷酸具有酸性和/或碱性标记保护基团。

根据项目21所述的合成可以对未保护的前体嵌入寡聚核苷酸进行。

根据项目22或23所述的前体嵌入寡聚核苷酸被附着到固体支持物上。

根据项目24所述的方法，其中，所述的固体支持物包括被活化的表面。

根据项目24所述的方法，其中，所述的支持物选自由磁珠、琼脂糖珠、琼脂糖凝胶珠、玻璃、塑料表面、重金属和芯片表面所组成的组中。

项目1～20所述的嵌入寡聚核苷酸是通过逐步寡聚核苷酸合成所获得的，其使用连接到最终共轭体系或者最终共轭体系一部分的连接体的单体。所述连接体具有至少两个反应基团，所述反应基团可以可选择地与寡聚核苷酸或寡聚核苷酸类似物的生长链反应。所述单体能够与结合支持物的核苷酸、寡聚核苷酸、核苷酸类似物或寡聚核苷酸类似物的生长链发生反应，并可选择地通过在寡聚核苷酸类似物的期望序列中掺入一种或多种核苷酸、核苷酸类似物，以进一步延长所述寡聚核苷酸或寡聚核苷酸类似物；从所述固体支持物断裂所述寡聚核苷酸或寡聚核苷酸类似物；以及断裂所述碱性/酸性标记保护基团，这样获得了所述嵌入寡聚核苷酸。

根据项目1～20所述的嵌入寡聚核苷酸能够与双链体链之一形成Hoogsteen三链体或者反向Hoogsteen三链体，其中，所述双链体是DNA双链体、RNA双链体或它们的杂交体。项目1～20的嵌入寡聚核苷酸的寡聚物部分能够与单链形成Hoogsteen双链体或者反向Hoogsteen双链体或者Watson-Crick双链体，其中，所述单链是DNA、RNA或它们的杂交体。

根据项目1～20所述包含R₁、共轭剂1和R₂以及最终共轭剂2和R₃的单体形成凸起时，Hoogsteen三链体和Hoogsteen双链体表现出提高的热稳定性。

根据项目1～20所述的嵌入寡聚核苷酸被连接到DNA反应试剂上。所述DNA反应试剂是能够介导突变的诱变剂，或者是光诱导交联剂，或者是放射性试剂，或者是烷基化基团，或者是能够招募DNA损伤细胞酶的分子。

一种适合用于反义治疗和抗原治疗的药物组合物，其中，该组合物包含根据项目1～20所述的嵌入寡聚核苷酸。

一种治疗由存在不期望双链体寡聚核苷酸所介导的疾病或病症的方法，其中，该方法包括为需要这种治疗的受试者给药治疗有效量的根据项目1～20所述的嵌入寡聚核苷酸或其药物组合物。

一种用于进行化学选择性连接的方法，其使用根据项目1～20所述的嵌入寡聚核苷酸连接到包含DNA、RNA或其杂交体的模板上的DNA反应基团。所述DNA反应基团是能够与其他化学基团在适当条件下发生反应的化学基团。

根据项目33所述的方法，其中，所述化学选择性连接是生物正交(bioorthogonal)。

根据项目34所述的方法，其中，DNA反应基团之一是叠氮化物或末端乙炔基或膦(phosphane)。

根据项目1～20所述的嵌入寡聚核苷酸能够用于纯化DNA质粒(双链DNA)。

根据项目1～20所述的嵌入寡聚核苷酸能够用于抑制转录。

根据项目1～20所述的嵌入寡聚核苷酸能够用于荧光原位杂交(FISH)以及这种方法的类似方法，例如多路(多色)荧光原位杂交(M-FISH)、常规FISH以及COMBO-FISH等。

根据项目1～20所述的嵌入寡聚核苷酸能够用于基因修复。

根据项目1～20所述的嵌入寡聚核苷酸能够用于核酸纳米机器，该机器基于双链体-三链体的转换，其中，核酸被限定为项目1中的寡聚物。

根据项目1～20所述的嵌入寡聚核苷酸能够用于核酸纳米机器，该机器基于平行双链体-反向平行双链体的转换，其中，核酸被限定为项目1中的寡聚物。

根据项目1～20所述的嵌入寡聚核苷酸，其中，通过杂交到相应的DNA、RNA及它们的类似物上，改变了荧光性能。

一种体系，其中根据项目1～20所述的嵌入寡聚核苷酸被附着到固体支持物上。

根据项目43所述的体系，其中，所述固体支持物是被活化的表面。

根据项目43所述的体系，其中，所述固体支持物选自由磁珠、琼脂糖珠、琼脂糖凝胶珠、玻璃、塑料表面、重金属和芯片表面所组成的组中。

附图说明

图1

在20mM卡可基酸钠、100mM NaCl、10mM MgCl₂，pH7.2中，在260nm处记录的针对渐增的温度(1℃/分钟)所做的三链体解链一阶导数图；

图2～6

单链、反向平行双链体和平行双链体以及平行三链体的荧光谱。检测条件：10℃下缓冲液(20mM卡可基酸钠、100mMNaCl、10mM MgCl₂，pH 6.0)中每种链1μM，激发：373nm(激发狭缝4.0nm)；发射：380～600nm(发射狭缝对于A、B和E为2.5nm，对于C和D是0.0nm)。ON6和ON12被用作在不同条件下记录光谱中的参照。

实施例

实施例1

最近，我们已经报道了为Watson-Crick型双链体设计的几种嵌入核酸的合成和性能(方案1)。^[9]在寡聚脱氧核苷酸()的中部凸起插入(R)-1-O-(1-芘基甲基)甘油，导致与互补ssDNA的显著提高的亲和力，而INA/RNA双链体和Hoogsteen-型三链体和双链体被去稳定化。^[9a，e]其也提到在将嵌入剂凸起插入到寡聚脱氧核苷酸之后，会维持双链体形成的错配灵敏性。^[9b]柔性短甘油连接体和适当嵌入剂的独特组合导致目前用于核酸化学生物学的有价值的分子，其中所述柔性短甘油连接体会扭曲磷酸酯主链，嵌入剂会通过去溶剂化和通过与核酸碱基的堆积而稳定INA/DNA。

我们决定开发这种类型的嵌入剂用于设计TFO。为了增强使用短的柔性连接体的TFO的稳定性，嵌入剂的芳香族结构需要足够长以将嵌入剂置入三链螺旋的dsDNA部分。因此(R)-1-O-(4-聚芳基-苯基)甲基甘油能够是好的选择，因为苯基也能够模拟三链螺旋TFO部分的核酸碱基。聚芳基嵌入剂也能够通过乙炔桥附着到该苯基上，其提供必要的结构刚性和扭转柔性并仍联合芳香族结构。乙炔键本身被认为会改善嵌入性能。根据通过MacroModel 8.0对(R)-1-O-[4-(1-芘基乙炔基)-苯基甲基]甘油的分子建模，在三键周围存在1-芘基和苯基的扭转，其扭转角度为15.3°。相信这种扭转能力能够有助于嵌入剂调节自身到dsDNA内部恰当的位置。因此，我们将这种类型的核酸称作扭转嵌入核酸(TINA，方案1)。这里，我们报道了在合成Sonogashira型后，在柱上对寡聚脱氧核苷酸的衍生获得了不同的TINA，其被发现在Hoogsteen型双链体和三链体中格外高的亲和力。还提供了对核酸螺旋的热稳定性和荧光研究，其中所述核酸具有TINA插入作为根据Watson-Crick或Hoogsteen结合模式所形成的凸起。

方案1嵌入核酸(INA)的单体和扭转嵌入核酸(TINA)的化学结构

合成后对寡聚核苷酸的修饰是对多种假核苷亚磷酰胺常规和耗时的制备方法的更佳备选，其中假核苷亚磷酰胺对于选择合适的TNA候选是必需的。已经有多项报告关注在固相合成中钯(0)催化的寡聚核苷酸修饰。发现Sonogashira偶联条件适合DNA合成，并且对于具有保护基团的核酸碱基没有观察到副反应。根据已知的规程，在序列的5’-末端引入5’-O-DMT-2’-脱氧-5-碘尿苷后，DNA合成会停止，接着在Sonogashira条件下进行对寡聚核苷酸支持物的处理。然后，将寡聚物的合成进行最后。然而，在继续的寡聚核苷酸合成中，在插入后，并不是所有的功能团都能够保存下来。存在标准氨基磷酸酯的偶联效率在柱上衍生之后下降的风险，这在我们下面描述的实验中也观察到了。尽管事实上某些有机金属偶联剂被用于寡聚核苷酸合成后的修饰，但是对位于序列中部的可转化核苷2’-脱氧-5-碘尿苷的合成后Sonogoshira型反应被报道是不成功的。作为替换，我们尝试在掺入到寡聚物中部之后，在Sonogoshira型反应中使用(R)-1-O-(4-碘苄基)甘油。在本文中使用许多具有末端三键的芳香族结构(2-5)(方案1)。

从4-碘苄基溴和(S)-(+)-2，2-二甲基-1，3-二氧戊环-4-甲醇按照4个步骤合成所需要的亚磷酰胺8，其总产率为47％(方案2，见实验细节的支持信息)。在0.2μmol规模的DNA合成过程中，使用标准的核苷酸偶联条件(偶联2分钟，4，5-二氰咪唑作为激活剂)以及提高的去保护时间(100秒)，化合物8的偶联效率被评估为超过99％。DNA合成之后，在室温干燥条件下，在1mL注射器中使用Sonogoshira偶联反应混合物对带具有4-碘苯基部分的DMT-on寡聚核苷酸的CPG-支持物进行处理，其中所述偶联反应混合物在干燥的DMF/Et₃N(3.5/1.5，500μL)中含有Pd(PPh₃)₄或Pd(PPh₃)₂Cl₂(7.5mM)，具有末端乙炔基的芳香族结构(22.5mM)和CuI(7.5mM)。在偶联反应之前使用氩气而不是氮气对支持物和注射器进行冲洗以避免Glazer氧化二聚是重要的。如果为每种单独的寡聚物将Sonogashira反应混合物直接制备在塑料注射器中，而不是大量制备Sonogashira反应混合物用于多次偶联反应，发现所述转化更好。在偶联反应(3-4小时)之后，使用DMF(2×0.5mL)和CH₃CN(2×1mL)冲洗CPG，并干燥。接着使用32％NH₄OH(2h)从CPG-支持物断裂寡聚核苷酸，并在55℃下去保护(过夜)。由于不同的亲脂能力，所以通过在C₁₈柱上的半制备HPLC分离未反应的寡聚物和目标TINA。在出现重叠的峰(结构2)的情况下，采用更长的HPLC程序(参见支持信息)。在第一次分离后，使用10％AcOH对DMT-on寡聚核苷酸进行处理，接着在HPLC上再次纯化，并从乙醇沉淀。根据离子交换HPLC所判断的，发现最终TFO的纯度对于含有寡聚脱氧核苷酸的纯嘧啶超过90％，对于具有嘌呤的寡聚脱氧核苷为85～88％。通过MALDI-TOF对该组合物进行验证。

方案2：亚磷酰胺8的合成。试剂和条件：(a)4-碘苄基溴、KOH和甲苯；(b)80％的含水(aq.)CF₃COOH、室温(rt)、100％经过两个步骤；(c)DMTC1、吡啶、室温、70％；(d)NC(CH₂)₂OP(NPrⁱ₂)₂、四唑二异丙铵(diisopropylammonium tetrazolide)、CH₂Cl₂，0℃至室温，过夜，67％。

在Sonogashira偶联过程中，该转化依赖于乙炔基的反应性以及寡聚物的序列。正如通过使用1-乙炔基芘的大量实验可以判断，使用新鲜的反应混合物进行一次以上处理比延长的时间反应(4-16h)更有效。形成了较少量的略溶Glazer副产物，在1-乙炔基芘的情况中，Pd(PPh₃)₄作为催化剂观察到了比Pd(PPh₃)₂Cl₂作为催化剂好的寡聚物衍生。与高嘧啶(homopyrimidine)序列相比(80-85％)，即使在单个处理后再使用Sonogashira偶联反应混合物对具有寡聚核苷酸的支持物进行双重处理，序列中出现嘌呤也会导致转化成目标TINA的较低的转化率(50-60％)，其中所述Sonogashira偶联反应混合物含有1-乙炔基芘。这对于其他芳香族乙炔似乎也是正确的，因为在含有嘌呤的序列中，使用4-乙炔基联苯没有获得目标寡聚核苷酸，4-乙炔基联苯在测试的乙炔中发现是最有反应性的化合物。在ON14的合成中，我们体验到与在Sonogashira反应之后中断DNA合成第二次插入8后、并继续合成DNA相比，使用具有1-乙炔基芘的Sonogashira反应混合物处理完整的寡聚核苷酸提供了更纯的寡聚物。在前一情况中，根据离子交换HPLC所判断的，含芘的短寡聚物污染了最终的TINA。

最近，报道了在水中存在吡咯烷(pyrrolidine)的情况下，使用PdCl₂进行的无铜Sonogashira偶联反应。与水的兼容性，有氧条件以及痕量的同型偶联产物(homocoupling product)是本方法非常大的优点。我们对完全去保护的ON2采取类似的条件。然而，在使用1-乙炔基萘和PdCl₂在水/吡咯烷(1∶1)中在50℃或20℃下处理ON2过夜后，在HPLC纯化之后，没有观察到期望的核酸的痕迹(trace)。

通过热变性实验，检验具有合成的寡聚核苷酸的三链体、DNA/DNA和DNA/RNA双链体的热稳定性。作为解链曲线的一阶导数(first derivative)所确定的解链温度(T_m，℃)被列在表1～4中。在pH依赖的Hoogsteen型碱基配对中对具有不同TINA的序列进行研究，同时在针对双链体D1的平行三链体中，以及针对ON15的平行dsDNA中(表1)。相同的序列(ON1-14)被用于针对ON16的Watson-Crick DNA/DNA反向平行双链体。对于后面的双链体类型，与前面描述的INA类似，混合的嘧啶/嘌呤序列也被用于TINA寡聚核苷酸以与ssDNA和ssRNA进行杂交(表4)。

可以从表1中的T_m数据看出，在pH 6.0下与野生型复合物(ON1针对D1和ON15)相比，对具有(R)-1-O-(4-碘苯基甲基)甘油在序列中部作为凸起的ON2观察到Hoogsteen型三链体和双链体相当大的去稳定化。使用芳基取代基取代碘提供了更稳定的三链体(ON3-ON6针对D1，pH 6.0)。观察到最高的T_m值46.0℃是在pH 6.0下的1-芘基乙炔基取代基，其对应于与野生型三链体相比的ΔT_m＝19.0℃。即使在pH 7.2时，尽管高胞嘧啶含量(36％)，单个引入5也会导致三链体(ON6/D1)相当大的稳定化。在该pH下，没有检测到野生型三链体的杂交(图1)。对于平行双链体，在pH6.0下，分别检测到1-萘基乙炔基(ON5)和1-芘基乙炔基(ON6)每种修饰3.0℃和14.5℃的稳定化。正如所期待的，在较低pH(pH＝5.0)下，发现平行双链体更稳定，因为胞嘧啶的质子化。可以得出结论，在(R)-1-O-(苯基甲基)甘油中苯环的4-位结合芳香族结构导致Hoogsteen型螺旋杂交亲和力的提高。令人感兴趣的，萘环和芘环提供了比4-联苯和苯好得多的稳定性。这支持与小的芳香族结构相比，具有大表面的芳香族结构如芘优选用于结合到(R)-1-O-(4-取代的苯基甲基)甘油以达到Hoogsteen型螺旋中好的结合的观点。

与野生型dsDNA(ON1/ON16，Table 1)相比，观察到了全部所研究被修饰的寡聚脱氧核苷酸的反向平行dsDNA的去稳定化，除了在5’-末端(ON10/ON16)安置嵌入剂5外。后一种情况中的稳定作用可以归于芳香族多环体系堆积在临近的核酸碱基上(作为盖子的作用)，而非环连接体的这种作用是最小的。杂交亲和力还依赖于TINA的结构。最小去稳定化的双链体是使用4和5形成的，而引入结构1～3作为该序列中部的凸起的dsDNA的去稳定化要更大。在此阶段，已经可以得出结论作为凸起被引入螺旋的TINA是改善Hoogsteen型螺旋的稳定性，而不是Watson-Crick型双链体的稳定性。因此在较不稳定的平行三链体(ON6/D1)中单个插入(R)-1-O-[4-(1-芘基乙炔基)苯基甲基]甘油在pH 6.0会将该三链体稳定到具有相同核苷酸成分的Watson-Crick双链体(ON6/ON16)的水平。不同TINA的热稳定性促使我们更紧密地研究含有TINA的1-芘基乙炔基的性能。

通过将1-芘基乙炔基置于TFO中的不同位置，观察到了Hoogsteen三链体和双链体热稳定性的某些波动。如果胞嘧啶临近5’-或3’-侧(ON7-ON9)，在平行三链体和平行双链体都不如5被置于两个胸腺嘧啶之间(ON6)在pH6.0下稳定。这可能是芳香族结构与带正电的C⁺·G对之间的相互作用的结果。令人感兴趣的，在pH7.2下，如果胞嘧啶不被质子化，则在所测试的具有单个插入1-芘基乙炔基的TFO(ON6-ON10)中检测到在5’-摇摆末端(dangling end)的TFO(ON10)具有最低的三链体杂交亲和力。令人吃惊的是，这里不存在盖子作用(lid effect)。这可能是具有目标dsDNA的TFO的富含C区域在生理条件下普遍较低的稳定性的结果。然而，重要的观察是在中性介质中通过将5置于富含C区域的中部(ON9)，可以达到有效的杂交亲和力。人们可以推测是否嵌入将使质子化在生理pH下在三链体结构中更有可能，因为所述嵌入剂是分开两个带正电的三聚体。

使用ON11-ON14研究热稳定性对多个芘嵌入剂5凸起插入之间距离的依赖(表1)。在重叠的三链体和双链体转换的情况中，在373nm处进行解链实验。然而，在373nm处有时观察不到非常确定的转换。在这些情况中，对于在pH6.0在双链解链温度附近的温度下三链体的解链的假设，是基于与在pH7.2下260nm处的解链的比较。如果插入嵌入剂5作为下一个最近的邻近者(ON12)，则与未修饰的ON1相比，Hoogsteen三链体和双链体在pH 6.0被稳定化。然而，在两种情况中，稳定性都比单个插入5(ON6)低，并且在pH 7.2没有观察到形成三链体。这可能是由于两个凸起(R)-1-O-甲基甘油连接体互相定位太近所引起的双链和三链螺旋的巨大中断。如果两个插入的5被两个或者三个核酸碱基分开(分别为ON13和ON14)，则带有D1和ON15的复合物比具有单个插入的复合物更稳定。在pH7.2下，三链体的Tm甚至比生理条件37℃还要高(见图1中的ON14/D1)。与在中部插入两个5相似，一个插入在5’-末端并在两个插入之间有6个碱基对的间隔的双重插入(ON11)在pH 6.0大大地稳定Hoogsteen型双链体和三链体。与Hoogsteen螺旋相反，与野生型双链体ON1/ON16相比，具有双重插入5的反向双链体(ON12-14/ON16)表现出降低的稳定性，特别在两个插入之间有一个或者三个核酸碱基时。如果将带有双重插入5的平行和反向平行双链体在pH 5.0的热稳定性进行比较，则Hoogsteen双链体ON11/ON15和ON14/ON15甚至比相应的Watson-Crick双链体(ON11/ON16和ON14/ON16)更稳定。对于苯并吡啶并吲哚(benzopyridoindole，BPI)衍生物，首次报道了通过加入嵌入剂，平行三链体和平行双链体的稳定化。当将BPI加入到寡聚脱氧核苷酸的水溶液中时，已经检测到了非完美匹配的Watson-Crick DNA双链体重组成完美匹配的Hoogsteen配对的DNA双链体。期望通过将5插入到寡聚脱氧核苷酸中获得对完全匹配的平行双链体的相似作用。

在pH 5.0观察到平行三链体超常的稳定化。TFO中高含量的胞嘧啶将未修饰的三链体的解链(T_m＝55.0℃)改变为双链体的解链温度附近。然而该值仍比pH 5.0下双链体的解链温度(T_m(D1)＝56.5℃)要低。在TFO中单个凸起插入的1-萘乙炔基(1-naphthalenylethynyl)衍生物4稍微提高了三链体的稳定性(ΔT_{m(ON5/D1-ON1/D1)}＝2.0℃)。然而，在所有情况中凸起插入5会导致整个复合物在高于dsDNA(D1)的T_m的温度下分裂。在373nm处，与260nm相同的温度下，观察到了ON11的清楚转换状态，这确认三链体和双链体同时解链。在pH 5.0下，观察到了热稳定性对在TFO中双重插入5在pH 6.0时相同的依赖性。因此，作为最近的下一个邻近者的5的双重插入(ON12)以及在中部和5-末端(ON11)的5的双重插入分别是最小和最大被稳定化的三链体。在pH 5.0下，三链体ON14/D1分别比相应的平行和反向平行双链体更稳定16.5℃和20.5℃。重要的是，即使在pH 7.2，寡聚核苷酸ON14也会形成比相应的Watson Crick dsDNA(T_m＝38.0℃，ON14/ON16)稳定的Hoogsteen型三链体(T_m＝43.0℃，ON14/D1)。在pH7.2，平行双链体(ON14/ON15)的解链温度认为低于在pH 6.0下观察到的38.0℃，因为这种双链体对pH敏感。该数据清楚地证明在序列中部具有三个碱基间隔的多次插入5的寡聚核苷酸的区分dsDNA和ssDNA的能力。

研究对于在序列的中部和5’-末端具有凸起插入的平行三链体和双链体，错配的敏感性(表2)。在三链体的情况中，对错配的敏感性依赖于嵌入剂的插入位置。当在嵌入剂3’-位置上嘌呤链中的腺嘌呤被鸟嘌呤替换(ON6/D3和ON11/D3，表2)时，检测到匹配三链体和不匹配三链体之间最低值的ΔT_m＝11.5℃。在所有其他的情况中，T_m的降低在14.0℃～22.0℃的范围内。具有单个插入5的错配平行双链体在8.0℃～13.0℃的范围内被去稳定化，这与错配的野生型平行双链体在相同的范围内。为了比较，敏感性最低的错配未修饰的双链体表现出在pH 6.0下9℃的ΔT_m(T_m(ON1/ON15)-T_m(ON1/ON18))。

我们研究了具有(R)-1-O-[4-(1-芘基乙炔基)苯基甲基]甘油(5)的TFO的荧光特征，其是形成三链体并辨别双链体错配最有效的TINA。将5引入到寡聚核苷酸得到通过373nm处的激发在400nm和421nm处具有最大值的特征性单体荧光图谱(图2，黑色曲线)，这与之前公开插入DNA内的4-[4-(1-芘基乙炔基)苯基]-1，3-丁二醇的数据类似。^[18]在所有的情况中，通过形成三链体或双链体，检测到4nm的单体荧光的移动。与单链ON6相比，形成完全匹配的三链体导致提高大约1.5倍的单体荧光(图2，ON6/D1)。对于非完美匹配的三链体，荧光的强度取决于dsDNA的序列。因此，与ON6相比，检测到TA转换位点(inversion site)(ON6/D2)几乎两倍的提高。相反，当在TFO插入5附近的dsDNA中错配胞嘧啶和鸟嘌呤碱基(D3和D4)时，观察到与完美匹配的三链体相比单体荧光的降低(图2)。特别地，鸟嘌呤提供了大的影响，其中对于错配的三链体ON6/D3的荧光强度低两倍。

有趣地，与单链影响相比，通过形成反向平行双链体检测到单体荧光的相当大的提高(ON6/ON16，图4)，而平行双链体的形成(ON6/ON15)仅导致稍微提高的荧光(图4)。当另一个4-(1-芘基乙炔基)苯基残基作为ON12中下一个最近的邻近者出现时，单链的单体荧光大约下降了三倍(图4，与ON6和ON12相比)，可以观察到受激子荧光最大值在500nm，强度为单体强度的一半(图3)。对于相同的寡聚物，在错配的三链体中，观察到了单体荧光的相当大的降低以及受激子带的消失(图3，ON12/D1)。这意味着在三链体螺旋的环境中，芘部分不能够通过结合到dsDNA上而相互联系。类似地，当ON12与ON15形成Hoogsteen配对的dsDNA时，则受激子带消失(图3)。相反，当与单链ON12的荧光强度相比时，观察到反向平行双链体(ON12/ON16)非常高的单体荧光强度和提高的受激子荧光(图4)。这说明在形成Watson-Crick dsDNA之后，相同带中的两个芘基仍然相互紧密接触，尽管在Hoogsteen型dsDNA中情况似乎不是这样。以这种方式，杂交和荧光性能都反映了TINA针对Watson-Crick和Hoogsteen型螺旋的不同特征。而且，在富含嘧啶链中(R)-1-O-[4-(1-芘基乙炔基)苯基甲基]甘油(5)作为凸起的下一个最近的邻近者的荧光数据可以被总结如下：单链ON12：在400nm和421nm处中等单体荧光和在500nm处的受激子带；平行三链体ON12/D1：低单体荧光，并且没有受激子带；平行双链体ON12/ON15：中等单体荧光带，并且没有受激子带；反向平行双链体ON12/ON16：高单体荧光和受激子带。

表3中展示了结构5通过掺入三链体的Watson-Crick双链体部分，影响平行三链体螺旋稳定性的能力。当5被插入作为双链体(ON1、ON6和ON9针对D5)嘧啶链中的凸起，与未修饰的三链体(ON1/D1)相比，在所有的情况中三链体都被稳定化。在热变性实验中在373nm[5的λ_max]处检测到三链体ON1/D1的两个转换状态(T_m＝36.5℃和55.5℃)，其分别对应于三链体和双链体的解链。通过373nm吸收对解链的检测说明嵌入剂参与了双链体和三链体的形成。当与仅在三链体的双链体部分具有嵌入剂的三链体(ON1/D5)相比时，在Watson-Crick和Hoogsteen的嘧啶链中都插入5作为凸起相互反向(ON6/D5)不会改变三链体的解链。当两个芘部分5(每个嘧啶链中一个)被放置为被3个碱基对间隔的凸起(ON9/D5)时，则三链体的解链与双链体的转换状态非常相近，这通过双重掺入5到TFO中也观察到了上述情况。与未修饰的复合物相比，当化合物5被插入到嘌呤链中作为凸起时(ON1针对D6和针对ON21)观察到了降低的三链体和平行双链体稳定性。

我们还使用已经对INA描述的相同序列和条件，研究了具有5的TINA针对Watson-Crick型双链体中ssDNA和ssRNA的混合嘌呤/嘧啶序列的杂交亲和力(表4)。当与野生型双链体相比时，对5作为序列中部的凸起观察到了TINA/DNA(ΔT_m在-8.0℃～-15.5℃的范围内)以及TINA/RNA(ΔT_m＝-10.0℃)相当大的去稳定化。第二嵌入剂5作为下一个最近的邻近者插入到DNA内(ON24)导致了双链体的进一步去稳定化(ON24/ON25和ON24/ON27)。将5相反地掺入到两条互补的混合嘌呤-嘧啶链中作为复合物ON23/ON26，导致了36.0℃的T_m值，这与TINA/DNA双链体(ON23/ON25和ON22/ON26)在相同级别的水平上。然而，当INA被插入到INA/INA双链体的相同位置上时，它们(T_m＝43.6℃)不如INA/DNA(T_m＝51.5℃)稳定。

在单独作为双链体和作为三链体中一部分的Watson-Crick dsDNA中具有4-(1-芘基乙炔基)苯基部分的复合物的荧光性能被表示在图4～6中。与插入到嘧啶链相比(ssON6，图5)，当5被插入到嘌呤链中(ssON21)时，单体荧光会被相当大地提高。通过将三链体和双链体与未修饰的DNA和ssON21(数据未显示)进行装配，可以观察到稍微降低的荧光强度。令人吃惊的发现是，对于混合的序列，单体荧光4-(1-芘基乙炔基)苯基部分在高嘧啶序列中的强灵敏性通过形成反向平行双链体完全消失(ON23/ON25、ON23/ON27图6)。这与之前关于使用相同序列凸起插入(R)-1-O-(1-芘基甲基)甘油的报道结果也不同。

当两个芘基嵌入剂5被一个碱基对分开时，则所观察到ssON24的受激子带(图6)不会通过形成反向平行双链体而消失(ON24/ON25和ON24/ON27图6)。这种观察与上面对具有TINA的平行三链体和平行双链体的观察相反，也与之前获得的INA的结果相反。^[9b]通过在高嘧啶和混合嘧啶/嘌呤链中都形成具有凸起5作为下一个最接近的邻近者的反向平行双链体(分别为ON12/ON16和ON24/ON25)，出现受激子带说明两个芘基残基被非常近地定位，并且相互联系，并且没有被完全包埋入与邻近Watson-Crick碱基对的堆积相互作用中。这也可以解释通过掺入5作为凸起，反向平行双链体稳定性的降低。

接着我们检测了，如果将两种或者三种染料相互相反地置于它们的互补链之一中，是否能够形成双链体和三链体的受激子带。在ON21/ON6(图5)或反向平行双链体ON20/ON21(图5)和ON23/ON26(图6)中都没有观察到受激子带。这种结果与显示当4-[4-(1-芘基乙炔基)苯基]-1，3-丁二醇在具有混合序列的反向平行dsDNA的互补链中被互相相反定位时的工作相关。只有对于在所有三条链中具有相互相反设置的三个4-(1-芘基乙炔基)苯基部分的三链体，才在500nm处检测到了弱受激子带(ON6/D7，图5)。结论是，定位于平行和反向平行双链体以及平行三链体不同链上的4-(1-芘基乙炔基)苯基部分之间的联系被阻止，这使得与INA发现的相反，不太可能使嵌入剂被链扣(zipping)在一起形成受激子。因此，在双链体中被互相相反定位的INA的两个芘部分的链扣(zipping)已经在NMR结构中被观察到，并且这一双链体结构导致在稳态荧光光谱中通过在343nm处进行激发，在480nm处形成受激子带(未公开的数据)。

Watson-Crick型双链体中两种不同的芘嵌入核酸INA和TINA在荧光光谱和杂交性能方面的区别清楚地说明将额外的1-苯基乙炔基部分加入到(R)-1-O-(1-芘基甲基)甘油(INA)的芳香族部分的结果。根据这项工作，我们也已经显示芘与三链体亲和力差的普通意思不是全面的特征，因为我们已经成功地将芘适当地置于Hoogsteen型三链体中。对dsDNA的稳定性仅有非常小的影响的嵌入剂，其稳定平行三链体结构的能力是已知的。因此，2-(2-萘基)喹啉-4-胺及其类似物的加入导致三链体DNA相当大的稳定化[对于2-(2-萘基)喹啉-4-胺，ΔT_m＝35.6℃]，其对双链体DNA杂交亲和力提高较低(ΔT_m＝5.5℃)。类似的工作报道了寡聚脱氧核苷酸的合成和杂交性能，其中所述寡聚脱氧核苷酸具有二萘嵌苯直接偶联或者通过丙基连接体偶联到2’-脱氧核糖残基的异头位上。具有多环部分的TINA比单体三链体-特异性嵌入剂的优点之一是TINA可以被插入到序列期望的位置多次，而不是在溶液中使用过量的嵌入剂。而且这里所描述的对于TINA，平行三链体和双链体的高稳定化以及反向平行双链体的去稳定化，对于共价附着到寡聚脱氧核苷酸的其它嵌入系统，至今还没有被观察过。在这种情况中，当掺入TINA作为多个凸起插入到寡聚脱氧核苷酸中时，该寡聚脱氧核糖核酸是具有区分dsDNA和ssDNA能力的独特的分子。当将它们的三链体和反向平行双链体的稳定性在pH 6.0和pH 5.0下进行比较(表1)时，从ON13和ON14中可以清楚地看出该特征。这揭示了在检测平行三链体形成时，减少来自双链体形成的假阳性数目的可能性。例如，这种情况可以是在非变性条件下基因组上的荧光原位杂交(FISH)，以及用于使用三链螺旋亲和层析或者三链螺旋亲和沉淀纯化质粒DNA，这些是能够在pH 6.0和pH 5.0下进行的。对平行三链体形成和双链体形成的这种类型的区分不能够使用已知也能够稳定反向平行双链体的形成三链体的寡聚物例如PNA、LNA或N3’-＞P5’氨基磷酸酯达到。

使用Sonogoshira型合成后修饰具有(R)-1-O-(4-碘苯基)甲基甘油的寡聚核苷酸，我们筛选了几种扭转嵌入核酸(TINA)，以获得它们提高Hoogsteen配对的双链体和三链体的热稳定性的能力。在寡聚脱氧核苷酸中插入(R)-1-O-[4-(1-芘基乙炔基)苯基甲基]甘油(5)作为凸起被发现是最有效的TINA，其具有区分匹配和错配的序列的良好性能。与天然双链体相比，通过在该序列的中部插入TINA，可以去稳定化Watson-Crick型DNA/DNA和DNA/RNA双链体。我们相信TINA是第一个共价结合到寡聚脱氧核苷酸上的嵌入体系，其作为凸起表现出对Hoogsteen碱基配对的提高的亲和力，以及对Watson-Crick型螺旋降低的亲和力。亚磷酰胺8的短合成路线，以及对寡聚核苷酸的合成后Sonogashira修饰时TINA与其他稳定三链体的核酸相比有竞争力的优势。通过在一条链上研究双重插入TINA(5)，可以得出结论将3个核酸碱基置于两个凸起的(R)-1-O-[4-(1-芘基乙炔基)苯基甲基]甘油之间对于Hoogsteen DNA螺旋的高热稳定性可以是最佳的。另一方面，通过在嘧啶DNA序列插入5作为下一个最接近的凸起的邻近者，不同的荧光性能(形成受激子带)可以用于检测平行三链体、平行dsDNA和反向平行dsDNA的形成。使用单凸起插入5在12-19℃范围提高热稳定性，可以用于降低所需的TFO长度。而且，在pH 7.0下，可以获得Hoogsteen型双链体和三链体的良好热稳定性，即使序列中存在多个胞嘧啶(在本工作中最高达到36％)。在适当条件下(序列、pH、盐浓度等)，5的多次插入可以用于将较不稳定的Hoogsteen双链体的解链温度提高到相同长度的Watson-Crick双链体的水平。考虑到开发具有对在dsDNA中C-G和T-A转换位点有高亲和力的被修饰核酸碱基以及交替链(alternate-stranded)三链体，我们认为三链体形成的这类改进将扩大TINA的适应性。通过将5插入到环状寡聚脱氧核苷酸的嘧啶链或者向目标ssDNA和ssRNA插入夹子(clamp)而稳定三链体的能力也是显然有可能的。作为下一步，研究致力于插入TINA和INA对不同于经典的Watson-Crick和Hoogsteen复合物的核酸螺旋稳定性的影响。因此，核酸类似物仍然有有限的实用性，其能够稳定反向Hoogsteen碱基配对，i-基序(C-C⁺碱基对)或四链体(富含G的序列)。我们相信，TINA稳定平行三链体和双链体以及区分Hoogsteen和Watson-Crick型核酸螺旋的能力，可以使TINA在设计生物和纳米技术中基于DNA的工具中非常有用，其中特异性的识别、高热稳定性和自组织或重组织是极其重要的。

在Varian Gemini 2000光谱仪上以对于¹H为300MHz，对于¹³C为75MHz记录NMR光谱。在¹H NMR光谱中所使用的内标是对于CDCl₃为TMS(δ：0.00)；在¹³C NMR中为CDCl₃(δ：77.0)。使用4.7 Tesla Ultima Fourier转化(FT)质谱仪(Ion Spec，Irvine，CA)进行精确的离子质谱测定。使用来自2，5-二羟基苯甲酸(2，5-dihydroxybenzoic acid)基质的离子对[M+Na]⁺离子进行峰匹配。使用从Merck购买的TLC板60F₂₅₄进行薄层色谱(TLC)分析，并在UV光(254nm)下进行显影。用于柱层析的硅胶(0.040-0.063mm)是从Merck购买的。用于柱层析的溶剂在使用之前被蒸馏，而试剂是以购买时的状态进行使用的。

实施例2

制备(S)-1-(4，4’-二甲氧基三苯基甲氧基)-3-(4-碘苄氧基)丙-2-醇。

在Dean-Stark条件下，在甲苯(80mL)中，存在KOH(8.8g，154.0mmol)的情况下，将(S)-(+)-2，2-二甲基-1，3-二氧戊环-4-甲醇(6，1.17g，8.9mmol)和4-碘苄基溴(2.5g，8.4mmol)回流12小时。使反应混合物冷却，并加入H₂O(30mL)。在进行相分离后，使用甲苯(2×15mL)将水层进行清洗。使用H₂O(30mL)将组合的有机相进行清洗，并在真空中进行浓缩。使用80％的含水AcOH(25mL)对残余物在室温下处理48小时。在真空中去除溶剂，并使用甲苯/EtOH(30mL，5∶1，v/v)共蒸发两次。在减低的压力下对残余物进行干燥以提供作为微黄色油的(R)-3-(4-碘苄氧基)丙-1，2-醇(7，100％，2.3g)，其在下一步中直接被使用，而不需要进一步纯化。

将该油(2.3g，8.4mmol)溶解在无水吡啶(25mL)中，并在氮气中加入4，4’-二甲氧基三苯甲基氯(3.5g，10.4mmol)。24小时后，加入MeOH(2mL)，即接着加入EtOAc(150mL)，并使用标准含水NaHCO₃(40mL×2)对该混合物进行萃取。使用EtOAc(20mL×2)对水相进行萃取。将组合的有机层进行干燥(Na₂SO₄)、过滤并在减低的压力下蒸发。使用甲苯/EtOH(25mL，1∶1，v/v)共蒸发残余物两次。残余物被从EtOAc(30mL)吸附到硅胶(1.5g)上，并使用石油醚中的EtOAc(0-30％，v/v)干燥柱真空层析进行纯化，以提供作为黄色泡沫的化合物(S)-1-(4，4’-二甲氧基三苯基甲氧基)-3-(4-碘苄氧基)丙-2-醇(70％，3.6g)。¹H NMR(CDCl₃)δ2.42(br.s.，1H，OH)，3.20(m，2H，CH(OH)CH₂OCH₂)，3.56(m，2H，CH₂ODMT)，3.78(s，6H，2×OCH₃)，3.97(m，1H，CHOH)，4.43(s，2H，CH₂Ar)，6.78(d，4H，J＝8.5Hz，DMT)，7.00(d，2H，J＝8.0Hz，碘苯基)，7.30-7.45(m，9H，DMT)，7.63(d，2H，J＝8.0Hz，碘苯基)；¹³C NMR(CDCl₃)55.2(OCH₃)，62.2(CH₂ODMT)，69.9(CH(OH)CH₂OCH₂)，71.6(CHOH)，72.6(CH₂-碘苯基)，86.1[C(Ar)₃]，93.1，129.4，137.4，137.7(碘苯基)，113.1，126.7，127.8，128.1，130.0，135.9，144.7，158.5(DMT)。HR-MALDI-MS计算为C₃₁H₃₁IO₅Na[M+Na]⁺m/z 633.1108，实验结果为m/z633.1116。

实施例3

制备(S)-2-O-[2-氰乙氧基(二异丙基氨基)膦基]-1-O-(4，4’-二甲氧基三苯基甲基)-3-O-(4-碘苄基)甘油(方案2中的化合物8)。

在氮气中将(S)-1-(4，4’-二甲氧基三苯基甲氧基)-3-(4-碘苄氧基)丙--2-醇(2.0g，3.3mmol)溶解在无水CH₂Cl₂(50mL)中。在使用冰水浴进行外部冷却的情况下，加入N，N-四唑二异丙铵(diisopropylammoniumtetrazolide)(0.850g，5.0mmol)，并接着逐滴加入2-氰乙基四异丙基亚磷酰二胺(1.1g，3.7mmol)。在16小时后，分析TLC显示不再有原材料，使用H₂O(30mL)结束反应。使层分离，并使用H₂O(30mL)清洗有机相。使用CH₂Cl₂(25mL)清洗组合的水层。干燥(Na₂SO₄)有机相、过滤，并加入硅胶(1.5g)和吡啶(0.5mL)，在减低的压力下去除溶剂。使用利用NEt₃(0.5％，v/v)/EtOAc(0-25％，)/石油醚的硅胶干燥柱真空层析纯化残余物。将组合的UV-活性馏分进行真空蒸发，这提供了作为泡沫的最终化合物8(1.8g，67％)，其被用于ODN合成。³²P NMR(CDCl₃)δ149.8，149.9，比例为1∶1。HR-ESI-MS计算为C₄₀H₄₆IO₆N₂PLi[M+Li]⁺m/z 817.2449，实验结果为m/z 817.2447。

实施例4

制备(R)-1-O-(4，4’-二甲氧基三苯基甲基)-3-O-[4-(1-芘基乙炔基)苯基甲基]甘油。

向(R)-3-(4-碘苄氧基)丙-1，2-二醇(4.2mmol)的DMF(40mL)溶液中，加入Et₃N(5.8mL)，并将使用氩气吹泡经过溶液30分钟。之后，在氩气下，溶解1-乙炔基芘(1.05g，4.65mmol)，并将CuI(56mg，0.3mmol)和Pd(PPh₃)₄(125mg，0.11mmol)加入到该溶液中。在室温下氩气中搅拌反应混合物过夜，接着加入CH₂Cl₂(150mL)，并使用0.3M EDTA铵盐的水溶液(2×75mL)进行萃取。使用H₂O(3×75mL)对有机层进行清洗，干燥(Na₂SO₄)，过滤并在真空中蒸发至干燥。使用甲苯/EtOH(30mL，1∶1，v/v)对残余物共蒸发两次，这提供了作为油的1-O-[4-(1-芘基乙炔基)苯基甲基]甘油(3.1g)。将该油与吡啶(20mL)进行共蒸发，接着溶解在无水吡啶(50mL)中，并使用冰水浴进行冷却，接着在氩气下加入4，4’-二甲氧基三苯甲基氯(1.45g，4.41mmol)。在室温下搅拌反应混合物16个小时，接着加入额外一部分4，4’-二甲氧基三苯甲基氯(0.5g，1.5mmol)。24小时后，TLC显示不再有原材料，使用MeOH(2mL)停止反应，并使用EtOAc(150mL)进行稀释，使用标准含水NaHCO₃(100mL×2)进行萃取。使用EtOAc(50mL×2)对水相进行萃取。将组合的有机层进行干燥(Na₂SO₄)、过滤，并在减低的压力下进行蒸发。使用甲苯/EtOH(25mL，1∶1，v/v)对残余物共蒸发两次。将残余物从EtOAc(50mL)吸附在硅胶(2.0g)，并使用利用环己烷中的EtOAc(0-100％，v/v)的干燥柱真空层析进行纯化，以获得作为黄色泡沫的(S)-1-O-(4，4’-二甲氧基三苯基甲基)-3-O-[4-(1-芘基乙炔基)苯基甲基]甘油(60％，1.75g)。¹H NMR(CDCl₃)δ2.48(d，1H，J＝5.0Hz，OH)，3.24(m，2H，CH(OH)CH₂OCH₂)，3.31(m，2H，CH₂ODMT)，3.78(s，6H，2×OCH₃)，4.00(m，1H，CHOH)，4.58(s，2H，CH₂Ar)，6.80(d，4H，J＝8.5Hz，DMT)，7.10-7.45(m，11H，DMT)，7.72(d，2H，J＝8.0Hz，苯基)，8.00-8.30(m，9H，芘-1-基)；¹³C NMR(CDCl₃)55.2(OCH₃)，64.3(CH₂ODMT)，70.0(CH(OH)CH₂OCH₂)，71.7(CHOH)，(CH₂-苯基)，86.1[C(Ar)₃]，88.7，94.9(C C)，117.7，127.7，138.5，139.4(苯基)，113.1，124.5-131.8，136.0，144.8，158.5(DMT，芘-1-基)。HR-MALDI-MS：m/z计算为C₄₉H₄₀Na⁺O₅[M+Na]⁺731.2768，实验结果为731.2739。

实施例5

制备(R)-2-O-[2-氰乙氧基(二异丙基氨基)膦基]-1-O-(4，4’-二甲氧基三苯基甲基)-3-O-[4-(1-芘基乙炔基)苯基甲基]甘油。

使用与化合物8相同的步骤，利用(R)-1-O-(4，4’-二甲氧基三苯基甲基)-3-O-[4-(1-芘基乙炔基)苯基甲基]甘油(1.7g，2.4mmol)、N，N-四唑二异丙铵(0.620g，3.6mmol)、2-氰乙基四异丙基亚磷酰二胺(1.150g，3.8mmol)、无水CH₂Cl₂(50mL)进行24小时，制备该化合物。获得了作为泡沫的最终化合物(1.8g，83％)，其被用于ODN合成。³²P NMR(CDCl₃)δ150.3，150.5比例为3∶2。HR-MALDI-MS：m/z计算为C₅₈H₅₇N₂Na⁺O₆P[M+Na]⁺931.3846，实验结果为931.3814。

实施例6

使用合成后的途径合成和纯化TINA。

在来自Applied Biosystems的Expedite^TM核酸合成系统模型(NucleicAcid Synthesis System Model)8909上合成ODN，其使用4，5-二氰基咪唑作为激活剂，以及增加的去保护时间(100秒)和偶联时间(2分钟)，以得到干MeCN/CH₂Cl₂1∶1混合物中的0.075M亚磷酰胺8溶液。合成DNA后，在偶联反应之前，使用氩气(2分钟)对具有CPG-支持物和含有4-碘苯基部分的DMT-on寡聚核苷酸的柱进行冲洗。在干燥条件，室温下，在1mL塑料注射器中准备Sonogashira偶联试剂混合物，其含有在干DMF/Et₃N(3.5/1.5，500μL)中的Pd(PPh₃)₄或Pd(PPh₃)₂Cl₂(7.5mM)、具有末端乙炔基的芳香族结构(22.5mM)以及CuI(7.5mM)。在使用之前，也将注射器使用氩气进行冲洗。将具有Sonogashira偶联试剂混合物的注射器连接到具有CPG的柱上，并从柱的另一侧连接另一个空注射器。使用反应混合物利用注射器将具有CPG支持物的修饰的寡聚核苷酸清洗多次。每45分钟后，重复最后的操作。3～4小时后，将反应混合物从支持物去除，并使用DMF(2×0.5mL)和CH₃CN(2×1mL)对柱进行清洗，并干燥。在ON12-ON14、ON21和ON24的情况中，使用新制的Sonogashira偶联反应混合物对CPG支持物处理一次或者多次。之后，使用32％的氨水将5’-DMT-on寡聚核苷酸从固体支持物上断裂(室温，2小时)并去保护(55℃，过夜)。使用反向半制备HPLC在Waters Xterra^TM MS C₁₈柱上完成纯化5’-O-DMT-on TINA。将ODN在100μL10％的醋酸水溶液(30min)进行DMT去保护，并在32％的氨水(1mL)进行稀释，并在HPLC上再次纯化。将具有ODN的响应馏分进行蒸发，使用1M含水NaOAc(150μL)进行稀释，并从乙醇(550μL)中沉淀ODN。通过MALDI-TOF分析在来自PerSeptive Biosystems的Voyager Elite活组织分光度测量术研究站(Biospectrometry Research Station)上确认被修饰的ODN。使用来自Merck Hitachi的LaChrom系统在GenPak-Fax柱(Waters)上，通过离子交换层析检测最终TFO的纯度。

实施例7

使用(R)-2-O-[2-氰乙氧基(二异丙基氨基)膦基]-1-O-(4，4’-二甲氧基三苯基甲基)-3-O-[4-(1-芘基乙炔基)苯基甲基]甘油合成和纯化TINA。

在来自Applied Biosystems的Expedite^TM核酸合成系统模型(NucleicAcid Synthesis System Model)8909上合成ODN，其使用4，5-二氰基咪唑作为激活剂，以及增加的去保护时间(100秒)和偶联时间(2分钟)，以得到干MeCN/CH₂Cl₂1∶1混合物中的所述0.075M亚磷酰胺溶液。在完成DNA合成后，使用32％的氨水，将5’-DMT-on寡聚核苷酸从固体支持物上断裂(室温，2小时)并去保护(55℃，过夜)。使用反向半制备HPLC在Waters Xterra^TMMS C₁₈柱上完成纯化5’O-DMT-on TINA。将ODN在100μL 80％的醋酸水溶液(30min)进行DMT去保护，并在1M的NaOAc水溶液(150μL)中进行稀释，并在乙醇(550μL)中沉淀。通过MALDI-TOF分析在来自PerSeptive Biosystems的Voyager Elite Biospectrometry Research Station上确认被修饰的ODN。使用来自Merck Hitachi的LaChrom系统在GenPak-Fax柱(Waters)上，通过离子交换层析检测最终TFO的纯度。

实施例8检测解链温度

在Perkin-Elmer UV/VIS光谱仪Lambda 35上进行解链温度的检测，其被安装有PTP-6温度程序仪(programmer)。形成所述三链体，通过首先在相应的缓冲液溶液中混合Watson-Crick双链体的两条链，每条链的浓度都是1.0μM。将溶液加热到80℃5分钟，冷却到室温，并加入第3链(TFO)，接着保持在15℃30分钟。在相应的缓冲液溶液中混合两条链，每条链的浓度都是1.0μM，接着加热到70℃5分钟，然后冷却到室温，形成所述双链体。根据通过检测260nm处的吸光度针对渐增温度(每1分钟1.0℃)获得的解链曲线的一阶导数图的最大值，确定解链温度(T_m，℃)。较慢速度升高温度的(每1分钟0.5℃)获得了相同的曲线。还在373nm处进行实验。根据重复实验所确定的，所有的解链温度都在±1.0℃的偏差之内。

实施例9

荧光检测

荧光检测是在Perkin-Elmer荧光光谱仪LS-55上进行的，其被装配Julabo F25温度控制仪。以与T_m检测中相同的方式形成三链体和双链体，除了在所有的情况中仅使用1.0μM TFO。在20mM卡可基酸钠、100mM NaCl、10mM MgCl₂，pH 6.0的缓冲液中10℃下记录光谱。

实施例10

对所合成寡聚核苷酸的MALDI-TOF MS、反向(DMT-on)和离子交换(DMT-off)HPLC分析

寡聚核苷酸  m/z [M+H]⁺，    m/z [M+H]⁺，    RP-HPLC，     R_t IE-HPLC，

            计算值(Da)      实验结果(Da)    (分钟)^[a]     纯度^[d]

ON2         4490.8          4489.2          15.1          90％

ON3         4489.1          4488.9          15.2/38.1^[b]  90％

ON4         4541.1          4541.6          16.2          95％

ON5         4516.0          4518.2          15.8          95％

ON6         4589.2          4589.2          16.0          96％

ON7         4589.2          4593.0          16.1          93％

ON8         4589.2          4588.2          16.1          95％

ON9         4589.2          4588.2          16.3          97％

ON10        4589.2          4589.2          18.7          91％

ON11        5054.6          5058.9          18.6          94％

ON12        5054.6          5060.1          17.4/32.9^[c]  93％

ON13        5054.6          5058.0          17.1          97％

ON14        5054.6          5058.2          17.0          93％

ON20        5510.8          5513.1          16.2          95％

ON21        5802.4          5799.7          27.2^[c]       86％

ON23        4081.8          4083.1          16.2          88％

ON24        4549.3          4551.2          17.4          91％

ON26        4143.8          4143.9          15.8          85％

[a]Waters Delta Prep 4000制备型层析系统。缓冲液A[950mL 0.1MNH₄HCO₃和50mL CH₃CN，(pH＝9.0)]以及缓冲液B[250mL 0.1NH₄HCO₃和750mL CH₃CN，(pH＝9.0)]。流速2.5mL/min。梯度：4分钟100％A，11分钟内线性梯度到100％B，5分钟内100％B，接着在2分钟内线性梯度到100％A，以及3分钟内100％A；[b]Waters Delta Prep 4000制备型层析系统，与^[a]的缓冲液相同。流速1.0mL/分钟。梯度：5分钟100％A，30分钟内线性梯度到70％B，在70％B2分钟，8分钟内到达100％B，接着在15分钟内到达100％A；[c]Waters Delta Prep 700半制备型层析系统。缓冲液A[H₂O中0.05M三乙基醋酸铵(pH＝7.0)]和缓冲液B(H₂O中75％CH₃CN)。流速2.5mL/min。梯度：2分钟100％A，38分钟内线性梯度到达70％B，7分钟内线性梯度到达100％B，100％B 3分钟，接着10分钟内100％A；[d]在GenPak-Fax柱上(Waters)的来自Merck Hitachi的LaChrom系统。缓冲液A[H₂O中25mM Tris·HCl、10mM EDTA(pH＝8.0)]以及缓冲液B(H₂O中1M NaCl)。流速0.75mL/分钟。梯度：5分钟97％A和3％B，41分钟内线性梯度到达35％B，3分钟内到达75％B，接着10分钟内97％A和3％B。

序列表

<110>University of Southern Denmark

Filichev，Vyacheslav V.

Erik，Bjerregaard Nielsen

<120>使用扭转嵌入核酸(TINA)稳定并选择性地形成Hoogsteen型三链体和双链体以及制

备TINA的工艺

<130>PIDK0712218

<160>29

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>14

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>合成的寡聚核苷酸

<400>1

cccctttctt tttt                                                        14

<210>2

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<212>DNA

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<223>合成的寡聚核苷酸

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<222>(7)..(7)

<223>嵌入剂1

<400>2

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<223>合成的寡聚核苷酸

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ccccttntct ttttt                                                       15

<210>4

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<223>合成的寡聚核苷酸

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<223>合成的寡聚核苷酸

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<223>嵌入剂4

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ccccttntct ttttt                                                       15

<210>6

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<212>DNA

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<223>合成的寡聚核苷酸

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<223>嵌入剂5

<400>6

ccccttntct ttttt                                                       15

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<223>合成的寡聚核苷酸

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<223>合成的寡聚核苷酸

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<223>合成的寡聚核苷酸

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cccctnttnc tttttt                                                      16

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gacggggaaa gaaaaaa                                                     17

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ggggaaagaa aaaa                                                        14

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<223>合成的寡聚核苷酸

<400>17

gacggggaat gaaaaaa                                                     17

<210>18

<211>17

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>合成的寡聚核苷酸

<400>18

gacggggaag gaaaaaa                                                     17

<210>19

<211>17

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>合成的寡聚核苷酸

<400>19

gacggggaac gaaaaaa                                                     17

<210>20

<211>18

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>合成的寡聚核苷酸

<220>

<221>misc_feature

<222>(9)..(9)

<223>嵌入剂5

<400>20

ttttttctnt tccccgtc                                                    18

<210>21

<211>18

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>合成的寡聚核苷酸

<220>

<221>misc_feature

<222>(10)..(10)

<223>嵌入剂5

<400>21

gacggggaan agaaaaaa                                                    18

<210>22

<211>12

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>合成的寡聚核苷酸

<400>22

ctcaagcaag ct                                                          12

<210>23

<211>13

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>合成的寡聚核苷酸

<220>

<221>misc_feature

<222>(7)..(7)

<223>嵌入剂5

<400>23

ctcaagncaa gct                                                         13

<210>24

<211>14

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>合成的寡聚核苷酸

<220>

<221>misc_feature

<222>(6)..(6)

<223>嵌入剂5

<220>

<221>misc_feature

<222>(8)..(8)

<223>嵌入剂5

<400>24

ctcaangnca agct                                                        14

<210>25

<211>12

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>合成的寡聚核苷酸

<400>25

agcttgcttg ag                                                          12

<210>26

<211>13

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>合成的寡聚核苷酸

<220>

<221>misc_feature

<222>(7)..(7)

<223>嵌入剂5

<400>26

agcttgnctt gag                                                         13

<210>27

<211>12

<212>RNA

<213>人工

<220>

<223>合成的寡聚核苷酸

<400>27

agcuugcuug ag                                                          12

<210>28

<211>17

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>合成的寡聚核苷酸

<400>28

gacggggaaa gaaaaaa                                                     17

<210>29

<211>17

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>合成的寡聚核苷酸

<400>29

ctgccccttt ctttttt                                                     17