胶原蛋白人造产品、胶原蛋白溶液制备方法及从动物组织中分离胶原蛋白的方法

摘要

本发明公开了不同动物组织中分离胶原蛋白的方法，制备胶原蛋白溶液的方法及胶原蛋白的人造产品。为了这个目的，本发明提供了一种从动物组织制备胶原蛋白溶液的方法，包括胶原蛋白的最终处理：在中性、低温条件下处理就有预定浓度的胶原蛋白溶液，然后在30至35℃过夜处理；离心收集胶原蛋白；将收集到的胶原蛋白溶解于弱酸溶剂或者磷酸缓冲盐溶液(PBS)，从而制备浓度为1至5mg/mL的胶原蛋白溶液。本发明由上述组成，可以实现从动物骨和软骨组织、皮肤组织和腱/韧带组织有效分离胶原蛋白的方法，从上述分离组织制备胶原蛋白溶液的方法，利用上述胶原蛋白制备基质和高度浓缩胶原蛋白溶液。

说明书

技术领域

本发明涉及从不同动物组织中分离胶原蛋白的方法，制备胶原蛋白溶液的方法及胶原蛋白的人造产品。本发明尤其涉及一种从动物骨骼、软骨组织、皮肤组织及腱/韧带组织有效分离胶原蛋白的方法，一种利用上述分离组织制备胶原蛋白溶液、胶原蛋白基质及高度浓缩胶原蛋白溶液的方法。

背景技术

通常，胶原蛋白是一种构成动物骨骼、软骨、牙齿、腱、皮肤及鱼鳞的硬质蛋白。胶原蛋白是一种纤维样的固体，在电子显微镜下观察，呈现为缠结的具有交叉条纹的周期结构。

胶原蛋白是一种结构蛋白，常常存在于各种哺乳动物中，其构成了机体所有蛋白总重量的30％。目前，已知的胶原蛋白有20种，其中I型胶原蛋白是最大量的。胶原蛋白是由分子量大约为300kDa的单体蛋白通过特定位点的共价键横向连接而成的。因此，成熟的胶原蛋白呈现为一种典型的纤维样形状，不溶于水，具有高拉伸强度。胶原蛋白由组成型氨基酸构成，例如，甘氨酸、脯氨酸、羟基脯氨酸、丙氨酸及谷氨酸，其显著特征是羟基脯氨酸含量高，这在其它形式的蛋白中是不常见的。

其中，胶原蛋白具有一种结构，三个多肽链通过氢键围绕另一个多肽链呈螺旋状扭转。胶原蛋白在水、弱酸和弱碱中不降解，但是胶原蛋白煮沸后导致其变成单链结构的明胶，是可溶的。与明胶不同，胶原蛋白不需加热即有一定的粘度，因此其易于凝胶化。另外，由于胶原蛋白的分子量比明胶大，胶原蛋白更适合生物组织并且具有高生物活性。因此，当用胶原蛋白处理伤口时，与明胶促进组织再生相比，胶原蛋白更易促进愈合过程。另外，即使胶原蛋白变硬，其还是具有高柔韧性，并且在短时间内快速横向连接，这致使减少凝胶化时间。胶原蛋白对蛋白水解酶不敏感，例如胰蛋白酶、胃蛋白酶、无花果蛋白酶、木瓜蛋白酶和弹性蛋白酶，但是其易被胶原酶降解。从组织中分离胶原蛋白包括有机溶剂萃取，酸/碱处理，蛋白水解酶作用，例如胰蛋白酶、胃蛋白酶、无花果蛋白酶、木瓜蛋白酶和弹性蛋白酶，得到胶原蛋白。

另外，为了体内应用，如上获得的胶原蛋白溶解于生物无毒溶剂，例如水、生理盐水、硼酸盐缓冲液，或者含盐水溶液，例如氯化钠、蛋白质、糖和脂肪。

目前，许多提高胶原蛋白分离效率的方法正在研究中。为了保证足够的医疗用途用胶原蛋白，需要大量的原材料，也需要胶原蛋白分离方法的重大改进。

尤其，胶原蛋白不仅在提高血小板浓度和聚集血小板方面有一定作用，而且可以通过改变血小板的形状和生物化学结构来激活血小板，因此胶原蛋白可以广泛地被应用于止血剂。

自从十九世纪五十年代以来，已有大量分离胶原蛋白的方法，但是分离非变性形式的纯胶原蛋白是十分困难的。因此，为了在不同领域应用胶原蛋白，发展从不同组织中分离胶原蛋白并获得大量胶原蛋白的方法是必要的。

然而，现在已知的分离胶原蛋白的方法是从哺乳动物(鼠、牛、猪及类似物)的皮肤或腱中分离胶原蛋白。不幸的是还没有能从骨组织中分离胶原的方法。

发明内容

本发明鉴于上述问题，第一个目的是提供一种从动物不同组织中分离及利用胶原蛋白的方法。

为了这个目的，本发明的第二个目的是提供一种从动物骨及软骨组织、皮肤组织和腱/肌肉组织中有效分离胶原蛋白的方法。

本发明的第三个目的是提供一种从上述分离组织中制备胶原蛋白溶液的方法。

本发明的第四个目的在于提供一种利用上述胶原蛋白溶液制备胶原蛋白基质和高度浓缩胶原蛋白溶液的方法。

本发明的第五个目的在于提供一种从各种动物组织中分离胶原蛋白的方法，一种制备胶原蛋白溶液及人造产品的方法，通过显著地提高产品质量和可靠性来提高消费者的满意度。

上述其它目的与本发明的一个方面一致，通过提供用动物不同组织制备胶原蛋白溶液的方法来实现，包括在最终处理胶原蛋白后将具有预定浓度的胶原蛋白溶液置于低温中性条件，然后30-35℃过夜处理；离心收集胶原蛋白；将上述收集的胶原蛋白溶解于冷弱酸溶剂或者磷酸缓冲盐溶液(PBS)，胶原蛋白的浓度为1至5mg/mL。

为达到上述目的，本发明的首选方式将配合附图作详细描述。

本发明应用的一种从动物不同组织分离胶原蛋白的方法，一种制备胶原蛋白溶液及人工制品的方法，参见图1至图4。

与本发明以下的描述相关，考虑到与本发明相关的已知功能或结构的描述可能会使本发明不清楚，其中的详细描述会被省略掉。

下文提到的术语是考虑到本发明的功能而确定的，可能与厂商的意图或者相关领域的普通实践不同。因此，这里用到的术语是根据本发明的说明书内容定义的。

本发明提供可一种改进的从不同组织中有效分离胶原蛋白的方法，尤其是从骨组织中分离胶原蛋白的方法，及分离的胶原蛋白的应用方法。

这里使用的术语“分离的胶原蛋白”是指胶原蛋白经处理后去除了强抗原性肽，用酸或酶从不同动物中提取来的，例如胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、木瓜蛋白酶和无花果蛋白酶。

本发明所述的胶原蛋白在4-10℃，酸性条件下可溶，但是在30-37℃，中性条件下不可溶解。另外，当预定浓度的胶原蛋白在30-37℃时，将PH值由酸性调至中性，本发明所述的胶原蛋白呈凝胶形式。给胶原蛋白一个刺激导致其由凝胶形式转变为不可溶的纤维样形式。

在本方法适合的温度和PH条件下，在4℃，中性条件下滴定胶原蛋白，在预定的时间段内，甚至是中性条件下，可以保持特定的溶液状态。

另外，利用胶原蛋白在不同PH值、温度、盐浓度和乙醇沉淀条件下的优点分离胶原蛋白。

进一步，本发明利用胶原蛋白置于30-37℃，中性条件下一段时间可发生分层分离的特点聚集胶原蛋白，离心使胶原蛋白沉淀。

如下文讨论，胶原蛋白可以提高血小板浓度，引起血小板凝集，通过改变血小板形状和生物化学结构来激活血小板。因此胶原蛋白可以被广泛应用于止血剂。

胶原蛋白的粘度与PH相关，在pH5.0至6.0粘度最高。

为此，本发明所述的胶原蛋白经过最终处理，胶原蛋白溶液具有一个预定的浓度，先在低温、中性条件下处理，然后30-35℃振荡过夜处理。过夜处理后，离心收集胶原蛋白，浓缩的胶原蛋白溶解在弱酸溶剂或者磷酸缓冲盐溶液(PBS)，冷藏，制备胶原蛋白浓度为1-5mg/mL的胶原蛋白溶液。

本发明所述的胶原蛋白可被应用于制备基质和高度浓缩溶液。

如图3所示，基质的制备是将过滤纯空气注入到适合浓度和PH值的胶原蛋白中，形成预定气孔，冻干，干热干燥。

胶原蛋白基质是由浓度为3-5mg/mL的胶原蛋白溶液制备的。特别地，过滤纯空气被注入至PH为5.0-6.0的胶原蛋白溶液中，因此形成预定的气孔。然后将形成气孔的胶原蛋白溶液冻干处理，热处理包装，环氧乙烷气体或γ-射线照射灭菌，形成胶原蛋白基质。基质根据模子的形状可以被制成各种形式。上述制备的基质可以用作止血剂，支持物及类似物，不同形式的胶原蛋白止血剂及支持物通常可以在市场上购买到。进一步，胶原蛋白基质还可以包括其它成分，例如纤维蛋白原、凝血酶，用来提高胶原蛋白作为止血剂的作用。所述胶原蛋白基质还可以用在附着有止血剂的绑带上。

为了利用高度浓缩胶原蛋白，参见图4，本发明通过用孔径为的0.22μm的滤器过滤灭菌浓度为1mg/mL的胶原蛋白溶液，然后浓缩灭菌胶原蛋白至胶原蛋白浓度为3-7％，制备胶原蛋白溶液。高度浓缩胶原蛋白溶液可以作为皮肤去皱填充物，作为相关产品还可以购买到。另外，在伤口和被损坏区域喷洒含有抗生物质或者生长因子的高度浓缩胶原蛋白溶液，可以促进创伤和损坏区域组织再生。

附图说明

图1是本发明制备的胶原蛋白SDS-PAGE电泳分离结果照片；

图2是利用图象分析仪分析本发明制备的胶原蛋白结果曲线图及照片；

图3是利用本发明的胶原蛋白制造的基质产品照片；

图4是利用本发明胶原蛋白制造的高度浓缩胶原蛋白溶液照片。

具体实施方式

现在，参考如下实施例，对本发明做进一步详细描述。这些实施例仅用于解释本发明，不限制本发明的范围和精神。

实施例1

将猪骨组织粉碎成粒径为1-500μm的粉末，用0.5N HCl处理。经酸处理的骨组织用胃蛋白酶重复处理2至5次，共计3至7天，分离I型胶原蛋白，I型胶原蛋白用盐处理进行分级分离和乙醇处理，从而获得重量为原始组织重量5-10％的胶原蛋白。特别地，本程序如下做进一步详细描述：

1.分离的猪骨组织经蒸馏水、乙醇、丙酮及类似物充分洗涤。

2.骨组织切成圆环形状，-20℃保存。

3.为了从骨组织中分离胶原蛋白，骨组织制成粒径为1-500μm的粉末。

4.研磨成粉末的骨组织用乙醇和蒸馏水洗涤。

5.上述洗涤过的骨粉末用0.5N HCl过夜处理，10-100rpm振荡。

6.过夜处理后，骨粉末用胃蛋白酶处理，组织和胃蛋白酶的比例是10-50∶1，胃蛋白酶用前溶在0.1N HCl中。

7.胃蛋白酶处理2-5次，共计3-7天。

8.胃蛋白酶处理过的骨粉末溶液4℃，12,000g离心30分钟，分离并保存上清，沉淀重复步骤7。

9.用终浓度为0.5至0.8M的NaCl处理上述分离并保存的上清，4℃，4小时至1天。

10.12,000g，4℃离心30分钟，弃沉淀，收集上清。

11.上清在中性条件下滴定至NaCl终浓度为1.6M。

12.上述溶液4℃处理4小时至1天，离心，弃沉淀，收集上清。

13.向收集到的上清中加入NaCl，至NaCl终浓度为2.6M，4℃静置4小时至1天。

14.离心，弃上清，所得沉淀用95％乙醇洗涤一至两次，蒸馏水重悬。

15.在重悬溶液中加入1N HCl，每100mL悬浮液加1mL1N HCl，4℃中性条件下滴加。

16.上述滴定溶液30-37℃静置4小时至1天，离心。

17.沉淀下来的胶原蛋白用弱酸溶剂或PBS重悬，浓度为1-30mg/mL，4℃保藏。

实施例2

将猪软骨组织粉碎为粉末，用0.5N HCl处理。经酸处理的软骨组织用胃蛋白酶重复处理，分离II型胶原蛋白，II型胶原蛋白用盐处理进行分级分离和乙醇处理，从而获得重量为原始组织重量5％-10％的胶原蛋白。特别地，本程序如下做进一步详细描述：

1.分离的猪软骨组织经蒸馏水、乙醇、丙酮及类似物充分洗涤。

2.为了从软骨组织中分离胶原蛋白，软骨组织制成粒径为1-500μm的粉末。

3.研磨成粉末的软骨组织用乙醇和蒸馏水洗涤。

4.上述洗涤过的软骨粉末用盐酸胍溶液(4M盐酸胍，0.05MTris-HCl，pH 7.5)过夜处理。

5.过夜处理的软骨粉末用0.1N HCl洗涤一至两次。

6.软骨粉末用0.5N HCl过夜处理，10至100rpm振荡。

7.过夜处理后，软骨粉末用胃蛋白酶处理，组织和胃蛋白酶的比例是10-50∶1，胃蛋白酶用前溶在0.1N HCl中。

8.胃蛋白酶处理2-5次，共计3-7天。

9.胃蛋白酶处理过的软骨粉末溶液4℃，12,000g离心30分钟，分离并保存上清，沉淀重复步骤8。

10.用终浓度为0.5-0.8M的NaCl处理上述分离并保存的上清，4℃，4小时至1天。

11.12,000g，4℃离心30分钟，弃沉淀，收集上清。

12.上清在中性条件下滴定至NaCl终浓度为2.6M。

13.上述溶液4℃处理4小时至1天，离心，弃沉淀，收集上清。

14.向收集到的上清中加入NaCl，至NaCl终浓度为3.5-4.0M，4℃静置4小时至1天。

15.离心，弃上清，所得沉淀用95％乙醇洗涤一至两次，蒸馏水重悬。

16.在重悬溶液中加入1N HCl，每100mL悬浮液加1mL1N HCl，4℃中性条件下滴加。

17.上述滴定溶液30-37℃静置4小时至1天，离心。

18.沉淀下来的胶原蛋白用弱酸溶剂或PBS重悬，浓度为1-30mg/mL，4℃保藏。

实施例3

将猪皮肤组织制成厚度为500μm-5mm的片，置于网格尺寸为200-500μm的网中，用0.5N HCl处理。经酸处理的软骨组织用胃蛋白酶重复处理，分离I型胶原蛋白，I型胶原蛋白用盐处理进行分级分离和乙醇处理，从而获得重量为原始组织重量10％-15％的胶原蛋白。特别地，本程序如下做进一步详细描述：

1.分离的猪皮肤组织经蒸馏水、乙醇及类似物充分洗涤，-20℃保藏。

2.为了从皮肤组织中分离胶原蛋白，皮肤组织制成厚度为500μm-5mm的片状。

3.片状组织至于网格尺寸为200-500μm的网中，用乙醇和蒸馏水洗涤。

4.洗涤过的组织片用胃蛋白酶(组织和胃蛋白酶的比例是10-50∶1，胃蛋白酶用前溶在0.1N HCl中)处理。

5.胃蛋白酶重复处理2-3次，共计2-3天。

6.胃蛋白酶处理过的皮肤组织溶液，4℃，12,000g离心30分钟，分离并保存上清，沉淀重复步骤5。

7.用终浓度为0.5至0.8M的NaCl处理分离并保存的上清，4℃，4小时至1天。

8.12,000g，4℃离心30分钟，弃沉淀，收集上清。

9.上清在中性条件下滴定至NaCl终浓度为1.6M。

10.上述溶液4℃处理4小时至1天，离心，弃沉淀，收集上清。

11.向收集到的上清中加入NaCl，至NaCl终浓度为2.6M，4℃静置4小时至1天。

12.离心，弃上清，所得沉淀用95％乙醇洗涤一至两次，蒸馏水重悬。

13.在重悬溶液中加入1N HCl，每100mL悬浮液加1mL1N HCl，4℃中性条件下滴加。

14.上述滴定溶液30-37℃静置4小时至1天，离心。

15.沉淀下来的胶原蛋白用弱酸溶剂或PBS重悬，浓度为1-30mg/mL，4℃保藏。

实施例4

将猪腱/韧带组织制成厚度为500μm-5mm的片，用胃蛋白酶处理，分离I型胶原蛋白，I型胶原蛋白用盐处理进行分级分离和乙醇处理，从而获得重量为原始组织重量10％-20％的胶原蛋白。特别地，本程序如下做进一步详细描述：

1.分离的猪腱/韧带组织经蒸馏水、乙醇及类似物充分洗涤，-20℃保藏。

2.为了从腱/韧带组织中分离胶原蛋白，腱/韧带组织制成厚度为500μm-5mm的片状。

3.用乙醇和蒸馏水洗涤组织片。

4.洗涤过的组织片用胃蛋白酶处理，组织和胃蛋白酶的比例是10-50∶1，胃蛋白酶用前溶在0.1N HCl中。

5.胃蛋白酶重复处理2-3次，共计2-3天。

6.胃蛋白酶处理过的腱/韧带组织溶液，4℃，12,000g离心30分钟，分离并保存上清，沉淀重复步骤5。

7.用终浓度为0.5-0.8M的NaCl处理上述分离并保存的上清，4℃，4小时至1天。

8.12,000g，4℃离心30分钟，弃沉淀，收集上清。

9.上清在中性条件下滴定至NaCl终浓度为1.6M。

10.上述溶液4℃处理4小时至1天，离心，弃沉淀，收集上清。

11.向收集到的上清中加入NaCl，至NaCl终浓度为2.6M，4℃静置4小时至1天。

12.离心，弃上清，所得沉淀用95％乙醇洗涤一至两次，蒸馏水重悬。

13.在重悬溶液中加入1N HCl，每100mL悬浮液加1mL1N HCl，4℃中性条件下滴加。

14.上述滴定溶液30-37℃静置4小时至1天，离心。

15.沉淀下来的胶原蛋白用弱酸溶剂或PBS重悬，浓度为1-30mg/mL，4℃保藏。

实施例1-4提到的效果通过SDS-PAGE分析结果可以得到证实，参见图1所示，相关条带分子量分别是大约140kDa和130kDa。

另外，图2所示的胶原蛋白图象分析结果证实了I型胶原蛋白的特性，例如α1∶α2是2∶1，此为实验结果的评估。图3展示了利用本发明所得的胶原蛋白制备的人造基质产品。图4展示了利用本发明的胶原蛋白制备的人造高度浓缩胶原蛋白溶液。

从以上描述可见本发明可以从动物不同组织中分离并利用胶原蛋白。为了这个目的，本发明提供了一种从动物骨、软骨组织、皮肤和腱/韧带组织有效分离胶原蛋白的方法，一种利用上述分离组织制备胶原蛋白溶液的方法，一种利用胶原蛋白溶液制备基质和高度浓缩溶液的方法。因此，本发明实现了产品的高质量和可靠性，有助于提高消费者的满意度。

尽管本发明的较佳实施例揭示了目的，然而对本技术的修改、增加和代替是允许的，并没有避开本发明的权利范围和精神。