产生形成具有高固氮活性根瘤的植物的方法

摘要

本发明涉及一种产生能形成具有增强的固氮活性的根瘤的结瘤植物的方法，包括在结瘤植物中使非共生珠蛋白基因过表达。

说明书

技术领域

本发明涉及一种产生形成具有固氮活性根瘤的结瘤植物的方法。

背景技术

诸如大豆(Glycine max)、赤豆(Phaseolus angularis)以及菜豆(Phaseolus vulgaris)的豆科作物通过感染根瘤菌形成根瘤(结瘤)，其是共生器官。在这种根瘤中的共生根瘤菌的类菌体固定大气氮，使得即使在土壤低含氮量的情况下植物也能生长得很好。因此，当栽培豆科作物时，除施加常规肥料之外常用预培养的根瘤菌处理作物种子。为进一步增强豆科作物根瘤的固氮能力，已开发了具有增强的固氮能力的根瘤菌(JP 2003-33174 A)。

除豆科作物之外，人们知道共生固氮细菌能侵入诸如金合欢属(Acacia)和合欢(Albizia julibrissin)的豆科树木以及诸如日本桤木(Alnusjaponica)和夜叉桤木(Alnus firma)的非豆科树木的根部并在其中增殖，形成根瘤，有效地固定大气氮，从而提供氮给宿主树木。这些结瘤树木在其活的树叶中具有高氮浓度，因而在落叶中具有高氮浓度。因此，结瘤树木能有效地增加土壤中微生物水平并改善土壤品质，使得土壤肥沃。因此，这样的树木也作为所谓的改善土壤树木用于绿化荒地。

不仅在农业方面，而且在环境保护方面，增强这样的植物的根瘤的固氮能力都被认为是非常有用的。

其间，人们知道在豆科植物根瘤细胞中，只存在于豆科植物中的共生珠蛋白基因表达非常强。共生血红蛋白(也称为豆血红蛋白)由作为上述共生珠蛋白基因的基因产物的珠蛋白和血红素组成，据称占根瘤中所有可溶性蛋白的20％-30％。但是在根瘤之外的组织中共生血红蛋白却是完全不存在的。如同动物血液中的血红蛋白一样，共生血红蛋白对氧等具有强亲和力。人们认为共生血红蛋白在根瘤细胞中起调节氧分压至足以满足根瘤中根瘤菌呼吸的水平并阻止固氮酶失活的作用，因为固氮酶是根瘤菌固氮能力所需要的，但能通过氧被失活。

随着近来基因分析技术的发展，已揭示了除豆科植物之外的植物也具有珠蛋白基因。在除豆科植物之外的植物中所发现这样的珠蛋白基因与豆科植物的共生珠蛋白基因不同。因此，已将这样的珠蛋白基因称为“非共生珠蛋白基因”(也称为非共生血红蛋白基因)。人们普遍相信所有的植物都具有非共生珠蛋白基因。换句话说，豆科植物具有共生珠蛋白基因和非共生珠蛋白基因，但非豆科植物则仅具有非共生珠蛋白基因。已报道了属于豆科的模式植物百脉根(Lotus japonicus)的非共生珠蛋白基因(Uchiumi等，Plant Cell Physiol.(2002)43(11)：pp.1351-1358)。

不象共生珠蛋白基因，人们知道非共生珠蛋白基因在所有植物组织中表达。已报道了当植物暴露于低温(4℃)或低氧分压(5％或更低的氧浓度)下，其非共生珠蛋白基因的表达水平增加。还已报道了在非共生珠蛋白基因已导入且过表达的拟南芥(Arabidopsis thaliana)中抗低氧胁迫的抗性得到增强(Hunt，P.W.，等，Proc.Natl.Acad.Sci.(2002)U.S.A.99：pp.17197-17202)。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种产生形成具有增强的固氮活性的根瘤的结瘤植物的方法，以及一种显示其根瘤高固氮活性的结瘤植物。

作为对获得上述目的深入研究的结果，本发明人已发现已导入并过表达百脉根非共生珠蛋白基因的百脉根，以及已导入并过表达夜叉桤木非共生珠蛋白基因的百脉根能形成具有高固氮活性的根瘤。本发明人基于这样的研究结果完成了本发明。

本发明包括如下。

[1]一种产生能形成具有增强的固氮活性的根瘤的结瘤植物的方法，包括在结瘤植物中使非共生珠蛋白基因过表达。

更优选地，该方法中的非共生珠蛋白基因包含选自下列(a)-(e)的DNA：

(a)包含SEQ ID NO：1或8所示核苷酸序列的DNA；

(b)在严格条件下与包含和SEQ ID NO：1或8所示核苷酸序列互补的核苷酸序列的DNA杂交、并编码具有非共生珠蛋白活性的蛋白的DNA；

(c)编码包含SEQ ID NO：2或9所示氨基酸序列的蛋白的DNA；

(d)编码包含下述氨基酸序列、并具有非共生珠蛋白活性的蛋白的DNA，所述的氨基酸序列是在SEQ ID NO：2或9所示氨基酸序列的基础上通过缺失、取代或添加1-50个氨基酸所衍生的氨基酸序列；和

(e)包含SEQ ID NO：3或10所示核苷酸序列的DNA。

在该方法中，优选地，通过将与过表达启动子连接的非共生珠蛋白基因导入结瘤植物中，使该非共生珠蛋白基因过表达。

根据该方法，优选地，可产生能形成具有至少大于野生型品系3倍的增强的固氮活性的根瘤的结瘤植物。根据该方法产生的这样的结瘤植物能形成具有增强的固氮活性的根瘤，优选显示10nM/min/g-100nM/min/g的固氮活性的根瘤。

在该方法中，其中使非共生珠蛋白基因过表达的结瘤植物优选为豆科植物。更优选地，根据该方法，进一步用共生固氮细菌接种具有过表达非共生珠蛋白基因的结瘤植物。

[2]根据上述[1]的方法产生的结瘤植物，其中结瘤植物能形成具有增强的固氮活性的根瘤。这样的结瘤植物更优选在其根上具有根瘤。

[3]一种用于增强根瘤固氮活性的载体，包含与过表达启动子连接的非共生珠蛋白基因。

待包含于该载体中的非共生珠蛋白基因优选来源于豆科植物或非豆科结瘤植物。该非共生珠蛋白基因更优选包含描述于上述[1]的(a)-(e)中的DNA。

[4]一种在植物栽培上增加固氮效率的方法，包括栽培上述[2]的结瘤植物。

根据本发明产生结瘤植物的方法，目的结瘤植物的根瘤的固氮活性可明显改善。当其用于上述产生方法中时，用于增强根瘤固氮活性的本发明的载体能有助于明显增强根瘤的固氮活性。此外，根据本发明可获得的结瘤植物能形成具有高固氮活性的根瘤，导致促进植物生长并增加含氮量。本发明还涉及一种通过栽培结瘤植物在植物栽培上增加固氮水平的方法，并且该方法有可能不仅在给定的环境中增加要从大气中固定的氮的量以及在这样的环境下增加相关结瘤植物的产量或生长量，而且还能增加土壤中氮的量并因此肥土。

本说明书包括了本申请要求优先权的日本专利申请号2005-071677的说明书和附图的公开内容。

附图简述

图1显示了百脉根非共生珠蛋白基因的基因组结构和氨基酸序列。

图2显示了野生型百脉根中非共生珠蛋白基因的表达水平。图2A显示了在不同组织中的表达水平。图2B显示了在胁迫条件下的表达水平。

图3显示了用于发根转化的转化载体的结构。

图4显示了展示证实在转化体中导入非共生珠蛋白基因的实验结果的照片。图4A显示了在转化体中发根诱发。图4B显示了在转化体根中所观察到的GFP荧光。图4C显示了通过RT-PCR所证实的转基因表达。

图5显示了展示在转化的发根上形成的根瘤的照片。图5A显示了由于导入不含有LjHb1基因的载体所获得的百脉根发根(对照根)。图5B显示了其中已导入并过表达LjHb1基因的发根。白色箭头标记指示在转化的发根上形成的根瘤。网状箭头标记指示在非转化的发根上形成的根瘤。显示只有转化的根瘤发出荧光。

图6显示了通过气相色谱测定的乙烯量数据，显示了在转化的发根上形成的根瘤的固氮活性(ARA活性)水平。

图7是显示用于在大肠杆菌(Escherichia coli)中表达百脉根珠蛋白的载体的示意图。

图8显示了展示在大肠杆菌中表达的百脉根珠蛋白(非共生的[左图，图8A]和非共生的[右图，图8B])对一氧化氮亲和力的吸收光谱。每条线表示通过在不同时间处对珠蛋白与一氧化氮的混合进行测定获得的数据。

图9显示了展示通过RT-PCR证实的在百脉根转化体中AfHb1转基因表达的的照片。

图10显示了在其中已导入AfHb1的转化的全植物(百脉根)以及在因此所形成的根瘤中固氮活性(ARA活性)水平。

实施本发明的最佳方式

在下文中，本发明将得到详细描述。

1.结瘤植物

根据本发明，通过在结瘤植物中使非共生珠蛋白基因过表达产生能形成具有增强的固氮活性的根瘤的结瘤植物。在说明书中，“结瘤植物”意指能结瘤或形成根瘤的植物物种。根瘤为具有团粒状结构的共生器官，所述团粒状结构由在结瘤植物根部中的共生固氮细菌驻留所形成。这样的结瘤植物的例子不仅包括豆科植物(包括豆科作物和豆科树木)，还包括某些非豆科植物(主要为非豆科树木)例如桦木科或桤木科成员，其在种属上被命名为放线菌根植物。根瘤菌作为共生固氮细菌共生于豆科植物根部中，形成根瘤。就上述某些非豆科植物来说，放线菌作为共生固氮细菌共生于根部中，形成根瘤。当它们为豆科植物时，用于本发明的结瘤植物的例子包括百脉根、大豆、赤豆、菜豆、豌豆(Pisumsativum)、蚕豆(Vicia faba)、落花生(Arachis hypogaea)、紫花苜蓿(Medicago sativa)(紫苜蓿)、蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)、车轴草属(三叶草)、豇豆(Vigna sinensis)、兵豆(Lens esculenta)(小扁豆)、刺槐(Robinapseudoacacia)、金雀花(Cytisus scoparius)、胡枝子属、槐(Sophorajaponica)以及甲合欢(Paraserianthes Falcataria)。当它们为非豆科植物时，用于本发明的结瘤植物的例子包括夜叉桤木、日本桤木(Alnusjaponica)、杨梅(Myrica rubra)、矮木麻黄(Casuarina stricta)、马桑(Coriaria japonica)以及胡颓子属。

在本发明中，结瘤植物可以是带有根瘤的植物体，或在非共生珠蛋白基因导入、植物体再生的时间点或任何其他时间点不带有根瘤的植物体，只要它们是能结瘤或形成根瘤的植物的生物种即可。

在说明书中，术语“结瘤植物”不仅指结瘤植物体(全植物)，还指植物器官(如叶、花瓣、茎、根、种子、下胚轴以及子叶)、植物组织(如表皮、韧皮部、薄壁组织、木质部、维管束、栅栏组织以及海绵组织)以及植物体的任何部分例如培养的植物细胞(如愈伤组织)。

2.非共生珠蛋白基因及其获得

根据本发明的非共生珠蛋白基因编码与血红素(卟啉和亚铁离子络合盐)相结合以形成非共生血红蛋白的珠蛋白。如同动物血红蛋白一样，非共生血红蛋白为对氧、二氧化碳、一氧化碳等具有强亲和力的蛋白。与其生血红蛋白相比，非共生血红蛋白对氧、二氧化碳、一氧化碳等具有更强的亲和力。在说明书中，为这样的非共生珠蛋白基因所编码的珠蛋白的活性称为非共生珠蛋白活性。

根据本发明的非共生珠蛋白基因可分离自任何植物。本发明的非共生珠蛋白基因更优选来源于结瘤植物。非共生珠蛋白基因可分离自诸如百脉根或大豆的豆科植物或可分离自诸如夜叉桤木的非豆科结瘤植物。要用于本发明中的这样的非共生珠蛋白基因还可分离自除结瘤植物之外的植物，例如单子叶植物(如大麦(Hordeum vulgare)、稻(Oryzasativa)或玉米(Zea mays))。已知可用于本发明中的非共生珠蛋白基因的例子如下：百脉根(Uchiumi等，Plant Cell Physiol.(2002)43(11)：pp.1351-1358)、夜叉桤木(DDBJ/EMBL/GenBank入藏登记号AB221344)、稻(DDBJ/EMBL/GenBank入藏登记号U76030)、紫花苜蓿(DDBJ/EMBL/GenBank入藏登记号AF172172；Serogelyes等，FEBS Lett.(2000)482，pp.125-130)、大豆(DDBJ/EMBL/GenBank入藏登记号U47143；Anderson，等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(1996)93(12)，pp.5682-5687)以及拟南芥(DDBJ/EMBL/GenBank入藏登记号U94998；Trevaskis等，PNAS(1997)94 pp.12230-12234)。

待用于本发明中的非共生珠蛋白基因可以是cDNA或含有外显子和内含子的基因组DNA。本文使用的“基因”的例子包括DNA和RNA。这样的DNA的例子包括至少一种基因组DNA、cDNA以及合成的DNA。这样的RNA的例子包括mRNA等。

本文使用的“基因”除编码序列之外还可以包含非翻译区(UTR)序列。

在一个非限制性的优选实施方案中，百脉根非共生珠蛋白基因可用作为根据本发明的来源于豆科植物的非共生珠蛋白基因。例如，包含分离自百脉根的SEQ ID NO：1的核苷酸序列的DNA或包含分离自百脉根的SEQ ID NO：3的核苷酸序列的基因组片段DNA可适当地用作为本发明的非共生珠蛋白基因。此外，也可方便地使用编码包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列的百脉根非共生珠蛋白的DNA。

作为本发明的非共生珠蛋白基因，还可使用编码包含在SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的基础上通过缺失、取代或添加1-50个、优选1-35个、更优选1个或几个(如2-10个)氨基酸所衍生的氨基酸序列的蛋白的DNA，只要所述蛋白具有非共生珠蛋白活性即可。此外，要用于本发明中的这样的非共生珠蛋白基因还可以是在严格条件下与包含和SEQ IDNO：1所示核苷酸序列互补的核苷酸序列的DNA、或包含与编码包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列的非共生珠蛋白的DNA的核苷酸序列互补的核苷酸序列的DNA杂交、并编码具有非共生珠蛋白活性的蛋白的DNA。本发明的非共生珠蛋白基因还可以是编码包含与SEQ ID NO：2的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列并具有非共生珠蛋白活性的蛋白的DNA。

在另一个实施方案中，夜叉桤木非共生珠蛋白基因可适当地用作为根据本发明的来源于非豆科结瘤植物的非共生珠蛋白基因，但例子不限于此。例如，包含分离自夜叉桤木的SEQ ID NO：8的核苷酸序列的DNA或包含分离自夜叉桤木的SEQ ID NO：10的核苷酸序列的基因组片段的DNA可适当地用作为本发明的非共生珠蛋白基因。此外，编码包含SEQID NO：9的氨基酸序列的夜叉桤木非共生珠蛋白的DNA也可方便地使用。

编码包含在SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列的基础上通过缺失、取代或添加1-50个、优选1-35个、以及更优选1个或几个(如2-10个)氨基酸所衍生的氨基酸序列的蛋白的DNA，也可用作为本发明的非共生珠蛋白基因，只要其具有非共生珠蛋白活性即可。要用于本发明中的这样的非共生珠蛋白基因可以是在严格条件下与包含和SEQ ID NO：8所示核苷酸序列互补的核苷酸序列的DNA或包含与编码包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列的非共生珠蛋白的DNA的核苷酸序列互补的核苷酸序列的DNA杂交、并编码具有非共生珠蛋白活性的蛋白的DNA。本发明的非共生珠蛋白基因还可以是编码包含与SEQ ID NO：9的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列并具有非共生珠蛋白活性的蛋白的DNA。

在本发明中，术语“严格条件”指在就是特异性杂交形成之下的条件。在这样的条件的例子下，共享有高同源性的核酸，具体来说，具有90％或更高以及优选95％或更高的同源性的DNAs互相杂交，但共享有低于这样的同源性的核酸并不互相杂交。更具体地说，这样的严格条件指其中钠盐浓度在15mM-750mM、优选50mM-750mM、以及更优选300mM-750mM，温度在25℃-70℃、以及优选50℃-70℃、以及更优选55℃-65℃，和甲酰胺浓度在0％-50％、优选20％-50％、以及更优选35％-45％的条件。此外，在严格条件下，杂交后洗滤条件通常为其中的钠盐浓度在15mM-600mM、优选50mM-600mM、以及更优选300mM-600mM，和温度在50℃-70℃、优选55℃-70℃、以及更优选60℃-65℃的条件。

在本发明一个非限制性的实施方案中，非共生珠蛋白基因编码的珠蛋白的非共生珠蛋白活性表示为包含这样的珠蛋白的非共生血红蛋白对氧、二氧化碳、一氧化氮等的亲和力。根据如下所述进行本发明的非共生珠蛋白活性的测定。例如，利用含有编码相关的非共生珠蛋白的非共生珠蛋白基因的表达载体重组产生珠蛋白，然后利用所获得的珠蛋白和血红素重建非共生血红蛋白。利用常规技术测定非共生血红蛋白对氧、二氧化碳、一氧化氮等的亲和力，并因此可将测量值用作为非共生珠蛋白活性的指标。可利用本领域技术人员已知的方法非共生血红蛋白对氧、二氧化碳或一氧化氮的亲和力。

在一个实例中，可基于通过在一氧化氮存在下测定500nm-600nm波长处吸光度所获得的吸收光谱测定这样的非共生血红蛋白对一氧化氮的亲和力。一般而言，当利用500nm-600nm波长的光对血红蛋白作吸光度曲线图时，在540nm-575nm处观察到两个特征峰(参见图8)。就血红蛋白而言，在与一氧化氮反应结束后观察到这两个峰消失。因此，可通过将血红蛋白与一氧化氮混合并接着根据常规技术分析吸收光谱，从而测定血红蛋白对一氧化氮的亲和力。一般来说，分离的和/或纯化的血红蛋白以与氧结合的形式存在(称为氧合血红蛋白)。当重组产生时，例如，非共生血红蛋白还是以与氧结合的形式被分离。要用于本文中的非共生血红蛋白较氧对一氧化氮具有更高的亲和力。因此，当添加一氧化氮到分离的非共生血红蛋白中时，在吸收光谱中观察到的两个峰消失了并接着观察到与一氧化氮反应结束后所获得的位移谱。MichelePerazzoli等，The Plant Cell(2004)16，pp.2785-2794提及到了关于测定血红蛋白对一氧化氮亲和力的这样的方法。

通过在非共生血红蛋白和共生血红蛋白之间进行上述测定的吸收光谱的比较分析，可相对地比较它们对一氧化氮的亲和力。吸收光谱的比较揭示了与共生血红蛋白相比，非共生血红蛋白能与一氧化氮结合得更快。在本发明中，非共生血红蛋白对一氧化氮的亲和力可被测定用作为与一氧化氮混合直至在吸收光谱中观察到非共生血红蛋白与一氧化氮结合所需时间的指标。

在本发明中，利用含有编码这样的非共生珠蛋白(SEQ ID NO：2或9)的基因的载体，可在大肠杆菌中重组产生非共生珠蛋白，然后可收集在大肠杆菌中用非共生珠蛋白和血红素重建的非共生血红蛋白。接着可例如利用上述方法测定非共生血红蛋白对一氧化氮的亲和力。优选地，本发明的非共生珠蛋白与包含这样的非共生珠蛋白(SEQ ID NO：2或9)的非共生血红蛋白具有相同程度的对一氧化氮的亲和力，但例子不限于此。

如上所述，根据本发明的非共生珠蛋白基因可通过利用基于例如SEQ ID NOs：1-3和8-10的序列设计的引物，以及来源于任何植物(如结瘤植物例如百脉根或夜叉桤木)的核酸作为模板，进行PCR扩增作为核酸片段而获得。此外，本发明的非共生珠蛋白基因可通过利用来源于任何植物(如结瘤植物例如百脉根或夜叉桤木)的核酸作为模板，以及非共生珠蛋白基因一部分的DNA片段作为探针，进行杂交作为核酸片段而获得。在这些方法中要用作为模板的核酸可以是例如利用常规技术抽提自任何植物的基因组DNA或通过由利用常规技术抽提的mRNA反转录合成的cDNA。要用作为模板的核酸可以是纯化的基因组DNA、纯化的cDNA、cDNA文库、基因组DNA文库等。或者，要用于本发明中的这样的非共生珠蛋白基因还可通过本领域已知的多种核酸序列合成法例如化学合成法被合成为核酸片段。

此外，可将期望的突变导入通过位点专一诱变等从而所获得的非共生珠蛋白基因的核苷酸序列中(最终，导入核苷酸序列所编码的氨基酸序列中)。为了将突变导入基因，可以使用诸如Kunkel法、缺口双链体法的已知技术或任何基于那些方法的技术。例如，可使用利用位点专一诱变的诱变试剂盒(如Mutan-K(TAKARA)或Mutan-G(TAKARA))或LA PCR体外诱变系列试剂盒(TAKARA)导入突变。

此外，用于本发明中的实验方案，例如mRNA制备、cDNA制备、PCR、RT-PCR、文库构建、连接入载体、细胞转化、DNA测序、化学合成核酸、测定蛋白N-末端侧氨基酸序列、诱变和蛋白提取可根据常规实验手册中所述的方法进行。这样的实验手册的一个例子是Sambrook等，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，2001，编辑，Sambrook，J.&Russell，D.W.，Cold Spring Harbor Laboratory Press。

3.在结瘤植物中非共生珠蛋白基因过表达

根据本发明，利用基因工程技术在结瘤植物中使非共生珠蛋白基因过表达。本文使用的用语“使过表达”意指：通过任何基因工程技术(如基因转移)在宿主生物体中遗传改造基因，使得基因以高于该基因在宿主生物体中的正常表达水平表达(如高10％或更多)；或将基因导入不具有该基因的宿主生物体中，使得该基因在其中表达。用于非共生珠蛋白基因过表达的具体方法并不受限，任何本领域技术人员已知的技术都可使用。一般方法的一个例子是包含将非共生珠蛋白基因连接到过表达启动子下游，使得基因能以正确的读框表达，然后将如此所构建的转化载体导入结瘤植物中的技术，但该例子并不局限于此。在该情况下，通过例如利用适当的限制性内切酶切割含有非共生珠蛋白基因的DNA片段，接着符合读框地插入并将该DNA片段连接到位于含有过表达启动子的表达载体中的该过表达启动子下游的适当的限制性内切酶位点中，将非共生珠蛋白基因插入载体中。或者，可将之前通过将非共生珠蛋白基因连接到过表达启动子下游制备的DNA片段插入载体中。还可通过诸如同源重组的方法将与过表达启动子连接的非共生珠蛋白基因的基因组片段插入结瘤植物的基因组DNA中。任何上述结瘤植物(如百脉根)都可适当地用作为其中使非共生珠蛋白基因过表达的结瘤植物。

在本发明中，“过表达启动子”意指在宿主植物细胞中能引起已与之连接的该细胞的基因强表达(大量表达)的启动子。本发明的过表达启动子可具体是能启动根瘤特异性表达的根瘤特异性启动子。本发明的过表达启动子可以是诱导型启动子或组成型启动子。启动子是包含通常位于结构基因5’上游的表达调控区的DNA或其修饰的序列。在本发明中，任何适合于植物细胞中外源基因表达的启动子都可用作为过表达启动子。用于本发明中的这样的过表达启动子的优选例子包括，但不限于花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子、稻肌动蛋白启动子、修饰的35S启动子、烟草PR1a启动子以及拟南芥PR-1启动子。

任何用于植物细胞的基因导入载体都可用作为用于导入非共生珠蛋白基因的转化载体。例如，当使用土壤杆菌法时，优选使用土壤杆菌衍生的质粒载体(如Ti质粒)或二元载体。要用于本发明中的这样的转化载体包含非共生珠蛋白基因以及任选的过表达载体，并可进一步包含供二元载体系统使用的用于促进转化体选择的选择标记基因、报道基因、复制起点(如Ti或Ri质粒衍生的复制起点)等。选择标记基因的例子包括药物抗性基因，例如喜福德(Cefotax)基因、潮霉素抗性基因、二氢叶酸还原酶基因、氨苄青霉素抗性基因、新霉素抗性基因和卡那霉素抗性基因。报道基因的例子包括绿色荧光蛋白基因(GFP)和荧光素酶基因(LUC和LUX)。在本发明中，“载体”包含所谓的表达盒。“表达盒”意指含有启动子DNA序列以及待表达基因的DNA序列的DNA片段，其中因基因的DNA序列与启动子DNA序列连接而使该基因能在植物细胞中表达。这样的表达盒可缺少自主复制的能力。

此外，已知包含过表达启动子的载体的例子包括基于pBI的二元载体(如pKANNIBAL、IG121-Hm、pBI121、pBI101、pBI101.2、pBI101.3和pCAMBIA1301)。

本发明还提供了包含上述与过表达启动子连接的非共生珠蛋白基因的载体。这样的转化载体可非常方便地使用，因为该载体能导入任何结瘤植物中以增强根瘤的固氮活性。

任何广泛用于植物的植物转化方法都可用作为用于将转化载体导入结瘤植物的方法，包括但不限于土壤杆菌法、基因枪法、电穿孔法、聚乙二醇(PEG)法、微量注射法以及原生质体融合法。这些植物转化方法披露于普通教科书中，例如“New Edition，Experimental Protocols forModel Plants，Genetic Techniques to Genomic Analysis”(在IsaoShimamoto和Kiyotaka Okada指导下，(2001)Shujunsha Co.，Ltd.)。优选地，通过利用诸如卡那霉素抗性的选择标记的方法，选择业已导入转化载体的植物细胞，并通过检测报道蛋白或转基因的表达分析证实转基因的表达。优选地，除此之外，通过常规技术再生植物体。

更具体地说，就土壤杆菌法而言，例如使用Nagel等的方法。首先，利用电穿孔将载体导入土壤杆菌中。接着，根据Plant Molecular BiologyManual(S.B.Gelvin等，Academic Publishers)；Thykaer，T.等，CellBiology，第2版.(1998)pp.518-525；Stiller，J.，等，J.Exp.Bot.(1997)48，pp.1357-1365；Ogar，P.等，Plant Science(1996)116 159-168；或Hiei Y.等，Plant J.(1994)6，271-282中所述的方法用如此转化的土壤杆菌感染植物以将目的基因导入植物中。然后再生植物体。

当使用聚乙二醇法时，首先，可通过用酶消化除去细胞壁以获得原生质体。然后可利用聚乙二醇将非共生珠蛋白基因导入细胞中，然后将细胞再生为植物体(Datta SK：In Gene Transfer To Plants(Potrykus I和Spangenberg，编)即.66-74(1995))。

当使用电穿孔法时，首先，可通过用酶消化除去细胞壁以获得原生质体。可将电脉冲施加于原生质体以将非共生珠蛋白基因导入细胞中，然后将细胞再生为植物体(Toki S，等，Plant Physiol.，100：1503(1992))。

当使用基因枪法时，可使用完整的植物体、植物器官和植物组织。或者，可从其中制备切片或原生质体然后使用(Christou P，等，Biotechnology 9：957(1991))。使用基因转移装置(如PDS-1000(BIO-RAD))，用高压气体将已包被有非共生珠蛋白基因的金、钨等的微粒(每个微粒的直径在大约1μm-2μm)轰击所制备的样品，以将非共生珠蛋白基因导入植物细胞中。取决于所使用的植物和样品，可改变处理条件，但通常来说，在大约450psi-2000psi的压力以及离靶大约4cm-12cm的距离下进行轰击。一旦非共生珠蛋白基因导入细胞能够，可如上所述将细胞再生为植物体。

在本发明如此所转化的结瘤植物中，非共生珠蛋白基因可以插入植物基因组DNA中的形式表达或可作为基因组外DNA(如以保留在载体中的形式)表达。

优选通过诸如的RNA印迹法、DNA印迹法或基于报道基因表达的方法的常规技术，来证实在其中如上所述已使非共生珠蛋白基因过表达的转化的植物细胞或植物组织(如发根、叶、茎和根瘤)或其再生的植物体中非共生珠蛋白基因的表达。

4.植物体中根瘤的形成以及根瘤固氮活性的测定

当在其中共生固氮细菌存在的给定环境下生长时，其中根据本发明已使非共生珠蛋白基因过表达的转化的结瘤植物能形成根瘤。然而，还有可能通过用共生固氮细菌接种这样的结瘤植物来人工结瘤。可根据本领域技术人员众所周知的方法用共生固氮细菌接种这样的结瘤植物(如参见Higashi，S.，Katahira，S.和Abe，M.Plant and Soil 81，pp.91-99(1984))。

本文使用的术语“共生固氮细菌”意指能与植物共生、形成根瘤、固氮为氨并将其提供给宿主植物(即具有固氮能力)的微生物。这样的共生固氮细菌包括，当它们是真细菌时，为根瘤菌属(Rhizobium)、慢生根瘤菌属(Bradyrhizobium)、固氮根瘤菌属(Azorhizobium)、中华根瘤菌属(Snorhizobium)、中慢生根瘤菌属(Mesorhizobium)和另类根瘤菌属(Allorhizobium)的根瘤菌，以及当它们是放线菌时，为弗兰克氏菌属(Frankia)的细菌。已知根瘤菌感染豆科植物和榆科Parasponia属植物。已知弗兰克氏菌属细菌主要感染桦木科、杨梅科等的树木。对于上述共生固氮细菌-宿主植物关系还知道一些例外的情况。因此，可用能感染目标植物所属的植物种的共生固氮细菌接种转化的结瘤植物。例如，可用百脉根根瘤菌(百脉根慢生根瘤菌(Mesorhizobium loti))接种百脉根。

当根据本发明用共生固氮细菌接种具有过表达非共生珠蛋白基因的结瘤植物以形成根瘤时，根瘤中的固氮活性明显增强了。与没有过表达非共生珠蛋白基因的相同物种的对照植物(野生型品系)中的活性水平相比，这样的根瘤的每单位重量根瘤的固氮活性增加至少2倍，优选至少3倍(如3-6倍)。

可利用任何本领域技术人员已知的用于测定固氮活性的方法测定根瘤的固氮活性。在本发明中，根瘤的固氮活性优选测定为在根瘤提取物中还原乙炔为乙烯的活性(乙炔还原活性：ARA活性)。ARA活性可表示为每单位重量(如1克)根瘤每单位时间(如1小时或1分钟)产生的乙烯的量。可根据例如下述实施例测定这样的ARA活性。具有过表达根据本发明的非共生珠蛋白基因的结瘤植物在根瘤中显示10nM/min/g-100nM/min/g、优选11nM/min/g-40nM/min/g的ARA活性，但例子不限于此。

本发明进一步涉及如上所述获得的具有过表达非共生珠蛋白基因以及在其根上有根瘤的结瘤植物。

5.其他实施方案

利用本发明方法产生的结瘤植物形成了具有高固氮活性的根瘤。因此，通过栽培这样的植物，在栽培环境下大量大气中的氮能得到固定。因此，本发明还提供了一种在植物栽培上增加固氮效率的方法。表达“在植物栽培上增加固氮效率”意指与在相同环境下通过非转化的相应植物所获得的固氮水平相比，在预定时期内增加每一预定播种面积或每一栽培植物体的固氮水平。在本发明中，“栽培”意指在特定场所或在特定环境下有意种植相关植物。在本发明中，表达“栽培”包括农业栽培，但不一定需要农业劳动(耕地、播种、种植幼苗、疏剪、杀菌、剪枝、间苗和收割)。本发明中栽培的例子包括，但不限于栽培作物或园艺植物、环境美化修整花园、恢复退化陆地或海滨活力的种植、肥沃贫营养土的种植以及改善诸如盐土或干土的土壤品质的种植。

在植物栽培上通过增加固氮效率，利用本发明方法所产生的结瘤植物能增加在给定环境下从大气中固定的氮的量，能增加相关植物组织中固定的氮的浓度，由此能增加结瘤植物的产量或生长量。此外，从长远观点来看，栽培本发明的结瘤植物能通过增加土壤中氮的量肥土，并能增加使用这样的土壤的其他植物的产量。此外，栽培本发明的结瘤植物能有效地恢复寡营养土、盐渍土、干土等的活力。

实施例

参照下列实施例进一步阐述本发明。然而，这些实施例并不限制本发明的技术范围。

[实施例1]百脉根非共生珠蛋白基因(LjHb1)的分离和鉴定

利用PCR法通过筛选百脉根基因组文库(Sato等(2000)DNA Res.8：pp.311-318)分离百脉根的非共生珠蛋白基因(LjHb1)。基于存在于百脉根EST文库中的非共生珠蛋白基因同系物(克隆名称：AV413959，DDBJ/EMBL/GenBank入藏登记号AB238220)的序列设计用于筛选的引物。引物序列如下所示：

LjHb1F1：5’-TTCTCACTTCACTTCCATCGC-3’(SEQ ID NO：4，正向引物)；

LjHb1F2：5’-TTGGTCAAGTCATGGAGCG-3’(SEQ ID NO：5，正向引物)；

LjHb1R1：5’-TCACAGTGACTTTTCCAGCG-3’(SEQ ID NO：6，反向引物)；和

LjHb1R2：5’-AGACAGACATGGCATGAGGC-3’(SEQ ID NO：7，反向引物)。

使用GeneAmp^(R) PCR System 9700(Applied Biosystems)，在下列反应条件下进行扩增LjHb1基因的PCR：94℃持续30秒、55℃持续30秒以及72℃持续30秒的30个循环。

作为百脉根基因组文库筛选的结果，鉴定了存在于TAC克隆(LjTOI01)中的LjHb1基因。根据百脉根基因组中LjHb1基因的序列分析所揭示的，LjHb1基因从起始密码子到终止密码子全长1012bp，编码161个氨基酸残基。百脉根非共生珠蛋白基因(LjHb1)的基因组结构和该基因所编码的氨基酸序列示于图1中。LjHb1基因具有包含4个外显子和3个内含子的结构，其为珠蛋白基因植物中共有的结构，并且存在于百脉根6个染色体中的染色体3上。

[实施例2]非共生珠蛋白基因(LjHb1)的表达分析

在两个实验系列中利用RT-PCR进行LjHb1的表达分析，其中分别检查在不同组织和胁迫条件下的表达。在涉及检查在不同组织中表达的实验系列中，使用了四种类型的百脉根(发芽后的第6周生长的单株植物)组织样品：1)叶；2)茎；3)根；和4)根瘤。在涉及检查在胁迫条件下表达的实验系列中，在此使用的四种类型的样品为：1)未处理的(对照)样品；2)添加蔗糖的样品；3)低温处理的样品；和4)低氧处理的样品。已在实施例1中使用的引物LjHb1F1和LjHb1R2用于RT-PCR。单步RT-PCR试剂盒(QIAGEN)用于反转录及其转录产物的扩增。通过电泳测定LjHb1基因的表达水平。成像电泳照片。LjHb1表达水平表示为基于条带密度的相对值。

图2A显示了检查在不同组织中表达的实验结果。其显示LjHb1在生长的单株植物的不同器官中表达。表达水平(相对值)为：叶0.4；茎0.4；根1.0；以及根瘤36.0。因此，在根瘤组织中LjHb1表达特别强。此外，图2B显示了检查在胁迫条件下表达的实验结果。其显示与未处理的样品相比，根据相对表达水平，通过诸如低温处理(参见图2B；表达水平：大约250)和低氧处理(图2B；表达水平：大约450)的胁迫处理，LjHb1也是强表达的。

[实施例3]构建转化载体

为了产生过表达LjHb1的转化的百脉根植物体和转化的发根，制备包含与强启动子连接的LjHb1 cDNA的基因构建体。此外，为了构建要用于转化的载体，使用质粒pKANNIBAL(Wesley等2001 the plant Journal27，581-590)、pHKN29(Kumagai和Kouchi，2003 MPMI 16(8)，663-668)和pIG121-Hm(Ohta等，1990，Plant Cell Physiol.，31，805-813)。

根据常规技术从百脉根根瘤中提取总RNA，然后通过RT-PCR合成为cDNA。使用所得到的cDNA作为模板，通过PCR克隆全长LjHb1cDNA。具体来说，将所获得的全长LjHb1 cDNA(SEQ ID NO：1)连接到pKANNIBAL中花椰菜花叶病毒35S启动子的下游。接着从所产生的载体上切下35S-LjHb1 cDNA片段，然后连接到pHKN29中GFP区的下游以产生质粒载体pR35SLjHb1(图3)。该pR35SLjHb1用于下述转化的发根的诱导。

此外，将全长LjHb1 cDNA连接到pIG12I-Hm中35S启动子的下游以产生质粒载体pT35SljLb1。如下所述，该pT35SljLb1用于产生转化的百脉根植物体。

[实施例4]产生转化的发根并证实基因导入和基因表达

利用实施例3中构建的质粒载体，通过毛根土壤杆菌(Agrobacteriumrhizogenes)介导的发根诱导转化系统产生其中已导入LjHb1基因的转化的百脉根发根。

首先，通过电穿孔将实施例3中构建的能过表达LjHb1的载体pR35SLjHb1直接导入毛根土壤杆菌LBA1334(Clara Diaz博士提供的(Institute Molecular Plant Science，Leiden University))中。用带有pR35SLjHb1的毛根土壤杆菌的细菌细胞悬浮液接种在播种后第5天于下胚轴部位切断的百脉根幼苗。随后，将幼苗置于已灭菌的滤纸上，然后在共培养培养基(1/10 B5，0.5μg/ml BAP，0.05μg/ml NAA，5mM MES(pH 5.2)和20μg/ml乙酰丁香酮)中共培养5天。在共培养结束后，将幼苗置于补充有抗生素喜福德(200μg/ml；Chugai Pharmaceutical Co.，Ltd.)的GamborgB5培养基(Nihon Pharmaceutical Co.，Ltd.，生产，Wako PureChemical Industries，Ltd.销售)中，使得发根得以诱导。图4A显示了如此所诱导的发根。此外，图4A显示了不同样品在生长阶段或发根发育期间的差异。

通过GFP荧光检测和经PCR扩增检测35S启动子和LjHb1融合基因，证实发根中转基因LjHb1存在与否。在其中LjHb1基因已导入的发根中，产生了GFP并由此观察到绿色荧光(图4B)。在图4B中，左边照片(左上和左下)为所观察到的亮视野图像，右边照片(右上和右下)为所观察到的暗视野图像。由于过表达共生珠蛋白基因，清晰地观察到发根中的GFP荧光。

此外，根据常规技术从转化的发根中提取总RNA，然后进行RT-PCR使得转基因LjHb1的表达得以证实。此外，使用来源于野生型品系的百脉根发根作为对照。图4C显示了该结果。如图4C所示，将已知在任何百脉根组织中以及在任何阶段以相同水平表达的LjeIF-4A基因用作为指标，用于证实在测试和对照样品中用于使基因表达的RNA量相同。

如上述结果所证实的，在其中LjHb1基因已导入的发根中，LjHb1基因表达以较其中LjHb1基因没有导入的野生型品系发根约大100倍的量得到诱导。

[实施例5]转化的发根的结瘤和根瘤固氮活性的测定

在实施例4中证实了被诱导发育发根并且LjHb1基因导入其中的植物。将该植物移植到栽培土壤(蛭石∶珍珠岩＝4∶1)中。将补充有终浓度为1mM的KNO₃的Fahraeus培养基(Fahraeus，(1957)J.Gen.Microbiol.16(2)374-381)应用于植物，并让植物生长1周。随后，将植物移植到新鲜的栽培土壤中，然后用1×10⁷细胞/毫升浓度的百脉根根瘤菌(百脉根慢生根瘤菌MAFF 303099)接种发根。用根瘤菌接种后，使用不含有氮源的培养基，然后让植物进一步生长4周。在植物生长室中让转化的植物保持在25℃-26℃、16小时光照/8小时黑暗循环的生长条件下。4周后，在发根上形成的根瘤(图5)。

接着，测定发根上形成的根瘤的固氮活性为还原乙炔为乙烯的活性(乙炔还原活性；ARA)。具体来说，首先，将从发根上收集的根瘤置于15-cm试管中，然后用橡皮帽密封试管。使用抽气器将试管中的空气完全抽出，接着用乙炔气体充满试管。在室温下保温2小时后，收集试管中的气体，然后通过气相色谱测定所产生的乙烯的量。图6显示了测量结果。

如图6中所示的测量结果，每单位重量的在其中LjHb1已导入并过表达的发根上形成的根瘤(即每克重量的根瘤)的ARA活性计算为11.15nM/min/g[1.45×21.5-0.5＝30.67(nM/g)；30.67(nM)/2.75min＝约11.15nM/min/g]。另一方面，作为对照，每单位重量的在其中无LjHb1导入的发根上形成的根瘤(每克重量的根瘤)ARA活性计算为2.12nM/min/g[1.45×4-0.5＝5.3(nM/g)；5.3(nM)/2.5min＝2.12nM/min/g]。表明在其中LjHb1已导入并过表达的发根(转化体)上形成的根瘤的固氮活性为对照的5倍或更多。

[实施例6]转化植物体的产生

1)用根癌土壤杆菌(A.tumefaciens)感染百脉根

通过从紧靠子叶之下的部位并沿根分界线切割，从播种后第5天的百脉根幼苗上切下各自的下胚轴。其间，通过电穿孔将实施例3中构建的pT35SljLb1直接导入根癌土壤杆菌(A.tumefaciens)EHA105(Nagoya大学Kenzo Nakamura博士提供的)中。添加终浓度为100μM的乙酰丁香酮到所得到的带有pT35SljLb1的根癌土壤杆菌EHA105的细菌细胞悬浮液中(1.0×10⁷细胞/毫升，OD₆₀₀＝0.10×0.15)。将所切下的下胚轴浸入悬浮液中。在悬浮液中将下胚轴切成厚约5mm的切片。将切片持续浸入细菌细胞悬浮液中30分钟，使得切片感染土壤杆菌。感染后，将切片置于已灭菌的滤纸上，然后在共培养培养基(1/10 B5，0.5μg/ml BAP，0.05μg/ml NAA，5mM MES(pH 5.2)，和20μg/ml乙酰丁香酮)中于25℃共培养3-5天。

2)愈伤组织诱导

将共培养的切片转移到补充有用于灭菌的抗生喜福德(250μg/ml)和用于选择转化体的抗生素潮霉素B的愈伤组织培养基(1xB5，2％蔗糖，0.5μg/ml BAP，0.05μg/ml NAA，10mM NH₄，和0.3％植物凝胶(phytagel))上。用14小时光照/10小时黑暗循环于25℃下培养切片5周。每隔1-2周移植切片一次。

3)从愈伤组织诱导芽

在上述愈伤组织培养基中培养5周后，将切片转移到芽诱导培养基(1xB5，2％蔗糖，0.5μg/ml BAP，0.05μg/ml NAA，10mM NH₄，和0.3％植物凝胶)上。用14小时光照(6100lux)/10小时黑暗循环于25℃下培养切片2周。随后，将切片上所形成的愈伤组织移植到补充有潮霉素B的芽诱导培养基中。在与上述相同的培养条件下培养愈伤组织3周。每隔1-2周移植愈伤组织一次。

4)芽伸长

将愈伤组织转移到芽伸长培养基(1xB5，2％蔗糖，0.2μg/ml BAP，和0.3％植物凝胶)上，然后用14小时光照(6100lux)/10小时黑暗循环于25℃下培养3周。每隔1-2周移植愈伤组织一次。随后，将愈伤组织移植到不含有植物激素的芽伸长培养基上。接着在类似于上述的培养条件下培养愈伤组织2-3周，从而促进芽伸长。

5)根诱导和伸长

使用剃刀将置于芽伸长培养基上的产生自愈伤组织的5mm或更长的芽从各自芽基部分切离。将芽基部分纵向插入根诱导培养基(1/2 B5，1％蔗糖，0.5μg/ml NAA，和0.4％植物凝胶)中，并用14小时光照(6100lux)/10小时黑暗循环培养芽1周或更久。随后，将具有膨胀的切面的芽插入根伸长培养基(1/2 B5和1％蔗糖)中。接着在类似于上述的培养条件下培养芽2-3周，从而促进根伸长。

6)培养转化植物体

如上所述通过根伸长获得了植物体。将植物体从培养基中拔出，然后在水中彻底洗掉粘附在根上的凝胶。将植物体移植到充满有1∶10稀释的商业B5培养基(Wako Pure Chemical Industries，Ltd.)的蛭石上。接着用14小时光照(6100lux)/10小时黑暗循环栽培植物体。如此栽培的百脉根植物体产生了种子，并收获种子。随后，将种子播种于Power土(用于园艺的栽培土壤；Kureha Chemical Co.)中用于栽培。

通过其的PCR扩增检测35S启动子和LjHb1的融合基因，来证实LjHb1基因是否成功地导入如此所生长的植物体中。此外，通过RT-PCR证实LjHb1基因表达水平的增加。

[实施例7]转化的百脉根植物体的结瘤和固氮活性

如上述实施例6证实了转化的百脉根植物体产生和LjHb1基因导入并在植物体中过表达。将转化的植物体移植到栽培土壤(蛭石∶珍珠岩＝4∶1)中用于栽培。用1×10⁷细胞/毫升浓度的百脉根根瘤菌(百脉根慢生根瘤菌MAFF 303099)接种植物体。在用根瘤菌接种后，在植物生长室中于25℃-26℃用16小时光照(6100lux)/8小时黑暗循环栽培转化的植物体4周。在4周栽培后，从植物体上收集所形成的根瘤，然后以类似于实施例5中的方法测定ARA活性。作为测定的结果，每单位重量的由过表达LjHb1的转化的百脉根植物体形成的根瘤(每克重量的根瘤)的ARA活性计算为17.21nM/min/g。作为对照，每单位重量的其中LjHb1没有导入的百脉根(通常为野生型百脉根)上形成的根瘤(每克重量的根瘤)的ARA活性计算为5.05nM/min/g。

此外，在转化体和非转化体中，在该实施例中所获得的每株植物体上形成的根瘤的平均数目为7。在诸如大小和颜色的根瘤外观上没有观察到特别的差异。

[实施例8]百脉根非共生珠蛋白与百脉根共生珠蛋白对一氧化氮亲和力的比较

根据常规技术，将实施例3中获得的全长LjHb1 cDNA(该序列从其起始密码子到终止密码子示于SEQ ID NO：1。编码SEQ ID NO：2的氨基酸序列)克隆入蛋白表达载体pGEX4T-3(Amersham Pharmacia Biotech)中(图7)。然后将该载体导入大肠杆菌中以获得转化体。为了制备对照样品，将百脉根共生珠蛋白基因类似地克隆入表达载体pGEX4T-3中(图7)，然后将该载体导入大肠杆菌以获得转化体。培养如此所获得的大肠杆菌转化体用于诱导基因表达。因此，在大肠杆菌的细菌细胞中可溶的活性非共生珠蛋白能大量地重组产生。随后，根据常规技术收集已表达非共生珠蛋白基因的大肠杆菌细胞。在破裂大肠杆菌细胞后，进行蛋白纯化，从而能获得活性非共生血红蛋白。让通过破裂大肠杆菌细胞所获得的珠蛋白与来自大肠杆菌的血红素缔合，从而以具有血红蛋白活性的形式得到分离，因为其中已导入非共生珠蛋白基因的大肠杆菌中也提供了血红素。

随后，将一氧化氮与如此所获得的共生血红蛋白混合，然后全程测定吸光。图8显示了在波长500nm-600nm处于与一氧化氮混合开始后0分钟、5分钟、15分钟以及30分钟时获得的吸收光谱。如图8所示，随着与一氧化氮混合时间的延长，540nm和575nm处的两个峰逐渐地消失了。具体就非共生血红蛋白来说，575-nm峰以更快的速度消失，在混合开始15分钟后就几乎完全消失了。另一方面，就共生血红蛋白来说，540-nm峰没有显著地减少。甚至在混合开始后30分钟时，该575-nm峰仍然保留，尽管其较弱，但仍然观察到两个峰。

[实施例9]夜叉桤木非共生珠蛋白基因(AfHb1)的分离和鉴定

利用百脉根非共生珠蛋白基因LjHb1的DNA片段作为探针，通过筛选夜叉桤木根瘤cDNA文库(Sasakura，F.等，″A class 1 hemoglobin genefrom Alnus firma functions in symbiotic and nonsymbiotic tissues todetoxify nitric oxide.″Mol.Plant Microbe.Interact.(2006)19(4)，在印刷中)分离夜叉桤木的非共生珠蛋白基因(AfHb1)。

基于百脉根非共生珠蛋白基因LjHb1(克隆名称：AV413959，DDBJ/EMBL/GenBank入藏登记号AB238220)的序列设计用于筛选的探针。利用实施例1中所用的引物LjHb1F1(5’-TTCTCACTTCACTTCCATCGC-3’：SEQID NO：4)和LjHb1R1(5’-TCACAGTGACTTTTCCAGCG-3’：SEQ ID NO：6)，由百脉根的基因组DNA通过PCR扩增获得该探针。在由94℃持续30秒、55℃持续30秒以及72℃持续30秒的30个循环组成的条件下，使用GeneAmp^(R)PCR System 9700(Applied Biosystems)进行用于扩增要用作为探针的LjHb1片段的PCR。

作为上述夜叉桤木根瘤cDNA文库筛选的结果，鉴定了AfHb1基因。作为核苷酸序列分析的结果，AfHb1基因被认为是一种包含在cDNA中从起始密码子到终止密码子长度483bp的序列并编码160个氨基酸的基因。从AfHb1(DDBJ/EMBL/GenBank入藏登记号AB221344)的cDNA序列的起始密码子到终止密码子的核苷酸序列示于SEQ ID NO：8。该核苷酸序列所编码的氨基酸序列示于SEQ ID NO：9。此外，夜叉桤木AfHb1基因的基因组DNA序列(从起始密码子至终止密码子)示于SEQ ID NO：10。

[实施例10]夜叉桤木非共生珠蛋白基因(AfHb1)的表达分析

使用根据常规技术从作为样品的夜叉桤木不同器官的组织中抽提的mRNAs，通过RT-PCR进行AfHb1的表达分析。对于RT-PCR，使用了下列AfHb1F1和AfHb1R3引物。单步RT-PCR试剂盒(QIAGEN)用于反转录及其转录产物的扩增。下列AfHb1F1和AfHb1R3引物也用于反转录产物的扩增。在此所使用的引物序列如下所示：

AfHb1F1：5’-GCTGCTATCAAATCTGCAAT-3’(SEQ ID NO：11，正向引物)和

AfHb1R3：5’-GGGGGGCTGTGATTTTAG-3’(SEQ ID NO：12，反向引物)。

使如此所获得的扩增产物经电泳，然后将所得到的电泳照片进行成像。基于条带密度测定每个组织中AfHb1基因的表达水平。

通过RT-PCR获得的表达分析结果揭示了AfHb1基因已在生长的夜叉桤木植物的不同器官内得到表达。具体来说，AfHb1基因在根瘤组织中强表达。如同百脉根LjHb1基因一样，揭示了AfHb1基因的表达也受诸如低温处理的胁迫处理的强诱导。

[实施例11]转化载体的构建

尝试产生过表达AfHb1基因的转化的百脉根以阐明AfHb1基因的功能。为了构建用于转化的载体，使用质粒pKANNIBAL(Wesley等，2001，The Plant Journal 27，581-590)和pHKN29(Kumagai和Kouchi.2003MPMI16(8)，663-668)。

首先，由抽提自夜叉桤木根瘤的总RNA通过反转录合成cDNA。使用合成的cDNA作为模板，通过PCR克隆全长AfHb1 cDNA。将如此所获得的AfHb1 cDNA连接到pKANNIBAL中花椰菜花叶病毒35S启动子下游。此外，切下35S-AfHb1 cDNA片段，然后连接到pHKN29中GFP区下游，由此最终制备转化载体pAfHb1S。

[实施例12]转化的发根的产生

使用毛根土壤杆菌介导的发根诱导转化系统将AfHb1转化百脉根。该转化方法是基于发根被诱导并且通过毛根土壤杆菌转化的共转染原理。根据实施例3的方法产生该实施例中转化的发根。

通过电穿孔，将实施例11中构建的能过表达AfHb1基因转化载体pAfHb1S直接导入毛根土壤杆菌LBA1334中。通过用其中载体pAfHb1S已导入的毛根土壤杆菌LBA1334的细菌细胞悬浮液接种，感染已在下胚轴部分切离的播种后第5天的百脉根幼苗。随后，将幼苗置于已灭菌的滤纸上，然后在共培养培养基中共培养5天。在共培养结束后，将幼苗置于补充有抗生素喜福德(200μg/ml；Chugai Pharmaceutical Co.，Ltd.)的Gamborg B5培养基(Nihon Pharmaceutical Co.，Ltd.生产，Wako PureChemical Industries，Ltd.销售)的琼脂培养基上，从而诱导发根。

以类似于实施例4中的方法，通过GFP荧光检测和RT-PCR证实发根中转基因AfHb1存在与否。结果是，在所有已用其中AfHb1已导入的毛根土壤杆菌感染的个体百脉根植株中，发出GFP荧光的发根是被诱导的。另一方面，作为通过RT-PCR证实的结果，在其中AfHb1已导入的发根(转化体)中，AfHb1基因表达以较其中AfHb1基因没有导入的野生型品系发根约大100倍的表达水平得到诱导。图9显示了利用RT-PCR证实AfHb1基因表达的结果。在图9中，LjeIF-4A是阳性对照。

[实施例13]转化植物个体表型的分析

在实施例12中证实了已经历AfHb1基因转化的发根。将具有这样的发根的植物移植到栽培土壤(蛭石∶珍珠岩＝4∶1)中。将补充有1mM终浓度的KNO₃的Fahraeus培养基(Fahraeus，(1957)J.Gen.Microbiol.16(2)374-381)应用于植物，然后让植物生长1周。随后，将植物移植到新鲜的栽培土壤中，并用1×10⁷细胞/毫升浓度的百脉根根瘤菌(百脉根慢生根瘤菌MAFF 303099)接种发根。在用根瘤菌接种后，使用不含有氮源的Fahraeus培养基，然后让植物进一步生长4周。在植物生长室中让转化的植物保持在25℃-26℃、16小时光照/8小时黑暗循环的生长条件下。在生长的植物体的发根上形成了根瘤。在转化体和非转化体中，每株植物体形成的根瘤平均数目为9。在诸如大小和颜色的根瘤外观上，于转化体和非转化体之间没有观察到特别的差异。

接着，将在发根上形成的根瘤的固氮活性测定为转化体表型之一。根据实施例5中所述的方法将根瘤的固氮活性测定为还原乙炔为乙烯的活性(乙炔还原活性；ARA)。结果示于图10。在图10中，“对照”指使用其中不含有AfHb1基因的质粒pHKN29已导入的百脉根作为样品所获得的结果。

作为测定的结果，与其中AfHb1没有导入的野生型品系百脉根的发根上形成的根瘤相比，在其中AfHb1已导入并过表达的发根上形成的根瘤具有每单位重量根瘤大3-5倍的固氮活性。如图10所示，在其中已使AfHb1过表达的发根上形成的根瘤具有每单位重量7.2nM/min/g的ARA活性(平均值)。还对其中AfHb1已导入的百脉根全植物体进行测定，显示每单位重量的ARA活性(平均值)为13nM/min/g。另一方面，作为对照，在其中AfHb1没有导入的野生型品系发根上形成的根瘤具有每单位重量2.6nM/min/g的ARA活性(平均值)。其中AfHb1没有导入的野生型品系的全植物体具有每单位重量5nM/min/g的ARA活性(平均值)。

基于上述结果，证实了其中夜叉桤木非共生珠蛋白基因AfHb1已导入的百脉根也具有明显改善的在发根上形成的根瘤的固氮活性。

工业实用性

根据用于产生本发明结瘤植物的方法，可获得带有具有明显改善的固氮活性的根瘤的结瘤植物。此外，通过栽培本发明的结瘤植物在植物栽培上用于增加固氮水平的方法可用于增加上述结瘤植物的产量或生长量，或通过增加土壤中氮水平以及恢复退化土地的活力等而肥土。

所有在此引用的出版物、专利和专利申请以其全文并入作为参考。

序列表文本

SEQ ID NOs：4-7、11和12的序列为引物。

序列表

<110>Kagoshima University

<120>产生形成具有高固氮活性根瘤的植物的方法

<130>PH-2687-PCT

<140>PCT/JP2006/304681

<141>2006-03-03

<150>JP 2005-071677

<151>2005-03-14

<160>12

<170>PatentIn 2.0版

<210>1

<211>486

<212>DNA

<213>百脉根

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(486)

<220>

<223>发明人：Uchiumi，Toshiki；Shimoda，Yoshikazu

<400>1

atg tcc acc ctt ggg agc aca tgt ttc act gaa gag caa gaa gct ctt     48

Met Ser Thr Leu Gly Ser Thr Cys Phe Thr Glu Glu Gln Glu Ala Leu

 1               5                10                 15

gtg gtc aag tca tgg agc gtg atg aag aag aat tct gct gaa ctg ggt     96

Val Val Lys Ser Trp Ser Val Met Lys Lys Asn Ser Ala Glu Leu Gly

            20                25                  30

ctc aag ctt ttc ttg aaa ata ttt gag att gct cca tca gct cag aaa    144

Leu Lys Leu Phe Leu Lys Ile Phe Glu Ile Ala Pro Ser Ala Gln Lys

        35                40                   45

ttg ttc tct ttc ttg aga gat tca aaa gtt cct ttg gag gag aac ccc    192

Leu Phe Ser Phe Leu Arg Asp Ser Lys Val Pro Leu Glu Glu Asn Pro

    50                55                  60

aag ctc aag cct cat gcc atg tct gtc ttt gtc atg act tgt gaa tca    240

Lys Leu Lys Pro His Ala Met Ser Val Phe Val Met Thr Cys Glu Ser

 65                 70                75                 80

gca gct caa ctg cgg aag gct gga aaa gtc act gtg aga gaa tca acc    288

Ala Ala Gln Leu Arg Lys Ala Gly Lys Val Thr Val Arg Glu Ser Thr

               85                 90                95

ttg aaa aag cta ggt gct acc cat tat aaa tat gga gta gta aac gag    336

Leu Lys Lys Leu Gly Ala Thr His Tyr Lys Tyr Gly Val Val Asn Glu

          100                 105               110

cat ttt gag gtt aca aag ttt gca cta ctg gat acc ata aaa gaa gct    384

His Phe Glu Val Thr Lys Phe Ala Leu Leu Asp Thr Ile Lys Glu Ala

       115                120                125

gta cct gaa atg tgg tca cca gag atg aag aat gca tgg aca caa gct    432

Val Pro Glu Met Trp Ser Pro Glu Met Lys Asn Ala Trp Thr Gln Ala

    130                135               140

tat gat cag ctg gtc ggt gcc att aaa tct gaa atg aag cca tca tct    480

Tyr Asp Gln Leu Val Gly Ala Ile Lys Ser Glu Met Lys Pro Ser Ser

145               150                 155                 160

tct tag                                                            486

Ser

<210>2

<211>161

<212>PRT

<213>百脉根

<400>2

Met Ser Thr Leu Gly Ser Thr Cys Phe Thr Glu Glu Gln Glu Ala Leu

 1              5                 10                 15

Val Val Lys Ser Trp Ser Val Met Lys Lys Asn Ser Ala Glu Leu Gly

            20                 25                 30

Leu Lys Leu Phe Leu Lys Ile Phe Glu Ile Ala Pro Ser Ala Gln Lys

        35                 40                  45

Leu Phe Ser Phe Leu Arg Asp Ser Lys Val Pro Leu Glu Glu Asn Pro

    50                 55                 60

Lys Leu Lys Pro His Ala Met Ser Val Phe Val Met Thr Cys Glu Ser

 65                 70                75                 80

Ala Ala Gln Leu Arg Lys Ala Gly Lys Val Thr Val Arg Glu Ser Thr

               85                 90                95

Leu Lys Lys Leu Gly Ala Thr His Tyr Lys Tyr Gly Val Val Asn Glu

           100                105                110

His Phe Glu Val Thr Lys Phe Ala Leu Leu Asp Thr Ile Lys Glu Ala

       115                 120              125

Val Pro Glu Met Trp Ser Pro Glu Met Lys Asn Ala Trp Thr Gln Ala

    130                135                140

Tyr Asp Gln Leu Val Gly Ala Ile Lys Ser Glu Met Lys Pro Ser Ser

145               150                  155                160

Ser

<210>3

<211>1012

<212>DNA

<213>百脉根

<400>3

atgtccaccc ttgggagcac atgtttcact gaagagcaag aagctcttgt ggtcaagtca     60

tggagcgtga tgaagaagaa ttctgctgaa ctgggtctca agcttttctt gaagtaagtc    120

atttaatttc atcaacatta taagttcatg gcatatatag ttgtattttc atttttgtcc    180

ttagacaaca atgtgctatt tagaacaatt gaattgataa taaaaattgt gtctttgtag    240

aatatttgag attgctccat cagctcagaa attgttctct ttcttgagag attcaaaagt    300

tcctttggag gagaacccca agctcaagcc tcatgccatg tctgtctttg tcatggtaac    360

cttacttcct ttcactctgt ctccattcac catttgaatg aatgataaat actatgttta    420

gattaactac tcttttctct ttcatcagaa tctaccaagg agcttctcat gattttggtt    480

acaaaataaa ttgtagaaga attttcgaat acgaaatcag ataaattaag aagctttatt    540

ttgtttttgt tattgcagac ttgtgaatca gcagctcaac tgcggaaggc tggaaaagtc    600

actgtgagag aatcaacctt gaaaaagcta ggtgctaccc attataaata tggagtagta    660

aacgagcatt ttgaggtata tatataaaat ttcaattagt atgtttgaga aagcattgtt    720

tatttgaaag tgtcaacata tacaagattg aaaatgacat ttgctatatt aacttttaca    780

tcaagttgta taaaacaatg taatcttgca tatggagtgc tttttgtatt tgatggggca    840

tatgtataat ttattctttg gttttgtaaa ggttacaaag tttgcactac tggataccat    900

aaaagaagct gtacctgaaa tgtggtcacc agagatgaag aatgcatgga cacaagctta    960

tgatcagctg gtcggtgcca ttaaatctga aatgaagcca tcatcttctt ag           1012

<210>4

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：引物

<400>4

ttctcacttc acttccatcg c    21

<210>5

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：引物

<400>5

ttggtcaagt catggagcg    19

<210>6

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：引物

<400>6

tcacagtgac ttttccagcg    20

<210>7

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：引物

<400>7

agacagacat ggcatgaggc    20

<210>8

<211>483

<212>DNA

<213>夜叉桤木

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(483)

<400>8

atg aac acc ttg gaa gga aga ggg ttc aca gaa gag caa gaa gct gtg     48

Met Asn Thr Leu Glu Gly Arg Gly Phe Thr Glu Glu Gln Glu Ala Val

 1              5                10                 15

gtg gtg aag tca tgg aat gca atg aag cct aat gct gga gaa ttg ggt     96

Val Val Lys Ser Trp Asn Ala Met Lys Pro Asn Ala Gly Glu Leu Gly

            20                25                  30

cta aaa ttc ttc ttg aag ata ttt gag att gca cca tca gct cag aag    144

Leu Lys Phe Phe Leu Lys Ile Phe Glu Ile Ala Pro Ser Ala Gln Lys

        35                 40                  45

ctc ttc tct ttc ttg aga gac tca aat gtt tct ctc gaa cga aat cca    192

Leu Phe Ser Phe Leu Arg Asp Ser Asn Val Ser Leu Glu Arg Asn Pro

    50                 55                 60

aag ctt aag tcc cat gcc atg tct gtc ttt ctg atg acc tgt gaa tcg    240

Lys Leu Lys Ser His Ala Met Ser Val Phe Leu Met Thr Cys Glu Ser

 65                 70                 75                80

gca gtg caa ctc cgg aaa gcc ggc aaa gtt act gtg aga gag tcg agc    288

Ala Val Gln Leu Arg Lys Ala Gly Lys Val Thr Val Arg Glu Ser Ser

                85                90                95

ttg aaa aag ttg ggt gct gtc cac ttc aag cat ggg gtg gtc gat gaa    336

Leu Lys Lys Leu Gly Ala Val His Phe Lys His Gly Val Val Asp Glu

          100                 105                110

cat tat gag gtc aca aag ttt gcg ctg ctg gaa act atc aag gaa gcg    384

His Tyr Glu Val Thr Lys Phe Ala Leu Leu Glu Thr Ile Lys Glu Ala

       115                 120                125

gtg cca gaa atg tgg tca ccg gag atg aag att gca tgg gga gaa gct    432

Val Pro Glu Met Trp Ser Pro Glu Met Lys Ile Ala Trp Gly Glu Ala

    130                 135                140

tat gat cag ttg gtt gct gct atc aaa tct gca atg aag cct tct tct    480

Tyr Asp Gln Leu Val Ala Ala IIe Lys Ser Ala Met Lys Pro Ser Ser

145                150                 155                 160

tag                                                                483

<210>9

<211>160

<212>PRT

<213>夜叉桤木

<400>9

Met Asn Thr Leu Glu Gly Arg Gly Phe Thr Glu Glu Gln Glu Ala Val

 1              5                10                 15

Val Val Lys Ser Trp Asn Ala Met Lys Pro Asn Ala Gly Glu Leu Gly

            20                25                  30

Leu Lys Phe Phe Leu Lys Ile Phe Glu Ile Ala Pro Ser Ala Gln Lys

        35                 40                   45

Leu Phe Ser Phe Leu Arg Asp Ser Asn Val Ser Leu Glu Arg Asn Pro

    50                 55                 60

Lys Leu Lys Ser His Ala Met Ser Val Phe Leu Met Thr Cys Glu Ser

 65                 70                75                 80

Ala Val Gln Leu Arg Lys Ala Gly Lys Val Thr Val Arg Glu Ser Ser

                85                90                 95

Leu Lys Lys Leu Gly Ala Val His Phe Lys His Gly Val Val Asp Glu

          100                 105                110

His Tyr Glu Val Thr Lys Phe Ala Leu Leu Glu Thr Ile Lys Glu Ala

       115                 120               125

Val Pro Glu Met Trp Ser Pro Glu Met Lys Ile Ala Trp Gly Glu Ala

    130                135                 140

Tyr Asp Gln Leu Val Ala Ala Ile Lys Ser Ala Met Lys Pro Ser Ser

145                150                 155                 160

<210>10

<211>892

<212>DNA

<213>夜叉桤木

<400>10

atgaacacct tggaaggaag agggttcaca gaagagcaag aagctgtggt ggtgaagtca     60

tggaatgcaa tgaagcctaa tgctggagaa ttgggtctaa aattcttctt gaagtaagcc    120

atattaataa atttatcgtt tgattataat taatttccca tatatatcaa tggctgttga    180

tttgaacaaa tgggttttgt aggatatttg agattgcacc atcagctcag aagctcttct    240

ctttcttgag agactcaaat gtttctctcg aacgaaatcc aaagcttaag tcccatgcca    300

tgtctgtctt tctgatggta agaccccttt gagtgatttg aatcgagatt atctatgttg    360

tagtttcatg gtttttggtt tgtttgaaag atatggtttc atggtttggt aggctaagac    420

ggctatgaaa tctgtgagag ttaatcttct aattgattgg ccggaaagtg gaaacctatt    480

aattaagaat aagcatgtaa tcaattgtgt ttggttaatt ttgtatatgt atattgcaga    540

cctgtgaatc ggcagtgcaa ctccggaaag ccggcaaagt tactgtgaga gagtcgagct    600

tgaaaaagtt gggtgctgtc cacttcaagc atggggtggt cgatgaacat tatgaggtac    660

gacgtagtat cctcatccat ccatgcattt gctcatatat ccctgctgat taattatttc    720

catggctgat catggctttg taaatggttc acaggtcaca aagtttgcgc tgctggaaac    780

tatcaaggaa gcggtgccag aaatgtggtc accggagatg aagattgcat ggggagaagc    840

ttatgatcag ttggttgctg ctatcaaatc tgcaatgaag ccttcttctt ag            892

<210>11

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：引物

<400>11

gctgctatca aatctgcaat    20

<210>12

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：引物

<400>12

ggggggctgt gattttag    18